KR20180128791A

KR20180128791A - 수박 웅성불임 개체 선발용 분자마커 및 이의 이용

Info

Publication number: KR20180128791A
Application number: KR1020170064345A
Authority: KR
Inventors: 이긍표; 장윤정; 심태용; 이선주
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2017-05-24
Filing date: 2017-05-24
Publication date: 2018-12-04
Also published as: KR102100366B1

Abstract

본 발명은 수박 웅성불임 판별 분자마커 및 이의 이용에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 수박 웅성불임 개체를 판별하기 위한 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커 조성물 및 키트 등에 관한 것이다. 본 발명에 따른 수박 웅성불임 판별 분자마커의 제공으로, 어린 식물체 또는 종자의 DNA를 추출하여 바로 웅성불임 여부를 확인할 수 있으며, 마커의 수적제한을 받지 않으며 안정적이고 빠르게 수박 웅성불임 개체 판별이 가능한 장점이 있다. 또한, 본 발명의 방법으로 선별한 웅성불임성 수박 품종의 보급은, 잡종강세(heterosis)를 활용한 1대 잡종(F₁ hybrid) 종자 생산에 있어 사람이 직접 인공 수분하는 제웅 작업을 생략할 수 있어 노동력과 시간을 절약 할 수 있으며, 자연교배를 통해 인공 수분보다 효율적으로 후대 종자(hybrid seed) 생산이 가능할 것으로 기대된다.

Description

수박 웅성불임 개체 선발용 분자마커 및 이의 이용 {Molecular marker to select male-sterile watermelon and use thereof}

본 발명은 수박 웅성불임 판별 분자마커 및 이의 이용에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 수박 웅성불임 개체를 판별하기 위한 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커 조성물 및 키트 등에 관한 것이다.

웅성불임성이란 정상적인 꽃가루가 형성되지 않아 자가수분으로 열매를 맺지 못하는 현상을 말하며, 크게 유전자적 웅성불임성(genetic male sterility, GMS)과 세포질적 웅성불임성(cytoplasmic male sterility, CMS)이 있다. 수박에서 웅성불임성을 활용하기 위해서는 먼저 웅성불임성 계통을 확보해야 하며, 자연적으로 유기된 웅성불임 개체를 이용하는 방법 외에, 1) 방사선이나 화학물질 등의 처리를 통해 인위적으로 웅성불임성을 유도하는 방법, 2) 유전공학적 방법(genetic engineering)을 사용하여 웅성불임성을 유도하는 방법(M. E. Williams, Lecmans, & Michiels, 1997), 및 3) 원형질체융합(protoplast fusion)을 사용하여 웅성불임성을 유도하는 방법으로 나누어 볼 수 있다.

수박의 생산에 있어 잡종강세(heterosis)는 중요하게 이용되고 있지만, 후대(hybrid)를 생산하기 위해서는 사람이 직접 수분을 시켜주어야 하고, 자가 수분을 방지하기 위해서는 암술에는 봉투를 씌우고, 수술을 제거하는 제웅 작업을 해야하는 번거로움이 있다. 이러한 과정은 복잡하고 많은 시간이 소요되며, 후대 종자(hybrid seed)의 순도를 검정해야 하는 단점이 있다. 하지만 웅성불임성을 사용할 경우 제웅 작업과 같이 번거로운 작업을 생략할 수 있고, 또한 자연 수분이 가능하기 때문에 시간, 인력, 비용을 절감할 수 있다. 따라서 웅성불임성은 후대(hybrid) 종자의 채종시 활용도가 높으며, 특히 3배체 수박종자 생산시 사용되는 4배체 계통으로의 웅성불임성 도입이 매우 유용한 육종방법으로 예상되고 있다. 이에 따라, 수박에서도 웅성불임성에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있으며, 현재까지 5 가지의 웅성불임성이 발견되었고, 2001년 우리나라에서 새로운 웅성불임성이 관찰된 바 있다.

현재까지 수박 웅성불임성은, 웅성불임인 개체의 화기와 화분의 형태를 관찰하고 교배를 통한 분리비를 확인하여, 단일열성 유전됨이 밝혀졌다. 하지만 염기서열 분석을 통해 웅성불임성에 관여하는 유전자를 탐색한 사례는 2015년 Seminis에서 특허로 출원한 자료가 유일한 것으로 조사되었다(Bachilava, Joobeur, & Tolla, 2015).

본 연구에서는 웅성불임성 유전자의 유전 양상을 확인하기 위해 웅성불임 계통인 DAH3615-MS와 웅성가임 계통인 DAH를 교배하여 얻은 형매교배(sib cross) 집단 그리고 같은 웅성불임성 유전자를 지니는 웅성불임 계통 msHdaS3-BC₅F₁과 웅성가임 계통 SN3615를 양친으로 하는 F₂ 집단에서 표현형 검정을 통해 웅성불임성 유전자의 유전양상을 확인했다. 이후 F₂ 집단에서 DNA를 추출 후, 2013년 발표된 수박의 draft genome(Guo et al., 2013)을 이용하여 웅성불임, 웅성가임 수박의 SNP를 조사하였고, SN3615와 msHdaS3-BC₅F₁을 NGS를 통해 분석하여 웅성불임성에 관여하는 유전자좌를 분석하였다. 이후 분석을 통해 찾은 유전자좌 내에서 2 개의 프라이머 세트를 제작하였고, HRM(high resolution melt) 분석 방법을 통해 웅성불임성 분자마커를 개발하였다.

본 발명은 수박 웅성불임 개체를 정확하고 빠르게 선별하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 수박 웅성불임 개체를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물, 프라이머 세트, 및 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 수박 웅성불임 개체를 판별하는 방법을 제공하는데 있다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

서열번호 1의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 및 서열번호 2의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 단일염기다형성을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 수박 웅성불임 개체를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 3 및 4으로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 6으로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 수박 웅성불임 개체를 판별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 수박 웅성불임 개체를 판별하기 위한 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 수박 웅성불임 개체를 판별하는 방법을 제공한다.

(a) 판별하고자 하는 수박 품종으로부터 게놈(genomic) DNA를 얻는 단계;

(b) 상기 게놈 DNA에서 서열번호 1의 501번째 염기 또는 서열번호2의 501번째 염기 타입을 검출하는 단계; 및

(c) 상기 검출한 염기 타입으로부터 수박 웅성불임 개체를 판별하는 단계.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 단계 (b)는 상기 프라이머 세트를 사용한 중합효소연쇄반(polymerase chain reaction, PCR)을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 수박 웅성불임 판별 분자마커의 제공으로, 어린 식물체 또는 종자의 DNA를 추출하여 바로 웅성불임 여부를 확인할 수 있으며, 마커의 수적제한을 받지 않으며 안정적이고 빠르게 수박 웅성불임 개체 판별이 가능한 장점이 있다.

또한, 본 발명의 방법으로 선별한 웅성불임성 수박 품종의 보급은, 잡종강세(heterosis)를 활용한 1대 잡종(F₁ hybrid) 종자 생산에 있어 사람이 직접 인공 수분하는 제웅 작업을 생략할 수 있어 노동력과 시간을 절약 할 수 있으며, 자연교배를 통해 인공 수분보다 효율적으로 후대 종자(hybrid seed) 생산이 가능한 장점이 있다.

도 1은 DAH3615-MS x DAH 형매교배 집단의 가계도이다.
도 2는 maHdaS3 x SN3615 F₂ 집단의 가계도이다.
도 3은 웅성불임 및 웅성가임 개체의 화기 구조를 확인한 사진이다. A는 수꽃의 약(anther)이 작고 쪼그라든 모양이며, 화분(pollen)이 발생하지 않는 특징을 보이는 웅성불임 개체의 사진이고, B는 웅성가임 개체의 사진, C는 maHdaS3 x SN3615 F₂ 집단의 부본이며, D는 DAH3615-MS x DAH 형매교배 집단 육성시 사용한 부본 웅성가임의 개체 사진이다.
도 4는 HRM 마커를 이용한 유전자형 판별 결과를 나타낸 것으로, AA는 웅성가임(MS/MS), aa는 웅성불임(ms/ms), 및 Aa는 웅성가임(MS/ms)를 의미한다.
도 5는 서열번호 1의 염기서열 및 해당 염기서열 내에서 SNP의 위치 및 프라이머 세트의 위치를 나타낸 것이다.
도 6은 서열번호 2의 염기서열 및 해당 염기서열 내에서 SNP의 위치 및 프라이머 세트의 위치를 나타낸 것이다.
도 7은 수박 웅성불임성의 연관유전자 선발을 위한 delta-SNP index결과를 나타낸 것이다.
도 8은 웅성불임성의 웅불임계통을 whole-genome resequencing을 통하여 수박 참조게놈에 alignment한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명자들은 수박 웅성불임성 계통의 유전양식을 F₂분리집단과 형매교배 집단에서 확인하고, 웅성불임성과 연관된 유의미한 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 발굴하고, 상기 단일염기다형성을 이용한 분자마커를 사용하여 웅성불임성 수박 개체를 선별하기 위한 판별방법을 개발하기 위해 연구 노력하였다. 구체적으로, 웅성불임성 유전자의 유전 양상을 확인하기 위해 웅성불임 계통인 DAH3615-MS와 웅성가임 계통인 DAH를 교배하여 얻은 형매교배(sib cross) 집단 그리고 같은 웅성불임성 유전자를 지니는 웅성불임 계통 msHdaS3-BC₅F₁과 웅성가임 계통 SN3615를 양친으로 하는 F₂ 집단에서 표현형 검정을 통해 웅성불임성 유전자의 유전양상을 확인하였고, 이후 F₂ 및 형매교배 집단에서 DNA를 추출 후, 2013년 발표된 수박의 draft genome(Guo et al., 2013)을 이용하여 웅성불임, 웅성가임 수박의 SNP를 조사하였고, SN3615와 msHdaS3-BC₅F₁을 차세대염기서열분석(next generation sequencing; NGS)을 통해 분석하여 웅성불임성에 관여하는 유전자좌를 분석하였다. 이후 분석을 통해 찾은 유전자좌 내에서 2 개의 프라이머(primer) 세트를 제작하였고, HRM(high resolution melting) 분석 방법을 통해 웅성불임성 분자마커를 개발하였다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 수박 웅성불임성 유전자좌에서 특이적으로 차별화되어 나타나는 단일염기다형성 마커 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 SNP 마커 조성물은 수박에 적용되나, 이에 한정되지는 않는다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “수박(Citrullus lanatus, watermelon)”은 한반도에서 재배되거나 혹은 품종 개량을 목적으로 육종된 수박을 의미하나, 이에 한정되지는 않는다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머(primer)"란, 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 이때, PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "SNP 마커"란, 개체 또는 종을 식별하기 위해 이용되는 DNA 서열 상의 단일 염기 다형성 대립인자 염기쌍을 의미한다. SNP는 비교적 그 빈도가 높고 안정하며 유전체 전체에 분포되어 있고 이에 의하여 개체의 유전적 다양성이 발생하므로, SNP 마커는 개체 간의 유전적 근접성을 알려주는 지표의 역할을 할 수 있다. SNP 마커는 일반적으로 단일 염기 다형성에 수반되는 표현형의 변화를 포함하지만 경우에 따라 그렇지 않을 수도 있다. 본 발명의 SNP 마커의 경우 아미노산 서열의 변이 또는 수박의 웅성불임성과 같은 개체의 표현형의 차이를 나타낼 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "다형성(polymorphism)"이란, 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 의미하며 다형성 부위 중에서, 개체에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일 염기 다형성이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 5% 또는 10% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "대립유전자(allele)"란, 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 의미한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “뉴클레오타이드” 또는 “폴리뉴클레오타이드”는 단일가닥 또는 이중가닥의 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 특별히 다르게 언급되어 있지 않은 한 자연의 (폴리)뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다.

본 발명은 서열번호 1의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 단일염기다형성을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 및 서열번호 2의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 단일염기다형성을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 수박 웅성불임 개체를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 서열번호 1의 염기서열은 수박의 6번 염색체에 존재하는 염기서열일 수 있으며, 바람직하게는 6번 염색체의 10.4Mb 영역일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 서열번호 2의 염기서열은 수박의 6번 염색체에 존재하는 염기서열일 수 있으며, 바람직하게는 6번 염색체의 12Mb 영역일 수 있다.

본 발명에 따른 SNP 마커는, 서열번호 1의 염기서열 내에서 501번째 염기가 (G->A)이거나, 서열번호 2의 염기서열 내에서 501번재 염기가 (A->G)인 경우, 수박 웅성불임성 개체인 것으로 판별할 수 있는바, 상기 SNP 마커를 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트를 분자마커로 사용함으로써 품종 개발시, 웅성불임성 수박의 형질 발현 후 표현형 분석을 수행할 필요 없이, 어린 식물체 또는 종자의 DNA를 추출하여 비교적 빠르고 정확하게 웅성불임성 개체 여부를 확인할 수 있다.

이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 증폭시킬 수 있는 수박 웅성불임성 개체를 판별하기 위한 프라이머 세트를 제공하며, 상기 프라이머 세트의 서열은 상기 SNP 마커와 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 상기 SNP 마커와 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 바람직하게는, 상기 프라이머 세트는, 서열번호 3 및 4으로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 6으로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 수박 웅성불임 개체를 판별하기 위한 프라이머 세트를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에서는, 2개의 프라이머 세트를 이용하여 F₂ 분리집단의 각 개체를 대상으로 유전자형과 표현형 검정을 수행하였고, 그 결과 F₂ 분리집단에서 서열번호 1의 경우 총 80개 중 3개의 개체만이 개발된 마커와 표현형 결과가 상이하여 약 96%의 효율을 나타내었고, 서열번호 2의 경우 총 80개 중 5개의 개체만이 개발된 마커와 표현형 결과가 상이하여 약 93%의 효율을 나타냄을 확인하였다(실시예 4 및 표 5 참조). 또한, 서열번호 1의 경우 F₂ 분리집단에서 개발된 마커와 표현형 결과가 높은 비율로 일치하여, MS-DAH3615 x DAH 형매교배 집단에서 프라이머 세트 1을 이용하여 해당 집단의 각 개체를 대상으로 유전자형과 표현형 검정을 수행하였으며, 그 결과 마커와 표현형 결과가 86개체 중 3개체만이 상이하여 약 96%의 효율을 나타내었다(실시예 5 및 표 7 참조). 상기에 따라서, 본 발명이 제시한 SNP 마커는 신속하고 정확하게 수박 웅성불임성 개체 판별을 가능하게 하며, 본 발명에 따른 프라이머 세트는 효과적으로 수박 웅성불임성 개체 판별이 가능하게 할 것으로 기대된다.

상기와 같이, 본 발명에 따른 프라이머 세트는 HRM 분석을 통하여 염기 서열에서의 변이를 확인하는데 사용될 수 있는바, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 수박 웅성불임성 개체를 판별하기 위한 PCR(polymerase chain reaction) 키트를 제공한다. 상기 PCR 키트는 HRM 분석용 PCR 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 “HRM”은 PCR 영역 내에 존재하는 DNA 상의 SNP에 따라서, 형광시약과 결합한 증폭산물 DNA를 약 60℃에서 90℃까지 온도를 변화시키며 단일가닥의 DNA로 변성될 때의 형광강도 변화를 측정하는 방법을 의미한다. HRM 분석은 시퀀싱(sequencing) 없이 SNP를 구분할 수 있으며, 매우 빠르고 간편하게 유전자형을 구분할 수 있다는 장점이 있다.

또한, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 (a)판별하고자 하는 수박 품종으로부터 게놈(genomic) DNA를 얻는 단계; (b)상기 게놈 DNA에서 서열번호 1의 501번째 염기 또는 서열번호 2의 501번째 염기 타입을 검출하는 단계; 및 (c)상기 검출한 염기 타입으로부터 수박 웅성불임 개체를 판별하는 단계를 포함하는 수박 웅성불임 개체를 판별하는 방법을 포함할 수 있다. 상기 (b)단계는 본 발명이 제공하는 프라이머 세트를 사용한 PCR을 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다(표 5 참조). 또한, 상기 (c)단계는 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔-전기영동, 서열분석, 방사선 측정, 형광 측정, 및 인광 측정으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 형매교배(sib cross) 집단과 F ₂ 집단의 확보

이하 실시예에서는 웅성가임인 모본 DAH3615-MS 와 웅성불임인 부본 DAH를 양친으로 하는 BC3F2 집단에서 형매교배(sib-crossing)를 통해 얻어진 웅성가임:웅성불임=1:1 집단(이하 형매교배 집단으로 칭함)(도 1 참조)과 웅성불임인 모본 msHdaS3-BC5F1과 웅성가임인 부본 SN3615을 양친으로 하고 표현형의 분리비가 웅성가임:웅성불임=3:1인 F₂ 집단(msHdaS3-BC5F1 X SN3615 유래)을 활용하였다(이하 F₂ 집단으로 칭함)(도 2 참조). 또한 BSA(Bulked segregant analysis) 및 SNP-index(single nucleotide polymorphism-index) 비교를 통한 웅성불임성 유전자좌를 탐색하기 위해 형매교배 집단과 F₂ 집단을 사용하였다. 상기 수박 DAH, DAH3615-MS, msHdaS3-BC₅F_1, 및 SN3615의 종자는 ㈜파트너 종묘에서 분양을 받아 사용하였다.

실시예 2. 수박 웅성불임성 유전양상 분석

수박 웅성불임성의 유전양상을 확인하기 위하여, F₂ 집단과 형매교배 집단을 이용하여 웅성불임과 웅성가임의 표현형 검정을 실시하였다. 웅성불임 개체의 수꽃은 웅성가임 개체의 수꽃에 비해 상대적으로 크기가 작고, 수꽃의 크기가 비슷하더라도 웅성불임 개체의 경우 약(anther)의 크기가 작고, 정상적인 모양을 형성하지 못했으며, 화분(pollen)이 생성되지 않는 특징을 보였다(도 3 참조). 따라서 F₂ 집단과 형매교배 집단의 웅성불임성과 웅성가임성은 각 개체에서 수꽃의 크기와 약(anther)의 크기 및 모양, 화분(pollen) 생성의 유무를 통해 검정하였다.

그 결과, 하기 표 1 및 표 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, F₂ 집단에서는 웅성가임:웅성불임=3:1의 분리비로 분리되었고, 형매교배 집단에서는 웅성가임:웅성불임=1:1의 분리비로 분리되는 것으로 나타났으며, F₂ 집단의 p-value는 0.2059, 형매교배 집단의 p-value는 0.2511로 통계적 유의성이 인정되었다. 따라서 웅성불임 유전자는 단일열성유전 된다는 것을 알 수 있었다. 하기 표 1 및 표 2에 MF는 웅성가임, MS는 웅성불임을 의미한다.

실시예 3. 수박 웅성불임성 연관 유전자좌의 탐색

형매교배 집단과 F₂ 집단에서 표현형이 웅성불임과 웅성가임으로 확연히 차이가 나는 개체들을 이용하였으며, 형매 교배 집단에서는 웅성불임 30개체와 웅성가임 30개체의 DNA를 혼합(bulking)하였고, F₂ 집단에서는 웅성불임 20개체와 웅성가임 20개체의 DNA를 혼합(bulking)하였다. 각기 혼합한 DNA 에서의 염기서열 편향성을 확인하기 위해서 PCR 산물의 존재 및 크기 유무를 비교하는 기존의 Bulked Segregation Analysis (BSA) 방법과는 다르게, 본 실시예에서는 웅성불임 및 웅성가임 DNA 혼합물을 각기 Illumina sequencing platform에서 차세대 염기서열 분석(Next Generation Sequencing, NGS)방법으로 염기서열 해독 후, 두 개의 DNA 혼합물(bulk) 각각의 서열을 비교/분석하는 NGS-BSA 방법을 사용하였다. 상기 bulked DNA를 Illumina 사의 NextSeq500을 이용하여 10Gbp씩 염기서열 데이터(sequence data)를 생산했다. 이 후 sequencing된 read를 Bowtie2 mapping algorithm을 이용하여 참조게놈(reference genome)(Guo et al., 2013)과 비교(alignment)하고, 이를 이용하여 VCF(Variant Call Format)를 생산하였다. 이후 VCF 파일을 기반으로 NGS-BSA 결과를 확보하였으며, 구체적으로 delta SNP-index를 다음과 같은 수식으로 “delta (SNP-index)=(MS SNP index) (MF SNP index)” 계산하였다.

그 결과, 도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, 다른 염색체와 달리 6번 염색체에서 유의미한 피크가 도출되었는 바, 상기 6번 염색체의 12.9M~14.5M지역을 후보 유전자좌 확인하였으며, 해당 지역에서 표 3과 같이 프라이머를 작성하여 HRM을 수행하였다. HRM 검정 결과는 하기 표 4에 나타내었다. 표 4에서 표현형 결과와 HRM 검정 유전자형 결과가 일치하지 않는 개체들은 빨간색으로 표시하였다. 구체적으로, 프라이머 delta MS 1,2,3 에서는 약 89%의 효율을, 프라이머 delta MS 4에서는 약 85% 효율을, 프라이머 delta MS 5에서는 약 84% 효율을, 프라이머 delta MS 6에서는 약 82% 효율을 나타냈다.

	Primer	SNP	Sequence	mer
set 1	Delta MS1-1-F	A->G	CCTGCAATTTAGAAGAGGGAAG	22
set 1	Delta MS1-1-R	A->G	ATCGGTGGCCCTCAAATTCT	20
set 2	Delta MS1-2-F	A->G	CATTTTTCTCTTTCTTCTTAGTGTGC	26
set 2	Delta MS1-2-R	A->G	TCAATGCCCTGTCACTACCC	20
set 3	Delta MS1-3-F	A->G	CGCAAGTTCATAATCGATGG	20
set 3	Delta MS1-3-R	A->G	AGCCTCCGGATCTCCATATT	20
set 4	Delta MS1-4-F	G->A	TGGAGTGAGATGATTTTGTTAAGC	24
set 4	Delta MS1-4-R	G->A	CCACGCCCAAGGACCATA	18
set 5	Delta MS1-5-F	C->T	TCATCTTTAAATCTTGTAATTGCTTCA	27
set 5	Delta MS1-5-R	C->T	CCCACTACATCGAGATTTCAGTAA	24
set 6	Delta MS1-6-F	T->G	GCATAACAATAGCGGAAAGTTTG	23
set 6	Delta MS1-6-R	T->G	ATCCCCTAATCACCGTTGTAACT	23

위 결과를 토대로 12.9M~14M로 점진적으로 멀어질수록 기대하는 유전자형과 표현형의 결과가 일치하지 않는 것을 확인할 수 있었으며, 12.9M 지역으로 가까워 질수록 유전형과 표현형이 일치하는 비율이 높아지는 것을 확인할 수 있었다.

이는 NGS-BSA 진행 시 양극단의 표현형을 보이는 개체를 선별하여 DNA 혼합물(bulk)를 생성해야 하는데, 웅성불임의 경우 MSMS(homo-웅성가임)과 MSms(hetero-웅성가임)의 표현형이 동일하여 양극단의 표현형을 선발하지 못하였으며, 해당 DNA 혼합물(bulk)를 이용하여 resequencing 결과를 토대로 delta SNP index를 구할 때 웅성불임 개체의 DNA 혼합물(bulk)의 염기서열 차이를 확인하는 과정에서 MSMS와 MSms를 구분하지 못하여 유의미한 결과를 얻는데 어려움이 있었을 것으로 판단되었다.

이에 본 발명자들은 NGS-BSA 결과를 기초로 웅성불임과 참조유전체의 직접적인 서열비교를 통하여 6번 염색체의 12.9M 앞부분에서 유의한 SNP를 발굴하는 것을 목표로 하여, 해당 집단의 모부본 maHdaS3와 SN3615 두 개체를 resequencing을 진행하였으며, 해당염기서열의 물리적 지도를 통하여 기존에 알려진 수박 참조게놈(reference genome) 97103을 기반으로 모부본의 resequencing 결과를 공개 소프트웨어인 Tablet program (ver. 1.16.09.06, https://ics.hutton.ac.uk)을 이용하여 염기서열 비교를 수행하였다. 그 결과, 도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, 6번 염색체의 10.4M~12M 지역에서 유의한 SNP를 발굴하였다. 그 후 해당지역에서 서열번호 3 및 4; 및 서열번호 5및 6의 PCR 프라이머 세트를 제작하여 F₂집단에서 HRM검정을 실시하였다.

실시예 4. 프라이머 세트 제작 및 HRM 마커 분석

실시예 3을 통해 확인된 후보 유전자좌 영역 내에서 SNP를 구체적으로 확인하기 위하여, 상기 영역에서 2개의 프라이머 세트를 개발하였고, 이를 공개 생물정보분석 소프트웨어인 Primer3Plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi)를 이용하여 제작하였다. 상기 제작된 프라이머 세트를 이용하여 F₂ 분리집단에서 HRM 검정을 실시하였다. 상기 2개의 프라이머 세트의 구체적인 정보는 하기 표 5에 나타내었고, HRM 검정 결과는 하기 표 6에 나타내었다. 표 6에서 표현형 결과와 HRM 검정 유전자형 결과가 일치하지 않는 개체들은 빨간색으로 표시하였다.

구체적으로, 표 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 프라이머 세트 1의 경우 총 80개 중 3개의 개체만이 개발된 마커와 표현형 결과가 상이하여 약 96%의 효율을 나타내었고, 프라이머 세트 2의 경우 총 80개 중 5개의 개체만이 개발된 마커와 표현형 결과가 상이하여 약 93%의 효율을 나타냄을 확인하였다.

상기에 따라서, 본 발명이 제시한 SNP 마커는 신속하고 정확하게 수박 웅성불임성 개체 판별을 가능하게 하며, 본 발명에 따른 프라이머 세트는 효과적으로 수박 웅성불임성 개체 판별이 가능하게 할 것으로 기대된다.

실시예 5. HRM마커의 적용성 검증

실시예 4를 통해 제작된 프라이머 세트 중 유전자형과 표현형 결과 효율이 가장 높은 프라이머 세트 1을 이용하여 DAH3615-MS와 DAH 계통을 양친으로 하는 BC₃F₂ 집단 및 형매교배 집단을 이용하여 HRM검정을 실시 하였다. HRM 검정 결과는 하기 표 7에 나타내었다. 표 7에서 표현형 결과와 HRM 검정 유전자형 결과가 일치하지 않는 개체들은 빨간색으로 표시하였다.

그 결과, 표 7에서 확인 할 수 있는 바와 같이, 프라이머 세트 1에서 형매교배 집단 86개체 중 3개의 개체만이 개발된 마커와 표현형 결과가 상이하여 약96%의 효율을 나타냄을 확인하였다. 상기에 따라서, 본 발명이 제시한 SNP 마커는 신속하고 정확하게 수박 웅성불임성 개체 판별을 가능하게 하며, 본 발명에 따른 프라이머 세트는 효과적으로 수박 웅성불임성 개체 판별이 가능하게 할 것으로 기대된다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Molecular marker to select male-sterile watermelon and use thereof <130> MP17-077 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1001 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 1 gggagtttgt tgcgtgcaaa aaggaagaaa tttgtttatt ttaaacttgt accagtgtat 60 tattacgaat aatatcaata gtatattagt caagtatttc atcaatataa acaaatgtat 120 agcaatataa ataattcaag tctataaata gcatatctgt atcaatagta taaatgatag 180 catcattatc aagtttataa atagcatatt tgtcgagtgc atcatgacca aatttatcaa 240 tagtatatta atcaagtgca atagcaatat aaaagagtgc ttccttatca agtttatcaa 300 tagtatattg gtgtataatc aagtatatta gtcaagtata tcaagtttac caacaatata 360 aatgagtgca taattgacaa atttatcatc agtatataag ccaggtgcat catttatcaa 420 gtatatcaaa tttatcaaca atatataata aatattcaag tatatcagtc aagtgcatcg 480 ttatcaagta tattagtcaa gtatatcaaa tgtatatgaa gggtatcaaa tcagtgtatc 540 aagtgtattt atacacagta gtgtatcaag ggtatcaagt gtgtatagtg tatcaagtgt 600 atcaagtgta tcgagtatat caaatgtata ttagtagtga gggtataaca gacattttac 660 atgctgagtt gggcttcatt tgttgctatt tgtgcaaata tgatacattt gtttagggat 720 tgcataatac catattaatt tcttttttaa ttcaaatgta tcaagtgtac atcagtagtg 780 tataagttat atcagaggta tcaagtgtgt caagtgtatc aaatttatca agtgtatagt 840 acttttttta cattttttat tttaaattgt gaactaacct tgatttttgc tatttttgta 900 aaactaaaag ttttaagcct gatattaaga atttatcaag aagaagaaga agtacctgtt 960 ccgggttcaa tccaaggaga gacgaagatg gtcggaaccc t 1001 <210> 2 <211> 1001 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 2 caataaccca aaaaatgcta taaaactcta taaatacaac acaacacaac ccaccattta 60 ttattattat taacaaagcc caatctccaa tgtccaatgc ccacccttcc ttctgccatt 120 tttccagaca ttcccaccat tgctaccaca ctttcccttt cactatcctc attgctatcc 180 cacactccta acattcttct acaccaactc ttcatataca taaatatcat taccctacat 240 cactctcttt tgtcttttaa ctttctaaat ctacactttt ctccctttat tttttagttt 300 catttctatt tacctcttgt ttatcttaat gaaaacatca taaatcataa atcaacatta 360 ctgcaaaaag taggccccat ttaattatct ttggtgttgt ttctctacat atggagccac 420 ttcaaaattg taataaaaaa ccgcaaattg attaactagc ggaggatgtt caatcttaaa 480 accgaaaatt agtgattact aattctttta aaatttatta ataaacatta acatcactgg 540 tgaaaaatca aaattaaaaa tgtaaatttt aaaacttgag aaattattga aatgaaattc 600 aaaactcgag aaaaataaaa cattttgaga cataagaacc aaataaaaat taaactcaaa 660 acttagaggt aggatgtaac attttgaaat ctacctacca aatatatttg actaaaccca 720 aaactcaaga accaaatatt cattgaagtc ttatgtcaca atgtgaccat cttttaatca 780 tcattgtata taaattcaaa aaattggaca tttctaataa ccattagttc ttttgtaatt 840 tctctatcta tacatttgag tgcaaagact tcaaccacaa caaatggggt caatagttct 900 acggacgtat gagaaagaaa gaaagaaaga atacacaaat atctagaatt tttgttaaga 960 aatcattttt tttttaatcc acattaaaat gtgacgattt c 1001 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dtMS-10-757F <400> 3 caagtatatc agtcaagtgc atcgt 25 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dtMS-10-757R <400> 4 ttgatacact atacacactt gataccc 27 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dtMS-12-833 F <400> 5 aactagcgga ggatgttcaa 20 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dtMS-12-833 R <400> 6 ttttgatttt tcaccagtga tgtt 24

Claims

서열번호 1의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 및
서열번호 2의 염기서열 내에서 501번째 염기에 위치하는 단일염기다형성을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 수박 웅성불임 개체를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물.
서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 6으로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 수박 웅성불임 개체를 판별하기 위한 프라이머 세트.
제 2 항의 프라이머 세트를 포함하는, 수박 웅성불임 개체를 판별하기 위한 키트.
하기 단계를 포함하는, 수박 웅성불임 개체를 판별하는 방법:
(a) 판별하고자 하는 수박 품종으로부터 게놈(genomic) DNA를 얻는 단계;
(b) 상기 게놈 DNA에서 서열번호 1의 501번째 염기 또는 서열번호 2의 501번째 염기 타입을 검출하는 단계; 및
(c) 상기 검출한 염기 타입으로부터 수박 웅성불임 개체를 판별하는 단계.
제 4 항에 있어서,
상기 단계 (b)는 제 2항의 프라이머 세트를 사용한 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 수박 웅성불임 개체를 판별하는 방법.