CN101864428B - Cast基因与ob基因双酶切方法的建立及其在猪聚合育种中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物基因工程技术领域，研究两个影响肉质性状的候选基因即钙蛋白酶抑制蛋白(CAST)基因和肥胖(OB)基因在松辽黑猪标记辅助选择中的应用。在CAST基因内含子6存在一个A→G的碱基突变，导致了Hinf I限制性酶切位点的改变，产生多态性片段；OB基因第3469位碱基处存在一个T→C的碱基突变，导致限制性片段长度多态性的产生。将两个候选基因两个突变位点作为一个分子标记，通过聚合PCR-RFLP的方法，用限制性内切酶Hinf I检测两个突变位点，并将检测结果与松辽黑猪的肉质性状进行关联分析，以期为松辽黑猪的选种、早期选育、杂种优势的利用等提供基础参数，为松辽黑猪改良育种和新品系的培育提供理论依据和实验基础。本发明的特点在于建立CAST基因和OB基因聚合PCR，同时建立两个候选基因同一个限制性内切酶Hinf I聚合酶切方法，为松辽黑猪的标记辅助选择提供实验依据。

Description

CAST基因与OB基因双酶切方法的建立及其在猪聚合育种中的应用

本发明属于动物基因工程技术领域，涉及松辽黑猪肉质性状候选基因在标记辅助选择中的应用，具体地说是钙蛋白酶抑制蛋白(CAST)基因和肥胖(OB)基因两种基因聚合作为分子标记及在松辽黑猪肉质性状选择中的应用，以期对松辽黑猪的选种、早期选育、杂种优势的利用等提供基础参数，为松辽黑猪改良育种和新品系的培育提供理论依据和实验基础，并且本发明对于其它猪种也具有实际的参考价值。 

背景技术

1996年Koohmaraie[Koohmaraie M.B iochemical factors regulation thetoughening and tenderization process of meat[J].Meat Sci，1996，43：193.]研究发现CAST基因编码的钙蛋白酶抑制蛋白是一种内源性的、需Ca²⁺激活的、专一性抑制钙蛋白酶活性的抑制剂，可抑制肌肉内蛋白质降解，降低肌细胞生长速度；屠宰后可抑制钙蛋白酶的活性，降低蛋白质水解。 

当钙蛋白酶被Ca²⁺激活后，如果附近有钙蛋白酶抑制蛋白存在，将迅速与之结合，影响其自溶稳定性，抑制钙蛋白酶的活性，从而保证钙蛋白酶只进行局部的特定位点的水解。1999年Roman等[Roman L，Hruska U S.Effect ofcalpastatin on degradation of myofibrillar proteins byμ-calpain underpostmorterm conditions[J].Journal of Animal Science，1999，77：2685-2692.]研究证实自溶是钙蛋白酶表现活性的重要步骤，钙蛋白酶抑制蛋白是通过抑制钙蛋白酶的自溶而发挥作用的。 

2001年Malek等[Malek M，Dekkers J C M，Lee H K，et al.A moleculargenome scan analysis to identify chromosomal regions influencing economic traitsin the pig.II.Meat and muscle composition[J].Mamm Genome，2001，12：637-645.]将猪肉嫩度等肉品质性状的数量性状位点(QTL)定位于2号染色体。1996年Rettenberger等[Rettenberger C，Bruch J，Fries R，et al.Assignment of 19porcientype I loci by somatic cell hybrid analysis detects new regions of conservedsynteny between human and pig[J].Mamm Genome.1996，7：275.]将钙蛋白酶抑制蛋白定位于猪2号染色体上。1998年Ernst等[Ernst CW.Robic A，Yerle M.et al.Mapping of alpastatin and three microsatellites to porcine chromosome 2q2.1-2.4[J].Anim Gene.1998，29：212.]进一步将钙蛋白酶抑制蛋白定位于2q2.1-2.4，并在内含子6发现了3个PCR-RFLP多态性位点(Hinf I，Msp I，Rsal)。2000年Pagan等[Pagan M，Raney NE，Koohmaraie M，et al.Identification of novelpolymorphism at the bovine calpastain and isulin-like growth factor bindingproteun2loci[J].J Anim Sci.2000，78(Suppl.2)：27.]认为钙蛋白酶抑制蛋白是猪肉嫩度的候选基因。 

2003年Kuryl等[Kuryl J，Kapelanski W，Pierzchala M，et al.Preliminaryobservations on the effect of calpastatin gene(CAST)polymorphism on caracasstraits in pig[J].Animal Science Papers and Reports，2003，(21)：87-95]等进一步分析了CAST基因在几个猪种中的多态性，并对该基因的多态性与屠体性状的相关进行了分析，发现CAST/MspI不同基因型和肉质存在显著相关。而孙立彬等[孙立彬，孟和，李婧，等.猪钙蛋白酶抑制蛋白基因PCR-RFLP多态性与肉质性状及背膘厚间的关系分析[J].上海交通大学学报.2005，23(1)：57-62]进一步对125 头PIC杂交猪进行屠宰测定，通过CAST(Hinf I，MspI)不同基因型与屠体性状、肉质性状的相关分析，得出CAST基因对肌内脂肪含量具有显著影响，证明了CAST基因是一个对肉质相关性状非常有用的候选基因。 

1994年Zhang等[何岚，齐学林，高烨.青少年血清瘦素水平与肥胖、血糖及胰岛素的关系[J].西安交通大学学报，2006.]克隆了小鼠和人的肥胖(ob)基因，并鉴定了它们所表达的蛋白，该蛋白被命名为瘦素(leptin)。瘦素由脂肪组织分泌的反映体脂含量、调节体重和摄食的重要信号因子，其能调节动物青春期发育[Chen S C，Cunningham J J，Smeyne R J.Expression of ob receptor splicevariants during Prenatal development of the mouse[J].J Recept Signal TransductRes，2000，20(1)：87-103.]，生殖器官发育[Ducy P，Amling M，Takeda S，et al.Leptin inhibits bone formation through ahypothalamic relay：a central control ofbone mass[J].Cell，2000，100(2)：197-207.]和繁殖功能[Korner J，Chua J r SC，Williams J A，et al.Regulation of hypo thalamic proopiom elanocortin by leptin inlean and obese rats[J].Neuroendocringology，1999，70(6)：377-383.]，妊娠[Mercer JG，Moa K M，Ross A W，et al.Photoperiod regulates arcuate nucleus POMC，AGRP，and leptin receptor mRNA in Siberian hamster hypothalamus[J].Am JPhysiol Regul Integr Comp Physiol，2000，278(1)：271-281.]，胚胎发育[ChagnonY C，Wilmore J H，Bor Aecki J B.Associations between the leptin receptor geneand adiposity in middleaged Caucasian males from the HER ITA GE family study[J].J Clin Endocrino Metab，2000，85(1)：29-34.]，造血功能[J in L，Zhang S，Burguera B G，et al.Leptin and leptin receptor expression in rat and mousepituitary cells[J].Endocrinology，2000，141(1)：333-339.]，以及最近发现其在维持 “破骨细胞”的骨再吸收作用与“造骨细胞”的骨形成作用之间的一种平衡中可能扮演一个重要角色[Forent Elefteriou，Jong Deok A hn，Shu Takeda.Leptin regulation of bone resorption by the sympathetic nervous system and CART[J].Natrure，2005，434：514-520.]。 

发明内容

本发明的目的是提供一种CAST基因和OB基因作为松辽黑猪肉质性状的分子标记。 

本发明的第二个目的是建立作为松辽黑猪分子标记的CAST基因和OB基因聚合RCR-RFLP检测方法。 

本发明的第三个目的是提供所涉及的分子标记在松辽黑猪肉质性状关联分析上的应用。 

本发明通过以下技术方案实现： 

在CAST基因内含子6存在一个A→G的碱基突变，导致了HinfI限制性酶切位点的改变，导致限制性片段长度多态性(Restriction Fragment LengthPolymorphism，RFLP)的产生；OB基因第3469位碱基处存在一个T→C的碱基突变，产生多态性片段。将两个候选基因这两个突变位点作为分子标记，通过PCR-RFLP的方法，用限制性内切酶Hinf I检测两个突变位点，并将检测结果与松辽黑猪的部分肉质性状进行关联分析，以期为松辽黑猪的选种、早期选育、杂种优势的利用等提供基础参数，为松辽黑猪改良育种和新品系的培育提供理论依据和实验基础。 

本发明的分子标记鉴定方法和松辽黑猪部分部分肉质性状关联分析过程如图10所示。 

本发明的分子标记鉴定方法，通过下述步骤实现： 

一、CAST基因和OB基因聚合PCR的方法 

1.采集松辽黑猪肝脏组织 

屠宰时进行肝脏组织采集。为得到高质量的基因组DNA，用冰盒将肝脏带回实验室，并及时提取。 

2.从采集松辽黑猪肝脏组织提取基因组DNA 

用常规的酚-氯仿抽提法提取总基因组DNA，并进行纯度和浓度检测，贮于-20℃冰箱备用。 

3.设计特异性引物并进行聚合PCR扩增 

设计CAST基因和OB基因特异引物，CAST基因上游引物：5′-AAAGCCTACCCACGCACT-3′，下游引物：5′-GCAGATACACCAGTAACAGAAA-3′；OB基因上游引物：5′-GAGCCAACATCTCTCTCGCTGAG-3′，下游引物：5′-GACTCCTGGAAGCTCAGGTTTCTTC-3′。PCR反应总体系为50微升，其中10×buffer 5.0微升，2.5mM dNTP 4.0微升，10.0pmol/μL的两对上游引物和下游引物各1.0微升，1U Taq DNA聚合酶，20-50纳克基因组DNA，最后用四馏水补足至50微升。 

循环程序如下：94℃预变性5min，94℃变性1min，60.5℃复性45sec，72℃延伸1min，32个循环，72℃终延伸10min。反应结束后，PCR扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。 

二、建立聚合PCR-RFLP方法并鉴定突变位点 

PCR结束后使用限制性内切酶HinfI进行聚合酶切反应。酶切反应体系为：CAST基因和OB基因聚合PCR产物8微升，Hinf I限制性内切酶4U，加双 蒸水至30微升。酶切反应条件为：37℃水浴6.5小时。用3.0％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，凝胶成像系统观察并记录基因型。在所设计的CAST特异引物的第200位置存在A→G的碱基突变，导致了Hinf I限制性酶切位点发生改变，当该位点为A碱基时，存在酶切位点，电泳检测结果为505+372+210+200+175bp，命名为A等位基因；当该位点为G碱基时酶切位点消失，505和200bp的片段合并产生705bp的片段，电泳检测结果为705+372+210+175bp，命名为B等位基因；这两个等位基因可组成3种基因型，即AA型、BB型、AB型，如图3所示，其中M泳道为标准分子量Marker，7和10泳道为AB基因型，8和11泳道为AA基因型，9泳道为BB基因型。OB基因第3469位碱基处存在一个T→C的碱基突变，产生多态性片段，当该位点为T碱基时，不存在酶切位点，电泳检测结果为465bp，命名为T等位基因；当该位点为C碱基时，存在HinfI酶切位点，电泳检测结果为347+118bp，命名为C等位基因；这两个等位基因也可组成3种基因型，即TT型、TC型和CC型，如图3所示，12泳道为TC基因型，13泳道为TT基因型，14泳道为CC基因型。聚合酶切时，CAST基因和OB基因这四个等位基因也可组成9种基因型，即AATT基因型、AATC基因型、AACC基因型、ABTT基因型、ABTC基因型、ABCC基因型、BBTT基因型、BBTC基因型和BBCC基因型。如图3所示，1泳道为BBTT基因型，2泳道为AATC基因型，3泳道为AATT基因型，4泳道为BBTC基因型，5泳道为BBCC基因型，6泳道为ABTC基因型。 

三、对标记性状进行关联分析 

本发明通过部分肉质性状关联分析过程，对松辽黑猪部分肉质性状进行关联分析并预测相应基因型个体肉质性状的生长潜力。肉质性状关联分析过 程，是通过下述步骤实现的。 

使用SPSSl2.0软件中的General Linear Model过程，建立如下统计分析模模型并消除系统效应来分析不同基因型和肉质性状的关联。 

统计分析模型为：Y_i＝μ+G_j+e_i。其中，Y_i为被观测个体的生产性能表型值，μ为生产性能的最小二乘均值，G_j为基因型对生产性能的效应值，e_i为对应于观察值的随机残差。 

对松辽黑猪CAST基因和OB基因的Hinf I多态性位点与部分肉质性状进行关联分析，基因型检测结果表明在93个个体中BBTT基因型个体有12个，AATC基因型个体有26个，AATT基因型个体有45个，BBTC基因型个体有3个，BBCC基因型个体有5个，ABTC基因型个体有3个。分析结果如表1所示，其中，同一性状最小二乘均值及标准差后具有不同字母表示差异显著(P＜0.05)，具有不同大小写字母表示差异极显著(P＜0.01)。由表1可知，B等位和T等位基因是松辽黑猪肉质性状的有利等位基因，BBTT基因型标记可作为用于提高松辽黑猪部分肉质性状的分子标记，并对一些性状提出预测值，最小二乘均值±标准差即为对相同月龄松辽黑猪肉质性状。将此突变位点作为一个分子标记，通过PCR-RFLP的方法鉴定此突变位点，并将鉴定结果与松辽黑猪部分肉质性状相关联，为松辽黑猪的选种选育提供理论基础。 

利用本发明建立的PCR-RFLP方法即可检测处在任何生长阶段的松辽黑猪CAST基因和OB基因聚合基因型并评估其生长潜力，也可通过检测5-6月龄的松辽黑猪个体的CAST基因和OB基因不同聚合基因型，提出部分肉质性状的估测值。 

本发明的效果是如下： 

1.建立了CAST基因和OB基因聚合PCR的方法 

通过设计特异引物、优化反应体系和反应条件，建立了CAST基因和OB基因聚合PCR的方法，扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示目的片段大小为463bp和1459bp，为特异性PCR产物，如图2所示。 

2.建立了松辽黑猪CAST基因和OB基因聚合PCR-RFLP诊断方法 

通过优化酶切反应体系和反应条件，对特异性目的片段463bp和1459bp进行酶切，建立了松辽黑猪CAST基因和OB基因聚合PCR-RFLP诊断方法。经过酶切9种基因型在松辽黑猪群体中检测到了6种基因型，即BBTT基因型、AATC基因型、AATT基因型、BBTC基因型、BBCC基因型、ABTC基因型，如图3所示。 

3.对标记性状进行关联分析 

表1部分肉质性状在6种基因型即BBTT基因型、AATC基因型、AATT基因型、BBTC基因型、BBCC基因型、ABTC基因型的最小二乘平均值及标准差 

表1CAST基因和OB基因聚合酶切不同基因型的部分肉质性状的最小二乘分析 

注：LSM为最小二乘均数，SE为标准误；同行比较，标有不同字母者为差异显著(P＜0.05)。 

附图说明

图1是基因组DNA经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中M泳道为标准分子量Marker，1-6泳道为基因组DNA。

图2是CAST基因和OB基因扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中M泳道为标准分子量Marker，1-4泳道为被检测的4个PCR产物。 

图3是3.0％琼脂糖凝胶电泳检测CAST基因和OB基因扩增产物的Hinf I酶切结果。其中M泳道为标准分子量Marker，1-6泳道为聚合酶切结果，泳道1为BBTT基因型，泳道2为AACT基因型，泳道3为AATT基因型，泳道4为BBCT基因型，泳道5为BBCC基因型，泳道6为ABCT基因型；7-11为CAST基因聚合前酶切结果，泳道7和10为AB基因型，泳道8和11为AA基因型，泳道9为BB基因型；12-14为OB基因聚合前酶切结果，泳道12为TC基因型，泳道13为TT基因型，泳道14为CC基因型。 

图4是实施例1中CAST基因和OB基因扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中M泳道为标准分子量Marker DL 2000，泳道1和2为被检测的2个PCR产物。 

图5是实施例1中CAST基因和OB基因扩增产物的Hinf I聚合酶切电泳检测结果。其中M泳道为标准分子量Marker DL 2000，泳道1为ABTT型，泳道2为AATC型为被检测的酶切产物。 

图6是实施例2中CAST基因和OB基因聚合PCR电泳检测结果。其中M泳道为标准分子量Marker DL 2000，泳道1和2为被检测的PCR产物。 

图7是实施例2中CAST基因和OB基因扩增产物的Hinf I聚合酶切电泳检测结果。其中M泳道为标准分子量Marker DL 2000，泳道1为ABTT型，泳道2为AATC型为被检测的酶切产物。 

图8是实施例3中CAST基因和OB基因聚合PCR电泳检测结果。其中 M泳道为标准分子量Marker DL 2000，泳道1和2为被检测的PCR产物。 

图9是实施例3中CAST基因和OB基因扩增产物的Hinf I聚合酶切电泳检测结果。其中M泳道为标准分子量Marker DL 2000，泳道1为BBTT型，泳道2为BBTC型为被检测的酶切产物。 

图10是本发明的分子标记鉴定方法和性状关联分析过程图。 

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，用具体实施方式详细描述具体内容。 

本发明利用已公布的CAST基因和OB基因序列和已提取的松辽黑猪基因组DNA，分别设计特异性引物一对，然后利用两队引物进行聚合PCR扩增，最后利用PCR-RFLP方法，使用限制性内切酶Hinf I对PCR反应产物进行酶切。将酶切结果分型并将不同基因型与松辽黑猪部分肉质性状性状关联，并对不同基因型个体的部分性状预测，为松辽黑猪的选种、早期选育、杂种优势的利用等提供基础参数，为松辽黑猪改良育种和新品系的培育提供理论依据和实验基础。 

一、聚合PCR(聚合酶链式反应)反应的建立及条件的优化 

1.特异性引物的设计 

根据Genebank上公布的序列，利用Oligo6.0软件设计特异性引物。 

CAST基因上游引物：5′-AAAGCCTACCCACGCACT-3′ 

下游引物：5′-GCAGATACACCAGTAACAGAAA-3′； 

OB基因上游引物：5′-GAGCCAACATCTCTCTCGCTGAG-3′ 

下游引物：5′-GACTCCTGGAAGCTCAGGTTTCTTC-3′。 

扩增产物长度为469bp和1459bp。 

2.聚合PCR反应及反应条件 

PCR反应总体系为50微升，其中10×buffer 5.0微升，2.5mM dNTP 4.0微升，10.0pmol/μL的两对上游引物和下游引物各1.0微升，1U Taq DNA聚合酶，20-50纳克基因组DNA，最后用四馏水补足至50微升。 

循环程序如下：94℃预变性5min，94℃变性1min，60.5℃复性45sec，72℃延伸1min，32个循环，72℃终延伸10min。反应结束后，PCR扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。 

二、聚合PCR-RFLP方法及条件的优化 

本发明中为得到高效、高速的效果，选用Fermentas的Hinf I内切酶。酶切反应体系为：CAST基因和OB基因聚合PCR产物8微升，Hinf I限制性内切酶4U，加双蒸水至30微升。酶切反应条件为：37℃水浴6.5小时。用3.0％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，凝胶成像系统观察并记录基因型。 

在所设计的CAST特异引物的第200位置存在A→G的碱基突变，导致了Hinf I限制性酶切位点发生改变，当该位点为A碱基时，存在酶切位点，电泳检测结果为505+372+210+200+175bp，命名为A等位基因；当该位点为G碱基时酶切位点消失，505和200bp的片段合并产生705bp的片段，电泳检测结果为705+372+210+175bp，命名为B等位基因；这两个等位基因可组成3种基因型，即AA型、BB型、AB型，如图3所示，其中M泳道为标准分子量Marker，7和10泳道为AB基因型，8和11泳道为AA基因型，9泳道为BB基因型。OB基因第3469位碱基处存在一个T→C的碱基突变，产生多态性片段，当该位点为T碱基时，不存在酶切位点，电泳检测结果为465bp，命名为T等位基因；当该位点为C碱基时，存在Hinf I酶切位点，电泳检测结果为347+118bp，命名为C等位 基因；这两个等位基因也可组成3种基因型，即TT型、TC型和CC型，如图3所示，12泳道为TC基因型，13泳道为TT基因型，14泳道为CC基因型。聚合酶切时，CAST基因和OB基因这四个等位基因也可组成9种基因型，即AATT基因型、AATC基因型、AACC基因型、ABTT基因型、ABTC基因型、ABCC基因型、BBTT基因型、BBTC基因型和BBCC基因型。如图3所示，1泳道为BBTT基因型，2泳道为AACT基因型，3泳道为AATT基因型，4泳道为BBCT基因型，5泳道为BBCC基因型，6泳道为ABCT基因型。 

三、对标记性状进行关联分析 

利用93个基因组DNA样品分析松辽黑猪，分析CAST基因和OB基因PCR-RFLP与部分肉质性状的关系。运用SPSS12.0软件中的General LinearModel过程，建立如下模型并消除系统效应来分析不同基因型和性状间的关联。 

统计分析模型为：Y_i＝μ+G_j+e_i。其中，Y_i为被观测个体的生产性能表型值；μ为生产性能的最小二乘均值；G_j为基因型对生产性能的效应值；e_i为对应于观察值的随机残差。 

实施例1 

在中国吉林省吉林红嘴种猪繁育有限公司的松辽黑猪中随机抽取5月龄的待屠宰个体，在屠宰时采集肝脏组织进行基因组DNA的提取并整理其相关的性状资料。提取的基因组DNA经分光光度仪测定，浓度为53.78ug/ml，OD260/OD280Ratio为1.768。利用本发明设计的引物、PCR反应体系和条件进行PCR扩增。PCR反应总体系为50微升，其中10×buffer 5.0微升，2.5mM d NTP 4.0微升，10.0pmol/μL的两对上游引物和下游引物各1.0微升，1U TaqDNA聚合酶，20-50纳克基因组DNA，最后用四馏水补足至50微升。PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃变性1min，60.5℃复性45sec，72℃延伸1min，32个循环，72℃终延伸10min。反应结束后，PCR扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示为特异性PCR产物。如图4所示，其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1和2为被检测的PCR产物。将PCR产物按本发明设计的RFLP方法进行酶切反应。CAST基因和OB基因聚合PCR产物8微升，Hinf I限制性内切酶4U，加双蒸水至30微升。酶切反应条件为：37℃水浴6.0小时。用3.0％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，凝胶成像系统观察并记录基因型。如图5所示，其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1和泳道2为被检测的酶切产物；经鉴定1泳道为ABTT型，2泳道为AATC型。其性状与本发明所预测的值的对比见表2。 

表2实施例1中抽取的个体性状测量值与估计值对比 

实施例2 

在中国吉林省延边州放养的松辽黑猪中随机抽取6月龄的待屠宰个体，在屠宰时采集肝脏组织进行基因组DNA的提取并整理其相关的性状资料。提取的基因组DNA经分光光度仪测定，浓度为52.64ug/ml，OD260/OD280Ratio为1.861。利用本发明设计的引物、PCR反应体系和条件进行PCR扩增。PCR反应总体系为50微升，其中10×buffer 5.0微升，2.5mM dNTP 4.0微升，10.0pmol/μL的两对上游引物和下游引物各1.0微升，1U Taq DNA聚合酶，20-50纳克基因组DNA，最后用四馏水补足至50微升。PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃变性1min，60.5℃复性45sec，72℃延伸1min，32个循环，72℃终延伸10min。反应结束后，PCR扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示为特异性PCR产物。如图6所示，其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1和2为被检测的PCR产物。将PCR产物按本发明设计的RFLP方法进行酶切反应。CAST基因和OB基因聚合PCR产物8微升，Hinf I限制性内切酶4U，加双蒸水至30微升。酶切反应条件为：37℃水浴4.5小时。用3.0％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，凝胶成像系统观察并记录基因型。如图7所示，其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1和泳道2为被检测的酶切产物；经鉴定1泳道为ABTT型，2泳道为AATC型。其性状与本发明所预测的值的对比见表3。 

表3实施例2中抽取的个体性状测量值与估计值对比 

实施例3 

在中国吉林省通化地区的松辽黑猪中随机抽取5月龄的待屠宰个体，在屠宰时采集肝脏组织进行基因组DNA的提取并整理其相关的性状资料。提取的基因组DNA经分光光度仪测定，浓度为54.38ug/ml，OD260/OD280Ratio为1.815。利用本发明设计的引物、PCR反应体系和条件进行PCR扩增。PCR反应总体系为50微升，其中10×buffer 5.0微升，2.5mM dNTP 4.0微升，10.0pmol/μL的两对上游引物和下游引物各1.0微升，1U Taq DNA聚合酶，20-50纳克基因组DNA，最后用四馏水补足至50微升。PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃变性1min，60.5℃复性45sec，72℃延伸1min，32个循环，72℃终延伸10min。反应结束后，PCR扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。 扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示为特异性PCR产物。如图8所示，其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1和泳道2为被检测的PCR产物。将PCR产物按本发明设计的RFLP方法进行酶切反应。CAST基因和OB基因聚合PCR产物8微升，HinfI限制性内切酶4U，加双蒸水至30微升。酶切反应条件为：37℃水浴5.0小时。用3.0％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，凝胶成像系统观察并记录基因型。如图9所示，其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1和泳道2为被检测的酶切产物；经鉴定1泳道为BBTT型，2泳道为BBTC型。其性状与本发明所预测的值的对比见表4。 

表4实施例3中抽取的个体性状测量值与估计值对比 

Claims (5)

1.一种松辽黑猪的CAST基因和OB基因聚合PCR的方法，该方法包含以下步骤：

(1)采集松辽黑猪肝脏组织；(2)提取肝脏组织的基因组DNA；(3)使用CAST基因和OB基因的特异引物进行PCR扩增，所使用的特异引物为：

CAST基因上游引物：5′-AAAGCCTACCCACGCACT-3′

CAST基因下游引物：5′-GCAGATACACCAGTAACAGAAA-3′

OB基因上游引物：5′-GAGCCAACATCTCTCTCGCTGAG-3′

OB基因下游引物：5′-GACTCCTGGAAGCTCAGGTTTCTTC-3′。

2.权利要求1所述的松辽黑猪的CAST基因和OB基因聚合PCR的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应程序为94℃预变性5min，94℃变性1min，60.5℃复性45sec，72℃延伸1min，32个循环，72℃终延伸10min。

3.松辽黑猪CAST基因和OB基因聚合PCR-RFLP检测方法，该方法包括以下步骤：

(1)先使用权利要求1所述方法进行PCR扩增，同时获得CAST基因和OB基因；

(2)PCR结束后使用限制性内切酶Hinfl进行聚合酶切反应，用电泳检测酶切结果；

CAST基因扩增产物的第200位置存在一个A→G的碱基突变，导致了Hinfl限制性酶切位点的改变，产生多态性片段；OB基因第3469位碱基处存在一个T→C的碱基突变，导致限制性片段长度多态性的产生。

4.权利要求3所述的松辽黑猪CAST基因和OB基因聚合PCR-RFLP检测方法，其特征在于，所述限制性内切酶Hinfl的反应体系为：CAST基因和OB基因聚合PCR产物8微升，Hinfl限制性内切酶4U，加双蒸水至30微升，酶切反应条件为37℃水浴6.5小时。

5.松辽黑猪CAST基因和OB基因聚合PCR-RFLP检测方法在松辽黑猪肉质性状关联分析中的应用。 

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