CN117721223B - 虾夷扇贝积累类胡萝卜素相关的InDel分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种虾夷扇贝积累类胡萝卜素相关的InDel分子标记及其应用，属于分子育种技术领域。所述InDel分子标记在积累类胡萝卜素虾夷扇贝中所在的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述InDel分子标记在普通虾夷扇贝中所在的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；用于扩增虾夷扇贝积累类胡萝卜素相关的InDel分子标记的引物对，上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物序列如SEQ ID NO.4所示。本发明通过检测所述InDel分子标记，可以便捷、快速的在苗种期和亲本中筛选纯合的积累类胡萝卜素的虾夷扇贝个体，为“海大金贝”的选育以及性状的优化提供了有效技术支持。
Description
技术领域
本发明属于分子育种技术领域，具体涉及一种虾夷扇贝积累类胡萝卜素相关的InDel分子标记及其应用。
背景技术
类胡萝卜素是一类普遍存在的，呈现黄色、红色及橙色的多烯化合物，是重要的维生素A原和抗氧化剂。食用类胡萝卜素可降低癌症、心血管疾病和肥胖的发生率，同时有效抑制白内障和黄斑病变的产生。动物只能从食物中获得而不能够从头合成类胡萝卜素，因此研究类胡萝卜素的吸收、代谢及生物利用效率具有重要的意义。同时，类胡萝卜素的经济价值不断上升，2023年度全球类胡萝卜素市场价值达18.4亿美元，预计在未来五年将以4.64%的复合年增长率增长（https://www.mordorintelligence.com）。
虾夷扇贝（Patinopecten yessoensis）属于冷水性双壳贝类，自然分布于日本北部、俄罗斯远东水域以及朝鲜半岛北部沿海，1982年由日本引进中国，是世界上品质最为优良的增养殖种类之一。2003年，在虾夷扇贝野生群体中发现了少数闭壳肌呈现鲜艳橘红色的突变个体，而普通虾夷扇贝野生个体的闭壳肌则呈现白色。经统计，虾夷扇贝闭壳肌呈现橘红色是一种比例极小的突变现象，突变比例约占0.2%。常规选育的结果表明：（1）闭壳肌颜色这一性状为可稳定遗传的质量性状；（2）橘红色闭壳肌虾夷扇贝生长速度较对照组具有明显优势；（3）抗逆性实验证明，颜色突变体虾夷扇贝的抗逆性较对照组高，表现出良好的抗逆性。经过选育得到了富含类胡萝卜素的虾夷扇贝新品种，命名为“海大金贝”。
在实际选育过程中，闭壳肌富集类胡萝卜素的性状在成贝期易于通过表型观察，但是在苗种期，因闭壳肌富集的类胡萝卜素较少，难以通过观察和含量检测鉴定，增加了苗种鉴定和定向选育的困难。另外，在“海大金贝”群体中会产生回复突变的白色闭壳肌扇贝，不利于维持“海大金贝”种群遗传稳定。开发虾夷扇贝积累类胡萝卜素相关分子标记，可以方便、快捷地筛选纯合的积累类胡萝卜素的扇贝苗种，并在“海大金贝”群体中剔除回复突变的白色闭壳肌扇贝，提高育种效率同时可用于维持海大金贝的种群质量。
发明内容
本发明的目的提供一种虾夷扇贝积累类胡萝卜素相关的InDel分子标记，还提供了该InDel分子标记的具体应用，以弥补现有技术的不足。
为实现上述目的，本发明采取的具体技术方案为：
一种虾夷扇贝积累类胡萝卜素相关的InDel分子标记，该分子标记位于虾夷扇贝Chr8染色体第23111924位碱基；所述InDel分子标记在积累类胡萝卜素虾夷扇贝中所在的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述InDel分子标记在普通虾夷扇贝中所在的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述InDel分子标记位于SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2核苷酸序列的第99位，该处的碱基为TACGT（ALT型，用1表示）或T（REF型，用0表示）。
一种用于扩增虾夷扇贝积累类胡萝卜素相关的InDel分子标记的引物对，上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物序列如SEQ ID NO.4所示。
所述虾夷扇贝积累类胡萝卜素相关的InDel分子标记或用于扩增虾夷扇贝积累类胡萝卜素相关的InDel分子标记的引物对在积累类胡萝卜素虾夷扇贝品种选育中的应用；比如在“海大金贝”品种选育中应用。
一种积累类胡萝卜素虾夷扇贝选育方法，包括以下步骤：
（1）对待检测虾夷扇贝进行取样，在小规格苗种期取整个软体组织，用于该群体苗种的鉴定；在大规格苗种期，取鳃丝进行无损取样，用于苗种的定向选育；在成贝期，同样取鳃丝进行无损取样，用于亲本的选择；样品取材后，置于酒精中备用；
（2）利用酚氯仿法提取待测个体DNA，用Nanodrop和1％琼脂糖凝胶检测提取DNA样品的浓度及纯度，保存于-20℃冰箱备用。
（3）以待测样品DNA为模板，使用SEQ ID NO.3~4所示的序列为引物进行PCR扩增，获得PCR产物；
（4）对PCR产物进行Sanger测序，确定InDel位点在待测个体中的基因型；
（5）若基因分型结果表现为1/1型，该个体为富集类胡萝卜素的虾夷扇贝个体；若基因分型结果表现为0/0型，该个体为不富集类胡萝卜素的普通虾夷扇贝个体。
所述InDel分子标记在为富集类胡萝卜素的“海大金贝”群体中的基因型频率与在普通虾夷扇贝中的基因型频率存在显著差异，可以有效区分积累和不积累类胡萝卜素的虾夷扇贝，以实现对“海大金贝”的选育。
与现有技术相比，本发明的优点和有益成果在于：
本发明提供了与虾夷扇贝类胡萝卜素相关的InDel分子标记和相应的引物组合，并通过检测所述InDel分子标记，可以便捷、快速的在苗种期和亲本中筛选纯合的积累类胡萝卜素的虾夷扇贝个体，为“海大金贝”的选育以及性状的优化提供了有效技术支持。
附图说明
图1为普通白色闭壳肌虾夷扇贝和橘红色闭壳肌“海大金贝”的总类胡萝卜素含量比较结果。
图2为富集类胡萝卜素的“海大金贝”的选育结果。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。以下实施例是对本发明的进一步说明，而非对本发明的限制。
实施例1：
一种虾夷扇贝积累类胡萝卜素相关的InDel分子标记的鉴定方法，包括以下步骤：
（1）实验所用的虾夷扇贝个体取自辽宁省大连市獐子岛养殖场，共63只，包括42只普通白色闭壳肌虾夷扇贝和21只橘红色闭壳肌“海大金贝”。经检测，“海大金贝”总类胡萝卜素含量显著高于普通虾夷扇贝（如图1所示）；
（2）利用酚氯仿提取法提取步骤（1）中所取个体闭壳肌组织的全基因组DNA，并构建全基因组重测序文库，送天津诺禾致源公司进行二代测序；
（3）对下机后的重测序数据进行质控分析，获得高质量的数据用于后续分析；利用BWA软件的MEM算法将高质量数据比对到虾夷扇贝参考基因组中，利用Samtools工具、Picard软件以及GATK软件HaplotypeCaller命令分别对数据进行排序、去重复序列、以及变异位点检测分型，获得普通虾夷扇贝和“海大金贝”每个个体的基因型数据；
（5）计算变异位点基因型频率在普通虾夷扇贝和“海大金贝”群体中的差异；如表1所示，虾夷扇贝Chr8染色体第23111924位碱基处鉴定得到一个InDel位点，该位点的基因型频率在“海大金贝”和普通虾夷扇贝群体中存在显著差异（P=2.45e-13），可作为虾夷扇贝类胡萝卜素积累相关的分子标记。
表1 InDel分子标记在普通虾夷扇贝和“海大金贝”群体的基因型频率
P geno，两种扇贝基因型频率差异性的p值。
实施例2：
本发明中的虾夷扇贝积累类胡萝卜素相关的InDel分子标记在虾夷扇贝群体中的验证及其辅助“海大金贝”选育的方法，包括下列步骤：
（1）针对所定位到的InDel位点（见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2），见表2，开发出相应的引物对（见SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4），对InDel分子标记的可靠性在虾夷扇贝群体中进行验证。引物信息如表3所示。
表2 虾夷扇贝类胡萝卜素积累相关InDel分子标记序列信息
表3 引物信息
（2）随机选取虾夷扇贝92只，利用Sanger测序对上述的InDel位点进行基因型分型检测。包括以下步骤：
1）提取待测扇贝个体的基因组DNA；
2）以步骤1）获取的基因组DNA作为模板，以SEQ ID NO.3~4所示的核苷酸序列作为引物进行PCR扩增，获得每个扇贝个体的PCR扩增产物；
3）对步骤2）获得的PCR扩增产物进行Sanger测序，确定待测每个扇贝个体在该位点处的基因型；
4）统计该InDel位点在普通虾夷扇贝和“海大金贝”群体中的基因型频率；
5）结合测序结果和表型性状，发现当InDel位点基因分型结果为0/0型时，该个体为普通虾夷扇贝个体；当InDel位点基因分型结果为1/1型时，该个体为“海大金贝”个体。
（3）辅助“海大金贝”选育和种质维持的方法
1）随机挑选50~100只待检测虾夷扇贝，在小规格苗种期取整个软体组织；在大规格苗种期取鳃丝进行无损取样；在成贝期，同样取鳃丝进行无损取样；
2）利用酚氯仿提取法提取样品DNA作为模板，并使用SEQ ID NO.3~4所示的核苷酸序列为引物进行PCR扩增，获取PCR扩增产物；对PCR扩增产物进行Sanger测序，确定每个扇贝个体基因型；
3）剔除基因分型结果为纯合0/0型和杂合0/1型的扇贝个体，保留分型结果为1/1型的扇贝个体。
利用以上所述的方法对虾夷扇贝进行鉴定和筛选，即可筛选出富集类胡萝卜素“海大金贝”个体，图2所示的即为筛选后的“海大金贝”亲本。该实施例说明了利用本发明筛选得到的InDel位点进行类胡萝卜素积累虾夷扇贝品种选育的有效性。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种虾夷扇贝积累类胡萝卜素相关的InDel分子标记，其特征在于，该InDel分子标记为 SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列自5’端起第99-103位碱基为TACGT/T；其中，SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第99-103位碱基为TACGT，基因分型为ALT型，用1表示；或SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第99-103位碱基为T，基因分型为REF型，用0表示。
2. 如权利要求 1 所述的一种虾夷扇贝积累类胡萝卜素相关的 InDel 分子标记，其特征在于，所述虾夷扇贝积累类胡萝卜素相关的 InDel 分子标记的引物对包括：上游引物序列如 SEQ ID NO.3 所示，下游引物序列如 SEQ ID NO.4 所示。
3. 权利要求 1 所述虾夷扇贝积累类胡萝卜素相关的 InDel 分子标记在积累类胡萝卜素虾夷扇贝品种选育中的应用。
4. 如权利要求 3 所述的应用，其特征在于，该应用具体为一种积累类胡萝卜素虾夷扇贝选育方法，包括以下步骤：
（1）对待检测虾夷扇贝进行取样，在小规格苗种期取整个软体组织，用于群体苗种的鉴定；
在大规格苗种期，取鳃丝进行无损取样，用于苗种的定向选育；在成贝期，同样取鳃丝进行
无损取样，用于亲本的选择；样品取材后，置于酒精中备用；
（2）提取待测个体 DNA，检测提取 DNA 样品的浓度及纯度，保存备用；
（3）以待测样品 DNA 为模板，使用 SEQ ID NO.3~4 所示的序列为引物进行 PCR 扩增，获得 PCR 产物；
（4）对 PCR 产物进行 Sanger 测序，确定 InDel 位点在待测个体中的基因型；
（5）若基因分型结果表现为 1/1 型，该个体为富集类胡萝卜素的虾夷扇贝个体；若基因分型结果表现为 0/0 型，该个体为不富集类胡萝卜素的普通虾夷扇贝个体；
（6）选择基因分型结果表现为 1/1 型的虾夷扇贝个体进行继续培养。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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