CN111019942A - 一种与桃果形性状共分离的染色体倒位及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与桃果形性状共分离的染色体倒位及其应用，涉及植物分子生物学技术。与桃果形性状共分离的染色体倒位近断点附近核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，远断点附近核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。利用倒位断点两侧核苷酸序列设计分子标记，用于育种中的标记辅助筛选，能提前筛选果形性状。所述的引物序列如SEQ ID NO.5、6……10所示。本发明具有下列优点和积极效果：①本发明揭示的S基因座大片段染色体倒位更有可能是导致桃果形发生扁平突变的关键原因；②本发明利用包含三对引物的分子标记能对个体果形性状做到精确判断或预测；③本发明找到的控制扁平果形的染色体倒位用于标记辅助选择，指导桃的杂交育种，能提前进行筛选，节约育种时间，提高育种效率。

Description

一种与桃果形性状共分离的染色体倒位及其应用

技术领域

本发明涉及植物分子生物学技术，属于基因组结构变异及其对植物表型影响的研究，尤其涉及一种与桃果形性状共分离的染色体倒位及其应用。

背景技术

桃是世界上最重要的果树之一，它大约在250万年之前起源于我国青藏高原西南部(Yu Y.et al.,Genome re-sequencing reveals the evolutionary history of peachfruit edibility.Nat Commun 2018；9：5404)。桃在我国的栽培和驯化可追溯到至少4000年前(Scorza R.and Okie W.R.,Peaches(Prunus).Acta Hortic 1991,290:177-234)，之后在罗马时期随丝绸之路传到了欧洲，现已成为温带地区的重要经济果树之一。桃的外部果实品质性状有着广泛的变异，其中无毛果皮(油桃)和扁平果形(蟠桃)是最显著、最重要的两个变异性状。由于蟠桃不仅果实大小和产量处于劣势，而且存在裂果问题，所以扁平果起初并不被人们认为是一个重要的性状，在西方国家的大多数育种项目中，扁形果实性状往往都被淘汰了(

R.et al.,Combining linkage and association mapping tosearch for markers linked to the flat fruit character in peach.Euphytica2013；190:279-288)。然而，蟠桃果实酸度相对较低、含糖量较高，具有风味佳等优点，近年来引起了人们广泛的关注。蟠桃原产于中国，因其名字象征着健康和长寿，故其在中国市场上颇受青睐。

桃属于蔷薇科，二倍体物种(2n＝16)，单倍体基因组小，约为230兆碱基对。桃果形包含园形和扁平形两种类型，该性状受单个位点(S)控制，遗传学研究将S位点定位与第6号染色体(Chr)的底部(Dirlewanger E.et al.,Genetic linkage map of peach[Prunuspersica(L.)Batsch]using morphological and molecular markers.Theor ApplGenet1998；97:888-895)。S位点与控制果重和产量的数量性状位点(QTLs)相邻，这就解释了为什么扁桃产量较低、果实较轻。此外，S位点还与控制果实败育、落果的QTL紧密相连，但目前尚不清楚果实败育和扁果性状是否由S位点的同一基因决定。

目前人们关于果形遗传基础的认识大多来自模式植物——番茄。番茄果实形态变异丰富，为全面研究控制果实形态的QTL提供了机会。迄今为止，已在番茄中鉴定出四个控制果实形状的候选基因：SUN、LOCULE NUMBER(LC)、FASCIATED(FAS)和OVATE，它们分别编码IQ67结构域蛋白、WUSCHEL同源结构域蛋白、YABBY转录因子和OVATE家族蛋白。其中，LC和FAS都控制着子房的数量，从而影响果实的形状(Cong B,et al.,Regulatory change inYABBY-like transcription factor led to evolution of extreme fruit size duringtomato domestication.Nat Genet 2008；40:800–804)，然而，SUN和OVATE都参与了果实伸长的调节。SUN是促进果实伸长的调节基因(Wu S.et al.,SUN regulates vegetative andreproductive organ shape by changing cell division patterns.PlantPhysiol2011；157:1175-1186)，而OVATE抑制生长的调节基因，使得果实变短(Jiping L.etal.,A new class of regulatory genes underlying the cause of pear-shapedtomato fruit.Proc Natl Acad Sci USA,2002；99:13302-13306)。番茄OVATE基因是植物中发现的第一个OVATE蛋白家族成员，该蛋白的C-末端有一个保守的70个氨基酸的OVATE结构域，也被称为DUF623结构域。最近的一项研究表明，西红柿的长果表型是由OVATE及其同源基因SLOFP20同时发生突变引起的(Wu S.et al.,A common genetic mechanismunderliesmorphological diversity in fruits and other plant organs.Nat Commun2018；9:4734)。

就桃而言，为了在杂交育种中开展分子标记辅助选择(MAS)，人们开发了与扁平果形连锁的简单序列重复(simple sequence repeat,SSR)标记(Dirlewanger E.et al.,Comparative mapping and marker-assisted selection in Rosaceae fruitcrops.Proc Natl Acad Sci USA 2004；101:9891-9896)，其中一个SSR标记(UDP98-412)预测扁平果表型的准确率95％以上(

R.et al.,Combining linkage andassociation mapping to search for markers linked to the flat fruit characterin peach.Euphytica 2013；190:279-288)。我国学者运用129份桃资源开展了全基因组关联分析(GWAS)研究，提出CAD1(ppa003772m)是控制桃扁平果形的候选基因，位于该基因内含子区的A/T单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)与扁平果形关联(CaoK.etal.,Genome-wide association study of 12agronomic traits in peach.NatCommun2016；7:13246)。随后国外研究指出LRR-RLK(Prupe.6g281100)是控制桃扁平果形的候选基因(López-Girona E.et al.,A deletion affecting an LRR-RLK gene co-segregates with the fruit flat shape trait in peach.Sci Rep-UK 2017；7:6714)。在蟠桃品种中，LRR-RLK基因发生了一个10kb左右大小(覆盖启动子和部分编码区)的缺失，对246个桃品种检测表明，该缺失与扁平果形性状共分离。然而，最近的一项研究表明，CAD1基因并非控制桃扁平果形的候选基因；同时扩大桃资源检测结果表明，与LRR-RLK基因相关的10Kb缺失与扁平果形不存在共分离现象(Guo J.et al.,Comparative transcriptomeand microscopy analyses provide insights into flat shape formation in peach(Prunus persica).Front Plant Sci 2018；8:2215)。因此，桃扁平果形的遗传基础仍不清楚，尚需进一步深入研究。

为此，我们利用第二代并结合第三代测序技术，开展蟠桃基因组结构变异研究，发现了一个与桃果形共分离的染色体倒位，这表明该倒位是导致桃扁平果形突变的核心变异，可以直接用于指导杂交育种，为桃果形性状的遗传改良提供了理论和技术支撑。

发明内容

本发明的目的就在于提供一种与桃果形性状共分离的染色体倒位及其应用。

本发明的目的是这样实现的：

一、与桃果形性状共分离的染色体倒位

本发明选用蟠桃品种‘124蟠’为试材，利用第二代Illumina和第三代PacBio技术对其基因组进行重测序和组装，然后将获得的蟠桃基因组草图与桃参考基因组(园桃‘Lovell’，v2.0)进行比较，结果发现S位点包含两种单倍体型(命名为H1和H2)，其中H2包含一个长达1.67Mb的染色体倒位，而H1没有倒位。

H2单倍体型中：

倒位近端断点两侧的部分序列如SEQ ID NO.1所示(简称为PanPB)，

倒位远端断点两侧的部分序列如SEQ ID NO.2所示(简称为PanDB)；

H1单倍体型中：

对应PanPB的等位序列如SEQ ID NO.3所示(简称为RefPB)，

对应PanDB的等位序列如SEQ ID NO.4所示(RefDB)。

在此基础上，进一步通过遗传学研究证实了该倒位与果形性状存在关联性，具体如下：

1、基于Illumina重测序reads的验证：从NCBI SRA数据库下载了610份桃资源基因组Illumina重测序数据库，包含了508份栽培品种和102份野生种。在栽培品种汇中蟠桃32份，园桃476份。通过序列比对鉴定覆盖倒位断点的reads，结果表明：1)所有蟠桃栽培品种覆盖断点的reads既有属于H1单倍体型的，也有属于H2单倍体型的；2)1个蟠桃野生种新疆蟠桃2号覆盖断点的reads都属于H2单倍体型的；3)所有园桃品种覆盖断点的reads都属于H1单倍体型的，没有属于H2单倍体型的。可见，S位点的染色体倒位与扁平果形关联。

2、基于PCR的分子标记验证：利用PanPB、PanDB以及他们的等位序列RefPB和RefDB设计PCR引物，对三个杂交F₁群体进行基因型检测，结果发现：1)2个园桃×蟠桃杂交后代都包含H1H1和H1H2两种基因型的个体，果形分别为园形和扁平形；2)在蟠桃×蟠桃杂交后代中，存在H1H1、H1H2、H2H2三种基因型，其中H1H1和H1H2个体的果形分别为园形和扁平形，而H2H2个体没有成熟的果实。此外，还利用分子标记对259份品种资源进行了检测，结果发现：所有的蟠桃品种(72份)的基因型都为H1H2，而所有园桃品种(187份)的基因型都为H1H1。分子标记结果也证实了S位点的染色体倒位与扁平果形关联。

上述结果表明，S位点的染色体倒位与扁平果形是完全共分离的，可能是导致桃扁平果形的核心变异序列。

二、与桃果形性状共分离的染色体倒位的应用

根据S位点的染色体倒位断点两侧的核苷酸序列(对应于H2单倍体型)及其对应的无倒位的等位核苷酸序列(对应于H1单倍体型)，设计三对分子标记P1F/P1R、P2F/P2R和P3F/P3R(引物序列如SEQ ID NO.5、6……10所示)，其中P1F/P1R用于检测H1单倍体型，而P2F/P2R和P3F/P3R用于检测H2单倍体型，这套标记用于育种中的标记辅助筛选，能提前鉴定筛选果形性状。

利用上述三对引物对检测个体基因组DNA进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测，发现检测个体可分为下列三种类型：

1)只包含H1一种单倍体型的个体，所结果实形状为园形；

2)包含H1、H2两种单倍体型的个体，所结果实形状为扁平形；

3)只包含H2一种单倍体型的个体，没有成熟的果实(花后幼果败育、掉落)。

因此，这三对引物组成了一套完整的分子标记，可用于杂交后代的果形性状的分子标记辅助选择。

与现有的方法相比，本发明具有下列优点和积极效果：

①本发明揭示的S基因座大片段染色体倒位可以很好地解释前人的一个发现：S位点的LD(连锁不平衡)的衰变速度较慢(Aranzana M.J.et al.,Genetic variation,population structure and linkage disequilibrium in peach commercialvarieties.BMC Genet 2010；11：69-69)。染色体倒位在抑制杂合子重组中起着重要作用。大片段倒位杂合子在倒位区常出现姊妹染色体配对问题，导致重组频率降低，故包含大片段倒位的染色体区域的LD衰变速度较慢(Hoffmann A.A.and Rieseberg L.H.,Revisitingthe impact of inversions in evolution:from population genetic markers todrivers of adaptive shifts and speciation？Annu Rev Ecol Evol Syst 2008；39:21-42)。这可以解释在S基因座上存在一个大的LD区段(LD block)，导致DNA标记或基因(包括PpCAD1和PpLRR-RLK)在倒位区内或靠近倒位区与扁平果性状共分离。这也说明了本发明的染色体倒位与前人报道的位于的PpCAD1和PpLRR-RLK基因内部的SNP或Indel相比，更有可能是导致桃果形发生扁平突变的关键原因。

②本发明利用包含三对引物的分子标记能对个体果形性状做到精确判断或预测，不仅与前人报道的位于PpCAD1基因内部的SNP标记以及位于PpLRR-RLK基因上的大片段缺失的检测更快速、更容易，而且检测结果更可靠。

③本发明找到的控制扁平果形的染色体倒位用于标记辅助选择，指导桃的杂交育种，能提前进行筛选，节约育种时间，提高育种效率。

附图说明

图1是联合分析Illumina二代和Pacbio三代重测序获得的蟠桃品种‘124蟠’基因组变异图谱，其中：

A代表基因组，B代表单碱基多态性(SNP)，C和D代表染色体倒位，E代表缺失，F代表插入；

结果表明在S位点附近存在一个较大的染色体倒位(～1.7Mb)。

图2是对S位点倒位区域的详细展示，其中：

H1和H2分别代表源自圆桃和扁平桃的单倍体型。

图3是利用S位点倒位现象开发的分子标记对杂交群体进行遗传分型的部分结果示意图，其中：

上图是对园桃×蟠桃杂交(‘沙红’ב燕蟠’)后代的部分分型结果；

下图是对蟠桃×蟠桃杂交(‘神农蟠桃’ב燕蟠’)后代的部分分型结果；

分型结果表明S位点倒位在杂交后代中与扁平桃性状连锁。

图4是利用S位点倒位现象以及NCBI sra数据库下载的桃重测序数据对不同桃资源进行基因分型的示意图：

将原始reads比对参考基因组后，对断点区域进行分析，对跨过断点和分裂比对的reads进行统计，从而判断基因型；

基于该方法我们共检测了610份桃资源，结果见‘发明内容’部分。

图5是利用S位点倒位现象开发的分子标记对栽培桃资源进行遗传分型的部分结果示意图：

其中甬道分别代表：1，晚蜜；2，瑞蟠18号；3，深红；4，红映霜；5，中桃3号；6，安农水蜜；7，中国沙红1号；8，春雪；M，DNA ladder；9，瑞蟠18号；10，房山蟠桃；11，玉霞蟠桃；12,124蟠桃；13，早露蟠桃；14，明月蟠桃；15，长生蟠桃；16，肉蟠桃。

分型结果表明S位点倒位在栽培桃资源中与扁平桃性状完全连锁；利用该分子标记对共计259份品种资源进行了检测，结果发现：所有的蟠桃品种(72份)的基因型都为H1H2，而所有园桃品种(187份)的基因型都为H1H1。

图6是S位点所有差异位点与果形的相关性分析：

利用Illumina二代和Pacbio三代重测序获得的变异信息，对NCBI下载的517份桃重测序数据开展差异位点与果形的相关性分析；

结果表明只有1.7Mb的倒位与果形的相关性系数为1。

具体实施方式

下面结合实施例详细说明：

实施例1，Illumina二代重测序文库构建和数据处理

文库制备：首先使用CTAB法从叶片中提取高质量基因组DNA(Porebski etal.1997),检测合格后按照Illumina标准建库方案实施，包括样品质量检测、文库构建、文库质量检测和文库测序等流程。样品基因组DNA检测合格后，用机械打断的方法(超声波)将DNA片段化，然后对片段化的DNA进行片段纯化、末端修复、3′端加A、连接测序接头，再用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，进行PCR扩增形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用Illumina进行测序。然后对测序得到的原始reads(双端序列)进行质量评估并过滤得到Clean Reads，用于后续生物信息学的分析。

数据处理：将Clean Reads与参考基因组序列进行比对，最后，基于比对结果进行SNP、InDel等变异检测和注释，并实现DNA水平差异基因挖掘和差异基因功能注释等。软件信息如下：质控，fastp软件；与参考基因组比对，bwa软件；SNP检测，GATK软件。

实施例2，Pacbio三代重测序文库构建和数据处理

文库构建：检测合格的DNA样品通过Covaris超声波破碎仪随机打断成片段；利用磁珠富集、纯化大片段DNA；片段化的DNA进行，损伤修复，末端修复；在DNA片段两端连接茎环状测序接头，并利用外切酶去除连接失败的片段。构建好的文库通过Pacbio Sequel进行测序。

数据处理：使用MaSuRCA软件，用Illumina二代测序数据对PacBio三代数据进行纠错。有效的高质量测序数据通过ngmlr软件(参数：-t 4)比对到参考基因组。利用SAMTOOLs(mpileup-m 2-F 0.002-d 1000)检测长度小于50bp的小片段插入与缺失(InDel)，然后用ANNOVAR软件对检测出的InDel进行注释。使用BreakDancer软件完成SV检测。变异位点的展示使用Circos软件完成。

实施例3，S位点染色体倒位分子标记的开发

根据S位点染色体倒位断点信息，我们设计了P1F/P1R、P2F/P2R和P3F/P3R三对引物用于筛选鉴定扁平桃性状，它们分别能够扩增RefPB、PanPB和PanDB区域。引物序列如SEQID NO.5、6……10所示。

PCR酶选用擎科生物金牌Mix(green)，循环内退火温度58℃，延伸时间30s，共35个循环。待PCR结束使用1％的琼脂糖胶电泳。

序列表

<110> 中国科学院武汉植物园

<120> 一种与桃果形性状共分离的染色体倒位及其应用

<130> 2019-12-9

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 730

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gagggctcga tgacgtagaa catatatccg cagattctgg attttgcagt ggtcgccatt 60

gtcatgtaat gtaatgtaaa gaagctgagc tctcagctat agtttggtaa gcaagacaca 120

ggtcacacaa gggtaggggg gcaacaacta gctctatata attcgtttta taaaaatctt 180

ccacgtgtgg catgcttaaa cagtttcttt gtttttttct tttcttcctt acgtggctat 240

ctagccgtgt attattgttg atttgatttc tcatcgacaa atatataaca atttgggttg 300

gtaagaataa tgaatggttt gtgcccaaaa aattgactgg tcaactgatc gtattagatt 360

aatctacatg tgaaaacttg cactaaatgc aaagaatttt aatctatatt aacaaattgt 420

tgattgagac gagaagatga tgaattctct caacacacaa taatatataa aaaaagtgct 480

acaaacttta tgtaaatgga ttactcaaag gacaaagaaa atataaaggc atttagaccc 540

aagtatgcca aaaaattatt cactcactaa aaataaaaat aaaaggaatg gaccagatgc 600

atgcatgatg cattttgaaa agcttggttg gtgcttccca atgtctcagt cgagcttaaa 660

ttgggtagac aaggccatgg aatcaaattg gcacagaggc acttgggtcc ttgtgcacag 720

aaagaaataa 730

<210> 2

<211> 812

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taaaagaata taaaatcctc cataaaccga cttcaacgag aatcgaactt tagcgctacg 60

ttaaatggag aagcactgga accaactcca ccaaacacac ccctatgcaa atgtctagca 120

cgctatacta tatatatata tataatatat ataaaaaaat ttcggaagcc cttaagaatc 180

ggagacccta tacggtggca ccacttgcgc caccccaggg cctcccctga atccaattgg 240

tttgttttta tttaagtgtg ttcatatata gtataccaat ctctactata aaatttatca 300

tagaccttat aagtttgtgt tttacgagtg cttctagaag gtccaagtgc ttatgaatca 360

aaaaaaacat tttctaaaaa agcacctaac aatatagtaa tatcagtacc cacaatttgt 420

gtctctgaaa acattctttt tgatgcgtcg agctataatg gaattgagtc aatatcattt 480

taacgatcaa attttattgt ttttcattat aattgtcttt caaactaacc aaaaataatc 540

tgaaaataaa tacaatgtta agagagtaaa taagaatcca attctcatca taattgtaca 600

gaataataaa gcacatcata ttatgaattg tagcttagtg gaaaaaaaaa aaggactttt 660

tgctatataa agaaatatat ttgacattca tagtggatga aagcgtgagt aaaaacccaa 720

ggataaaagc gcatgggtta atcggattac ccagtggtaa aactttctct ctcttcccat 780

ggtggcggag gctgactggg catcagggcc ag 812

<210> 3

<211> 794

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagggctcga tgacgtagaa catatatccg cagattctgg attttgcagt ggtcgccatt 60

gtcatgtaat gtaatgtaaa gaagctgagc tctcagctat agtttggtaa gcaagacaca 120

ggtcacacaa gggtaggggg gcaacaacta gctctatata attcgtttta taaaaatctt 180

ccacgtgtgg catgcttaaa cagtttcttt gtttttttct tttcttcctt acgtggctat 240

ctagccgtgt attattgttg atttgatttc tcatcgacaa atatataaca atttgggttg 300

gtaagaataa tgaatggttt gtgcccaaaa aattgactgg tcaactgatc gtattagatt 360

aatctacaag agacacaaat tgtgggtact gatattacta tattgttagg tgctttttta 420

gaaaatgttt tttttgattc ataagcactt ggaccttcta gaagcactcg taaaacacaa 480

acttataagg tctatgataa attttatagt agagattggt atactatata tgaacacact 540

taaataaaaa caaaccaatt ggattcaggg gaggccctgg ggtggcgcaa gtggtgccac 600

cgtatagggt ctccgattct taagggcttc cgaaattttt ttatatatat tatatatata 660

tatatagtat agcgtgctag acatttgcat aggggtgtgt ttggtggagt tggttccagt 720

gcttctccat ttaacgtagc gctaaagttc gattctcgtt gaagtcggtt tatggaggat 780

tttatattct ttta 794

<210> 4

<211> 750

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttctttcttt ctgtgcacaa ggacccaagt gcctctgtgc caatttgatt ccatggcctt 60

gtctacccaa tttaagctcg actgagacat tgggaagcac caaccaagct tttcaaaatg 120

catcatgcat gcatctggtc cattcctttt atttttattt ttagtgagtg aataattttt 180

tggcatactt gggtctaaat gcctttatat tttctttgtc ctttgagtaa tccatttaca 240

taaagtttgt agcacttttt tttatatatt attgtgtgtt gagagaattc atcatcttct 300

cgtctcaatc aacaatttgt taatatagat taaaattctt tgcatttagt gcaagttttc 360

acatgtaaac attctctttg atgcgtcgag ctataatgga attgagtcaa tatcatttta 420

actatcaaat tttattgttt ttcattataa ttgtctttca aactaaccaa aaataatctg 480

aaaataaata caatgttaag agagtaaata agaatccaat tctcatcata attgtacaga 540

ataataaagc acatcatatt atgaattgta gcttagtgga aaaaaaaaaa ggactttttg 600

ctatataaag aaatatattt gacattcata gtggatgaaa gcgtgagtaa aaacccaagg 660

ataaaagcgc atgggttaat cggattaccc agtggtaaaa ctttctctct cttcccatgg 720

tggcggaggc tgactgggca tcagggccag 750

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 用于检测检测H1单倍体型(RefPB的正向引物P1F)

<400> 5

cgcatcttga gcgaaacc 18

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 用于检测检测H1单倍体型(RefPB的反向引物P1R)

<400> 6

gaaggtccaa gtgcttatga atc 23

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 用于检测检测H2单倍体型(PanPB的正向引物P2F)

<400> 7

cgcatcttga gcgaaacc 18

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 用于检测检测H2单倍体型(PanPB的反向引物P2R)

<400> 8

cgactgagac attgggaagc 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 用于检测检测H2单倍体型(PanDB的正向引物P3F)

<400> 9

tggaaccaac tccaccaaac a 21

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 用于检测检测H2单倍体型(PanDB的反向引物P3R)

<400> 10

tccattatag ctcgacgcat ca 22

Claims (2)

1.一种与桃果形性状共分离的染色体倒位，其特征在于：

近断点附近核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，远断点附近核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.按权利要求1所述与桃果形性状共分离的染色体倒位的应用，其特征在于：

利用倒位断点两侧核苷酸序列设计分子标记，用于育种中的标记辅助筛选，能提前筛选果形性状；

所述的引物序列如SEQ ID NO.5、6……10所示。

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