KR20120074956A

KR20120074956A - 양파의 웅성불임 다형성 마커

Info

Publication number: KR20120074956A
Application number: KR1020100136953A
Authority: KR
Inventors: 김성길; 윤무경
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2010-12-28
Filing date: 2010-12-28
Publication date: 2012-07-06
Also published as: KR101338472B1

Abstract

본 발명은 양파의 웅성불임 또는 가임을 판정할 수 있는 새로운 서열의 핵산분자 마커 및 그 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 양파의 웅성가임 또는 불임과 관련된 다형성을 짧은 시간내에 판별할 수 있어 양파의 F₁ 잡종품종개발을 위한 웅성불임 양파의 대량생산이 가능하다. 또한, 양파의 웅성가임 또는 불임에 특이적인 본 발명의 유전자 마커를 통하여 정확한 유전형질의 분석이 가능하다.

Description

양파의 웅성불임 다형성 마커{Male-Sterility Polymorphism Markers in Onion}

본 발명은 양파의 웅성불임 또는 가임을 판정할 수 있는 새로운 서열의 핵산분자 마커 및 그 용도에 관한 것이다.

식물에서 웅성 불임(Male-sterility)은 다양한 화분립들(pollen grains)을 생성할 수 있는 능력으로 정의된다. 화분립은 140여종 이상이 보고된 바 있다(Hanson 1991). 웅성 불임은 원인이 되는 유전자의 위치에 따라 크게 핵 유전자적 웅성불임(genic male-sterility: GMS)과 세포질적 웅성불임(cytoplasmic male-sterility: CMS)으로 나뉜다.

지금까지 CMS의 원인이 되는 유전자들은 미토콘드리아에 존재하는 것으로 보고되었다(Fauron et al. 1990; Budar et al. 2003; Hanson and Bentolila 2004; Knoop 2004). 비슷한 웅성불임의 표현형이 나타남에도 미토콘드리아 유전자는 식물의 종에 따라 낮은 CMS 상동성을 가진다. 이러한 특이한 특성은 고등식물의 복잡성에 기인하는 것으로 보여진다.

대체로 15-18 kb의 단일 고리형으로 구성되는 동물의 미토콘드리아 지놈과 달리, 식물의 미토콘드리아 지놈은 크기가 200에서 2500 kb로 다양하고(Ward et al. 1981 Palmer and Herbon 1987), 반복서열-매개 상동성 재조합(homologous recombination)에 의해 만들어진 다중형으로 존재한다(Palmer 1988; Albert et al. 1998). 게다가 서브지놈 분자의 한 타입인 서브리몬(sublimon)은 단 반복(short repeats)에 의해 매개되는 재배열에 의해 발달한다. 이러한 동역학적 재배열(dynamic rearrangement)은 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 진화 배후의 구동력이 되며 CMS-유도성 유전자를 만드는 원인이 된다(Small et al. 1989). 대부분의 CMS-유도성 유전자는 예컨대 ATP 합성효소 및 미발견 유전자간 서열들(unknown intergenic sequences )을 코딩하는 것과 같은 선천적 미토콘드리아 유전자의 부분서열을 구성하는 키메릭 유전자이다(Hanson and Bentolila 2004).

비록 보통 키메라 유전자가 de novo 신생을 통해 유도되지만, CMS는 아화학양론적 쉬프팅(substoichiometric shifting)이라 불리는 메커니즘을 통해 CMS-유도 키메라 유전자를 포함하는 서브리몬(sublimon)의 복제수를 증가시킴으로써 유도 될 수 있는데, 서브리몬의 화학양론은 조직 배양과 같은 촉진 반응(Kanazawa et al. 1994)이나 서브리몬의 화학양론을 유지시키는 핵 유전자의 변이반응으로 변화한다(Mackenzie and Chase 1990; Janska et al. 1998; Arrieta-Montiel et al. 2001 Abdelnoor et al. 2003). 최근 연구결과 Msh1(Abdelnoor et al. 2006), RecA (Shedge et al. 2007), OSB1 (Zaegel et al. 2006)과 같은 몇몇 유전자를 규명했다. 이들은 모두 미토콘드리아 DNA(mtDNA)의 재조합을 억제하고 서브리몬의 전파를 유지하게 한다. Sandhu et al. (2007)에서는 담배 및 유전자변형 토마토에서 RNAi를 이용한 상기 Msh1 유전자의 불활성화는 유전자변형 mtDNA의 아화학량적 치환과 CMS 표현형을 야기 한다는 것을 밝혀냈다. CMS 유발 미토콘드리아 유전자들의 발현은 종종 회복유전자(Restorer-of-Fertility genes; RF genes)에 의해 억제된다. 옥수수의 Rf2 유전자를 제외하고, 유전자 산물은 알데하이드 디하이드로제네이즈이고, 모든 복제된 Rf 유전자는 펜타트리코펩타이드 반복(pentatricopeptide repeat ; PPR)단백질을 인코딩한다(Bentolila et al. 2002 Brown et al. 2003; Desloire et al. 2003; Koizuka et al. 2003 Komori et al. 2004 Klein et al. 2005).

PPR 유전자는 Arabidopsis에 속하는 커다란 유전자 군으로 구성되며, 세포소기관 생합성과 관련되어 있는 것으로 알려져 있다(Small and Peeters 2000 Lurin et al. 2004; Gothandam et al. 2005 Schmitz-Linneweber and Small 2008). 비록 PPR유전자에 의한 상세한 회복 메커니즘은 아직 알려진 바가 없으나 페튜니아(petunia)와 관련하여 핵 Rf 유전자들을 포함하는 거대한 미토콘드리아 복합체의 존재 및 CMS-유발 유전자와 mRNA 전사물간의 직접적인 상호작용에 대해 보고된 바가 있으며, 또한, 최근 쌀에서 Rf 유전자의 활동에 의한 CMS 억제에 대한 상세한 메커니즘이 해명되었다(Wang et al. 2006; Kazama et al. 2008; Fuji and Toriyama 2009). CMS의 두 가지 타입(CMS-S(Jones and Emsweller 1936) 및 CMS-T(Berninger 1965))과 회복시스템은 양파의 F₁ 잡종품종개발에 활용될 수 있다.

미토콘드리아 및 염록체 단편을 분석해 본 결과, CMS-T의 싸이토타입은 CMS-S와는 관련성 낮은 반면, 최근 정상적인 싸이토 타입으로부터 CMS-T가 발생했다는 사실은 CMS-T가 정상적인 싸이토타입과는 매우 관련성이 깊다는 것을 보여준다. 따라서 각각의 미토콘드리아 유전자는 각각 다른 시스템으로 CMS를 유발할 것으로 생각된다(Kim and Yoon 2010). 또한, 회복의 유전적 형식도 양 CMS 시스템 간에 차이가 있다. CMS-S 싸이토타입으로부터 유발된 CMS 회복은 하나의 Rf 로커스(Ms)만이 관련되어 있으나(Jones and Clarke 1943). CMS-T 싸이토타입으로부터 유발된 웅성불임의 회복은 독립된 세 개의 자리들에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다(Schweisguth 1973). CMS-S의 싸이토 타입은 다양환 환경 하에서도 안정적인 웅성불임을 가지고 또한, 단일 유전자 유전 형태로 간단하게 회복이 조절되므로 F₁ 잡종품종개발에 널리 사용되고 있다(Havey 2000). 따라서 CMS 타입의 판별과 Ms 로커스의 대립형질을 식별하는 것은 양파 F₁ 잡종재배의 필수적 단계이다. 그러나, 양파는 격년 작물이기 때문에 세포질 타입과 후대검정에 의한 대립형질의 식별에는 4~8년의 기간이 소요된다. 반면, 분자마커는 긴 시간 및 인력이 소요되는 후대검정을 대체하여 생육과정을 크게 과속화 시킬 수 있다. 양파의 싸이토타입을 판별하기 위한 몇몇 분자마커가 보고된 바 있다(Havey 1995 Sato 1998 Engelke et al. 2003 Kim et al. 2009). 예컨대, 세 가지 싸이토타입의 판별을 위한 심플 PCR (Simple Polymerase chain reaction)마커가 양파 미토콘드리아 지놈상의 새로운 키메라 유전자(orf725 )의 미분 화학양론에 기반하여 개발되었다(Kim et al. 2009). 반면 핵 Ms 자리의 대립형질 분별을 위한 분자 마커가 몇몇 보고된 바 있다(Get al. 2002; Martin et al. 2005).

본 발명자들은 양파의 웅성가임 또는 불임과 관련된 새로운 유전자 마커 특히 간단한 프로토콜, 특히 PCR(polymerase chain reaction)을 통하여 양파의 웅성가임 또는 불임을 판정할 수 있는 새로운 유전자 마커를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 OPT(oligopeptide transporter)로 추정되는 단백질을 코딩하는 서열목록 제1서열과 제2서열 그리고 PsaO(photosystem I subunit O)를 코딩하는 서열목록 제3서열과 제4서열을 시퀀싱 하고 이들 서열들이 양파의 웅성가임 또는 불임과 연관성이 매우 크고 이를 유전자 마커로 이용하는 경우에는 PCR로 양파의 웅성가임 또는 불임을 간편하게 판정할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 양파의 웅성 불임 또는 가임에 관련된 핵산분자를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 양파의 웅성불임 또는 가임을 판별하는 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 양파의 웅성불임 또는 가임을 판별하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 양파의 웅성가임(male fertility) 관련 핵산분자를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 양파의 웅성불임(male sterility) 관련 핵산분자를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 양파의 웅성가임(male fertility) 관련 핵산분자를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 양파의 웅성불임(male sterility) 관련 핵산분자를 제공한다.

본 발명자들은 양파의 웅성가임 또는 불임과 관련된 새로운 유전자 마커 특히 간단한 프로토콜, 특히 PCR(polymerase chain reaction)을 통하여 양파의 웅성가임 또는 불임을 판정할 수 있는 새로운 유전자 마커를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 OPT(oligopeptide transporter)로 추정되는 단백질을 코딩하는 서열목록 제1서열과 제2서열 그리고 PsaO(photosystem I subunit O)를 코딩하는 서열목록 제3서열과 제4서열을 시퀀싱 하고 이들 서열들이 양파의 웅성가임 또는 불임과 연관성이 매우 크고 이를 유전자 마커로 이용하는 경우에는 PCR로 양파의 웅성가임 또는 불임을 간편하게 판정할 수 있음을 규명하였다.

본 발명은 서열목록 제1서열 내지 제4서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산분자를 제공한다.

본 명세서에서 용어 “핵산분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

서열목록 제1서열 및 제2서열은 OPT로 추정되는 단백질을 코딩하는 서열로서 서열목록 제1서열은 양파의 웅성가임과 관련된 서열이고 서열목록 제2서열은 양파의 웅성불임과 관련된 서열이다.

서열목록 제3서열 및 제4서열은 PsaO를 코딩하는 서열로서 서열목록 제3서열은 양파의 웅성가임과 관련된 서열이고 서열목록 제4서열은 양파의 웅성불임과 관련된 서열이다.

생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 핵산분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 98%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv . Appl . Math . 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio . 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol . 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res . 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp . Appl . BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth . Mol . Biol . 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-10(1990))은 NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다.

이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

상기 서열목록 제1서열 내지 제4서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산분자는 양파의 F1 하이브리드 육종 프로그램에서 개체의 분리(segregation) 즉 웅성가임과 웅성불임의 개체를 분리하는 데 있어서 마커-기반 선별(marker-assisted selection)에 유용한 유전자 마커로 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 1-1442에 혼성화 되는 프라이머 및 뉴클레오타이드 1443-2400에 혼성화 되는 프라이머를 포함하는 양파의 웅성불임(male sterility) 또는 웅성가임(male fertility)를 판정하기 위한 키트를 제공한다.

서열목록 제1서열에서 뉴클레오타이드 961-1088 번째에 해당하는 부위는 양파의 웅성가임의 경우에는 존재하는 서열이지만 웅성불임의 경우에는 존재하지 않는 삽입-결실(indel) 변이가 발생하는 부위이다. 본 발명의 키트는 상기 변이 발생 부위에 인접한(flanking) 서열에 혼성화(또는 어닐링) 되는 프라이머를 포함하는 키트이다.

상기 프라이머를 이용하여 유전자 증폭(예컨대, PCR)을 한 결과, 뉴클레오타이드 961-1088 번째에 해당하는 부위를 포함하는 증폭산물이 얻어진 경우에는 웅성가임으로 판정하고 그렇지 않은 경우에는 웅성불임으로 판정한다.

본 발명의 한 쌍의 프라이머 즉 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함한다. 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 1-1442에 혼성화 되는 프라이머 및 뉴클레오타이드 1443-2400에 혼성화 되는 프라이머 중에서, 하나는 정방향 프라이머 및 다른 하나는 역방향 프라이머가 될 수 있다. 정방향 프라이머인 경우에는, 서열목록 제2서열에 혼성화 되는 서열(즉, 서열목록 제2서열에 상보적인 서열)을 가지며, 역방향 프라이머인 경우에는 서열목록 제2서열의 상보적인 서열에 혼성화 되는 서열을 갖는다. 본 명세서에서는, 역방향 프라이머인 경우에도 서열목록 제2서열을 기준으로 표시하였지만, 이는 본 명세서의 간단 명료함을 위한 것이며, 역방향 프라이머의 서열 또는 특허청구범위를 판단함에 있어서, 서열목록 제2서열의 상보적인 서열을 기준으로 하여야 한다.

본 명세서에서, 표현 “서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 1-1442에 혼성화 되는 프라이머”는, 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 1-1442에 해당하는 서열의 일부 서열에 혼성화 되는 통상적인 길이의 프라이머를 의미한다. 상기 통상적인 길이는 10-50 뉴클레오타이드이고, 바람직하게는 15-50 뉴클레오타이드이며, 보다 바람직하게는 20-40 뉴클레오타이드이고, 보다 더 바람직하게는 22-35 뉴클레오타이드이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 1-1442에 혼성화 되는 프라이머는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 1000-1442에 혼성화 되는 프라이머, 보다 바람직하게는 뉴클레오타이드 1100-1380에 혼성화 되는 프라이머, 보다 더 바람직하게는 뉴클레오타이드 1250-1340에 혼성화 되는 프라이머이다.

본 명세서에서, 표현 “서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 1443-2400에 혼성화 되는 프라이머”는, 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 1443-2400에 해당하는 서열의 일부 서열에 혼성화 되는 통상적인 길이의 프라이머를 의미한다. 상기 통상적인 길이는 10-50 뉴클레오타이드이고, 바람직하게는 15-50 뉴클레오타이드이며, 보다 바람직하게는 20-40 뉴클레오타이드이고, 보다 더 바람직하게는 22-35 뉴클레오타이드이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 이러한 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.

프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정된다. 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.

본 발명에서 이용되는 프라이머는 타깃 핵산서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함한다. 용어 “상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적 (perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.

본 명세서 용어 “혼성화(hybridization)" 는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.

용어“어닐링”과 “혼성화”는 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.

본 발명은 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 1443-2406에 혼성화 되는 프라이머 및 뉴클레오타이드 2407-3500에 혼성화 되는 프라이머를 포함하는 양파의 웅성불임(male sterility) 또는 웅성가임(male fertility)을 판정하기 위한 키트를 제공한다.

서열목록 제1서열에서 뉴클레오타이드 2048-2086 번째에 해당하는 부위는 양파의 웅성가임의 경우에는 존재하는 서열이지만 웅성불임의 경우에는 존재하지 않는 삽입-결실(indel) 변이가 발생하는 부위이다. 본 발명의 키트는 상기 변이 발생 부위에 인접한(flanking) 서열에 혼성화(또는 어닐링) 되는 프라이머를 포함하는 키트이다.

상기 프라이머를 이용하여 유전자 증폭(예컨대, PCR)을 한 결과, 뉴클레오타이드 2048-2086 번째에 해당하는 부위를 포함하는 증폭산물이 얻어진 경우에는 웅성가임으로 판정하고 그렇지 않은 경우에는 웅성불임으로 판정한다.

본 발명의 한 쌍의 프라이머 즉 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함한다. 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 1443-2406에 혼성화 되는 프라이머 및 뉴클레오타이드 2407-3500에 혼성화 되는 프라이머 중에서, 하나는 정방향 프라이머 및 다른 하나는 역방향 프라이머가 될 수 있다. 정방향 프라이머인 경우에는, 서열목록 제2서열에 혼성화 되는 서열(즉, 서열목록 제2서열에 상보적인 서열)을 가지며, 역방향 프라이머인 경우에는 서열목록 제2서열의 상보적인 서열에 혼성화 되는 서열을 갖는다. 본 명세서에서는, 역방향 프라이머인 경우에도 서열목록 제2서열을 기준으로 표시하였지만, 이는 본 명세서의 간단/명료함을 위한 것이며, 역방향 프라이머의 서열 또는 특허청구범위를 판단함에 있어서, 서열목록 제2서열의 상보적인 서열을 기준으로 하여야 한다.

본 명세서에서, 표현 “서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 1443-2406에 혼성화 되는 프라이머”는, 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 1443-2406에 해당하는 서열의 일부 서열에 혼성화 되는 통상적인 길이의 프라이머를 의미한다. 상기 통상적인 길이는 10-50 뉴클레오타이드이고, 바람직하게는 15-50 뉴클레오타이드이며, 보다 바람직하게는 20-40 뉴클레오타이드이고, 보다 더 바람직하게는 22-35 뉴클레오타이드이다.

서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 1443-2406에 혼성화 되는 프라이머는 바람직하게는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 1800-2406에 혼성화 되는 프라이머, 보다 바람직하게는 뉴클레오타이드 2100-2380에 혼성화 되는 프라이머, 보다 더 바람직하게는 뉴클레오타이드 2220-2320에 혼성화 되는 프라이머이다.

본 명세서에서, 표현 “서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 2407-3500에 혼성화 되는 프라이머”는, 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 2407-3500에 해당하는 서열의 일부 서열에 혼성화 되는 통상적인 길이의 프라이머를 의미한다. 상기 통상적인 길이는 10-50 뉴클레오타이드이고, 바람직하게는 15-50 뉴클레오타이드이며, 보다 바람직하게는 20-40 뉴클레오타이드이고, 보다 더 바람직하게는 22-35 뉴클레오타이드이다.

서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 2407-3500에 혼성화 되는 프라이머는, 바람직하게는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 2450-2800에 혼성화 되는 프라이머, 보다 바람직하게는 뉴클레오타이드 2480-2700에 혼성화 되는 프라이머, 보다 더 바람직하게는 뉴클레오타이드 2490-2600에 혼성화 되는 프라이머이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 1-1418에 혼성화 되는 프라이머 및 뉴클레오타이드 1431-2301에 혼성화 되는 프라이머를 포함하는 양파의 웅성불임(male sterility) 또는 웅성가임(male fertility)를 판정하기 위한 키트를 제공한다.

서열목록 제3서열에서 뉴클레오타이드 1420-1479에 해당하는 부위는 양파의 웅성가임의 경우에는 존재하는 서열이지만 웅성불임의 경우에는 존재하지 않는 삽입-결실(indel) 변이가 발생하는 부위이다. 본 발명의 키트는 상기 변이 발생 부위에 인접한(flanking) 서열에 혼성화(또는 어닐링) 되는 프라이머를 포함하는 키트이다.

상기 프라이머를 이용하여 유전자 증폭(예컨대, PCR)을 한 결과, 뉴클레오타이드 1420-1479에 해당하는 부위를 포함하는 증폭산물이 얻어진 경우에는 웅성가임으로 판정하고 그렇지 않은 경우에는 웅성불임으로 판정한다.

본 발명의 한 쌍의 프라이머 즉 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함한다. 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 1-1418에 혼성화 되는 프라이머 및 뉴클레오타이드 1431-2301에 혼성화 되는 프라이머 중에서, 하나는 정방향 프라이머 및 다른 하나는 역방향 프라이머가 될 수 있다. 정방향 프라이머인 경우에는, 서열목록 제4서열에 혼성화 되는 서열(즉, 서열목록 제4서열에 상보적인 서열)을 가지며, 역방향 프라이머인 경우에는 서열목록 제4서열의 상보적인 서열에 혼성화 되는 서열을 갖는다. 본 명세서에서는, 역방향 프라이머인 경우에도 서열목록 제4서열을 기준으로 표시하였지만, 이는 본 명세서의 간단/명료함을 위한 것이며, 역방향 프라이머의 서열 또는 특허청구범위를 판단함에 있어서, 서열목록 제4서열의 상보적인 서열을 기준으로 하여야 한다.

본 명세서에서, 표현 “서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 1-1418에 혼성화 되는 프라이머”는, 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 1-1418에 해당하는 서열의 일부 서열에 혼성화 되는 통상적인 길이의 프라이머를 의미한다. 상기 통상적인 길이는 10-50 뉴클레오타이드이고, 바람직하게는 15-50 뉴클레오타이드이며, 보다 바람직하게는 20-40 뉴클레오타이드이고, 보다 더 바람직하게는 22-35 뉴클레오타이드이다.

서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 1-1418에 혼성화 되는 프라이머는 바람직하게는 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 500-1418에 혼성화 되는 프라이머, 보다 바람직하게는 뉴클레오타이드 1000-1418에 혼성화 되는 프라이머, 보다 더 바람직하게는 뉴클레오타이드 1200-1380에 혼성화 되는 프라이머이다.

본 명세서에서, 표현 “서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 1431-2301에 혼성화 되는 프라이머”는, 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 1431-2301에 해당하는 서열의 일부 서열에 혼성화 되는 통상적인 길이의 프라이머를 의미한다. 상기 통상적인 길이는 10-50 뉴클레오타이드이고, 바람직하게는 15-50 뉴클레오타이드이며, 보다 바람직하게는 20-40 뉴클레오타이드이고, 보다 더 바람직하게는 22-35 뉴클레오타이드이다.

서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 1431-2301에 혼성화 되는 프라이머는, 바람직하게는 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 1431-2000에 혼성화 되는 프라이머, 보다 바람직하게는 뉴클레오타이드 1431-1900에 혼성화 되는 프라이머, 보다 더 바람직하게는 뉴클레오타이드 1600-1800에 혼성화 되는 프라이머이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 970-1088에 혼성화 되는 프로브를 포함하는 양파의 웅성불임(male sterility) 또는 웅성가임(male fertility)을 판정하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 2048-2086에 혼성화 되는 프로브를 포함하는 양파의 웅성불임(male sterility) 또는 웅성가임(male fertility)를 판정하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 1420-1479에 혼성화 되는 프로브를 포함하는 양파의 웅성불임(male sterility) 또는 웅성가임(male fertility)를 판정하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 타겟 서열과의 혼성화를 위한 프로브를 기반으로 한다. 만일, 상기 프로브와 시료 내 핵산서열을 혼성화 시킨 경우, 혼성화가 이루어진 경우에는 웅성가임으로 판정하고 그렇지 않은 경우에는 웅성불임으로 판정한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “프로브(probe)"는 타깃 핵산서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 단일쇄 핵산 분자이다. 바람직하게는, 프로브는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프로브는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 양파의 웅성불임 또는 웅성가임 판별방법를 제공한다:

(a) 양파로부터 gDNA(genomic DNA)를 수득하는 단계; 및

(b) 상기 양파 gDNA에 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 970-1088까지 서열 또는 뉴클레오타이드 2048-2086까지 서열이 존재하는 지 여부를 분석하는 단계, (i) 상기 양파 gDNA가 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 970-1088까지 서열 또는 뉴클레오타이드 2048-2086까지 서열이 존재하는 서열만을 포함하는 경우에는 웅성가임으로 판정하고, (ii) 상기 양파 gDNA가 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 970-1088까지 서열 또는 뉴클레오타이드 2048-2086까지 서열이 존재하는 서열과 뉴클레오타이드 970-1088까지 서열 또는 뉴클레오타이드 2048-2086까지 서열이 존재하지 않는 서열을 모두 포함하는 경우에는 웅성가임으로 판정하며, (iii) 상기 양파 gDNA가 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 970-1088까지 서열 또는 뉴클레오타이드 2048-2086까지 서열이 존재하지 않는 서열만을 포함하는 경우에는 웅성불임으로 판정한다.

(a) 양파로부터 gDNA(genomic DNA)를 수득하는 단계; 및

(b) 상기 양파 gDNA에 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 1420-1479까지 서열이 존재하는 지 여부를 분석하는 단계, (i) 상기 양파 gDNA가 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 1420-1479까지 서열이 존재하는 서열만을 포함하는 경우에는 웅성가임으로 판정하고, (ii) 상기 양파 gDNA가 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 1420-1479까지 서열이 존재하는 서열과 뉴클레오타이드 1420-1479까지 서열이 존재하지 않는 서열을 모두 포함하는 경우에는 웅성가임으로 판정하며, (iii) 상기 양파 gDNA가 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 1420-1479까지 서열이 존재하지 않는 서열만을 포함하는 경우에는 웅성불임으로 판정한다.

본 발명의 두 가지 방법 중에서 첫 번째 방법은, OPT의 삽입-결실 변이를 마커로 이용하는 것이고, 두 번째 방법은 PsaO의 삽입-결실 변이를 마커로 이용하는 것이다.

본 발명의 방법에 따르면, 우선 양파로부터 gDNA를 수득한다.

상기 gDNA는 양파의 다양한 기관으로부터 얻을 수 있으며, 예컨대, 잎, 뿌리, 줄기, 종자, 꽃 또는 화경으로부터 얻을 수 있고, 가장 바람직하게는 잎 또는 화경으로부터 얻는다. 핵산분자의 공급원 (source)로서의 식물체는 어떠한 발달 단계에 있는 것이든 모두 공급원으로서 이용될 수 있다.

양파로부터 gDNA를 분리/수득 하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시할 수 있다(참조: Murray MG, Thompson WF, Rapid isolation of high-molecular-weight plant DNA. Nucleic Acids Res 8:4321-4326(1980)).

단계 (b)는 당업계에 공지된 다양한 유전자 분석 방법에 따라 실시할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계 (b)는 프라이머를 이용한 유전자 증폭방법에 따라 실시한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계 (b)는 프로브를 이용한 혼성화 방법에 따라 실시한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계 (b)는 시퀀싱에 의해 실시된다.

본 발명의 방법을 프로브를 이용한 혼성화 방식에 따라 실시하는 경우에는,적합한 고상기질 예컨대, 마이크로어레이의 고상표면에 프로브가 고정화 되어 있다. 본 발명의 방법을 유전자 증폭을 통하여 실시하는 경우에는 프라이머가 이용된다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

본 발명의 방법은 혼성화에 기초하여 실시할 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 마커들의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브가 이용된다.

상술한 본 발명의 마커들의 뉴클레오티드 서열에 혼성화 되는 프로브를 이용하여 혼성화-기초 분석을 하여 웅성가임성 여부를 판단할 수 있다.

프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5 (Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P³² 및 S³⁵), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

프로브를 이용하는 경우, 프로브를 분리한 gDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO₄, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.

혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다. 따라서 본 발명의 웅성가임성 마커를 검출하는 방법을 혼성화에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브를 핵산 시료에 혼성화시키는 단계; (ii) 상기 혼성화 반응 발생 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 혼성화 과정에 의한 혼성화 시그널의 세기를 분석함으로써, 웅성가임성 여부를 판단할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대한 혼성화 시그널이 양성 대조군(즉, 웅성가임성의 양파로부터 얻은 gDNA)과 유사한 수준으로 나오는 경우에는 웅성가임으로 진단된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 유전자 증폭 방법에 따라 실시한다.

본 명세서에 기재된 용어“증폭”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification; TMA, WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction(CP-PCR), 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR), 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification(NASBA), 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명을 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 존재 여부를 조사한다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg² ⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링은 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격한 조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

이렇게 증폭된 증폭산물을 예를 들어, 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 존재 여부를 조사한다.

본 발명의 신규한 유전자 마커를 이용하여 유전자 분석을 하는 경우에는, 종래 기술과 비교하여 보다 간편하면서도 대량-규모로 신뢰성 있게 양파의 웅성가임과 웅성불임 개체를 구별 및 분리할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다.

(a) 양파의 웅성가임 또는 불임과 관련된 다형성을 짧은 시간내에 판별할 수 있어 양파의 F₁ 잡종품종개발을 위한 웅성불임 양파의 대량생산이 가능하다.

(b) 양파의 웅성가임 또는 불임에 특이적인 유전자 마커를 통하여 정확한 유전형질의 분석이 가능하다.

도 1은 OPT를 코딩하는 것으로 추정되는 다형성 인트론 서열에 기초한 심플 PCR-기반 공동우점 마커에 관한 것으로서,
도 1a는 Ms 위치에 연관된 OPT 대립형질들과 쌀의 OPT -코딩 유전자의 유전자구조를 비교한 그림이다. 화살표 모양의 박스들은 5’에서 3’ 방향을 나타내고 채워진/빈 박스들은 각각 인트론 및 엑손을 나타낸다. 회색 박스들은 삽입 또는 결실된 부분을 나타내고, 수평한 화살표는 프라이머 위치를 나타낸다. 직렬로 배열된 세 개의 검은색 화살표는 세 개의 34-bp 직렬반복들을 나타낸다.
도 1b는 뉴클레오티드 서열 플랭킨 반복들의 정렬을 나타내는 그림이다. 직사각형의 박스들에 둘러 쌓여있는 서열들은 반복서열이며, 화살표는 프라이머-결합 위치들을 나타낸다.
도 1c는 F₂ 식물들의 프라이머 쌍(OPT-F 및 OPT-R)을 통해 증폭한 PCR 생성물을 전기영동을 통해 분석한 결과를 보여주는 사진이다.
도 2는 PsaO를 코딩하는 것으로 추정되는 5’ 상단 서열에 기초한 심플 PCR 기반 공동우점 마커에 관한 것으로서,
도 1a는 PsaO를 코딩하는 것으로 추정되는 유전자의 구조를, 화살표 모양의 박스들은 5’에서 3’ 방향을 나타낸다. 채워진/빈 박스들은 각각 엑손 및 인트론들을, 회색 상자들은 반복 서열들을, 수평 화살표는 프라이머-결합 위치들을 나타낸다.
도 1b는 뉴클레오티드 서열 플랭킨 반복들의 정렬. 직사각형의 박스들에 둘러 쌓여있는 서열들은 반복서열이다. 화살표는 프라이머-결합 위치들을 나타낸다.
도 1c는 F₂ 식물들의 프라이머 쌍(PSAO-F 및 PSAO-R)을 통해 증폭한 PCR 생성물을 전기영동을 통해 분석한 결과를 보여주는 사진이다.
도 3는 PsaO 마커의 세 개의 서열을 정렬한 것 이며, 직사각형의 박스들에 둘러 쌓여있는 서열들은 반복서열 R1 및 R2를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

1. 실험재료 및 방법

식물체 및 DNA 추출( Plant materials and DNA extraction )

종전의 연구(Kim et al. 2004)에서 만들어낸 F₂개체군을 분자마커 개발 및 연관 분석에 사용하였다. F₁잡종을 만들기 위해 노란색 웅성 재배 계열(506L)을 붉은 웅성 2배반수체(doubled haploid)계열과 교배하였고, F₂개체를 만들기 위해 하나의 F₁잡종 식물을 자가수분하였다. 개개의 F2가 발아되고 구근들을 2008년 5월 수확하였다. 수확된 구근들을 심었고, 2009년 4월에 개화가 시작되었다. 188개의 웅성불임 F2 개체가 외관 조사에 의해 판별되었다. 56개 양파의 생식질로부터 얻은 마커 하플로타입의 분포는 미국 국가식물생식질시스템 농업연구서비스에서(National Plant Germplasm System, Agricultural Research Service, USA)에서 입수했다(표 1 참조). 또한, 웅성불임으로 재배된 8개 라인이 마커 하플로타입과 Ms 유전자형의 연관관계를 분석하기 위해 사용되었다. 세포질 타입은 이전 논문에 사용되었던 바이오마커 CMS-S로 확인했다(Kim et al. 2009). 잎 또는 화경으로부터 CTAB(cetyltrimethylammonium bromide)기법을 이용하여 총 지놈 DNAs를 추출하였다(Murray and Thompson 1980).

RFLP 마커를 심플 PCR-기반 공동우점종(codominant) 마커로의 전환

AOB272 및 AGF136 각각의 RFLP 프로브 서열을 접근번호 AA451592 및 AF366447번의 GenBank로부터 얻었다. AOB272 EST 프로브의 전체길이 cDNA는 RACE(Rapid amplification of cDNA ends)로 얻었다. 총 RNA는 RNA 추출키트(RNeasy Plant Mini Kit, QIAGEN, Valencia, CA, USA)를 사용하여 설명서에 따라 추출했다. 상업적으로 판매되는 RACE 키트(SMART RACE cDNA Amplification Kit, Clontech, Palo Alto, CA, USA)를 설명서에 따라 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 그리고 RACE PCR 생산물을 1%의 아가로즈젤로부터 잘라내고, 그 후 젤 슬라이스는 QIAGEN 키트(QIAquick PCR Purification kit)를 이용하여 정제하였다. 시퀀싱을 위해 정제된 RACE 산물은 TOPO TA 클로닝 백터(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 클로닝하였다. 클로닝된 RACE산물의 시퀀싱은 Big Dye를 이용하여 설명서에 따라 수행했고(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 서열은 ABI 3700 Genetic Analyzer(Applied Biosystems)를 사용하여 얻어냈다. 전체 길이의 지놈 서열은 RACE에 의해 얻은 전체 길이의 cDNA 서열에 기반하여 만들어졌다. 상기 AGF136 서열의 5’ 플랭킹 서열은 설명서에 따라 Universal Genome Walker Kit로부터 얻었다. 후술할 PCR 기법을 통해 증폭된 산물은 QIAGEN 키트를 이용하여 정제했다.

심플 PCR-기반 마커의 PCR 증폭

본 연구에서 개발된 두 가지 심플 PCR 마커들의 마커 타이핑을 위해, PCR은 10 μL 0.05 μg의 주형, 1 μL 10x PCR 완충액, 0.2 μL 정방향 프라이머(10 μM), 0.2 μL 의 역방향 프라이머(10 μM), 0.2 μL dNTPs (각 10 mM) 및 0.1 μL 중합효소믹스(Advantage 2 Polymerase Mix, Clontech) 반응혼합물에서 PCR을 수행했다. OPT 마커의 PCR 증폭은 초기 변성과정 95℃에서 5분, 94℃에서 30초, 68℃에서 60초 및 72℃에서 60초의 40회 및 최종적으로 72℃에서 10분의 신장과정으로 이루어진다. PsaO 마커의 PCR 증폭은 초기 변성과정 95℃에서 5분, 95℃에서 30초 , 65℃에서 30초 및 72℃에서 2분의 10회, 그리고 95℃에서 30초, 57℃에서 30초간 및 72℃에서 2분의 30회 및 마지막으로 72℃에서 7분의 신장과정으로 이루어진다. 분자마커의 분석에 사용된 프라이머는 다음의 표 1과 같다.

프라이머	프라이머 서열 (5'to 3')
OPT-F(정방향)	CCTTGGAAAGGCGCAACTAAAGATTTGA
OPT-R(역방향)	TGTGGCCCAATAATACAAACAAGCAGGA
PSAO-F(정방향)	CCTCATGCTTGCTTGGTCTT
PSAO-R(역방향)	AAGCGTGATCGATTGTAGGTCCTTT

연관분석( Linkage analysis )

바이오 마커와 Ms 로커스간의 연관 관계는 Carthagene 1.0(de Givry et al. 2005)을 사용하여 계산하였다. 염색체지도상 거리(cM)는 Kosambi 함수를 이용하여 재조합 빈도로부터 계산했다(Kosambi 1944).

2. 실험결과

두 개의 Ms 로커스-연관 RFLP 마커를 심플 PCR-기반 마커로 전환

Get al. (2002)에 의하면 대부분 Ms 로커스(AOB272)에 연관되어 있는 RFLP 마커는 0.9 cM의 거리를 가지는 것으로 보고된 바 있다. 간략히 설명하면, Get al.은 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 판별하기 위해, SSCP 및 단일 뉴클레오티드 신장기법을 사용하였다. 그러나 이러한 기법은 지나치게 복잡하여 큰 스케일의 육종물의 분석에는 활용하기 어렵다. 따라서 심플 PCR 마커를 설계하기 위하여, AOB272의 플랭킹 서열에 있는 유용한 삽입-결실(indel) 변이를 검색하였다. RFLP 분석에서 프로브는 양파의 EST 서열에서 유래된 AOB272 (GenBank accession: AA451592)가 사용되었다.

플랭킹 서열을 얻기 전 RACE 분석은 AOB272의 전체길이 cDNA 서열를 얻기 위하여 수행되었다. 2,205 bp의 코딩서열로 이루어진 완전한 cDNA 서열이 만들어졌다. 이러한 유전자는 올리고펩타이드전달체(oligopeptide transporter, OPT)군으로부터 단백질을 인코딩하는 것으로 추정되었고, 이는 변형된 아미노산 서열이 다른 식물종의 광범위한 OPT 패밀리 단백질군과 상동성을 보이기 때문이다

Musa acuminate의 OPT 군의 단백질(ABF70152)은 양파유전자산물과 가장 높은 상동성(81%)을 보여준다. 양파의 OPT 군 유전자의 완전한 지놈서열은 동형접합성 우성 또는 열성의 Ms 대립유전자를 가지는 F₂ 개체의 전체-길이 cDNA서열로부터 조합하여 만들어졌다. 지놈서열은 암호영역 내에 4개의 인트론을 가지며, 이들 모두는 4번째 인트론이 결여된 것을 제외하고 쌀의 OPT-코딩 유전자의 것과 동일한 장소에 위치해 있다(도 1a 참조).

첫 번째 인트론의 길이는 2 kb 이상인 반면, 다른 세 개의 인트론은 87 내지 97 bp 범위의 크기를 가진다. 우성 및 열성 Ms 대립형질 모두와 결합하고 있는 인트론 1 서열의 정렬 직후, 두 개의 유용한 108 및 439 bp의 삽입-결실 동질이상을 확인할 수 있었다(도. 1A). 두 종류의 반복서열(R1 및 R2)이 108-bp 삽입-결실 부근에서 발견되었고, 뉴클레오티드서열 배열은 우성 대립형질-연관 하플로타입이 두 개의 108-bp R1 반복서열을 포함하는 것을 보여준다. 이러한 108-bp 삽입-결실은 그것의 플랭킨 서열에 한 쌍의 프라이머를 설계함으로써 simple PCR-기반 마커의 개발에 활용되었다(Fig. 1B). PCR 결과는 동형접합성 우성, 이질접합성 및 동형접합성 열성 F2 개체가 simple PCR 마커에 의해 분명하게 구별되는 것을 보여준다(Fig. 1C). 이하, 상기 PCR 마커를 OPT 마커라 한다.

Martin et al. (2005)은 또 다른 RFLP 마커인 AGF136은 AOB272 마커와 반대 방향으로 Ms 로커스와 5.6 cM 거리 떨어진 정도로 연관되어 있다고 보고했다. 이러한 RFLP 마커를 심플 PCR 마커로 전환하기 위해, 프로브서열 AGF136(AF366447)이 PCR 프라이머 지놈서열 분리를 위한 PCR 프라이머의 설계를 위해 사용되었다. 전체-길이 지놈서열은 131개의 잔여물로 구성된 단백질을 발현하는 작은 유전자를 포함하고 있다(Fig. 2A). BLAST 조사결과 이 유전자는 광계Ⅰ 단위체 O(PsaO)를 인코딩하는 유전자와 상동성을 가지는 것으로 알려졌다. Arabidopsis thaliana 의 상기 PsaO 유전자(NM100711)는 72%의 아미노산 서열 일치성을 보여주고, 양파의 PsaO 유전자 및 Arabidopsis 는 숫자 및 위치에서 명백히 구별된다. 두 개의 지놈 서열의 배열은 우성 및 열성 Ms 대립형질 모두와 연관되어 있고 단지 4개의 SNPs(single nucleotide polymorphisms)가 발견된다. 보다 유용한 동질 이상을 구별하기 위해서는, 지놈워킹은 5’ 상단 서열 1,975 bp까지 분리하는 것과 함께 수행되어야 한다.

유용한 53-bp 삽입-결실 변이는 이러한 상단의 서열에서 구별된다. 앞서 설명한 OPT 유전자의 인트론 1 내부의 첫 번째 삽입-결실과 비슷하게 두 종류의 반복서열이 발견되었다. 지놈 서열은 두 가지 반복서열 모두를 두 개씩 가지고 있는 Ms 대립형질과 연관되어 있다(Fig. 2B). 53-bp 삽입-결실에 기초하여, 심플 PCR-기반 마커의 개발을 위해 이러한 삽입-결실의 플랭킨 서열에 설계되었다. PCR 결과는 이러한 마커가 Ms 유전자형들 사이를 구별할 수 있음을 보여준다(도 2c). 이하, 양파에 근본을 둔 PsaO gene을 PsaO 마커라 한다.

다양한 양파의 생식질 내 OPT 및 PsaO 마커 하플로타입의 분포( Distribution of OPT and PsaO marker haplotypes in diverse onion germplasm )

상기 OPT 마커는 18개 국가로부터 유래한 PI 수집종을 포함하는 다양한 양파의 생질질에 적용된다. 모든 실험식물체로부터 예상되는 PCR 산물의 크기가 성공적으로 증폭되었다(보충 표 1 참조). 29개의 상기 PCR 산물은 단일가닥의 서열이며, 추가적인 마커 해프로타입이 나타나지 않았다. 모든 수집종에서 large PCR 산물(OPT₆₅₉ 해프로타입)은 small PCR 산물(OPT₅₂₆)의 두 배의 빈도를 가진다(표 2). 양파 생식질의 Ms 로커스와 연관된 마커 하플로타입의 분포는 다음의 표 2와 같다. 본 연구의 실험에 사용된 양파의 생식질은 보조 표1에 기재되어있다.

마커	하플로타입	빈도(Frequency)
OPT	OPT₆₅₉	0.67
OPT	OPT₅₂₆	0.33
PSAO	PSAO₄₉₀	0.49
	PSAO₄₅₄	0.26
	PSAO₄₃₇	0.25

PSaO 마커의 경우 새로운 해프로타입(PSaO₄₅₄)에서 두 개의 R1 반복 및 단지 한 개의 R2 반복서열이 나타났고 상기 언급한 두 개의 해프로타입인 PSaO490 및 PSaO437이 몇몇의 수집종에서 발견되었다(도 3). 또한, 33개의 수집종(accession)으로부터 PCR 산물이 시퀀싱 되었을 때, 하플로타입 PSaO₄₃₇ 과 95% 상동성이 있는 다형성 변종의 뉴클레오티드 서열이 인도로부터 유래된 두 종류의 수집종에서 확인되었으며, PCR 산물의 크기는 하플로타입 PSaO₄₃₇의 크기와 동일한 것으로 확인되었다(데이터 생략). 테스트된 거의 반 정도의 수집종은 PSaO₄₉₀ 하플로타입을 포함하였고, 두 개의 다른 하플로타입의 빈도는 유사했다(표 2).

Ms 로커스와 분자 마커간의 연관분석

웅성불임 재배종(506L)과 웅성불임 이중 반수체 종(H6)을 교배하여 생성된 F₂ 개체군을 이용하여 Ms locus, OPT 및 PSAO 마커들 간 유전적 거리(genetic distance)를 측정하였다. 총 188개의 F2 개체를 대상으로 분석했다. OPT와 PSAO 마커는 Ms locus에 대하여 각각 반대방향으로 1.5 및 6.4 cM 거리로 연관되었다. 단지 한 개의 재조합이 OPT 마커와 Ms locus사이에 발견되었다. OPT 마커는 Ms locus와 매우 가까이 연관되어 있기 때문에, 마커 헤플로타입 및 Ms 대립형질은 CMS-S 세포질을 포함하는 다양한 웅성불임라인에서 분석하였다. 그러나 Ms 대립형질 및 OPT 마커 헤플로타입 사이에 특별한 연관관계는 없었으며, 작은 연관관계를 가진다는 점을 통해 불안정성 및 두 개의 loci 간에 잦은 재조합 사실을 알 수 있다(표 3). CMS-S 세포질을 포함하는 웅성 불임 교배종의 OPT 마커 하프로타입과 Ms 대립형질 사이의 연관관계는 다음의 표 3과 같다. ^a ‘+’ 및 ‘-’ 는 각각 OPT₆₅₉ 및 OPT₅₂₆ 하플로타입을 나타낸다.

웅성불임 교배종	Ms 대립형질	OPT 마커 하플로타임
ML	ms / ms	+ / - ^a
CRC	ms / ms	- / -
KTMR	ms / ms	+ / +
HNR	ms / ms	+ / +
POP	ms / ms	+ / -
SBRG	ms / ms	+ / -
TB	ms / ms	+ / +
CSIM	ms / ms	+ / +

3. 추가논의( Discussion ) - 양파의 지놈에서 비암호화 서열 내의 올리고뉴클레오티드 반복서열에서 다형성을 판별( Identification of polymorphisms in oligonucleotide repeats in non - coding sequences of the onion genome )

유용한 삽입/결실 변이는 OPT 및 PSAO를 코딩하는 것으로 추정되는 유전자의 인트론 및 외부서열에서 각각 발견되었다. 삽입-결실의 플랜킹 서열 조사결과, 14 내지 108 bp의 길이를 가지는 직렬반복 염기서열을 발견하였다. 이러한 직렬 반복의 삽입 또는 결실은 두 개의 우성 및 열성 Ms 대립형질-연관 서열 간에 길이를 다양하게 하는 결과를 나타낸다. 최근 몇몇 진핵생물의 전체 지놈서열이 발표되었고 반복 DNA 서열은 큰 부분을 구성하며((The Arabidopsis genome initiative 2000; Cannon et al. 2006), 이것은 식물종간에 지놈 사이즈를 다양화하는 원동력이 된다(Hawkins et al. 2008). 반복 DNA 군들은 크게 전이인자, 위성, 소위성체, 미세위성 및 텔로미어나 리보좀 유전자와 같은 직렬반복서열로 분류할 수 있다. 본 실험에서 확인된 반복배열은 이러한 것들 중 어느 것에도 속하지 않을 수 있는데, 이는 각 유니트 주제(unit morif)의 반복수가 기껏해야 2이기 때문이다.

그러나 이러한 반복서열의 단위길이들은 소위성체에 가깝고 소위성체의 길이는 고전적 정의에 따르면 6에서 100 bp 정도 범위이다(Vergnaud and Denoeud 2000). 모노머의 크기가 2bp 내지 5 bp 범위인 미세위성에 대해 광범위하게 연구된 것과는 달리, 비록 인간의 DNA 핑거프린팅에서 초가변 소위성체를 사용하여 깊은 연구가 수행된 바 있으나(Jeffreys et al. 1985; Bois 2003) 식물의 소위성체에 대해는 많이 알려진 바가 없다. 그러나, Beta vulgaris의 식물 소위성체(minisatellite)를 목표로 하는 분리를 통해 최근 많은 비특질화된 소위성체가 확인되었으며, 식물 소위성체에 특이한 특징을 이루는 것으로 확인되었다(Zakrzewski et al. 2010). 다른 식물의 소위성체들과 같이, Ms 로커스-플랭킨 서열내의 직렬반복서열의 삽입-결실은 반복서열-매개 지놈 재배열의 결과인 것으로 생각된다.

14-bp 직렬 반복의 결실(도 4)에 의해 만들어진 PsaO 마커의 세 번째 하플로타입의 확인은 이러한 직렬반복이 삽입결실의 빈도를 높이기 쉽다는 것을 보여준다. 그러나 이러한 직렬 반복은 다른 소위성체와 같이 다양하지 않다. 이는 여러 종류의 양파 생식질에서 단지 두 개 또는 세 개의 반복서열들만이 발견되기 때문이다(Table 2). 동질이상의 수가 적음에도 불구하고 이러한 반복서열들은 심플 PCR 기반 마커로서 저농도의 아가로즈 겔에서 육안으로 식별할 수 있는 가치있는 길이의 동질이상을 제공한다. 몇몇 소프트웨어 프로그램들은 적은 수의 직렬반복을 탐지할 수 있도록 설계되었다(Benson 1999; Bilgen et al. 2004). Bilgen 사에서 개발된 Tandom Repeats Analyzer 1.5를 이용하여 OPT-코딩 유전자의 첫 번째 인트론 내에 있는 3개의 34-bp의 직렬반복을 밝혀냈다(도 1a). 그러나 이 소프트웨어는 마커 개발에 사용되는 동질이상 직렬 반복서열을 밝혀내지 못하였다. 따라서, 최근 서열 정보의 과잉 속에서 유용한 반복들을 판별하기 위해서는 적은 수의 직렬반복을 발굴하기 위한 보다 복잡한 툴들이 요구된다.

Ms 대립형질의 유전자형 판별을 위한 신뢰성 있는 분자 마커들의 개발

Ms 로커스에 연관된 신뢰성 있는 PCR 마커들이 본 연구를 통해 개발되었다. OPT 마커들은 Ms와 1.5 cM의 거리로 매우 가까이 연관되어 있다. 따라서 우리는 Ms 로커스와 OPT 마커 사이에 높은 레벨의 연관 불균형을 기대하였다. 그러나 CMS-S 세포질을 포함하는 웅성불임 교배종들의 분석결과 특별히 의미있는 연관 불균형이 나타나지 않았다(표 3), 이는 양파교배의 역사를 통해 Ms 로커스 인접부분의 교차가 빈번히 일어났음을 나타낸다.

Ms 로커스 및 단단히 연관된 마커들 사이의 연관불균형은 미국에서 자란 양파 교배종에서도 관찰되었다(Gand Havey 2002). 따라서 다양한 양파 생식질로부터 얻은 가까이 연관된 분자마커를 사용해서 Ms 로커스의 만족할만한 유전자형을 예견하는 것은 불가능할 것이다. Ms 로커스의 적절한 유전자분석을 위해서는 보다 단단히 연관된 마커들이 개발되어야 한다. 반면 Ms 로커스에서 웅성회복의 원인이 되는 타겟 유전자에 기반한 소위 기능적 마커(Andersen and L2003)는 만약 타겟 유전자가 복제 된다면 완벽한 예견에 사용될 수 있다. 쌀, 애기장대 및 이와 관련된 곡물 종들과 같은 모델 식물들 사이의 신티니는 종종 분자마커 모델 식물, 예컨대 쌀 및 애기장대(Arabidopsis) 및 관련 작물종의 유전자 사이의 신티니(synteny)는 분자 마커 포화도(molecular marker saturation) 및 목표 유전자의 위치추적 클로닝(positional cloning)의 기초로서 종종 사용된다(Brown et al. 2003; He et al. 2008; Ramu et al. 2009). 또한, 애기장대 및 멜론 사이의 신터니는 nsv 로커스를 분리하는데 유용하며, 이는 멜론 괴저성 스팟 바이러스에 저항성을 부여한다(Nieto et al. 2006). Martin et al. (2005)에 따르면 같은 외떡잎 식물임에도 양파와 쌀의 지놈들 사이에는 매우 낮은 레벨의 신티니를 나타낸다. 실제로 추정상의 쌀의 3번 염색체에 있는 쌀의 이종 상동성 유전자는 양파의 OPT-코딩 유전자와 79%의 아미노산 서열 일치도를 보였다. 반면 쌀의 4번 염색체에 위치해 있는 추정상의 쌀의 이종 상동성 유전자(GenBank 입수 CT830376)와 양파의 PsaO 유전자는 가장 높은 상동성(64%의 아미노산 서열일치)을 보여준다. 따라서 위치적 클로닝 및 고밀도 연관지도 구축을 위해 양파 유전체들의 독자적인 연구가 요구된다. 비록 본 실험에서 개발된 심플 PCR-기반 마커는 Ms 유전자형을 예측하는데 실패했지만, Ms 좌위에 근접하게 옆에 배치된 OPT 마커는 파퓰레이션으로부터 특정 Ms 유전자형을 함유하는 원하는 분리 개체를 정확히 선별하는데 유용할 것이며, 마커 하플로타입과 Ms 대립형질 사이의 결합관계는 이미 양친계통(parental lines)에 알려져 있다. 또한, 두 가지 심플 PCR 마커는 재조합 선택 마커로서 Ms 대립형질의 마커-보조적 백크로싱으로 유용할 수 있다(Neeraja et al. 2007). OPT 마커는 Ms 로커스에 거의 근접하기 때문에 결합 드래그(linkage drag)가 만약 존재한다면 효과적으로 제거될 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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ccataacctc attctgccca ctgtttcgac ggtgagctta tggttccaat ttctgctgtc 360 atgcattcac attttgatct gcatctctgg ctccaacatc atccattcta agcattagag 420 ctcattctag atccaaatcg atcgtgtctt cgagtaagtt catctcagta ccaacctgtt 480 ttgattgtgg ggacttggtt gcagtccgcg ttgctctaac tccaaatgct cccccattgg 540 tttctagcct tgagttatga atttcaactg cttcggctat tctttgttgt tccatccttc 600 tcaaaagtcc atccagcatc ttctgttgtc gagccattat tacatcttgc atctttttca 660 tcattttttc cgtctcctct ctagtcacgt agatggattg attagagctt gatgacacct 720 cttgactgcc tacatgctct ggttgactcc ctacaattat atatctggtg ttaggtctct 780 tcatctcttt caaaattcag agccaagctt taggttgtca agcctagccc tttcttagta 840 aagcaaaaaa aaatgtttga ataaaaaatg gcaaaaacac cccagaagca attgaaaaca 900 ccaaaaatgt ataaatttaa tgaaataaat gtaaaagcgg tagaaaagat ataattttta 960 tagtgattcg acaaatacct ctgtctacat ccactttagt ctttattatt gattgattcc 1020 ctttataata atatataatt atgacttaaa tctcaccaca atctagcgga tctcggattt 1080 gggagtgttt agagtatttg gggaagaaga agatagaaca taattcaggt gtctaaaaag 1140 tccatcttta tttgctctag gtcttctgtt tatagagaaa ttgcctaaca aaatcggaaa 1200 cgcattaaat atcaagttca ggtttaagtc caagtatgca taagtgagca tcgatgccta 1260 aacatcgatt aaaagctctc ggtaccggct gtgtttggtt aatgccgatg gatttttttt 1320 acttgctttc acgatcttcc ctcatgcttg cttggtcttc aatttctcga tttttcggtg 1380 agtggttacc atcgagaggt tttcgatgag aggtcttcga caagaggttt tgcatattta 1440 atacttagcc aaattgttgt ttaagctcgt ttaagtccat tcgaagactg tggaaaattt 1500 tgttataaca ctttagatcc cagaaatacc taaatgctct gcaatctcac attataaatt 1560 gttattttta ggcagttgta actttgaacc gttatcttcg atgttgaagt tctgaaaatt 1620 attgtgcaaa acttaggtta gaaaaggtag gtctatactt gaattttgta ttgacggacc 1680 tcattttgat acttggagaa attaacgtgt ggctccgaat aaaggttttt ggatgattac 1740 acaagcttag aaaaggacct acaatcgatc acgcttatcc aaatacatct agttgtcact 1800 atagtatttg cccatgtcac caactacaac atccatgcaa tctatcaaaa taaagaacac 1860 cacaaacttg gactgaaaaa tcctagtcat aaactcatat taacttatgt taatatattg 1920 aactcacttt tatacctaca tcagtttatc tgctctgtgc atacaattag atcaaatggc 1980 agccatggga tctccagttt gcatgacaag accatcacta agctctggta cattatctta 2040 gttttgaatt ttaaacgatt tgtttaagtg tatgtacttt tgtatcatgt cattgaattc 2100 tatacaatgt aggttttttg aagtctaagg tggctgcaag aaacccacta caggttaaat 2160 cagcttcagg aggaaaatat acatggtaag atttttgtta ttatctctac atctaagcta 2220 attacaatat acaatatact aacctgagct tcaacattta aactatttat ggaaaatata 2280 aagctttgag agggattggt t 2301 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> OPT forward primer <400> 5 ccttggaaag gcgcaactaa agatttga 28 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> OPT reverse primer <400> 6 tgtggcccaa taatacaaac aagcagga 28 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> PSAO forward primer <400> 7 cctcatgctt gcttggtctt 20 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> PSAO reverse primer <400> 8 aagcgtgatc gattgtaggt ccttt 25

Claims

서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 양파의 웅성가임(male fertility) 관련 핵산분자.
서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 양파의 웅성불임(male sterility) 관련 핵산분자.
서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 양파의 웅성가임(male fertility) 관련 핵산분자.
서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 양파의 웅성불임(male sterility) 관련 핵산분자.
서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 1-1442에 혼성화 되는 프라이머 및 뉴클레오타이드 1443-2400에 혼성화 되는 프라이머를 포함하는 양파의 웅성불임(male sterility) 또는 웅성가임(male fertility)를 판정하기 위한 키트.
서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 1443-2406에 혼성화 되는 프라이머 및 뉴클레오타이드 2407-3500에 혼성화 되는 프라이머를 포함하는 양파의 웅성불임(male sterility) 또는 웅성가임(male fertility)를 판정하기 위한 키트.
서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 1-1418에 혼성화 되는 프라이머 및 뉴클레오타이드 1431-2301에 혼성화 되는 프라이머를 포함하는 양파의 웅성불임(male sterility) 또는 웅성가임(male fertility)를 판정하기 위한 키트.
서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 970-1088에 혼성화 되는 프로브를 포함하는 양파의 웅성불임(male sterility) 또는 웅성가임(male fertility)를 판정하기 위한 키트.
서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 2048-2086에 혼성화 되는 프로브를 포함하는 양파의 웅성불임(male sterility) 또는 웅성가임(male fertility)를 판정하기 위한 키트.
서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 1420-1479에 혼성화 되는 프로브를 포함하는 양파의 웅성불임(male sterility) 또는 웅성가임(male fertility)를 판정하기 위한 키트.
다음의 단계를 포함하는 양파의 웅성불임 또는 웅성가임 판별방법:
(a) 양파로부터 gDNA(genomic DNA)를 수득하는 단계; 및
(b) 상기 양파 gDNA에 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 970-1088까지 서열 또는 뉴클레오타이드 2048-2086까지 서열이 존재하는 지 여부를 분석하는 단계, (i) 상기 양파 gDNA가 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 970-1088까지 서열 또는 뉴클레오타이드 2048-2086까지 서열이 존재하는 서열만을 포함하는 경우에는 웅성가임으로 판정하고, (ii) 상기 양파 gDNA가 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 970-1088까지 서열 또는 뉴클레오타이드 2048-2086까지 서열이 존재하는 서열과 뉴클레오타이드 970-1088까지 서열 또는 뉴클레오타이드 2048-2086까지 서열이 존재하지 않는 서열을 모두 포함하는 경우에는 웅성가임으로 판정하며, (iii) 상기 양파 gDNA가 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 970-1088까지 서열 또는 뉴클레오타이드 2048-2086까지 서열이 존재하지 않는 서열만을 포함하는 경우에는 웅성불임으로 판정한다.
다음의 단계를 포함하는 양파의 웅성불임 또는 웅성가임 판별방법:
(a) 양파로부터 gDNA(genomic DNA)를 수득하는 단계; 및
(b) 상기 양파 gDNA에 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 1420-1479까지 서열이 존재하는 지 여부를 분석하는 단계, (i) 상기 양파 gDNA가 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 1420-1479까지 서열이 존재하는 서열만을 포함하는 경우에는 웅성가임으로 판정하고, (ii) 상기 양파 gDNA가 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 1420-1479까지 서열이 존재하는 서열과 뉴클레오타이드 1420-1479까지 서열이 존재하지 않는 서열을 모두 포함하는 경우에는 웅성가임으로 판정하며, (iii) 상기 양파 gDNA가 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 1420-1479까지 서열이 존재하지 않는 서열만을 포함하는 경우에는 웅성불임으로 판정한다.
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 프라이머를 이용한 유전자 증폭방법에 따라 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 프로브를 이용한 혼성화 방법에 따라 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 시퀀싱에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.