CN116694785B - 一种豹纹鳃棘鲈的生长相关snp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种豹纹鳃棘鲈的生长相关SNP分子标记及其应用，包括75个SNP分子标记及一个与生长显著相关的基因型组合，其可用于豹纹鳃棘鲈分子标记辅助育种，加快选育具有优良生长性状的豹纹鳃棘鲈品种，为豹纹鳃棘鲈的选育工作提供参考依据。
Description
技术领域
本发明属于水产生物育种领域，特别涉及一种豹纹鳃棘鲈的生长相关SNP分子标记及其应用。
背景技术
豹纹鳃棘鲈（Plectropomus leopardus）俗称东星斑，隶属于鲈形目，鲈亚科，鮨科，石斑鱼亚科，鳃棘鲈属，广泛分布于西太平洋，在日本和澳洲也有少量分布，其营养价值高，肉质鲜美，具有广阔的市场前景。东星斑已被列为国家二级保护动物，不能通过捕捞野生个体补充亲本资源。虽然现阶段东星斑已实现人工繁育，但国内主要由养殖户或企业进行逐代筛选培育，其种质改良的遗传基础亟待开展深入的研究。
在生产中，提高畜牧产品、水产品等的生长速率、缩短其生长所需时间、增加产量是畜牧业和水产养殖业最关心的问题，因而对经济物种生长调控机制的研究是养殖业领域的重要课题之一，生长过程受自身遗传和外部环境等多种因素影响，目前已有很多研究表明基因遗传对于生物生长性状起到十分重要的作用。
分子标记辅助育种是一种根据与特定性状紧密连锁的标记出现来推断和选择个体的育种方法。与传统的基于表型选择不同，分子标记辅助育种在DNA水平进行选择，因此具有更高的准确性。它能够在早期识别具有优良性状的个体，筛选出优秀的亲本，从而加速育种进程并缩短育种周期。在豹纹鳃棘鲈的育种中，人们希望通过选择与生长性状密切相关的分子标记以实现早期选种和提高育种准确性的目标。SNP分子标记具有共显性、二态性和广泛分布等多个优点，被认为是目前最有效的分子辅助育种标记方法，并广泛应用于动物的选择育种中。然而，对于豹纹鳃棘鲈育种而言，仍需进一步挖掘与生长性状相关的SNP分子标记，以实现更好的育种效果。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明提供豹纹鳃棘鲈生长相关SNP位点信息，对同一东星斑群体快速生长个体和慢速生长个体进行全基因组重测序，对重测序数据利用单倍型参考面板进行数据填充后进行全基因组关联分析，筛选出与生长相关的SNP位点及其分型信息，基于多种参数获得具有育种价值的分子标记及其组合型，并设计相关分子标记的特异性检测引物，以此可以快速准确的对生长相关位点进行检测，为后续培育具有优良生长性状的东星斑品种提供技术支持。
本发明技术方案如下：
本发明的目的之一是提供一种豹纹鳃棘鲈的生长相关SNP分子标记，包括以下75个SNP分子标记中的至少一个：
第 1 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈9号染色体的3779548bp处，其等位基因为G和A；
第 2 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈10号染色体的29219664bp处，其等位基因为A和G；
第 3 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈12号染色体的7535493bp处，其等位基因为T和A；
第 4 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈17号染色体的22143831bp处，其等位基因为T和C；
第 5 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈17号染色体的20653614bp处，其等位基因为A和C；
第 6 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈17号染色体的22147381bp处，其等位基因为T和C；
第 7 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈22号染色体的12860635bp处，其等位基因为G和T；
第 8 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈6号染色体的13882392bp处，其等位基因为G和A；
第 9 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈21号染色体的1121970bp处，其等位基因为G和A；
第 10 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈17号染色体的22328402bp处，其等位基因为A和G；
第 11 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈17号染色体的20119282bp处，其等位基因为T和A；
第 12 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈17号染色体的22032636bp处，其等位基因为A和C；
第 13 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈17号染色体的22316930bp处，其等位基因为T和C；
第 14 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈22号染色体的13185805bp处，其等位基因为T和G；
第 15 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈17号染色体的22125635bp处，其等位基因为T和C；
第 16 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈14号染色体的25399640bp处，其等位基因为T和C；
第 17 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈22号染色体的5549055bp处，其等位基因为C和A；
第 18 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈10号染色体的15026275bp处，其等位基因为A和T；
第 19 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈12号染色体的3579573bp处，其等位基因为T和C；
第 20 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈22号染色体的5549084bp处，其等位基因为C和A；
第 21 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈17号染色体的21422217bp处，其等位基因为T和C；
第 22 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈17号染色体的22336244bp处，其等位基因为A和G；
第 23 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈17号染色体的22314982bp处，其等位基因为T和A；
第 24 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈17号染色体的21538836bp处，其等位基因为T和G；
第 25 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈2号染色体的15194119bp处，其等位基因为G和C；
第 26 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈14号染色体的33290172bp处，其等位基因为A和G；
第 27 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈14号染色体的33290365bp处，其等位基因为A和T；
第 28 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈14号染色体的33290385bp处，其等位基因为T和C；
第 29 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈8号染色体的2042439bp处，其等位基因为A和G；
第 30 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈22号染色体的6248248bp处，其等位基因为A和G；
第 31 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈4号染色体的28099915bp处，其等位基因为A和C；
第 32 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈4号染色体的28881659bp处，其等位基因为A和C；
第 33 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈17号染色体的21539730bp处，其等位基因为G和A；
第 34 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈17号染色体的21538937bp处，其等位基因为A和T；
第 35 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈17号染色体的22207287bp处，其等位基因为A和T；
第 36 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈17号染色体的22207288bp处，其等位基因为A和C；
第 37 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈17号染色体的21537423bp处，其等位基因为C和G；
第 38 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈18号染色体的10489742bp处，其等位基因为C和A；
第 39 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈17号染色体的21537770bp处，其等位基因为C和A；
第 40 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈22号染色体的5353338bp处，其等位基因为G和A；
第 41 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈17号染色体的21538704bp处，其等位基因为A和T；
第 42 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈17号染色体的21538747bp处，其等位基因为G和T；
第 43 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈17号染色体的21538750bp处，其等位基因为T和C；
第 44 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈17号染色体的21538780bp处，其等位基因为T和C；
第 45 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈17号染色体的21600387bp处，其等位基因为T和G；
第 46 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈14号染色体的33232238bp处，其等位基因为C和T；
第 47 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈17号染色体的21538718bp处，其等位基因为C和G；
第 48 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈18号染色体的10489778bp处，其等位基因为G和T；
第 49 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈22号染色体的6627699bp处，其等位基因为A和G；
第 50 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈17号染色体的21538781bp处，其等位基因为G和A；
第 51 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈22号染色体的6627719bp处，其等位基因为G和T；
第 52 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈10号染色体的30391582bp处，其等位基因为A和C；
第 53 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈14号染色体的31303068bp处，其等位基因为T和A；
第 54 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈24号染色体的12142769bp处，其等位基因为T和C；
第 55 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈14号染色体的33160202bp处，其等位基因为A和G；
第 56 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈18号染色体的11082357bp处，其等位基因为G和A；
第 57 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈14号染色体的31302060bp处，其等位基因为G和A；
第 58 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈14号染色体的31302065bp处，其等位基因为T和A；
第 59 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈18号染色体的11081460bp处，其等位基因为G和C；
第 60 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈22号染色体的15840162bp处，其等位基因为A和T；
第 61 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈4号染色体的37769358bp处，其等位基因为G和A；
第 62 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈20号染色体的105950bp处，其等位基因为A和G；
第 63 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈14号染色体的34904859bp处，其等位基因为A和T；
第 64 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈7号染色体的37459096bp处，其等位基因为G和C；
第 65 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈20号染色体的241389bp处，其等位基因为G和A；
第 66 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈14号染色体的21534934bp处，其等位基因为A和C；
第 67 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈18号染色体的18161503bp处，其等位基因为C和G；
第 68 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈13号染色体的26526161bp处，其等位基因为C和G；
第 69 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈18号染色体的26689722bp处，其等位基因为A和G；
第 70 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈10号染色体的15747369bp处，其等位基因为A和G；
第 71 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈14号染色体的27059857bp处，其等位基因为C和T；
第 72 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈24号染色体的12681740bp处，其等位基因为C和T；
第 73 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈14号染色体的26262200bp处，其等位基因为G和A；
第 74 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈3号染色体的6858667bp处，其等位基因为G和T；
第 75 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈14号染色体的21869309bp处，其等位基因为T和C。
以上所述第1 SNP位点至第75 SNP位点所在的核苷酸序列依序如序列表中的SEQID NO.15 ~ SEQ ID NO.89所示。每条序列中第31位的字母r代表的是该SNP位点。
进一步说明：
当样本第 13SNP分子标记的基因型为TT或CT，第 46 SNP分子标记的基因型为CC或TC，和/或第 37 SNP分子标记的基因型为CC或GC时，该样本个体为高生长速率个体的概率显著高于其他基因型；
当样本第 1 SNP分子标记的基因型为AG，第 2 SNP分子标记的基因型为AA或GA，和/或第 3 SNP分子标记的基因型为TT或AT时，该样本个体为高生长速率个体的概率显著低于其他基因型。
本发明还根据SNP位点分型信息筛选出与豹纹鳃棘鲈生长相关的基因型组合，其通过SEQ ID NO.13所示的上游引物序列和SEQ ID NO.14所示的下游引物序列进行扩增。
进一步的，本发明还提供了用于检测所述的豹纹鳃棘鲈的生长相关SNP分子标记的引物组合，其中：
用于检测第13 SNP位点的引物对，上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示；
用于检测第46 SNP位点的引物对，上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物序列如SEQ ID NO.4所示；
用于检测第37 SNP位点的引物对，上游引物序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物序列如SEQ ID NO.6所示；
用于检测第1 SNP位点的引物对，上游引物序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物序列如SEQ ID NO.8所示；
用于检测第2 SNP位点的引物对，上游引物序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物序列如SEQ ID NO.10所示；
用于检测第3 SNP位点的引物对，上游引物序列如SEQ ID NO.11所示，下游引物序列如SEQ ID NO.12所示。
另一方面，本发明的目的之二是提供所述的生长相关SNP分子标记、所述的基因型组合以及所述的引物组合在培育豹纹鳃棘鲈快速生长个体中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益成果在于：
本发明基于多种参数获得具有育种价值的分子标记及组合型，相关SNP分子标记及组合型可用于豹纹鳃棘鲈分子标记辅助育种，加快选育具有优良生长性状的豹纹鳃棘鲈品种，为豹纹鳃棘鲈的选育工作提供参考依据。
附图说明
图1：P-value最显著SNP基因型频率统计图。
图2：PVE最显著SNP基因型频率统计图。
图3：基因型组合分析结果图；横坐标圆点标记为生长相关SNP位点；横坐标从左至右依序为chr17.21537420、chr17.21537423、chr17.21537576、chr17.21537577、chr17.21537730、chr17.21537770、chr17.21537771、chr17.21537779、chr17.21537780、chr17.21538036、chr17.21538476、chr17.21538483、chr17.21538704、chr17.21538718、chr17.21538747、chr17.21538750、chr17.21538780、chr17.21538781、chr17.21538836、chr17.21538937、chr17.21538969、chr17.21538984、chr17.21538985、chr17.21539093、chr17.21538175、chr17.21539192、chr17.21539314、chr17.21539366、chr17.21539368、chr17.21539371、chr17.21539372、chr17.21539386、chr17.21539730，代表的是SNP位点的位置信息。
图4：大小个体中各组合型分布情况。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好的理解本发明技术内容，下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步的说明。
实施例1豹纹鳃棘鲈的生长相关SNP分子标记的筛选
具体步骤如下：
（1）自海南省东方市感城镇晨海水产有限公司选取6月龄东星斑个体，其中包含80尾快速生长个体和80尾慢速生长个体。
（2）剪刀消毒后剪取尾鳍一部分（0.5-1cm2），用RNase-free（不含RNA酶）的1×PBS缓冲液漂洗后，立刻置于体积浓度95%乙醇溶液中，-20℃保存备用。
（3）同时测定每条东星斑个体的生长性状（体重、体长、体高和体宽），并做好标记，群体间生长性状存在极显著性差异（表1）。
（4）应用酚氯仿提取法提取步骤（2）中所取样品的全基因组DNA，利用DNA建库试剂盒构建全基因组重测序文库，随后进行全基因组重测序。
（5）利用Trimmomatic软件对重测序数据reads进行初步过滤：（a）去除质量参数Q小于30的reads；（b）去除带有部分接头二聚体的reads；（c）去除长度小于36bp的reads。为了保证数据的准确性，低于5×测序深度的个体数据被弃用，最终150个个体数据被保留用于后续分析。
（6）使用BWA软件对初步过滤后的重测序数据与东星斑基因组进行比对，获取sam文件，比对过程使用MEM(Burrows-Wheeler Transform)算法。
（7）使用SAMtools软件将sam文件转化为bam文件，后使用GATK软件中的HaplotypeCaller来完成序列处理和多态性位点检测分型，生成vcf文件。
（8）使用VCFtools软件将不同个体的vcf文件进行合并，基于本团队已构建的单倍型参考面板对合并后的vcf文件进行数据填充，填充后共获得8,735,699个SNP位点信息。
（9）使用PLINK2软件将vcf文件转化为ped文件和map文件，然后进行主成分分析。结果显示群体无明显分群。
（10）使用PopLDdecay软件，进行连锁不平衡分析，确定各SNP位点间的连锁不平衡状态。
（11）使用GEMMA软件推算群体间亲缘关系矩阵，发现个体间无显著亲缘关系，并引入5个主成分值作为协变量利用混合线性模型进行全基因组关联分析，筛选出75个与生长显著相关的SNP位点（P-value<1×10-5）（表2）。依据P-value，进一步统计与生长性状关联最为显著的3个SNP位点(chr17:22316930，chr14:33232238，chr17:21537423)的基因型频率并作为候选基因设计检测引物（表3）。对于SNP位点chr17:22316930，当样本基因型为TT或CT时，该样本个体为高生长速率个体的概率要显著高于其他基因型；对于SNP位点chr14:33232238，当样本基因型为CC或TC时，该样本个体为高生长速率个体的概率要显著高于其他基因型；对于SNP位点chr17:21537423，当样本基因型为CC或GC时，该样本个体为高生长速率个体的概率要显著高于其他基因型（图1）。
（12）计算每个SNP位点对于生长性状的PVE（表型变异解释率），选取PVE最高的3个SNP位点（chr9:3779548，chr10:29219664，chr12:7535493）统计基因型频率并作为候选基因设计检测引物（表3）。对于SNP位点chr9:3779548，当样本基因型为AG时，该样本个体为高生长速率个体的概率要显著低于其他基因型；对于SNP位点chr10:29219664，当样本基因型为AA或GA时，该样本个体为高生长速率个体的概率要显著低于其他基因型；对于SNP位点chr12:7535493，当样本基因型为TT或AT时，该样本个体为高生长速率个体的概率要显著低于其他基因型（图2）。
（13）根据生长相关SNP分布，在17号染色体中发现有一生长相关SNP位点集中分布区域，选取21537000-21539000这一2kb区域进行统计，根据其中SNP位点分型信息，共分出6种主要的基因型组合（组合型1-6）（图3），其中组合型1与生长性状呈显著正相关（图4），并设计检测引物（表3）。
本发明依据同龄豹纹鳃棘鲈群体中快速生长群体和慢速生长群体，利用填充后的低深度重测序数据通过GWAS分析，筛选出与生长性状显著相关的SNP位点，并且依据P-value和PVE进一步筛选出具有代表性的生长相关SNP位点，根据一个生长相关SNP显著富集的区域，筛选出了与生长性状呈显著正相关的基因型组合，基于以上的发现，设计了对应的检测引物，能够快速有效的实现对关键分子标签的识别，为后续豹纹鳃棘鲈的精准分子标记辅助育种提供了可靠的数据支撑和技术支持，能够加快选育出高生长速率的豹纹鳃棘鲈新品种。
表1 快速生长群体与慢速生长群体生长性状统计
注：***表示快速生长群体与慢速生长群体生长性状在0.001水平上存在显著性差异（P-value<0.001）。
表2 生长相关SNP位点信息统计
表3 引物信息
以上所述仅为本发明的部分实施例而已，并不用限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.检测豹纹鳃棘鲈的生长相关SNP分子标记的分型试剂在培育豹纹鳃棘鲈快速生长个体中的应用，其特征在于：
所述SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈9号染色体的3779548bp处，其等位基因为G和A；当样本所述SNP分子标记的基因型为AG时，该样本个体为高生长速率个体的概率显著低于其他基因型；
所述分型试剂中包括用于检测所述的豹纹鳃棘鲈的生长相关SNP分子标记的引物对，上游引物序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物序列如SEQ ID NO.8所示。
2.权利要求1所述检测豹纹鳃棘鲈的生长相关SNP分子标记的引物对在培育豹纹鳃棘鲈快速生长个体中的应用，其特征在于，所述 SNP分子标记位于豹纹鳃棘鲈9号染色体的3779548bp处，其等位基因为G和A；当样本所述SNP分子标记的基因型为AG时，该样本个体为高生长速率个体的概率显著低于其他基因型。
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