JPH09313187A - イネの細胞質雄性不稔回復遺伝子の近傍に位置するｄｎａマーカーおよびｄｎａ診断法 - Google Patents
イネの細胞質雄性不稔回復遺伝子の近傍に位置するｄｎａマーカーおよびｄｎａ診断法Info
- Publication number
- JPH09313187A JPH09313187A JP8136502A JP13650296A JPH09313187A JP H09313187 A JPH09313187 A JP H09313187A JP 8136502 A JP8136502 A JP 8136502A JP 13650296 A JP13650296 A JP 13650296A JP H09313187 A JPH09313187 A JP H09313187A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- rice
- gene
- seq
- dna marker
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 イネの稔性回復遺伝子の遺伝子型を識別で
き、稔性回復の能力の有無を簡便かつ確実に検定する方
法を提供する。 【解決手段】 イネの稔性回復遺伝子近傍に位置するＤ
ＮＡ配列を特定し、その中の単純繰り返し配列をＰＣＲ
で特異的に増幅させ、増幅ＤＮＡ断片の長さの違いを検
出することによって、稔性回復遺伝子に関する３種類の
遺伝子型を識別し、稔性回復能力の有無を判別する。 【効果】 ＤＮＡレベルで稔性回復遺伝子の遺伝子型が
識別でき、稔性回復能力を判別できるので、ハイブリッ
ドライスおよびその親系統の育成を省力化できると共
に、ハイブリッドライス種子の純度管理が可能になっ
た。
き、稔性回復の能力の有無を簡便かつ確実に検定する方
法を提供する。 【解決手段】 イネの稔性回復遺伝子近傍に位置するＤ
ＮＡ配列を特定し、その中の単純繰り返し配列をＰＣＲ
で特異的に増幅させ、増幅ＤＮＡ断片の長さの違いを検
出することによって、稔性回復遺伝子に関する３種類の
遺伝子型を識別し、稔性回復能力の有無を判別する。 【効果】 ＤＮＡレベルで稔性回復遺伝子の遺伝子型が
識別でき、稔性回復能力を判別できるので、ハイブリッ
ドライスおよびその親系統の育成を省力化できると共
に、ハイブリッドライス種子の純度管理が可能になっ
た。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、イネ、特にハイブ
リッドライスおよびその親系統の育成または育成された
ハイブリッドライス種子生産における種子純度および親
系統の純度の管理に利用される稔性回復形質の判別に関
し、更に詳しくは該判別に使用されるＤＮＡマーカーに
関する。
リッドライスおよびその親系統の育成または育成された
ハイブリッドライス種子生産における種子純度および親
系統の純度の管理に利用される稔性回復形質の判別に関
し、更に詳しくは該判別に使用されるＤＮＡマーカーに
関する。
【０００２】
【従来の技術】細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）は農業上極め
て重要な形質の一つでハイブリッド種子の生産に利用さ
れる。ＣＭＳは高等植物に広く見られる現象で、核と細
胞質の遺伝子産物の不親和によって正常な花粉が生産で
きなくなる現象である。核にコードされる稔性回復遺伝
子は、ＣＭＳ細胞質による花粉の不稔性を打ち消す機能
を持つ。従って、稔性回復遺伝子を持つハイブリッド植
物は可稔となるため、ハイブリッド植物にとっては核に
コードされる稔性回復遺伝子が必須となる。イネにおい
ても、野生種に栽培種を交配したり、インディカ種にジ
ャポニカ種を交配した場合に、核と細胞質の不親和によ
ってＣＭＳが生じることが知られている。さらに、これ
らのＣＭＳを回復する稔性回復遺伝子も幾つか同定され
ている。ハイブリッドライスを商業生産する方法とし
て、上記の細胞質雄性不稔と稔性回復遺伝子を組み合わ
せた「三系法」が確立されている。「三系法」とは細胞
質雄性不稔細胞質を持つ細胞質雄性不稔系統とこれを維
持するための維持系統およびハイブリッドライスで稔性
を回復させるための稔性回復遺伝子を有する稔性回復系
統を用いてハイブリッドライスを大規模生産する方法で
ある。稔性回復系統にとって必須となるのが稔性回復遺
伝子の有無である。従来、この稔性回復遺伝子の有無を
判別するためには、まず、調査対象とする系統を雄性不
稔系統と交配し、次に、得られた交配種子を播種して植
物体を育成し、その植物の自殖種子の形成率を調査する
必要があった。すなわち、この自殖種子の形成率が８０
％以上の場合に、稔性回復遺伝子を有すると判別してい
た。しかし、かかる方法では膨大な労力と時間を必要と
するため、簡便でかつ確実に稔性回復遺伝子の有無、さ
らには、稔性回復形質の有無の判別方法の開発が望まれ
ていた。
て重要な形質の一つでハイブリッド種子の生産に利用さ
れる。ＣＭＳは高等植物に広く見られる現象で、核と細
胞質の遺伝子産物の不親和によって正常な花粉が生産で
きなくなる現象である。核にコードされる稔性回復遺伝
子は、ＣＭＳ細胞質による花粉の不稔性を打ち消す機能
を持つ。従って、稔性回復遺伝子を持つハイブリッド植
物は可稔となるため、ハイブリッド植物にとっては核に
コードされる稔性回復遺伝子が必須となる。イネにおい
ても、野生種に栽培種を交配したり、インディカ種にジ
ャポニカ種を交配した場合に、核と細胞質の不親和によ
ってＣＭＳが生じることが知られている。さらに、これ
らのＣＭＳを回復する稔性回復遺伝子も幾つか同定され
ている。ハイブリッドライスを商業生産する方法とし
て、上記の細胞質雄性不稔と稔性回復遺伝子を組み合わ
せた「三系法」が確立されている。「三系法」とは細胞
質雄性不稔細胞質を持つ細胞質雄性不稔系統とこれを維
持するための維持系統およびハイブリッドライスで稔性
を回復させるための稔性回復遺伝子を有する稔性回復系
統を用いてハイブリッドライスを大規模生産する方法で
ある。稔性回復系統にとって必須となるのが稔性回復遺
伝子の有無である。従来、この稔性回復遺伝子の有無を
判別するためには、まず、調査対象とする系統を雄性不
稔系統と交配し、次に、得られた交配種子を播種して植
物体を育成し、その植物の自殖種子の形成率を調査する
必要があった。すなわち、この自殖種子の形成率が８０
％以上の場合に、稔性回復遺伝子を有すると判別してい
た。しかし、かかる方法では膨大な労力と時間を必要と
するため、簡便でかつ確実に稔性回復遺伝子の有無、さ
らには、稔性回復形質の有無の判別方法の開発が望まれ
ていた。
【０００３】本発明では、優性の稔性回復遺伝子の遺伝
子型をＲｆ−１で示し、稔性回復遺伝子を持たない劣性
の遺伝子型をrｆ−１で示す。従って、稔性回復遺伝子
を持つイネの遺伝子型はＲｆ−１／Ｒｆ−１の優性ホモ
型、これを持たないイネの遺伝子型はrｆ−１／rｆ−１
の劣性ホモ型、これらのハイブリッド（Ｆ１）の遺伝子
型はＲｆ−１／rｆ−１のヘテロ型で示される。
子型をＲｆ−１で示し、稔性回復遺伝子を持たない劣性
の遺伝子型をrｆ−１で示す。従って、稔性回復遺伝子
を持つイネの遺伝子型はＲｆ−１／Ｒｆ−１の優性ホモ
型、これを持たないイネの遺伝子型はrｆ−１／rｆ−１
の劣性ホモ型、これらのハイブリッド（Ｆ１）の遺伝子
型はＲｆ−１／rｆ−１のヘテロ型で示される。
【０００４】近年、ＤＮＡ解析技術の急速な進歩によっ
て、ＤＮＡレベルで目的遺伝子または目的形質を判別す
ることが可能となってきた。しかし、そのためには、目
的遺伝子そのものもしくは目的遺伝子と極めて近接して
存在する塩基配列（ＤＮＡマーカー）が必要であった。
現在のところ上記の稔性回復遺伝子の機能・構造は不明
で、これを直接同定する方法は存在しない。間接的に稔
性回復遺伝子の存在を同定する方法に関しては、これま
でにＲａｎｄｏｍ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏ
ｒｏｐｈｉｃ ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）法によって見出され
たＤＮＡマーカーが１個存在している（特開平０６−０
１６１６２）。このマーカーは稔性回復系統にのみ存在
し、稔性回復遺伝子を持たない系統には存在しない。す
なわち、このマーカーは優性のマーカーで、Ｒｆ−１を
持つ場合には有性のホモでもヘテロでも検出され、これ
を持たない場合（ｒｆ−１）には検出されない。従っ
て、稔性回復遺伝子に関して優性ホモ型（Ｒｆ−１／Ｒ
ｆ−１）とヘテロ型（Ｒｆ−１／rｆ−１）では検出さ
れ、劣性ホモ型（ｒｆ−１／ｒｆ−１）では検出されな
い。このため、この様な優性マーカーでは優性ホモ型と
ヘテロ型の遺伝子型を識別することができなかった。ま
た、ある遺伝子の有無を間接的に近傍のＤＮＡマーカー
を利用して判別する場合に、遺伝子本体との距離によっ
て誤差が生じるため、ＤＮＡマーカーが目的遺伝子に限
りなく近い程、精度が高く効果がある。さらに、目的遺
伝子に対して反対側に位置するＤＮＡマーカーと組み合
わせることによって、ＤＮＡ診断の精度は飛躍的に向上
する。これは、染色体の組換えに於いて二重組換えの生
じる確率に比例するからである。
て、ＤＮＡレベルで目的遺伝子または目的形質を判別す
ることが可能となってきた。しかし、そのためには、目
的遺伝子そのものもしくは目的遺伝子と極めて近接して
存在する塩基配列（ＤＮＡマーカー）が必要であった。
現在のところ上記の稔性回復遺伝子の機能・構造は不明
で、これを直接同定する方法は存在しない。間接的に稔
性回復遺伝子の存在を同定する方法に関しては、これま
でにＲａｎｄｏｍ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏ
ｒｏｐｈｉｃ ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）法によって見出され
たＤＮＡマーカーが１個存在している（特開平０６−０
１６１６２）。このマーカーは稔性回復系統にのみ存在
し、稔性回復遺伝子を持たない系統には存在しない。す
なわち、このマーカーは優性のマーカーで、Ｒｆ−１を
持つ場合には有性のホモでもヘテロでも検出され、これ
を持たない場合（ｒｆ−１）には検出されない。従っ
て、稔性回復遺伝子に関して優性ホモ型（Ｒｆ−１／Ｒ
ｆ−１）とヘテロ型（Ｒｆ−１／rｆ−１）では検出さ
れ、劣性ホモ型（ｒｆ−１／ｒｆ−１）では検出されな
い。このため、この様な優性マーカーでは優性ホモ型と
ヘテロ型の遺伝子型を識別することができなかった。ま
た、ある遺伝子の有無を間接的に近傍のＤＮＡマーカー
を利用して判別する場合に、遺伝子本体との距離によっ
て誤差が生じるため、ＤＮＡマーカーが目的遺伝子に限
りなく近い程、精度が高く効果がある。さらに、目的遺
伝子に対して反対側に位置するＤＮＡマーカーと組み合
わせることによって、ＤＮＡ診断の精度は飛躍的に向上
する。これは、染色体の組換えに於いて二重組換えの生
じる確率に比例するからである。
【０００５】ある特定の遺伝形質をＤＮＡを用いて判別
するためには、対象とする遺伝形質を支配する遺伝子ま
たはその近傍にあるＤＮＡを特定する必要がある。この
様なＤＮＡを特定する方法として、ゲノム構造を解析す
るための様々なフィンガープリント法が開発されてい
る。
するためには、対象とする遺伝形質を支配する遺伝子ま
たはその近傍にあるＤＮＡを特定する必要がある。この
様なＤＮＡを特定する方法として、ゲノム構造を解析す
るための様々なフィンガープリント法が開発されてい
る。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、イネ
の稔性回復遺伝子の優性ホモ型、劣性ホモ型、ヘテロ型
の３種類の遺伝子型を識別でき、イネの稔性回復の能力
の有無を簡便かつ確実に判別する方法を提供することに
ある。
の稔性回復遺伝子の優性ホモ型、劣性ホモ型、ヘテロ型
の３種類の遺伝子型を識別でき、イネの稔性回復の能力
の有無を簡便かつ確実に判別する方法を提供することに
ある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、２〜数塩
基の短いヌクレオチドの単位の繰り返し配列よりなるマ
イクロサテライトに着目し、これを利用してイネの稔性
回復遺伝子の共優性のＤＮＡマーカーを見出すことに成
功した。そして、ＰＣＲ法によって共優性のＤＮＡマー
カーを増幅しその存在を確認することによって、イネの
稔性回復遺伝子の優性ホモ型、劣性ホモ型、ヘテロ型の
３種類の遺伝子型が識別でき、これによりイネの稔性回
復形質を判別することが可能であることを見いだし、本
発明を完成した。
基の短いヌクレオチドの単位の繰り返し配列よりなるマ
イクロサテライトに着目し、これを利用してイネの稔性
回復遺伝子の共優性のＤＮＡマーカーを見出すことに成
功した。そして、ＰＣＲ法によって共優性のＤＮＡマー
カーを増幅しその存在を確認することによって、イネの
稔性回復遺伝子の優性ホモ型、劣性ホモ型、ヘテロ型の
３種類の遺伝子型が識別でき、これによりイネの稔性回
復形質を判別することが可能であることを見いだし、本
発明を完成した。
【０００８】即ち、本発明は、以下の工程よりなるイネ
の稔性回復形質を判別する方法、該方法に使用される共
優性のＤＮＡマーカー及びプライマーを提供するもので
ある。 a) イネのＤＮＡを鋳型とし、プライマーを用いたＰＣ
Ｒ法により、該イネ遺伝子中の稔性回復遺伝子の共優性
のＤＮＡマーカーの有無を確認し、 b) a)の結果より該イネの稔性回復遺伝子の遺伝子型を
識別し、 c) よって、該イネの稔性回復形質を判別する。
の稔性回復形質を判別する方法、該方法に使用される共
優性のＤＮＡマーカー及びプライマーを提供するもので
ある。 a) イネのＤＮＡを鋳型とし、プライマーを用いたＰＣ
Ｒ法により、該イネ遺伝子中の稔性回復遺伝子の共優性
のＤＮＡマーカーの有無を確認し、 b) a)の結果より該イネの稔性回復遺伝子の遺伝子型を
識別し、 c) よって、該イネの稔性回復形質を判別する。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明で言うイネの稔性回復遺伝
子の共優性のＤＮＡマーカーとは、イネの稔性回復遺伝
子の近傍に位置するＤＮＡであり、イネ細胞中の該ＤＮ
Ａの存在を調べることにより間接的に該稔性回復遺伝子
の有無が判別できるものを指す。
子の共優性のＤＮＡマーカーとは、イネの稔性回復遺伝
子の近傍に位置するＤＮＡであり、イネ細胞中の該ＤＮ
Ａの存在を調べることにより間接的に該稔性回復遺伝子
の有無が判別できるものを指す。
【００１０】本発明のイネの稔性回復遺伝子の共優性の
ＤＮＡマーカーとしては、例えば配列番号２或いは配列
番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
ＤＮＡマーカーとしては、例えば配列番号２或いは配列
番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
【００１１】共優性のＤＮＡマーカーによる稔性回復遺
伝子の有無を判別する精度は稔性回復遺伝子と共優性の
ＤＮＡマーカーとの距離によって決定される。これらの
ＤＮＡは稔性回復遺伝子の極近傍に位置するため、その
ＤＮＡの有無を調べることでイネの稔性回復形質を高い
精度で判別することができる。例えば、本発明者らによ
る稔性回復遺伝子をホモに持つイネと持たないイネを交
配して得られた後代の稔性回復形質の解析の結果、稔性
回復遺伝子と本発明の共優性のＤＮＡマーカーとの遺伝
的距離は約３．７ｃＭ（センチモルガン）と決定され
た。これらの結果は、組み換え世代である交配後代から
９６％以上の精度で稔性回復遺伝子の有無を判別できる
ことを意味している。
伝子の有無を判別する精度は稔性回復遺伝子と共優性の
ＤＮＡマーカーとの距離によって決定される。これらの
ＤＮＡは稔性回復遺伝子の極近傍に位置するため、その
ＤＮＡの有無を調べることでイネの稔性回復形質を高い
精度で判別することができる。例えば、本発明者らによ
る稔性回復遺伝子をホモに持つイネと持たないイネを交
配して得られた後代の稔性回復形質の解析の結果、稔性
回復遺伝子と本発明の共優性のＤＮＡマーカーとの遺伝
的距離は約３．７ｃＭ（センチモルガン）と決定され
た。これらの結果は、組み換え世代である交配後代から
９６％以上の精度で稔性回復遺伝子の有無を判別できる
ことを意味している。
【００１２】イネの稔性回復遺伝子のＤＮＡマーカーの
同定方法について以下に説明する。稔性回復遺伝子の遺
伝子型が異なるイネ（優性ホモ型と劣性ホモ型）から抽
出されたＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法によりそれぞれの
イネのゲノム構造を比較分析する。即ち、ＰＣＲ用のプ
ライマーとして配列番号１に示したＡＧの繰り返し配列
を有するオリゴヌクレオチドを用い、稔性回復遺伝子の
遺伝子型が異なるイネから抽出されたＤＮＡを鋳型とし
てＤＮＡ断片を増幅する。増幅されたＤＮＡ断片の分子
サイズを電気泳動法でにより確認し、稔性回復遺伝子の
１種の遺伝子型に特異的に存在するＤＮＡ断片（稔性回
復遺伝子のＤＮＡマーカー）を選抜する。この場合、１
種類のプライマーで異なるサイズに増幅された稔性回復
遺伝子のＤＮＡマーカーが選抜できる。この様にＰＣＲ
法による検査において単一のプライマーを用いて遺伝子
型を識別できるＤＮＡマーカーを特に共優性のＤＮＡマ
ーカーと呼び、特開平０６−０１６１６２で得られた優
性のＤＮＡマーカーのごときＰＣＲプライマーと各遺伝
子型に特異的なＤＮＡマーカーが１対１に対応するＤＮ
Ａマーカーとは区別される。上記のそれぞれの遺伝子型
に対応して増幅されたＤＮＡ断片（稔性回復遺伝子の共
優性のＤＮＡマーカー）の塩基配列を調べたところ、そ
れぞれ配列番号２或いは配列番号３に記載の塩基配列で
あった。これら共優性のＤＮＡマーカーは互いによく似
た塩基配列を有し、これら共優性のＤＮＡマーカーに
は、共にＧＡＴＧの４塩基のヌクレオチドを単位とする
繰り返し配列（マイクロサテライト）が見出された（配
列番号２の配列の第２２４番〜第２３９番及び配列番号
の第２２４番〜第２５５番）。この配列番号２または配
列番号３の繰返し配列をＰＣＲによって増幅することに
よってその長さの違いを明らかにすることが出来る。こ
の目的のためには対照とするマイクロサテライトを挟
み、向い合う２種類のプライマーが必要となる。これら
のプライマーとして、配列番号２または配列番号３のマ
イクロサテライト両側の塩基配列を基に合成したオリゴ
ヌクレオチドを用いることが出来る。一般に、ＰＣＲプ
ライマーとしては１５ないし３０ｂｐのオリゴヌクレオ
チドが利用される。合成したオリゴヌクレオチドをプラ
イマーとして用いることによって、上記マイクロサテラ
イトをＰＣＲ法により特異的に増幅させることが出来
る。増幅されたマイクロサテライトはイネの稔性回復遺
伝子の遺伝子型に対応してＧＡＴＧの４塩基のヌクレオ
チド単位の繰り返しの数が異なるため、増幅されたマイ
クロサテライトを含む稔性回復遺伝子の共優性のＤＮＡ
マーカーの長さによって稔性回復遺伝子の遺伝子型を識
別することができる。よって、この方法で１対のプライ
マーを用いれば３種類の遺伝子型が識別できることにな
り、イネの稔性回復遺伝子に関して優性ホモ、劣性ホ
モ、ヘテロの雑種第１代（Ｒｆ−１／ｒｆ−１）の形質
を判別することができる。
同定方法について以下に説明する。稔性回復遺伝子の遺
伝子型が異なるイネ（優性ホモ型と劣性ホモ型）から抽
出されたＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法によりそれぞれの
イネのゲノム構造を比較分析する。即ち、ＰＣＲ用のプ
ライマーとして配列番号１に示したＡＧの繰り返し配列
を有するオリゴヌクレオチドを用い、稔性回復遺伝子の
遺伝子型が異なるイネから抽出されたＤＮＡを鋳型とし
てＤＮＡ断片を増幅する。増幅されたＤＮＡ断片の分子
サイズを電気泳動法でにより確認し、稔性回復遺伝子の
１種の遺伝子型に特異的に存在するＤＮＡ断片（稔性回
復遺伝子のＤＮＡマーカー）を選抜する。この場合、１
種類のプライマーで異なるサイズに増幅された稔性回復
遺伝子のＤＮＡマーカーが選抜できる。この様にＰＣＲ
法による検査において単一のプライマーを用いて遺伝子
型を識別できるＤＮＡマーカーを特に共優性のＤＮＡマ
ーカーと呼び、特開平０６−０１６１６２で得られた優
性のＤＮＡマーカーのごときＰＣＲプライマーと各遺伝
子型に特異的なＤＮＡマーカーが１対１に対応するＤＮ
Ａマーカーとは区別される。上記のそれぞれの遺伝子型
に対応して増幅されたＤＮＡ断片（稔性回復遺伝子の共
優性のＤＮＡマーカー）の塩基配列を調べたところ、そ
れぞれ配列番号２或いは配列番号３に記載の塩基配列で
あった。これら共優性のＤＮＡマーカーは互いによく似
た塩基配列を有し、これら共優性のＤＮＡマーカーに
は、共にＧＡＴＧの４塩基のヌクレオチドを単位とする
繰り返し配列（マイクロサテライト）が見出された（配
列番号２の配列の第２２４番〜第２３９番及び配列番号
の第２２４番〜第２５５番）。この配列番号２または配
列番号３の繰返し配列をＰＣＲによって増幅することに
よってその長さの違いを明らかにすることが出来る。こ
の目的のためには対照とするマイクロサテライトを挟
み、向い合う２種類のプライマーが必要となる。これら
のプライマーとして、配列番号２または配列番号３のマ
イクロサテライト両側の塩基配列を基に合成したオリゴ
ヌクレオチドを用いることが出来る。一般に、ＰＣＲプ
ライマーとしては１５ないし３０ｂｐのオリゴヌクレオ
チドが利用される。合成したオリゴヌクレオチドをプラ
イマーとして用いることによって、上記マイクロサテラ
イトをＰＣＲ法により特異的に増幅させることが出来
る。増幅されたマイクロサテライトはイネの稔性回復遺
伝子の遺伝子型に対応してＧＡＴＧの４塩基のヌクレオ
チド単位の繰り返しの数が異なるため、増幅されたマイ
クロサテライトを含む稔性回復遺伝子の共優性のＤＮＡ
マーカーの長さによって稔性回復遺伝子の遺伝子型を識
別することができる。よって、この方法で１対のプライ
マーを用いれば３種類の遺伝子型が識別できることにな
り、イネの稔性回復遺伝子に関して優性ホモ、劣性ホ
モ、ヘテロの雑種第１代（Ｒｆ−１／ｒｆ−１）の形質
を判別することができる。
【００１３】さらに、稔性回復遺伝子を夾んで本発明で
得られた共優性のＤＮＡマーカーとは逆側に位置するＤ
ＮＡマーカー、例えば、配列番号６に示すＤＮＡマーカ
ー等と組み合わせることによって、飛躍的に稔性回復遺
伝子を有するイネを判別する精度が向上できることを見
出した。すなわち、本発明で見出された共優性のＤＮＡ
マーカーによって稔性回復形質を有すると判別された植
物体について、配列番号６に示すＤＮＡマーカーの有無
を調べる。ＤＮＡマーカーの有無を調べる方法としては
配列番号６に特異的なプライマーを用いて、ＰＣＲによ
るＤＮＡ断片の増幅の有無によって調べることが出来
る。プライマーとしては、配列番号６の塩基配列に基づ
き、お互いに向い合う１５〜３０ｂｐの２種類のオリゴ
ヌクレオチドを組み合わせて用いる。ＤＮＡマーカーを
持つ場合には稔性回復形質を有し、ＤＮＡマーカーを持
たない場合には稔性回復形質を有さないと判定する。
得られた共優性のＤＮＡマーカーとは逆側に位置するＤ
ＮＡマーカー、例えば、配列番号６に示すＤＮＡマーカ
ー等と組み合わせることによって、飛躍的に稔性回復遺
伝子を有するイネを判別する精度が向上できることを見
出した。すなわち、本発明で見出された共優性のＤＮＡ
マーカーによって稔性回復形質を有すると判別された植
物体について、配列番号６に示すＤＮＡマーカーの有無
を調べる。ＤＮＡマーカーの有無を調べる方法としては
配列番号６に特異的なプライマーを用いて、ＰＣＲによ
るＤＮＡ断片の増幅の有無によって調べることが出来
る。プライマーとしては、配列番号６の塩基配列に基づ
き、お互いに向い合う１５〜３０ｂｐの２種類のオリゴ
ヌクレオチドを組み合わせて用いる。ＤＮＡマーカーを
持つ場合には稔性回復形質を有し、ＤＮＡマーカーを持
たない場合には稔性回復形質を有さないと判定する。
【００１４】本発明の稔性回復遺伝子の共優性のＤＮＡ
マーカーを用いる、イネの稔性回復遺伝子の遺伝子型の
識別方法および稔性回復能力の有無の判別方法は以下の
とおりである。
マーカーを用いる、イネの稔性回復遺伝子の遺伝子型の
識別方法および稔性回復能力の有無の判別方法は以下の
とおりである。
【００１５】すなわち、イネ植物体またはイネ種子より
ＤＮＡを抽出する。ＤＮＡの抽出方法としてはどの様な
方法も用いることができ、粗精製のＤＮＡを用いること
もできる。抽出されたＤＮＡを鋳型として共優性のＤＮ
ＡマーカーをＰＣＲ法によって増幅する。増幅された異
なる２種類の分子サイズの共優性のＤＮＡマーカー断片
の電気泳動パターンから、鋳型としたＤＮＡを抽出した
イネの稔性回復遺伝子の優性ホモ型（Ｒｆ−１／Ｒｆ−
１）および劣性ホモ型（ｒｆ−１／ｒｆ−１）とヘテロ
型（Ｒｆ−１／ｒｆ−１）の遺伝子型を識別し、表現形
質を判別する。すなわち、Ｒｆ−１をホモに持つイネか
らは３４５ｂｐのＤＮＡ断片のみが、一方、ｒｆ−１を
ホモに持つイネからは３２９ｂｐのＤＮＡ断片のみが増
幅される。また、Ｒｆ−１とｒｆ−１を併せ持つヘテロ
型のイネからは２種類のＤＮＡ断片が同時に増幅され
る。これらＤＮＡ断片の有無を確認することによってイ
ネの稔性回復遺伝子の遺伝子型が識別できる。
ＤＮＡを抽出する。ＤＮＡの抽出方法としてはどの様な
方法も用いることができ、粗精製のＤＮＡを用いること
もできる。抽出されたＤＮＡを鋳型として共優性のＤＮ
ＡマーカーをＰＣＲ法によって増幅する。増幅された異
なる２種類の分子サイズの共優性のＤＮＡマーカー断片
の電気泳動パターンから、鋳型としたＤＮＡを抽出した
イネの稔性回復遺伝子の優性ホモ型（Ｒｆ−１／Ｒｆ−
１）および劣性ホモ型（ｒｆ−１／ｒｆ−１）とヘテロ
型（Ｒｆ−１／ｒｆ−１）の遺伝子型を識別し、表現形
質を判別する。すなわち、Ｒｆ−１をホモに持つイネか
らは３４５ｂｐのＤＮＡ断片のみが、一方、ｒｆ−１を
ホモに持つイネからは３２９ｂｐのＤＮＡ断片のみが増
幅される。また、Ｒｆ−１とｒｆ−１を併せ持つヘテロ
型のイネからは２種類のＤＮＡ断片が同時に増幅され
る。これらＤＮＡ断片の有無を確認することによってイ
ネの稔性回復遺伝子の遺伝子型が識別できる。
【００１６】
【実施例】以下に本発明を実施例に基づき詳細に説明す
る。
る。
【００１７】［実施例１］イネのＲｆ−１の準同質遺伝
子系統として、ＭＴＣ−１０Ａ、ＭＴＣ−１０Ｒおよび
ＭＴＣ−１０ＡにＭＴＣ−１０Ｒを交配して得たＦ１の
３種を用いた。ＭＴＣ−１０ＡとＭＴＣ−１０Ｒは、共
にＣｈｉｎｓｕｒａｈ Ｂｏｒｏ ＩＩに台中６５号を
戻し交配して得た系統である。ＭＴＣ−１０Ｒは稔性回
復遺伝子をホモに持つ稔性回復系統であり、ＭＴＣ−１
０Ａは稔性回復遺伝子を持たない細胞質雄性不稔系統で
ある。従って、ＭＴＣ−１０Ａの遺伝子型はｒｆ−１／
ｒｆ−１、ＭＴＣ−１０Ｒの遺伝子型はＲｆ−１／Ｒｆ
−１、Ｆ１の遺伝子型はＲｆ−１／ｒｆ−１である。Ｍ
ＴＣ−１０Ａ、ＭＴＣ−１０ＲおよびＦ１の植物体の葉
よりＤＮＡをＣＴＡＢ法（Ｌｉｃｈｅｎｓｔｅｉｎ ＆
Ｄｒａｐｅｒ １９８５）によって抽出した。
子系統として、ＭＴＣ−１０Ａ、ＭＴＣ−１０Ｒおよび
ＭＴＣ−１０ＡにＭＴＣ−１０Ｒを交配して得たＦ１の
３種を用いた。ＭＴＣ−１０ＡとＭＴＣ−１０Ｒは、共
にＣｈｉｎｓｕｒａｈ Ｂｏｒｏ ＩＩに台中６５号を
戻し交配して得た系統である。ＭＴＣ−１０Ｒは稔性回
復遺伝子をホモに持つ稔性回復系統であり、ＭＴＣ−１
０Ａは稔性回復遺伝子を持たない細胞質雄性不稔系統で
ある。従って、ＭＴＣ−１０Ａの遺伝子型はｒｆ−１／
ｒｆ−１、ＭＴＣ−１０Ｒの遺伝子型はＲｆ−１／Ｒｆ
−１、Ｆ１の遺伝子型はＲｆ−１／ｒｆ−１である。Ｍ
ＴＣ−１０Ａ、ＭＴＣ−１０ＲおよびＦ１の植物体の葉
よりＤＮＡをＣＴＡＢ法（Ｌｉｃｈｅｎｓｔｅｉｎ ＆
Ｄｒａｐｅｒ １９８５）によって抽出した。
【００１８】ＰＣＲはＧｅｎｅＡｍｐ９６００システム
（ＡＢＩ社）を使用し、２０μｌの反応量で行った。反
応液２０μｌ中には１０ｎｇ ＤＮＡ，０．５ｕｎｉｔ
ｓ ＴＡＫＡＲＡ Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ社），４ｎｍ
ｏｌｅ ｄＮＴＰ，１０ｐｍｏｌｅ ｐｒｉｍｅｒ，１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５０ｍＭＫ
Ｃｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2が含まれる。ＰＣＲ条件
は、９５℃で１０秒間のディネーチャー、５２℃で３０
秒間のアニール、７２℃で３０秒間の伸長反応を１サイ
クルとし、４５サイクル反応させた。反応後、２．５％
ＭｅｔａＰｈｏｒ Ａｇａｒｏｓｅ（ＦＭＣ社）で分画
した。配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡをプライマ
ーとして用いた場合に、ＭＴＣ−１０Ａ、ＭＴＣ−１０
Ｒともに複数のＤＮＡ断片が増幅された。これらのＤＮ
Ａ断片の中にＭＴＣ−１０ＡとＭＴＣ−１０Ｒ間で明確
な多型を示すＤＮＡ断片が見出された。すなわち、Ｒｆ
−１をホモに持つＭＴＣ−１０Ｒでは約４２０ｂｐのＤ
ＮＡ断片が、一方、ｒｆ−１をホモに持つＭＴＣ−１０
Ａでは約４００ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。
（ＡＢＩ社）を使用し、２０μｌの反応量で行った。反
応液２０μｌ中には１０ｎｇ ＤＮＡ，０．５ｕｎｉｔ
ｓ ＴＡＫＡＲＡ Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ社），４ｎｍ
ｏｌｅ ｄＮＴＰ，１０ｐｍｏｌｅ ｐｒｉｍｅｒ，１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５０ｍＭＫ
Ｃｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2が含まれる。ＰＣＲ条件
は、９５℃で１０秒間のディネーチャー、５２℃で３０
秒間のアニール、７２℃で３０秒間の伸長反応を１サイ
クルとし、４５サイクル反応させた。反応後、２．５％
ＭｅｔａＰｈｏｒ Ａｇａｒｏｓｅ（ＦＭＣ社）で分画
した。配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡをプライマ
ーとして用いた場合に、ＭＴＣ−１０Ａ、ＭＴＣ−１０
Ｒともに複数のＤＮＡ断片が増幅された。これらのＤＮ
Ａ断片の中にＭＴＣ−１０ＡとＭＴＣ−１０Ｒ間で明確
な多型を示すＤＮＡ断片が見出された。すなわち、Ｒｆ
−１をホモに持つＭＴＣ−１０Ｒでは約４２０ｂｐのＤ
ＮＡ断片が、一方、ｒｆ−１をホモに持つＭＴＣ−１０
Ａでは約４００ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。
【００１９】［実施例２］実施例１で得られたＭＴＣ−
１０ＡおよびＭＴＣ−１０Ｒ由来のそれぞれ約４００ｂ
ｐおよび約４２０ｂｐのＤＮＡ断片を電気泳動後回収
し、ＴＡクローニングキット（Ｉｎ Ｖｉｔｏｇｅｎ
社） を用いてプラスミドｐＣＲＴＭＩＩにサブクロー
ニングした。その結果、ＭＴＣ−１０ＡおよびＭＴＣ−
１０Ｒ由来のＤＮＡ断片を含むクローン、ｐＲｆ８３５
ＡおよびｐＲｆ８３５Ｒを得た。ｐＲｆ８３５Ａおよび
ｐＲｆ８３５Ｒの塩基配列は３７３Ｓ ＤＮＡシークエ
ンサー（ＡＢＩ社）を用いて決定した。ＤＮＡ断片の塩
基配列は、ＭＴＣ−１０Ａ由来のものが配列番号２のと
おり４０９ｂｐのものであり、ＭＴＣ−１０Ｒ由来のも
のが配列番号３に記載の４２１ｂｐのものであった。両
ＤＮＡ断片の塩基配列は極めて相同性が高く、これらの
クローンが同じ領域に由来することが明らかとなった。
両ＤＮＡ断片の塩基配列で２塩基で塩基置換が生じてい
た。両者のＤＮＡ鎖長の違いは、該ＤＮＡ断片に含まれ
るＧＡＴＧの４ｂｐよりなるヌクレオチド単位の繰り返
し数の違いであることが明らかとなった。すなわち、Ｍ
ＴＣ−１０ＡではＧＡＴＧのヌクレオチド単位が４回繰
り返されているのに対し、ＭＴＣ−１０Ｒでは該単位が
８回繰り返されていることが相違する。
１０ＡおよびＭＴＣ−１０Ｒ由来のそれぞれ約４００ｂ
ｐおよび約４２０ｂｐのＤＮＡ断片を電気泳動後回収
し、ＴＡクローニングキット（Ｉｎ Ｖｉｔｏｇｅｎ
社） を用いてプラスミドｐＣＲＴＭＩＩにサブクロー
ニングした。その結果、ＭＴＣ−１０ＡおよびＭＴＣ−
１０Ｒ由来のＤＮＡ断片を含むクローン、ｐＲｆ８３５
ＡおよびｐＲｆ８３５Ｒを得た。ｐＲｆ８３５Ａおよび
ｐＲｆ８３５Ｒの塩基配列は３７３Ｓ ＤＮＡシークエ
ンサー（ＡＢＩ社）を用いて決定した。ＤＮＡ断片の塩
基配列は、ＭＴＣ−１０Ａ由来のものが配列番号２のと
おり４０９ｂｐのものであり、ＭＴＣ−１０Ｒ由来のも
のが配列番号３に記載の４２１ｂｐのものであった。両
ＤＮＡ断片の塩基配列は極めて相同性が高く、これらの
クローンが同じ領域に由来することが明らかとなった。
両ＤＮＡ断片の塩基配列で２塩基で塩基置換が生じてい
た。両者のＤＮＡ鎖長の違いは、該ＤＮＡ断片に含まれ
るＧＡＴＧの４ｂｐよりなるヌクレオチド単位の繰り返
し数の違いであることが明らかとなった。すなわち、Ｍ
ＴＣ−１０ＡではＧＡＴＧのヌクレオチド単位が４回繰
り返されているのに対し、ＭＴＣ−１０Ｒでは該単位が
８回繰り返されていることが相違する。
【００２０】実施例１で用いたプライマーでは目的とす
る多型バンドに加えて複数のバンドが増幅されてくる。
そのため、遺伝子型の識別にはやや不都合である。より
明確に遺伝子型を識別するため、配列番号２又は配列番
号３に記載のＤＮＡ配列のみを特異的に増幅するための
４ｂｐのリピートを挟むＰＣＲプライマーｐＲｆ１（配
列番号４） とｐＲｆ２（配列番号５）を設計した。こ
れらのＰＣＲプライマーｐＲｆ１及びｐＲｆ２を用いて
ＧｅｎｅＡｍｐ９６００システム（ＡＢＩ社）を使用
し、実施例１の３種類の遺伝子型の植物体から抽出した
ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。反応液２０μｌ中
には１０ｎｇＤＮＡ，０．５ｕｎｉｔｓ ＴＡＫＡＲＡ
Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ社），４ｎｍｏｌｅ ｄＮＴ
Ｐ，１０ｐｍｏｌｅ プライマー（ｐＲｆ１），１０ｐ
ｍｏｌｅプライマー（ｐＲｆ２），１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５０ｍＭ ＫＣｌ，１．５ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2が含まれる。ＰＣＲ条件は、９５℃で１
０秒間のディネーチャー、６０℃で３０秒間のアニー
ル、７２℃で３０秒間伸長反応を１サイクルとし、３５
サイクル反応させた。反応後、２．５％ＭｅｔａＰｈｏ
ｒ Ａｇａｒｏｓｅ（ＦＭＣ社）で分画した。
る多型バンドに加えて複数のバンドが増幅されてくる。
そのため、遺伝子型の識別にはやや不都合である。より
明確に遺伝子型を識別するため、配列番号２又は配列番
号３に記載のＤＮＡ配列のみを特異的に増幅するための
４ｂｐのリピートを挟むＰＣＲプライマーｐＲｆ１（配
列番号４） とｐＲｆ２（配列番号５）を設計した。こ
れらのＰＣＲプライマーｐＲｆ１及びｐＲｆ２を用いて
ＧｅｎｅＡｍｐ９６００システム（ＡＢＩ社）を使用
し、実施例１の３種類の遺伝子型の植物体から抽出した
ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。反応液２０μｌ中
には１０ｎｇＤＮＡ，０．５ｕｎｉｔｓ ＴＡＫＡＲＡ
Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ社），４ｎｍｏｌｅ ｄＮＴ
Ｐ，１０ｐｍｏｌｅ プライマー（ｐＲｆ１），１０ｐ
ｍｏｌｅプライマー（ｐＲｆ２），１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５０ｍＭ ＫＣｌ，１．５ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2が含まれる。ＰＣＲ条件は、９５℃で１
０秒間のディネーチャー、６０℃で３０秒間のアニー
ル、７２℃で３０秒間伸長反応を１サイクルとし、３５
サイクル反応させた。反応後、２．５％ＭｅｔａＰｈｏ
ｒ Ａｇａｒｏｓｅ（ＦＭＣ社）で分画した。
【００２１】実験の結果、ＭＴＣ−１０ＡのＤＮＡを鋳
型とした場合には３２９ｂｐ、ＭＴＣ−１０ＲのＤＮＡ
を鋳型とした場合には３４５ｂｐのＤＮＡ断片が、ま
た、Ｆ１のＤＮＡを鋳型とした場合には３２９ｂｐと３
４５ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。すなわち、このＤ
ＮＡマーカーによってＲｆ−１に関する優性ホモ型（Ｒ
ｆ−１／Ｒｆ−１）、劣性ホモ型（ｒｆ−１／ｒｆ−
１）およびヘテロ型（Ｒｆ−１／ｒｆ−１）の３種類の
遺伝子型が識別できることが明らかとなった。
型とした場合には３２９ｂｐ、ＭＴＣ−１０ＲのＤＮＡ
を鋳型とした場合には３４５ｂｐのＤＮＡ断片が、ま
た、Ｆ１のＤＮＡを鋳型とした場合には３２９ｂｐと３
４５ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。すなわち、このＤ
ＮＡマーカーによってＲｆ−１に関する優性ホモ型（Ｒ
ｆ−１／Ｒｆ−１）、劣性ホモ型（ｒｆ−１／ｒｆ−
１）およびヘテロ型（Ｒｆ−１／ｒｆ−１）の３種類の
遺伝子型が識別できることが明らかとなった。
【００２２】［実施例３］実施例２の方法を用いた場合
の稔性回復遺伝子の判別の精度を明らかにするため、実
施例２で増幅される３２９ｂｐと３４５ｂｐのＤＮＡ断
片と稔性回復遺伝子との遺伝的距離を決定した。実施例
１で用いた準同質遺伝子系統のＭＴＣ−１０Ａを母親と
し、これにＭＴＣ−１０Ｒを交配してＦ１植物を育成し
た。得られたＦ１の花粉をＭＴＣ−１０Ａに交配し、３
２２個体のＢ１Ｆ１植物を得た。ＭＴＣ−１０ＡはＢＴ
型の細胞質を有する配偶体型細胞質雄性不稔であるの
で、ＭＴＣ−１０Ａ／ＭＴＣ−１０ＲのＦ１では稔性回
復遺伝子の遺伝子型Ｒｆ−１の花粉のみが正常に発達す
る。すなわち、Ｆ１の花粉をＭＴＣ−１０Ａに戻し交配
して得られるＢ１Ｆ１の遺伝子型はＲｆ−１／ｒｆ−１
のへテロとなり、すべての個体が稔性回復遺伝子を有す
る。３２２個体の植物体からＳｔｅｉｎｅｒらの方法
（（１９９５） Ｎｕｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓａｒ
ｃｈ １３：２５６９−２５７０）に従って、ＤＮＡを
粗抽出した。配列番号４および配列番号５のプライマー
を用いて、実施例２に示す条件でＰＣＲを行い、増幅さ
れたＤＮＡの電気泳動パターンを解析した。３２２個体
については全て、ＭＴＣ−１０Ａに由来する３２９ｂｐ
のバンドが検出された。一方、３１０個体ではＭＴＣ−
１０Ｒ由来の３４５ｂｐのバンドも検出されたが、１２
個体でＭＴＣ−１０Ｒ特異的なバンドは増幅されなかっ
た。即ち、１２個体でＯＳＲＲｆと稔性回復遺伝子との
間で組換えが生じたことになる。このことを元に、Ｋｏ
ｓａｍｂｉの計算式（（１９４４） Ａｎｎ Ｅｕｇｅ
ｎ１２：１７２−１７５）によって実施例２の３２９ｂ
ｐと３４５ｂｐのＤＮＡ断片と稔性回復遺伝子との遺伝
的な距離を算出したところ、３．７ｃＭ±１．１ｃＭで
あることが明らかとなった。
の稔性回復遺伝子の判別の精度を明らかにするため、実
施例２で増幅される３２９ｂｐと３４５ｂｐのＤＮＡ断
片と稔性回復遺伝子との遺伝的距離を決定した。実施例
１で用いた準同質遺伝子系統のＭＴＣ−１０Ａを母親と
し、これにＭＴＣ−１０Ｒを交配してＦ１植物を育成し
た。得られたＦ１の花粉をＭＴＣ−１０Ａに交配し、３
２２個体のＢ１Ｆ１植物を得た。ＭＴＣ−１０ＡはＢＴ
型の細胞質を有する配偶体型細胞質雄性不稔であるの
で、ＭＴＣ−１０Ａ／ＭＴＣ−１０ＲのＦ１では稔性回
復遺伝子の遺伝子型Ｒｆ−１の花粉のみが正常に発達す
る。すなわち、Ｆ１の花粉をＭＴＣ−１０Ａに戻し交配
して得られるＢ１Ｆ１の遺伝子型はＲｆ−１／ｒｆ−１
のへテロとなり、すべての個体が稔性回復遺伝子を有す
る。３２２個体の植物体からＳｔｅｉｎｅｒらの方法
（（１９９５） Ｎｕｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓａｒ
ｃｈ １３：２５６９−２５７０）に従って、ＤＮＡを
粗抽出した。配列番号４および配列番号５のプライマー
を用いて、実施例２に示す条件でＰＣＲを行い、増幅さ
れたＤＮＡの電気泳動パターンを解析した。３２２個体
については全て、ＭＴＣ−１０Ａに由来する３２９ｂｐ
のバンドが検出された。一方、３１０個体ではＭＴＣ−
１０Ｒ由来の３４５ｂｐのバンドも検出されたが、１２
個体でＭＴＣ−１０Ｒ特異的なバンドは増幅されなかっ
た。即ち、１２個体でＯＳＲＲｆと稔性回復遺伝子との
間で組換えが生じたことになる。このことを元に、Ｋｏ
ｓａｍｂｉの計算式（（１９４４） Ａｎｎ Ｅｕｇｅ
ｎ１２：１７２−１７５）によって実施例２の３２９ｂ
ｐと３４５ｂｐのＤＮＡ断片と稔性回復遺伝子との遺伝
的な距離を算出したところ、３．７ｃＭ±１．１ｃＭで
あることが明らかとなった。
【００２３】［実施例４］実施例３で用いたＢ１Ｆ１植
物から抽出したＤＮＡを用いて、特開平０６−０１６１
６２で見出されたＤＮＡマーカー（ｆＬ６０１：配列番
号６）と実施例２の３２９ｂｐと３４５ｂｐのＤＮＡ断
片との位置関係を調べた。配列番号７および配列番号８
のプライマーを用いて、実施例３と同じＤＮＡを鋳型と
し、条件でＰＣＲを行った。増幅されたＤＮＡの電気泳
動パターンを解析した。３２２個体中３１７個体でバン
ドの増幅が認められたが、５個体ではバンドの増幅が認
められなかった。Ｋｏｓａｍｂｉの計算式（前出）によ
ってｆＬ６０１と稔性回復遺伝子との遺伝的距離を計算
した結果、１．６ｃＭ±０．７ｃＭの距離であることが
明らかとなった。さらに、実施例３の結果をあわせて遺
伝的距離を計算し位置関係を解析した結果、ｆＬ６０１
は実施例２で見出された３２９ｂｐと３４５ｂｐのＤＮ
Ａ断片と稔性回復遺伝子を夾んで逆側に位置することが
明らかとなった。
物から抽出したＤＮＡを用いて、特開平０６−０１６１
６２で見出されたＤＮＡマーカー（ｆＬ６０１：配列番
号６）と実施例２の３２９ｂｐと３４５ｂｐのＤＮＡ断
片との位置関係を調べた。配列番号７および配列番号８
のプライマーを用いて、実施例３と同じＤＮＡを鋳型と
し、条件でＰＣＲを行った。増幅されたＤＮＡの電気泳
動パターンを解析した。３２２個体中３１７個体でバン
ドの増幅が認められたが、５個体ではバンドの増幅が認
められなかった。Ｋｏｓａｍｂｉの計算式（前出）によ
ってｆＬ６０１と稔性回復遺伝子との遺伝的距離を計算
した結果、１．６ｃＭ±０．７ｃＭの距離であることが
明らかとなった。さらに、実施例３の結果をあわせて遺
伝的距離を計算し位置関係を解析した結果、ｆＬ６０１
は実施例２で見出された３２９ｂｐと３４５ｂｐのＤＮ
Ａ断片と稔性回復遺伝子を夾んで逆側に位置することが
明らかとなった。
【００２４】［実施例５］単離した共優性のＤＮＡマー
カーと稔性回復の表現型と関連を調べるため、稔性回復
に関して表現形質の異なる１１品種を用いた。ＢＴ型細
胞質雄性不稔に対する稔性回復能力を持たない品種とし
て、ＭＴＣ−１０Ａ、あそみのり、キヌヒカリ、コシヒ
カリ、日本晴、つがるおとめ、つきのひかりの７品種
を、また、この稔性回復能力を持つ品種としてＣｈｉｎ
ｓｕｒａｈ Ｂｏｒｏ ＩＩ，ＩＲ４２，桂朝2号、Ｍ
ＴＣ−１０Ｒの４品種を供試した。これらの幼植物よ
り、Ｅｄｗａｒｄｓらの方法（（１９９２） Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓａｒｃｈ １９：１３４９）
に従ってＤＮＡを粗抽出した。実施例２に示した方法に
従って、配列番号４と配列番号５のプライマーを用いて
ＯＳＲＲｆを解析した。その結果、稔性回復能力のない
７品種では全てＭＴＣ−１０Ａと同じ３２９ｂｐのＤＮ
Ａ断片が、稔性回復能力を持つ４品種ではＭＴＣ−１０
Ｒと同じ３４５ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。すなわ
ち、この結果から、ＰＣＲによって稔性回復遺伝子の遺
伝子型を検査することによってイネ品種の稔性回復能力
の有無を判別できることが明らかとなった。
カーと稔性回復の表現型と関連を調べるため、稔性回復
に関して表現形質の異なる１１品種を用いた。ＢＴ型細
胞質雄性不稔に対する稔性回復能力を持たない品種とし
て、ＭＴＣ−１０Ａ、あそみのり、キヌヒカリ、コシヒ
カリ、日本晴、つがるおとめ、つきのひかりの７品種
を、また、この稔性回復能力を持つ品種としてＣｈｉｎ
ｓｕｒａｈ Ｂｏｒｏ ＩＩ，ＩＲ４２，桂朝2号、Ｍ
ＴＣ−１０Ｒの４品種を供試した。これらの幼植物よ
り、Ｅｄｗａｒｄｓらの方法（（１９９２） Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓａｒｃｈ １９：１３４９）
に従ってＤＮＡを粗抽出した。実施例２に示した方法に
従って、配列番号４と配列番号５のプライマーを用いて
ＯＳＲＲｆを解析した。その結果、稔性回復能力のない
７品種では全てＭＴＣ−１０Ａと同じ３２９ｂｐのＤＮ
Ａ断片が、稔性回復能力を持つ４品種ではＭＴＣ−１０
Ｒと同じ３４５ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。すなわ
ち、この結果から、ＰＣＲによって稔性回復遺伝子の遺
伝子型を検査することによってイネ品種の稔性回復能力
の有無を判別できることが明らかとなった。
【００２５】
【発明の効果】本発明により、イネの稔性回復遺伝子の
共優性のＤＮＡマーカーが提供される。本発明の共優性
のＤＮＡマーカーをＰＣＲによる稔性回復遺伝子の遺伝
子型の識別に利用することにより、イネの稔性回復遺伝
子の表現形質の判別を簡便にしかも精度よく行うことが
出来る。この本発明の方法により稔性回復能力の有無を
判別することが可能となり、ハイブリッドライスの親系
統の育成が効率化される。さらに、ハイブリッドライス
種子の純度管理が可能となる。
共優性のＤＮＡマーカーが提供される。本発明の共優性
のＤＮＡマーカーをＰＣＲによる稔性回復遺伝子の遺伝
子型の識別に利用することにより、イネの稔性回復遺伝
子の表現形質の判別を簡便にしかも精度よく行うことが
出来る。この本発明の方法により稔性回復能力の有無を
判別することが可能となり、ハイブリッドライスの親系
統の育成が効率化される。さらに、ハイブリッドライス
種子の純度管理が可能となる。
【００２６】
【００２７】配列番号：１ 配列の長さ：１８ 配列の形：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列： AGAGAGAGAG AGAGAGYC 18
【００２８】配列番号：２ 配列の長さ：４０９ 配列の形：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 起源： 生物名：Oryza sativa L. 組織の種類：緑葉 配列の特徴 特徴を示す記号：genomic ＤＮＡ 存在位置：1..409 配列： AGAGAGAGAG AGAGAGTCAT CAGACAGTGA ATCGAGCAAG CAACGCGAGG ACACGTACTT 60 ACGCACTCCA AATATTAAGG CGATCAGGCG ATCAGCAACT GCACTTTGCA AATTCGGCCG 120 ATGATAGCGT ATGCGTGATC AATTAACGTG TAATTCTTTT ACGTGTTCGC AAAAAAAACT 180 AGATTGCATA TGCATGACAC CTACACACGT ACACGGTACA CACGATGGAT GGATGGATGG 240 ATTGGGCGGC TCACCGAACT GGCCTCCTCT CGCACGCACG CACGAAGGCA GGCAGCCAGC 300 TAGCATCGAG GACGTACGTC CGAGCCGGCG AACGGATCTC TCCCGTGCAG CAAAGGCGTA 360 CGTATCTCGT CGCGGCCGGC AAGACGTCCC GGGCTCTCTC TCTCTCTCT 409
【００２９】配列番号：３ 配列の長さ：４２５ 配列の形：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 起源： 生物名：Oryza sativa L. 組織の種類：緑葉 配列の特徴 特徴を示す記号：genomic ＤＮＡ 存在位置：1..425 配列： AGAGAGAGAG AGAGAGTCAT CAGACAGTGA ATCGAGCAAG CAACGCGAGG ACACGTACTT 60 ACGCACTCCA AATATTAAGG CGATCAGGCG ATCAGCAACT GCACTTTGCA AATTCGGCCG 120 ATGATAGCGT ATGCGTGATC AATTAACGTG TAATTCTTTT ACGTGTTCGT AAAAATAACT 180 AGATTGCATA TGCATGACAC CTACACACGT ACACGGTACA CACGATGGAT GGATGGATGG 240 ATGGATGGAT GGATGGATTG GGCGGCTCAC CGAACTGGCC TCCTCTCGCA CGCACGCACG 300 AAGGCAGGCA GCCAGCTAGC ATCGAGGACG TACGTCCGAG CCGGCGAACG GATCTCTCCC 360 GTGCAGCAAA GGCGTACGTA TCTCGTCGCG GCCGGCAAGA CGTCCCGGGC TCTCTCTCTC 420 TCTCT 425
【００３０】配列番号：４ 配列の長さ：２１ 配列の形：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列： ACGAGATACC GTACGCCTTT G 21
【００３１】配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の形：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列： AACGCGAGGA CACGTACTTA 20
【００３２】配列番号：６ 配列の長さ：１１３７ 配列の形：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 起源： 生物名：Oryza sativa L. 組織の種類：緑葉 配列の特徴 特徴を示す記号：genomic ＤＮＡ 存在位置：1..1137 配列： GAGGGAAGAG GAGGAAGAAG AAGAGGAAGA AGCTGGTGAC GGTGAAGCTG AGCGACGAGC 60 TGATGGGATA CCTGCGGACC AAGGAGGTGA TGCCCTACCT CGCGCGCGAG ACGCCTCGCC 120 CGCTCCCGAT CGATCCCAGC ATCGCGCACA CATGTTCATT GGCCAAGAAC TCAGGCAGGA 180 AATCGCCGCC CAAGTTCACG AGAACAGAGA ATTTGACGCC TTCGTCCTCT ACCAGTACCG 240 CACCAAGGGC TACGCCGAGA TCCAGCAGGA GGTCACCGAC GACGACGACG ACGACGGCTA 300 GAATCTGTAT GGTATGTTTG GGCAGGGATC GATAATGGTT TGGGGTTGGT GGTATGGAGG 360 AGTAATGCTT ATCTAAATAT TTACTAGGGT GGCTCTGCTG CTCATTATTT AGGATATAAT 420 TACCATGGAC AATGGTGTTA TTATGGCCAT ATCTTTGCTA CTCTCTCCGT TCCATAATAT 480 AAGATACAAC TATTTTTTAG GGGGACCACC TATACATTTG CCGATAAATT TTCTTCTGAA 540 AATTTGACAG ATGTAATTAT AGTACAATCG TAGTGTAATT ACACTGTAAC TTATATATAA 600 CTAGTAATAT GCCCGTGCTA AACGCTACGG GGTAATTATG TTTGTCTTTA ATAACATTTA 660 AAATTTCATG TTAGCAATTT TTTTTCTGTT AGCATAAGGT CGTCAATATA AACTCAAATA 720 ACAGTATGAT ATGATATAGA TATCTTAATA ATAGTTTCAC CATGTTAAAC AAGATAACAA 780 TTGTCGATCA TCTTGTTACG TCTTCTTTCA AGATATACAT GGAACAACTA CTAAAATTTG 840 CCAATGGCAA CAGTAAATAT TTAGTGAGAC ACAAGTGTTA ATATATAGTC ATGTTATCAG 900 TCCAGTGCAA ATTGACGCAT CTAGAACACG ATGGTATGGA GAAGATAATC TCACAATATT 960 ACACCTGAGT AGTGATGACG TGCTGTACAA AAACAAGAGG AAGTTGGTGA GTAACATTCC 1020 GATTAACAAT TTACTACCTT CTAAAATATA TTTTCGAATT AATTTTGATC ATGCGAACCT 1080 ACCTTTGCTC ACCAGTCAAG AACGTCTTTA TACACGTATT TCTGGTGCTC TTCCCTC 1137
【００３３】配列番号：７ 配列の長さ：２０ 配列の形：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列： TTGACGCCTT CGTCCTCTAC 20
【００３４】配列番号：８ 配列の長さ：２０ 配列の形：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列： AGACGTAACA AGATGATCGA 20
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 中村 淳 千葉県茂原市東郷1144番地 三井東圧化学 株式会社内 (72)発明者 藤村 達人 千葉県茂原市東郷1144番地 三井東圧化学 株式会社内
Claims (19)
- 【請求項１】 イネの稔性回復形質を判別する方法であ
って、以下の工程よりなる方法。 a) イネのＤＮＡを鋳型とし、プライマーを用いたＰＣ
Ｒ法により、該イネ遺伝子中の稔性回復遺伝子の共優性
のＤＮＡマーカーの有無を確認し、 b) a)の結果より該イネの稔性回復遺伝子の遺伝子型を
識別し、 c) よって、該イネの稔性回復形質を判別する。 - 【請求項２】 該共優性のＤＮＡマーカーがイネの稔性
回復遺伝子の近傍４．７センチモルガン以内に位置する
ものであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 共優性のＤＮＡマーカーが４０９ｂｐの
長さを有することを特徴とする請求項１或いは２に記載
の方法。 - 【請求項４】 共優性のＤＮＡマーカーが配列表の配列
番号２に記載のＤＮＡ配列を有することを特徴とする請
求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 共優性のＤＮＡマーカーが４２５ｂｐの
長さを有することを特徴とする請求項１或いは２に記載
の方法。 - 【請求項６】 共優性のＤＮＡマーカーが配列表の配列
番号３に記載のＤＮＡ配列を有することを特徴とする請
求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 共優性のＤＮＡマーカーの有無の確認
を、ＧＡＴＧの４塩基のヌクレオチド単位の繰り返しよ
りなるマイクロサテライトの長さに基づいて行うことを
特徴とする請求項３〜６の何れか一項に記載の方法。 - 【請求項８】 プライマーが配列番号２の１番〜２３２
番及び配列番号２の４０９番〜２３２番より任意に選ば
れる、プライマーとして必要な連続した任意の長さのオ
リゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１〜４
又は請求項７の何れか一項に記載の方法。 - 【請求項９】 プライマーが配列番号３の１番〜２３２
番及び配列番号３の４０９番〜２３８番より任意に選ば
れる、プライマーとして必要な連続した任意の長さのオ
リゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１、
２、５〜７の何れか一項に記載の方法。 - 【請求項１０】 プライマー１５〜３０塩基のオリゴヌ
クレオチドであることを特徴とする請求項８又は９に記
載の方法。 - 【請求項１１】 ｂ）の工程において、イネの稔性回復
遺伝子の遺伝子型を識別するに際して、ａ）の工程の結
果と共に、下記のｄ）の工程の結果を考慮することを特
徴とする、請求項８又は１０記載の方法。 d) イネのＤＮＡを鋳型とし、プライマーを用いたＰＣ
Ｒ法により、該イネ遺伝子中の稔性回復遺伝子の共優性
のＤＮＡマーカーｆＬ６０１の有無を確認する。 - 【請求項１２】 ｄ）の工程において使用されるプライ
マーが配列表の配列番号７及び８に記載のＤＮＡである
ことを特徴とする請求項１１記載の方法。 - 【請求項１３】 イネ稔性回復遺伝子から４．７センチ
モルガン以内に位置するイネ稔性回復遺伝子の共優性の
ＤＮＡマーカー。 - 【請求項１４】 共優性のＤＮＡマーカーが４０９ｂｐ
の長さを有することを特徴とする請求項１３に記載のＤ
ＮＡマーカー。 - 【請求項１５】 共優性のＤＮＡマーカーが配列表の配
列番号２に記載のＤＮＡ配列を有することを特徴とする
請求項１４に記載のＤＮＡマーカー。 - 【請求項１６】 共優性のＤＮＡマーカーが４２５ｂｐ
の長さを有することを特徴とする請求項１３に記載のＤ
ＮＡマーカー。 - 【請求項１７】 共優性のＤＮＡマーカーが配列表の配
列番号３に記載のＤＮＡ配列を有することを特徴とする
請求項１６に記載のＤＮＡマーカー。 - 【請求項１８】 配列表の配列番号４の配列を有するＤ
ＮＡプライマー。 - 【請求項１９】 配列表の配列番号５の配列を有するＤ
ＮＡプライマー。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8136502A JPH09313187A (ja) | 1996-05-30 | 1996-05-30 | イネの細胞質雄性不稔回復遺伝子の近傍に位置するｄｎａマーカーおよびｄｎａ診断法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8136502A JPH09313187A (ja) | 1996-05-30 | 1996-05-30 | イネの細胞質雄性不稔回復遺伝子の近傍に位置するｄｎａマーカーおよびｄｎａ診断法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09313187A true JPH09313187A (ja) | 1997-12-09 |
Family
ID=15176669
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8136502A Pending JPH09313187A (ja) | 1996-05-30 | 1996-05-30 | イネの細胞質雄性不稔回復遺伝子の近傍に位置するｄｎａマーカーおよびｄｎａ診断法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09313187A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002014506A1 (fr) * | 2000-08-17 | 2002-02-21 | Japan Tobacco Inc. | Procede d'estimation du genotype du locus de recuperation de fertilite affectant le cytoplasme de fertilite male de type bt du riz |
| WO2003027290A1 (fr) * | 2001-09-19 | 2003-04-03 | Japan Tobacco Inc. | Procede pour conferer ou reguler la fertilite d'un cytoplasme a sterilite male de riz bt au moyen d'un gene de restauration de la fertilite, et procede d'estimation de la presence d'un gene de restauration de la fertilite |
| WO2002077277A3 (en) * | 2001-03-26 | 2003-05-15 | Council Scient Ind Res | Dna markers for assessing seed purity and a method of using dna sequences for assessing seed purity |
| KR100435152B1 (ko) * | 2001-06-25 | 2004-06-14 | 대한민국 | Ｐｃｒ－ｒｆｌｐ를 이용한 양파세포질 웅성불임인자 판별방법 |
| US7544856B2 (en) | 2002-07-05 | 2009-06-09 | Japan Tobacco Inc. | Rice restorer gene to the rice BT type cytoplasmic male sterility |
-
1996
- 1996-05-30 JP JP8136502A patent/JPH09313187A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002014506A1 (fr) * | 2000-08-17 | 2002-02-21 | Japan Tobacco Inc. | Procede d'estimation du genotype du locus de recuperation de fertilite affectant le cytoplasme de fertilite male de type bt du riz |
| WO2002077277A3 (en) * | 2001-03-26 | 2003-05-15 | Council Scient Ind Res | Dna markers for assessing seed purity and a method of using dna sequences for assessing seed purity |
| KR100435152B1 (ko) * | 2001-06-25 | 2004-06-14 | 대한민국 | Ｐｃｒ－ｒｆｌｐ를 이용한 양파세포질 웅성불임인자 판별방법 |
| WO2003027290A1 (fr) * | 2001-09-19 | 2003-04-03 | Japan Tobacco Inc. | Procede pour conferer ou reguler la fertilite d'un cytoplasme a sterilite male de riz bt au moyen d'un gene de restauration de la fertilite, et procede d'estimation de la presence d'un gene de restauration de la fertilite |
| AU2002335163B2 (en) * | 2001-09-19 | 2008-07-10 | Japan Tobacco Inc. | Method of imparting or controlling fertility with the use of fertility restoring gene for rice BT-male sterility cytoplasm and method of judging the existence of fertility restoring gene |
| US7544856B2 (en) | 2002-07-05 | 2009-06-09 | Japan Tobacco Inc. | Rice restorer gene to the rice BT type cytoplasmic male sterility |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Saito et al. | Fine mapping of the clubroot resistance gene, Crr3, in Brassica rapa | |
| AU2016270918B2 (en) | Genetic locus associated with phytophthora root and stem rot in soybean | |
| EP2708607B1 (en) | Genetic markers for Myb28 | |
| US20220256795A1 (en) | Genetic loci associated with disease resistance in soybeans | |
| US20220025471A1 (en) | Markers linked to reniform nematode resistance | |
| CA3212460A1 (en) | Increased transformability and haploid induction in plants | |
| Chen et al. | A recessive gene controlling male sterility sensitive to short daylength/low temperature in wheat (Triticum aestivum L.) | |
| JPH09313187A (ja) | イネの細胞質雄性不稔回復遺伝子の近傍に位置するｄｎａマーカーおよびｄｎａ診断法 | |
| US20240090396A1 (en) | Clubroot resistance in brassica | |
| CN112218524B (zh) | 高粱细胞质雄性不育标记和基因座 | |
| US11319554B2 (en) | Cucumber mosaic virus resistant pepper plants | |
| WO2010025103A1 (en) | Compositions and methods for assaying markers tightly linked to resistance locus bs2 of pepper | |
| JP2000139465A (ja) | イネの細胞質雄性不稔回復遺伝子近傍に位置するｄｎａマーカーおよびこれを用いた細胞質雄性不稔回復遺伝子の判別方法 | |
| US10066271B2 (en) | Genetic loci associated with Mal de Rio Cuarto virus in maize | |
| AU2014386227B2 (en) | Markers linked to reniform nematode resistance | |
| TOMITA et al. | Screening of DNA markers suitable for purity test of inbred lines in Brassica oleracea | |
| WO2024015712A9 (en) | Novel loci in grapes | |
| US20140259232A1 (en) | Molecular markers associated with earliness in maize | |
| JP2000342266A (ja) | イネ雑種不稔座近傍に位置するｄｎａマーカー及びこれを用いた雑種不稔座の遺伝子型の判別方法 | |
| JP2000342267A (ja) | イネ雑種不稔座ｓ−５座近傍に位置するｄｎａマーカーおよびこれを用いたｓ−５座の遺伝子型の判別方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060411 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20060808 |