CN1687414A - 猪解耦联蛋白3的基因组基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了猪解耦联蛋白3的基因组基因及其应用。猪解耦联蛋白3的基因组基因，是具有序列表中SEQ ID №：1的DNA序列或编码序列表中SEQ ID №：8蛋白质序列的多核苷酸。利用猪解耦联蛋白3的基因组基因鉴定瘦肉型猪的方法，是检测待测品种猪的种群基因型频率，如待测品种猪的种群基因型频率具有下列情况之一，则待测品种猪为瘦肉型猪：1)AA基因型频率大于等于0.8小于等于1.0，AB基因型频率小于等于0.1，BB基因型频率小于等于0.2；2)CC基因型频率大于等于0.8小于等于1.0，CD基因型频率小于等于0.1，DD基因型频率小于等于0.1；3)EE基因型频率大于等于0.8小于等于1.0，EF基因型频率小于等于0.1，FF基因型频率小于等于0.1。

Description

猪解耦联蛋白3的基因组基因及其应用

技术领域

本发明涉及猪解耦联蛋白3的基因组基因及其应用，特别涉及猪解耦联蛋白3的基因组基因及利用其鉴定瘦肉型猪的方法。

背景技术

近年来ob-，db，tub-，Ay-和fat等导致小鼠肥胖的基因的发现使人们对动物的能量平衡调节有了深入的了解。但在人类，除了极少数病例外，绝大多数肥胖者并未发现有这些缺陷基因。因此，调查人类肥胖相关基因仍是当前肥胖研究的重要方面。解耦联蛋白(uncoupling protein，UCP)是在啮齿动物的棕色脂肪(brownadipose tissue，BAT)的线粒体膜上发现的转运蛋白，具有解离呼吸链氧化磷酸化耦联的功能，将机体代谢用于合成能量物质ATP的能量转化为产生热量，并对机体能量平衡涉及的体重下降、静止代谢率、脂肪沉积和食物转化效率等性状具有显著的影响。

1、UCPs基因家族与分布

早在1961-1964年，人们就发现啮齿动物能利用体内褐色脂肪组织(brownadipose tissue，BAT)，对寒冷刺激、休眠、采食诱导时，产生热量维持体温十分重要。Ricquier通过比较冷热环境下小鼠体内的变化发现了一类分子量为32kD的功能未知的蛋白质。Nicholls通过标记细胞混合物注入BAT内，发现BAT的线粒体内膜存在一质子通透性很强的渗透孔，可解离呼吸链氧化磷酸化耦联作用产生热量。Lin研究证实这个渗透孔是位于线粒体内膜的一种蛋白质，也就是Ricquier发现的功能未知的蛋白质，由于该蛋白质具有解离呼吸链氧化磷酸化耦联的功能，使BAT中的能量以钠泵的形式消耗产生热量，所以将这个未知蛋白称为解耦联蛋白(uncoupling protein，UCP)。1997年Warden在BAT以外的其他组织中发现了一种具有UCP功能的蛋白质，因此将BAT中存在的UCP称为UCP1，将新发现的UCP称为UCP2；在同一年，Giacobino、Lowell、Reitman分别独立发现了UCP家族的另一成员——UCP3。

以往的观点认为，BAT在成年人或成年动物已经消失，但近年来的研究表明，户外工人和长期饮酒人群的颈动脉周围和心包存在BAT，此外成人的一些部位的脂肪组织检测到了UCP1及其mRNA。还有一些研究指出，成人脂肪组织中有大量的棕色脂肪细胞分布，并表达UCP。UCP3主要在骨骼肌、脂肪组织(包括白脂和红脂)中表达最为显著。

2、UCP基因的定位与结构

UCP3基因定位在人染色体11q13位置。小鼠的UCP3基因定位于7号染色体距着丝点50cM的位点，大鼠的定位于1号染色体，猪的定位在9p21-p24位置，牛的UCP3基因定位于BTA15。在人UCP研究中，基因连锁分析表明，UCP3基因所定位的11q13区域的微卫星标记与机体静止代谢率紧密连锁。

猪UCP3是由311个氨基酸残基组成的蛋白质，猪UCP3的的mRNA序列见Genbank Accession No.AF128837和Damon，M.，Vincent，A.，Lombardi，A.andHerpin，P.First evidence of uncoupling protein-2(UCP-2)and-3(UCP-3)gene expression in piglet skeletal muscle and adipose tissue.JOURNAL Gene246(1-2)，133-141(2000)。

3、UCP与脂肪沉积

由于UCP具有氧化磷酸化解耦联产生热量的功能，研究者们推测UCP对增重(肥胖)和能量转化效率存在显著作用。

小鼠UCP3基因定位于7号染色体，基因连锁分析表明7号染色体上存在影响热量产生、食物转化效率和皮下及性腺脂肪沉积的数量性状位点(QuantitativeTraits Loci，QTL)。整合入UCP3基因的酵母和小鼠肌肉细胞UCP3含量明显增高，线粒体质子流的通透性也显著增加，预示了UCP氧化磷酸化解耦联作用对能量转化效率的影响；同时研究者们通过突变分析发现小鼠UCP3基因与肥胖和II型糖尿病和肥胖及能量代谢关系密切。白喉毒素是真核生物蛋白质合成的抑制剂，研究发现，白喉毒素A链的转基因小鼠体内UCP含量低，小鼠表现肥胖。

由于UCP3仅分布于骨骼肌和棕色脂肪，人们认为它对调节能量代谢、体重、产热的调节十分重要。2000年7月，John在Nature上发表了采用UCP3基因敲除的小鼠的实验结果，这种转基因小鼠，能在骨骼肌中超量的表达人的UCP3，采食量大但体重小于野生型，采用核磁共振图象扫描表明脂肪组织减少，血浆葡萄糖降低，胰岛素水平降低，葡萄糖清除率提高，这表明骨骼肌的UCP3影响代谢率和葡萄糖动态平衡。科学家们预言，一旦UCP的功能作用得到确证，UCP将成为人类肥胖控制最有希望的药物。

Kimm研究了特定基因的特异等位基因对不同种族人的能量消耗的影响，证明美国黑人妇女的不静息能量消耗(REE)低于白人妇女，她们在UCP1、UCP2、UCP3位点分别有2、2、3个多态位点，他们发现美国黑人妇女UCP3外显子5的多态型CC基因型的REE低于TT型。UCP3外显子5的变异频率与其他变异在不同种族间存在连锁不平衡。

在严重肥胖和2型糖尿病患者中，发现了3个UCP3基因变异外显子3V102I错义突变，外显子4R143X无义和外显子6的剪切多态，外显子6的剪切多态的杂合子个体(UCP3S/UCP3L)脂肪氧化率下降，呼吸商明显升高，且严重肥胖个体UCP3S基因频率明显增高。Walder发现Pima印度人群UCP3基因外显子3的C/T同义突变。UCP3基因突变人群具有较高的静止代谢率，在老年人群中发现与肥胖相关。通过调节瘦蛋白(leptin)的活性控制体重，在缺乏食物的情况下，机体往往动用UCP甚至动用储存脂肪维持体温，在正常情况下，机体关闭UCP活性以节约能量利用。UCP3外显子6的剪切变异导致剪切结合(splice junction)和蛋白质成熟前终止，这种蛋白缺少第6转膜域，发生这种变异的个体，基础脂肪氧化下降50％。

UCPs由于其在能量代谢和机体中的特殊地位，受到了许多学者的重视。UCPs对不同动物类群、不同生长阶段作用的机理，其他基因的表达如何与UCPs合并影响动物的能量代谢与肥胖，UCPs在特定组织中对组织特异功能的影响等都需要深入研究。

发明内容

本发明的目的是提供猪解耦联蛋白3(UCP3)的基因组基因。

本发明所提供的猪解耦联蛋白3的基因组基因，具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：8蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

4)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

序列表中的序列1由7137个碱基组成，其开放阅读框架为自序列1的5′端第1位-7137位碱，包括6个外显子和5个内含子，自序列1的5′端第1位-126位碱基为第一外显子，自序列1的5′端第127位-851位碱基为第一内含子，自序列1的5′端第852位-1062位碱基为第二外显子，自序列1的5′端第1063位-1295位碱基为第二内含子，自序列1的5′端第1296位-1496位碱基为第三外显子，自序列1的5′端第1497位-3005位碱基为第三内含子，自序列1的5′端第3006位-3107位碱基为第四外显子，自序列1的5′端第3018位-3466位碱基为第四内含子，自序列1的5′端第3467位-3647位碱基为第五外显子，自序列1的5′端第3648位-7022位碱基为第五内含子，自序列1的5′端第7023位-7137位碱基为第六外显子。

序列表中的序列8是由311个氨基酸残基组成的猪UCP3。

所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

本发明的另一个目的是提供一种鉴定瘦肉型猪的方法。

本发明所提供的鉴定瘦肉型猪的方法，是检测待测品种猪的种群基因型频率，如待测品种猪的种群基因型频率具有下列情况之一，则待测品种猪为瘦肉型猪：

1)AA基因型频率大于等于0.8小于等于1.0，AB基因型频率小于等于0.1，BB基因型频率小于等于0.2；

所述基因型是按照如下方法确定：确定自SEQ ID NO：1的5′端第5631位碱基为C还是T；如自SEQ ID NO：1的5′端第5631位碱基为C时，其纯合体的基因型为AA；自SEQ ID NO：1的5′端第5631位碱基为T时，其纯合体的基因型为BB；它们的杂合体基因型为AB；

2)CC基因型频率大于等于0.8小于等于1.0，CD基因型频率小于等于0.1，DD基因型频率小于等于0.1；

所述基因型是按照如下方法确定的：确定自序列1的5′端第1073位-1077位碱基是否缺失；如自序列1的5′端第1073位-1077位碱基不缺失，其纯合体的基因型为CC；自序列1的5′端第1073位-1077位碱基缺失时，其纯合体的基因型为DD；它们的杂合体基因型为CD；

3)EE基因型频率大于等于0.8小于等于1.0，EF基因型频率小于等于0.1，FF基因型频率小于等于0.1；

所述基因型是按照如下方法确定：确定自SEQ ID NO：1的5′端第521位碱基为A还是G；如自序列表中SEQ ID NO：1的5′端第521位碱基为A时，其纯合体的基因型为EE；自序列表中SEQ ID NO：1的5′端第521位碱基为G时，其纯合体的基因型为FF；它们的杂合体基因型为EF。

可按照如下方法确定自序列1的5′端第1073位-1077位碱基是否缺失：用由序列表中SEQ ID №：4和SEQ ID №：5的核苷酸序列组成的一对引物对待测猪的基因组DNA进行PCR扩增，如得到的扩增产物为一条196bp的条带，该待测个体的自序列1的5′端第1073位-1077位碱基不缺失，则该待测个体的基因型是CC；如得到的扩增产物为一条191bp的条带，该待测个体的自序列1的5′端第1073位-1077位碱基缺失，则待测个体的基因型是DD；如得到扩增产物为一条196bp的条带和一条191bp的条带，待测个体的一对同源染色体中，一条染色体的自序列1的5′端第1073位-1077位碱基不缺失，另一条染色体的自序列1的5′端第1073位-1077位碱基缺失，则该待测个体的基因型是CD。

可按照如下方法确定自SEQ ID NO：1的5′端第521位碱基为A还是G：用由序列表中SEQ ID №：6和SEQ ID №：7的核苷酸序列组成的一对引物对待测猪的基因组DNA进行PCR扩增，用BstXI酶切该PCR扩增产物，如得到的酶切产物是一条524bp和一条526bp的酶切片段，待测个体自SEQ ID NO：1的5′端第521位碱基为A，则待测个体的基因型是EE；如得到的酶切产物是一条1050bp的酶切片段，待测个体自SEQ ID NO：1的5′端第521位碱基为G，则待测个体的基因型是FF；如得到的酶切产物是一条524bp，一条526bp和一条1050bp的酶切片段，待测个体的一对同源染色体中，一条染色体的自SEQ ID NO：1的5′端第521位碱基为A，另一条染色体的自SEQ ID NO：1的5′端第521位碱基为G，则待测个体的基因型是EF。

所述待测品种猪的种群可由30-50个体组成。

本发明的鉴定瘦肉型猪的方法，对于猪品种的改良和猪的瘦肉率、肌间脂肪的改善具有重要意义。

附图说明

图1为PCR扩增得到的UCP3第2内含子片段电泳图

图2为UCP3内含子1的A395G突变的基因型检测

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1、猪UCP3的基因组基因的获得

引物设计与PCR反应：依据已报道的小鼠、人UCP3基因序列设计引物，以大约克猪的基因组DNA为模板，分别利用引物对UCP3 exon 1F 5’-tctccttggacctcctct-3’和UCP3 exon 1R 5’-CTGCAGGCGGACCTTG-3’，UCP3intron 1F 5‘-GGCAGAGCCCCTGGGAC-3’和UCP3 intron 1R 5’-GATCCCTTGGGCGTGTA-3’，UCP3 exon 2F 5’-ATCCAGGGGGAGAACCA-3’和UCP3 exon2R 5’-CTTTCCACAGGCCCCGGAC-3’，UCP3 intron 3F 5’-ACTATGGACGCCTACAGAACC-3’和UCP3 intron 3R 5’-CATAGGTCACCATCTCGGC-3’，UCP3 exon 4F 5’-ATTCTGCCCAACATCACG-3’和UCP3 exon 4R 5’-CCTTTATAGAAGGCTGTG-3’，UCP3intron 5F 5’-GGTGAAGACCCGGTACAT-3’和UCP3 intron 5R 5’-GCAAAAAGGAAGGTGTGAA-3’，UCP3 exon 6F 5’-ATTCACACCTTCCTTTTT-3’和UCP3exon 6R 5’-TGGCCTTATGTGCGCGGAC-3’进行PCR扩增，对所得的PCR产物进行测序，与猪UCP3的mRNA序列(Genbank Accession No.AF128837；Damon，M.，Vincent，A.，Lombardi，A.and Herpin，P.First evidence of uncouplingprotein-2(UCP-2)and-3(UCP-3)gene expression in piglet skeletal muscleand adipose tissue.JOURNAL Gene 246(1-2)，133-141(2000))比对，拼接得到猪UCP3的基因组基因序列(序列1)，序列表中的序列1由7137个碱基组成，其开放阅读框架为自序列1的5′端第1位-7137位碱，包括6个外显子和5个内含子，自序列1的5′端第1位-126位碱基为第一外显子，自序列1的5′端第127位-851位碱基为第一内含子，自序列1的5′端第852位-1062位碱基为第二外显子，自序列1的5′端第1063位-1295位碱基为第二内含子，自序列1的5′端第1296位-1496位碱基为第三外显子，自序列1的5′端第1497位-3005位碱基为第三内含子，自序列1的5′端第3006位-3107位碱基为第四外显子，自序列1的5′端第3018位-3466位碱基为第四内含子，自序列1的5′端第3467位-3647位碱基为第五外显子，自序列1的5′端第3648位-7022位碱基为第五内含子，自序列1的5′端第7023位-7137位碱基为第六外显子。编码具有序列表中序列8的氨基酸残基序列的蛋白质猪UCP3。序列表中的序列8由311个氨基酸残基组成。

实施例2、利用猪UCP3基因的第5内含子多态性鉴定瘦肉型猪

实验动物：瘦肉型猪品种：长白猪、杜洛克、大约克；肥胖型(脂肪型)猪品种：民猪、金华猪、荣昌猪、藏猪和野猪。

1、PCR扩增猪UCP3基因的第5内含子片段

按常规方法分别提取上述品种猪各30个个体的基因组DNA，在引物U3I5S1F：5’-ACCTGCGCCGTTCCAACC-3’(序列2)和U3I5S1R：5’-AGCTCAGCTTGCGGTGCCGC-3’(序列3)的引导下，按照如下条件PCR扩增猪UCP3基因的第5内含子片段。

PCR反应体系：

10×扩增缓冲液                     1.5ul

4dNTP混合物，(42.5mmol/L)          1.2ul

引物(10pmol/ul)                    1.5ul

基因组DNA(100ng/ul)                1ul

Taq DNA聚合酶(3u/ul)               1ul

ddH₂O                             8.8ul

总体积                             15ul

反应条件：

94℃预变性5分钟；循环条件(94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分)，30个循环；72℃延伸7分钟；4℃保存。

2、14％非变性聚丙烯酰胺凝胶(30ml体积，0.1cm胶条)制作及电泳

清洗制胶用的玻璃板，烘干后，用0.8％琼脂糖封闭玻璃板和胶条间的缝隙。

配制30ml 14％的丙稀酰胺胶工作液：30％丙烯酰胺14.0ml，50％甘油4ml，5×TBE 6ml，10％过硫酸铵210ul，TEMED 12ul，加入纯水6ml，混合后迅速灌胶。

当胶灌至离玻璃板上沿0.1cm时停止灌胶，插入梳子，室温聚合半小时。随时观察凝胶聚合情况，并补加丙烯酰胺。凝胶聚合好后，向电泳槽加入1×TBE，用注射器冲洗加样孔。预电泳10分钟，同时准备点样。

取1.5ul PCR产物置于PCR管中，加入5ul变性缓冲液(SSCP上样缓冲液配比(10ml体积)：98％去离子甲酰胺 9.8ml，2％甘油0.2ml，0.01mol/L EDTA(pH8.0)，0.025％溴酚兰，二甲苯青0.025％)，98℃变性10分钟，迅速冰浴10分钟，用微量注射器点样。140伏，电泳14-16小时，结束电泳。将凝胶置于70％乙醇中，水浴震荡器缓慢摇匀固定10-15分钟。去离子水洗胶2遍，每次2分钟，洗去乙醇，用200ml染色液(200ml银染液：NH₃H2O 2ml；3.6％NaOH 4.ml；20％AgNO₃3.6ml；加去离子水至200ml)染色30分钟，去离子水洗胶3遍，每次2分钟，洗去多余的染色液；200ml显色液(200ml显色液：1％柠檬酸钠 1ml；甲醛100ul；加去离子水至200ml。)显色30分钟，倒掉显色液，去离子水洗掉多余的显色液，保鲜膜封好，扫描照相。

然后按照常规方法进行PCR产物的纯化，克隆和测序，测序结果表明该PCR产物是猪UCP3基因的第5内含子的第1898-2215位碱基(即自序列1的5′端第5545位-5862位碱基)；猪UCP3基因的第5内含子的第1984位碱基(即自序列1的5′端第5631位碱基)处存在C、T两个等位基因，即为多态性位点。如自序列表中SEQ ID NO：1的5′端第5631位碱基为C时，其纯合体的基因型为AA；自序列表中SEQ ID NO：1的5′端第5631位碱基为T时，其纯合体的基因型为BB；它们的杂合体基因型为AB。

上述各个基因型在瘦肉型猪品种(长白猪、杜洛克、大约克)与肥胖型猪品种(民猪、金华猪及荣昌猪)的基因型分布存在显著差异(表1)；如待测猪品种的种群中AA基因型频率大于等于0.8小于等于1.0，AB基因型频率小于等于0.1，BB基因型频率小于等于0.2，则该待测猪品种为瘦肉型猪品种。

本实施例说明UCP3基因第5内含子的第1984位碱基突变与猪的脂肪沉积、能量代谢有密切的联系。

表1.第5内含子各个基因型在8个猪品种中的分布

品种	头数	基因型分布
					AA	AB	BB
		长白猪	30	0.80				0.10	0.10
大约克	30				0.90	0	0.10
		杜洛克	30	0.80				0	0.20
民猪	30				0.47	0	0.53
		金华猪	30	0.63				0	0.37
荣昌猪	30				0.53	0.20	0.27
		藏猪	48	0.48				0.14	0.38
野猪	30				0.37	0.50	0.13

实施例3、利用UCP3基因第2内含子的11-15缺失多态性鉴定瘦肉型猪

实验动物：瘦肉型猪品种：长白猪、杜洛克、大约克；肥胖型(脂肪型)猪品种：民猪、金华猪、荣昌猪、藏猪和野猪。

用引物UCP3intron2F：5’-CACGCCCAAGGGATCGGACC-3’(序列4)和UCP3intron2R：5’-CTGTCCCTCCAGGGCCAGGG-3’(序列5)，PCR扩增UCP3基因第2内含子片段。其扩增条件、PCR扩增产物电泳及测序条件同实施例1。电泳结果如图1所示，表明获得的PCR产物有两种，一种大小为196bp，另一种大小为191bp。测序结果表明196bp的PCR产物是猪UCP3基因的第2外显子的第192位碱基-第2内含子的第176位碱基(即自序列1的5′端第1043位-1238位碱基)，191bp的PCR产物是猪UCP3基因第2内含子的第11-15位碱基(即自序列1的5′端第1073位-1077位碱基)缺失；UCP3基因第2内含子的第11-15位碱基(即自序列1的5′端第1073-1077位碱基)处存在缺失多态性位点。如自序列1的5′端第1073-1077位碱基不缺失时，其纯合体的基因型为CC，用UCP3intron2F和UCP3intron2R得到扩增产物为一条196bp的条带；自序列1的5′端第1073位-1077位碱基缺失时，其纯合体的基因型为DD，用UCP3intron2F和UCP3intron2R得到扩增产物为一条191bp的条带；它们的杂合体基因型为CD，用UCP3intron2F和UCP3intron2R得到扩增产物为一条196bp的条带和一条191bp的条带。图1中，1、5、8、11、14是CC基因型，2、12、15、16、17、18、19、20、21、22泳道是DD基因型，3、4、6、7、9、10、13泳道是CD基因型。

UCP3基因第2内含子各个基因型在8个猪品种中的分布情况如表2所示，

表2.UCP3基因第2内含子各个基因型在8个猪品种中的分布

品种	头数	基因型分布
					CC	CD	DD
		长白猪	30	1.00				0	0
大约克	30				0.80	0.10	0.10
		杜洛克	30	0.90				0	0.10
民猪	30				0.57	0	0.43
		金华猪	30	0.63				0	0.37
荣昌猪	30				0.63	0.10	0.27
		藏猪	48	0.28				0.04	0.68
野猪	30				0.37	0.20	0.43

表2表明瘦肉型的长白猪、大约克和杜洛克与中国肥胖型民猪、金华猪及荣昌猪的基因型分布存在显著差异；如待测猪品种的种群中CC基因型频率大于等于0.8小于等于1.0，DD基因型频率小于等于0.1，CD基因型频率小于等于0.1，则该待测猪品种为瘦肉型猪品种。

本实施例说明UCP3基因第2内含子的第11-15位碱基的缺失与猪的脂肪的沉积、能量的代谢有密切的联系。

实施例4、利用UCP3基因第1内含子的395位碱基的多态性鉴定瘦肉型猪

实验动物：瘦肉型猪品种：长白猪、杜洛克、大约克；肥胖型(脂肪型)猪品种：民猪、金华猪、荣昌猪、藏猪和野猪。

利用引物UCP3 intron 1F 5’-ATGGTTGGACTGAAGCCTT-3’(序列6)和UCP3intron 1R 5’-CCGATCCCTTGGGCGTGTA-3’(序列7)PCR扩增UCP3基因第1内含子片段。其扩增条件、PCR扩增产物电泳及测序条件同实施例1。电泳结果表明获得的PCR产物大小为1050bp。

然后按照常规方法进行PCR产物的纯化，克隆和测序，测序结果表明该PCR产物是猪UCP3基因的第1外显子的第1位碱基到第2外显子的第199位碱基(即自序列1的5′端第1位-1050位碱基)；猪UCP3基因的第1内含子的第395位碱基(即自序列1的5′端第521位碱基)处存在A、G两个等位基因，即为多态性位点。如自序列表中SEQ ID NO：1的5′端第521位碱基为A时，其纯合体的基因型为EE；自序列表中SEQ ID NO：1的5′端第521位碱基为G时，其纯合体的基因型为FF；它们的杂合体基因型为EF。

基因型为EE时，自序列表中SEQ ID NO：1的5′端第519-530位碱基出现限制性内切酶BstXI的识别位点(CCACACCCATGG)，用BstXI酶切该PCR扩增产物，得到的酶切产物是一条526bp和一条524bp的酶切片段；基因型为FF时，该PCR扩增产物无BstXI酶切，得到的酶切产物是一条1050bp的酶切片段；基因型为EF时，用BstXI酶切该PCR扩增产物，得到的酶切产物是一条526bp，一条524bp和一条1050bp的酶切片段(图2)。图2中1、3、5、6、7、8为FF型，2、9、10、11、13、14、15、16为EE型，4、12为EF型，M为100bp ladder marker。其中，BstXI酶切条件为在10μl上述PCR产物中加入0.5U限制性内切酶BstXI，1.5μl 10×酶切缓冲液(Takara公司的内切酶BstXI专用10×酶切缓冲液)，37℃温育4小时。酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。

上述各个基因型在瘦肉型猪品种(长白猪、杜洛克、大约克)与肥胖型猪品种(民猪、金华猪及荣昌猪)的基因型分布存在显著差异(表3)；如待测猪品种的种群中EE基因型频率大于等于0.8小于等于1.0，EF基因型频率小于等于0.1，FF基因型频率小于等于0.1，则该待测猪品种为瘦肉型猪品种。

表3.UCP3基因第1内含子各个基因型在8个猪品种中的分布

品种	头数	基因型分布
					EE	EF	FF
		长白猪	30	0.80				0.10	0.10
大约克	30				0.80	0.10	0.10
		杜洛克	30	0.90				0	0.10
民猪	30				0.37	0	0.63
		金华猪	30	0.23				0.20	0.57
荣昌猪	30				0.23	0.10	0.67
		藏猪	48	0.28				0.30	0.42
野猪	30				0.37	0.40	0.23

                           序列表

<160>8

<210>1

<211>7137

<212>DNA

<213>野猪属猪(Sus scrofa domestica Brisson)

<400>1

atggttggac tgaagccttc agacgtgcct cccaccatgg ctgtgaagtt cctgggggca     60

ggcacagcag cctgttttgc tgacctcctc acctttccac tggacacagc caaggtccgc    120

ctgcaggtag gtgccctttg gccaaaggtc actgttccca gaggggaggg gtcgagtccg    180

ccaccagggc ccccgggccc tctgcctgct ggtcctcaag aagggccctg agcagcccag    240

tcgccccgcg tcccaccgcc ccatcaccat cgcccaagac caaaggagct taactccttg    300

gcttgacgag ccaggtcccc ccttgccctg ctctgtaaac cataaagtga agtccacaca    360

aggaagctct ctgggagctt ggacaagcca ctgacgactc tcagtgagca aacgacaccg    420

ccctgccatg ctccctaagg atcaaatgcc acaccatgtc catctaaaag ctggaaactg    480

acaccagtct ggtttttttt ttttggtctt tttcagggcc acacccatgg catatggagg    540

ttcccaggct aggggtccca ttggatctgt agccacctgc ctacaccaca gccacagcat    600

ctcaggatct gggccacatc tgcaaactac accacagctc acagcaacac caggtcctta    660

acccactgag cgaggccagg gattgaacct gcgtcctcat ggatgctagt caggtttgct    720

aactgctgag ccaggacagg aacgccacga acctgtcatt tttactggga tgcgaccctg    780

cgatcacgct ggtctgaggt ccagccccgt ccacccccac tcagctcctt actgcagggt    840

gtgtccctca gatccagggg gagaaccagg cggtccagac ggcccggagc gcccagtacc    900

gcggggtgct gggcaccatt ctcaccatgg tgcgcaacga gggcccccgc agcccctaca    960

acgggctggt ggccggcctg cagcgccaga tgagcttcgc ctccatccgc atcggcctct   1020

acgactccgt caagcagctc tacacgccca agggatcgga ccgtgagtgc agagggcagg   1080

gcgggggggc aggatccagg ctgtgggtca ggggccaggg cagagggcag ggcagactca   1140

agaggcagag ctgggccgcg ggaggctggc accagacgcc catgaggagc ctcggcctcc   1200

atcaaggagg ctctggaacc ctggccctgg agggacagca cgaggcccag ggacatgctg   1260

gacagccgaa catggtccat ccctcgcctc ttcagactcc agcatcacca cccggatttt    1320

ggcgggctgc accacggggg ccatggcagt gacctgcgcc cagcccacgg acgtggtgaa    1380

ggttcgattc caggccagca tacacgccgg gcccgggagc aacaggaagt acagcgggac    1440

tatggacgcc tacagaacca tcgccaggga ggaaggggtc cggggcctgt ggaaaggtag    1500

gtccggactc caggctgggg gacttcggca gcgctttccc ttcccaaggg ctggcggcag    1560

ggaccgagca atggggagcc cccagcaggt ctactcctgc gattctaaac caacacccta    1620

cccatcccag catccctgcc acgctgccct gagttccctt caatgtgcca acccttggcc    1680

atgcgcaggg ctgcgaggag acagaaatga aaagaggccg cccttgtggc tctcacagtg    1740

acacagaggg gatgggacgt gtccaggagc agccgttcca cggggcagga cgtgctgggc    1800

tcacgtggag gcgcagagcc agaggcggga gaggctacgg gctgggggaa gcagttcaac    1860

cgctggacct caaaggcccc gtgggctccc ggtgtgtgga gatgggagga aggggcgagc    1920

ccagcaaagg cctaaggggt gacagcagag caccggctaa gaacaggcca ctgggggcag    1980

ctgcccagag gagggggctt gcttcagagc aaagctgcag gcttccctac gtgtctaagt    2040

agtgaccacc tcaacacatg ctggagtctc tcccacatgg ggccagggct caggaatcgt    2100

gcagaagcag ggatccacct gcatcagttt tttttttttt tttttttttt ttgcttttta    2160

gggccgaacc tgcagcatat ggaggttccc aggctaaggg tcgaattgca gccacagctg    2220

cccgcctaca ccacagccat agcaacgcag gatccaagcc gagtctgcaa cctacaccac    2280

agctcatggc aatgccagat ccttaaccca ctgagcgagc cagggatcga agctgcatct    2340

tcatggacat tagtcgggtt catttccact gagccatgat gggaactcct cacagcctta    2400

ctttcagtgg gccctcccag ggcccagccc tcttctgaga ccagggtttg gtcttgatgc    2460

tccaggagcc ctgccaaggt ttcattctgt ccctattcca ggagcccagc cttcttcttc    2520

caaaaaaaag gctgcctttt ctggctctag ccaggtctcc gggaggcatt gtttttcctt    2580

tctttctttc ttttttccac cctgcagcat atggagttct tgggccaggg gtcagatcca    2640

agccacactg tgacctatgc tgtgacacca cccgatcctt aacccactgt gcagggctgg    2700

ggatcagatc tgcatcccgg tgctccagag acgcctccta tcccattgtg ccacagtggg    2760

aactccgaga catagtttaa tttcaataga tgttgcatgt tatcctccaa aatgctgccc    2820

aaacacacac aagaaggcct ctttgtctct aagacagaca cggataatct gagtgttttt    2880

aaacatccgg aagcaaagcg tgggatctac ctgacgtggg ctcctctgag accacgtccc    2940

ccaaactggg gcctgtgacc ttgcagccgg gggcccactt ttcctcttcc ccccttccct    3000

gacaggaatt ctgcccaaca tcacgaggaa tgccatcgtg aactgtgccg agatggtgac    3060

ctatgatgtc atcaaggaga aggtgctaga ctaccacctg ctcacgggtg agcccctggg    3120

ctccaggcag actccacagc cctcccacag cccgggggga acctgggccc cctggagtgg    3180

gcaccaccca caggcaactg ggctttaaaa ggagtagggg gaggcagagc gcccagtcca    3240

acacccgggc catcattctg atgactagga aagcagccgg gacaggaggc cagagacctg    3300

ggctccgggc tggcaccgct catccctgag cgctgcgaga gacttagaaa gcccatcctc    3360

atgctccggg aatccagtga cattagggac acacacaccc cccccagaaa gcaagggccc    3420

ctccctctcc cagccggatg tttcctcttc ccctcccccg atgcagacaa cctgccctgc    3480

cactttgtct ctgccttcgg agctggcttc tgtgccaccg tggtggcctc cccagtggat    3540

gtggtgaaga cccggtacat gaactcgccc cccggccagt accagaaccc tctggactgc    3600

atgctgaaga tggtgaccca ggagggcccc acagccttct ataaagggtg agcccgcctc    3660

cccctcccgc cctcggtccc cgcctagact gtgcctatca cggtccatct caaaaagtgg    3720

accaggagtt cccgtcgtgg ctcagcagaa acgaaccgga ctagtatcca tgaggacgca    3780

ggttcgatcc ctggccccgc tcagtgagtt agggatccag cattgctgtg agctgcagtg    3840

tacatcacag acgtggctcg gaccctgcgt tgctatggct gtggtgtaga ccggcagcta    3900

tagctctgag tcaacctcca gcctgggaac ttccatatgc tgcaggtgtg gccccgaaaa    3960

gaaaaactgt aaaaagtgga ccaagtccga tttgcaaagt cggggaggct tatctgaggg    4020

aagggtatcc aggcataggt caaagtgcca tcagcaacca cgctggatgg gggagaggag    4080

agaggtggtt ggtaaccctg acccactgcc ttcacggtga gtcactgtca gcagctcaag    4140

gacccaacgt gttcatgctt ccttgcttca tttttcaccc cccaccgcac ctgcggtgtg    4200

ttcaagttgc tagaccaggg atcgaatcca cagcgcagcc gcagagaccc cagccgctgc    4260

agtaaccata ctgatcctta acctgctgtg gcaccaaaaa ctccctgatc tt gcctcttt    4320

gtcttggctg ttcccgatcc tcagctctga atgcctctcc tacctctaca tcgtagccat    4380

ccttccagac ttgttcaaat gctgcctcct ccccaacact ctcaggtgta aattttccct    4440

tcctgtgaat gtaatgcttc ctcgataccc ttttcatggt atctaccgct tcctaccctt    4500

ttgtttgttt ttgcttttta aggccacatc catggcttat ggaggttccc aggctagggg    4560

tcgaatcaga gctgcagctg ctggcctatg ccacagccac agccatgcca gatccttaac    4620

ccactgagcg aagccaggga ttgaacctgc atcttcatgg atgctagtca ggttcgttaa    4680

cagctgagcc acgacgggaa ctccaccact ccctacttta tattattata gctttttttt    4740

ttttgtcttt ttgtcttttt gctatttctt gggctgctcc cgtggcatat ggaggttccc    4800

aggctagggg tccaattgga gctatagcca ccagcctaca ccagagccac agcaactcag    4860

gatctgagcc acatctgtga cctacacccc aggtcatggc aatgccagat ccttaaccca    4920

ctgagcatgg ccagggatcg aacccgcaac ctcatggttc ccagtcggat tcgttaacca    4980

ctgcaccatg acgggaactc caccagttcc tactttatat tatatattct agcttttttt    5040

tttttttttt tgtctttttg ctatttcttt gggccgctcc tgcggcatat ggaggttccc    5100

aggctagggg tcaaatcgga gctgtagcca ccggcctacg ccagagccac agcaatgcag    5160

gatctgagcc gcgtctgcaa cctacaccac agctcacggc aacgccagat cattaaccca    5220

ctgagcaagg gcagggactg aacccgcaat tttatggtcc ctagtcggat tcgttaacca    5280

ctgcgccacg acgggaactc ctattctagc atttttatgt tgaaattatc ctccgtgcta    5340

gagggcaaac tcctggcagc gaaggactgg agcttatacg gttgaccttg aacgacacga    5400

aggttagggg cacggacccc aggcagctga aaacacacgt acaacaacga ctcgctggcc    5460

ctccctgcat gcagttcctc cacttcgtca gatcccagca actgcagatc gtgtagtatt    5520

tagcatttac tgtcgaaaga caagacctgc gccgttccaa cccgggtggt tcaagggtca    5580

gctgtaccca tcgcccatgt cccagagtcc ccacctccag gccatcaccc cgtaacgcag    5640

gtacccctaa gtcatcgagc atcaggccct gtgctgagca tgtcacagct attatctcaa    5700

cgccccctgg actggaccgt gttctccgca tttaccgaag ggaccgcgac tcaggtcgag    5760

agacctgtcc aggttcacag actcttggag cagcagagcc aggctcaaac ccagaaggtc    5820

gcacgccacc cccacgagcg aggcggcacc gcaagctgag ctctctgcgc agccccctca    5880

cctccaccag ggagggccga tgtctggcgc ccagggttcg agtagacccg acaggcacac    5940

acggtctcaa ccctgggatg gtgtcacaga gccggttcag ccgacagttg tcccctgtaa    6000

ccgccctgtc ccgcacgctt cagctgtggc cccttgcctc gggtgttctt tcccttggca    6060

gacattccct cggtgccccg gggggttggg ccccgtgtgc gcggagcttc ccgaggattt    6120

gccgacaggg gccccgggag cctgtgctgg gctgcaggtc cctgccgtcc tcgcgacgcc    6180

tccgtgaggc agatgccgtc ctggtcctcg tggtacacag cagtaaaccg aggctgggga    6240

agatgaagct caagttcaca aaacttcaac tgaaactggt caagctaggg tttgaaccca    6300

ggtctgagcc tagagttcaa attcgttgtc cccatgctac gctccctgcg aggagcccag    6360

gctgaggcct cacggagcgg ccttggtggg agggaggttg tggtgcccaa atcaagcccc    6420

acaggccaag accaaggagc caggcaagga gagggggtta caccagggag gaggagggac    6480

gcgggcacag gagcaggagg gtcaggctgg caggagccga gaggaccagg aggggatctg    6540

cagagagcga agcggaggag ggcaggtggg acgctcccag ctgcgctgtc ccaggacagg    6600

gaggctctct ggagagtagc taagcttgct gtcacctggg acccccgcgg ggctggcatt    6660

caggccctaa atgagccact taggctgtaa atgagcccag aaatggcctg cggtggggtg    6720

gagtcaggtg attttaactg agctactcaa cctgttactc aacctgttgc tgaacaaccc    6780

ccgccccacc gtccctaccc gatagaaccg agagaatgaa ccgtctgcca ccgtccccca    6840

gctcacaatg ctggtttcct tttgtgattc caacctctgc ccgagttcct tccatagagg  6900

agaaaaagac cccacgatct cagaagatgc ccgggactga gccagggcaa agcctcgggc  6960

tgtaacaccc agagaggggg gcgcggggtc cacccccctg accacgtgtc tcttcctctc  7020

agattcacac cttccttttt gcgcttggga agctggaacg tggtgatgtt tgtaagctac  7080

gagcagctga aacgggcctt gatgaaagtc cagatgctgc gggaatctcc gttttga     7137

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

acctgcgccg ttccaacc                                                  18

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

agctcagctt gcggtgccgc                                                20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

cacgcccaag ggatcggacc                                      20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

ctgtccctcc agggccaggg                                      20

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

atggttggac tgaagcctt                                       19

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

ccgatccctt gggcgtgta                                19

<210>8

<211>311

<212>PRT

<213>野猪属猪(Sus scrofa domestica Brisson)

<400>1

Met Val Gly Leu Lys Pro Ser Asp Val Pro Pro Thr Met Ala Val Lys

1               5                   10                  15

Phe Leu Gly Ala Gly Thr Ala Ala Cys Phe Ala Asp Leu Leu Thr Phe

            20                  25                  30

Pro Leu Asp Thr Ala Lys Val Arg Leu Gln Ile Gln Gly Glu Asn Gln

        35                  40                  45

Ala Val Gln Thr Ala Arg Ser Ala Gln Tyr Arg Gly Val Leu Gly Thr

    50                  55                  60

Ile Leu Thr Met Val Arg Asn Glu Gly Pro Arg Ser Pro Tyr Asn Gly

65                  70                  75                  80

Leu Val Ala Gly Leu Gln Arg Gln Met Ser Phe Ala Ser Ile Arg Ile

                85                  90                  95

Gly Leu Tyr Asp Ser Val Lys Gln Leu Tyr Thr Pro Lys Gly Ser Asp

            100                 105                 110

His Ser Ser Ile Thr Thr Arg Ile Leu Ala Gly Cys Thr Thr Gly Ala

        115                 120                 125

Met Ala Val Thr Cys Ala Gln Pro Thr Asp Val Val Lys Val Arg Phe

    130                 135                 140

Gln Ala Ser Ile His Ala Gly Pro Gly Ser Asn Arg Lys Tyr Ser Gly

145                 150                 155                 160

Thr Met Asp Ala Tyr Arg Thr Ile Ala Arg Glu Glu Gly Val Arg Gly

                165                 170                 175

Leu Trp Lys Gly Ile Leu Pro Asn Ile Thr Arg Asn Ala Ile Val Asn

            180                 185                 190

Cys Ala Glu Met Val Thr Tyr Asp Val Ile Lys Glu Lys Val Leu Asp

        195                 200                 205

Tyr His Leu Leu Thr Asp Asn Leu Pro Cys His Phe Val Ser Ala Phe

    210                 215                 220

Gly Ala Gly Phe Cys Ala Thr Val Val Ala Ser Pro Val Asp Val Val

225                 230                 235                 240

Lys Thr Arg Tyr Met Asn Ser Pro Pro Gly Gln Tyr Gln Asn Pro Leu

                245                 250                 255

Asp Cys Met Leu Lys Met Val Thr Gln Glu Gly Pro Thr Ala Phe Tyr

            260                 265                 270

Lys Gly Phe Thr Pro Ser Phe Leu Arg Leu Gly Ser Trp Asn Val Val

        275                 280                 285

Met Phe Val Ser Tyr Glu Gln Leu Lys Arg Ala Leu Met Lys Val Gln

    290                 295                 300

Met Leu Arg Glu Ser Pro Phe

305                 310

Claims (6)

1、猪解耦联蛋白3的基因组基因，具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：8蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

4)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

2、根据权利要求1所述的猪解耦联蛋白3的基因组基因，其特征在于：所述猪解耦联蛋白3的基因组基因具有序列表中SEQ ID №：1的DNA序列。

3、一种鉴定瘦肉型猪的方法，是检测待测品种猪的种群基因型频率，如待测品种猪的种群基因型频率具有下列情况之一，则待测品种猪为瘦肉型猪：

1)AA基因型频率大于等于0.8小于等于1.0，AB基因型频率小于等于0.1，BB基因型频率小于等于0.2；

所述基因型是按照如下方法确定：确定自SEQ ID NO：1的5′端第5631位碱基为C还是T；如自SEQ ID NO：1的5′端第5631位碱基为C时，其纯合体的基因型为AA；自SEQ ID NO：1的5′端第5631位碱基为T时，其纯合体的基因型为BB；它们的杂合体基因型为AB；

2)CC基因型频率大于等于0.8小于等于1.0，CD基因型频率小于等于0.1，DD基因型频率小于等于0.1；

所述基因型是按照如下方法确定的：确定自序列1的5′端第1073位-1077位碱基是否缺失；如自序列1的5′端第1073位-1077位碱基不缺失，其纯合体的基因型为CC；自序列1的5′端第1073位-1077位碱基缺失时，其纯合体的基因型为DD；它们的杂合体基因型为CD；

3)EE基因型频率大于等于0.8小于等于1.0，EF基因型频率小于等于0.1，FF基因型频率小于等于0.1；

所述基因型是按照如下方法确定：确定自SEQ ID NO：1的5′端第521位碱基为A还是G；如自序列表中SEQ ID NO：1的5′端第521位碱基为A时，其纯合体的基因型为EE；自序列表中SEQ ID NO：1的5′端第521位碱基为G时，其纯合体的基因型为FF；它们的杂合体基因型为EF。

4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：可按照如下方法确定自序列1的5′端第1073位-1077位碱基是否缺失：用由序列表中SEQ ID №：4和SEQ ID№：5的核苷酸序列组成的一对引物对待测猪的基因组DNA进行PCR扩增，如得到的扩增产物为一条196bp的条带，该待测个体的自序列1的5′端第1073位-1077位碱基不缺失，则该待测个体的基因型是CC；如得到的扩增产物为一条191bp的条带，该待测个体的自序列1的5′端第1073位-1077位碱基缺失，则待测个体的基因型是DD；如得到扩增产物为一条196bp的条带和一条191bp的条带，待测个体的一对同源染色体中，一条染色体的自序列1的5′端第1073位-1077位碱基不缺失，另一条染色体的自序列1的5′端第1073位-1077位碱基缺失，则该待测个体的基因型是CD。

5、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：可按照如下方法确定自SEQ IDNO：1的5′端第521位碱基为A还是G：用由序列表中SEQ ID №：6和SEQ ID №：7的核苷酸序列组成的一对引物对待测猪的基因组DNA进行PCR扩增，用BstXI酶切该PCR扩增产物，如得到的酶切产物是一条524bp和一条526bp的酶切片段，待测个体自SEQ ID NO：1的5′端第521位碱基为A，则待测个体的基因型是EE；如得到的酶切产物是一条1050bp的酶切片段，待测个体SEQ ID NO：1的自5′端第521位碱基为G，则待测个体的基因型是FF；如得到的酶切产物是一条524bp，一条526bp和一条1050bp的酶切片段，待测个体的一对同源染色体中，一条染色体的自SEQ ID NO：1的5′端第521位碱基为A，另一条染色体的自SEQ ID NO：1的5′端第521位碱基为G，则待测个体的基因型是EF。

6、根据权利要求3、4或5所述的方法，其特征在于：所述待测品种猪的种群由30-50个体组成。

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