MXPA01001100A - Gen del receptor melanocortina-4 y su uso como un marcador genetico para contenido de grasa, ganacia de peso y7o consumo de alimento para animales. - Google Patents

Abstract

Se describen marcadores geneticos en el gen del receptor melanocortina-4 (MC4R) porcino que estan asociados con contenido de grasa, velocidad de crecimiento, y consumo de alimento. Se describen adicionalmente datos de secuencia novedosas de regiones del gen que pueden usarse en una prueba PCR para seleccionar la presencia del marcador. El marcador genetico puede usarse para seleccionar animales para propositos de cria que tengan los rasgos deseados respecto al contenido de grasa, velocidad de crecimiento, y consumo alimenticio. Tambien se describen equipos que se aprovechan de la prueba PCR.

Description

GEN DEL RECEPTOR MELANOCORTINA-4 Y SU USO COMO UN MARCADOR GENÉTICO PARA CONTENIDO DE GRASA, GANANCIA DE PESO Y/O CONSUMO DE ALIMENTO PARA ANIMALES DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta solicitud reclama el beneficio de la Solicitud Provisional Norteamericana No. de Serie 60/094,287 presentada el 27 de julio de 1998, y la Solicitud Provisional Norteamericana No. de Serie 60/116,186 presentada el 15 de enero de 1993 , las descripciones de las cuales se incorporan en la presente para referencia. Esta invención fue apoyada por lo menos en parte por concesiones del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos a través de la Iowa Agriculture and Home Economics Experimept Station (IaHees) y Proj ect Number IOW03148 (Hatch Funds) . El gobierno de los Estados Unidos puede tener ciertos derechos en esta invención. La presente invención se refiere a un método para evaluar animales genéticamente analizando la presencia de al menos un marcador genético el cual es indicativo de uno o más de los rasgos de , contenido de grasa, velocidad de crecimiento, y consumo de alimento. En particular, el método analiza la variación en el gen del receptor melanocortina-4 (MC4R) el cual es indicativo de estos rasgos. Aún más particularmente, el método analiza un polimorfismo en el gen MC4R.

Existe una creciente demanda del consumidor por productos cárnicos que tengan un bajo contenido de grasa. Esta demanda se motivó al acumularse evidencia en la literatura científica de que un alto consumo de grasa animal, especialmente grasa con una alta proporción de ácidos grasos saturados, representa un significativo peligro a la salud, que incluye riesgo de trastorno cardiovascular. Otras preocupaciones de la salud asociadas a carnes con mucha grasa incluyen su alto contenido de colesterol y la adición de cantidades relativamente grandes de sal las cuales se agregan para mejorar las características de enlace, puesto que la sal ayuda para extraer el componente natural miosina de la carne que enlaza agua. Además, un número creciente de consumidores encuentra menos aceptables los productos cádmicos que contienen aditivos tales como fosfatos, aditivos emulsificantes, y antioxidantes. Encarados con consumidores que buscan un producto cádmico más saludable, los productores de carne están continuamente presionados para ofrecer productos más baratos y saludables. Los productos más baratos, desde luego, llegan de la disminución de los costos de producción. Los productores están siempre interesados en mejorar la velocidad de crecimiento y conversión de alimento de sus animales . Los costos menores de producción llegan del tiempo más corto de comercializar y costos menores para alimentar un animal. Esto puede incrementar el margen de ganancia en la industria ganadera y/o resultar en precios menores al consumidor. Al ser capaces de seleccionar los animales que tengan los rasgos antes mencionados, los productores pueden crecer animales con estas características deseables. La selección de rasgos deseables se ha hecho tradicíonalmente usado técnicas de crianza. Existen diferencias genéticas entre los animales individuales así como entre razas que pueden explotarse por técnicas de crianza para lograr animales con estas características deseables. Por ejemplo, las razas chinas son conocidas por alcanzar la pubertad en una etapa temprana y por su tamaño de cría grande, mientras que las razas americanas son conocidas por sus velocidades de crecimiento mayores y flacura. Así, sería deseable combinar las mejoras de ambos tipos de estas razas, mejorando con eso la producción de carne de puerco. Frecuentemente, sin embargo, la heredabilidad de los rasgos deseados es baja, por ejemplo, la heredabilidad del tamaño de cría es de alrededor de 10% - 15%. Los métodos de cría estándar los cuales seleccionan individuos en base a las variaciones fenotípicas no toman completamente en cuenta la variabilidad genética o las interacciones genéticas complejas que existen. Por lo tanto, existe una necesidad de una propuesta que trate con la selección por flacura, velocidad de crecimiento, y consumo de alimento en el ámbito celular o de ADN. Este método proporcionará un método para evaluar genéticamente animales para permitir a los criadores seleccionar más precisamente aquellos animales que no solamente expresan fenotípicamente rasgos deseables sino aquellos que expresan criterios genéticos subyacentes favorables. Esto se ha logrado considerablemente a la fecha por selección asistida por marcadores. El análisis de fragmento por restricción de longitud de polimorfismo (RFLP) se ha usado por diversos grupos para estudiar ADN de cerdo. Jung et al., Theor. Appl. Genet. , 77:271-274 (1989), incorporado en la presente para referencia, describe el uso de técnicas RFLP para mostrar variabilidad genética entre dos razas de cerdo. Se demostró polimorfismo para los genes Clase I de cerdo del antígeno de leucosito (SLA) en estas razas. Hoganson et al., Abstract for Annual Meeting of Mid estern Section of the American Society of Animal Science, March 26-28, 1990y incorporado en la presente para referencia, reporta sobre el polimorfismo de genes de cerdo del complejo principal de histo-compatibilidad (MHC) para cerdos chinos, también demostrado por análisis de RFLP. Jung et al., Animal Genetics, 26:79-91 (1989), incorporado en la presente para referencia, reporta sobre el análisis sobre RFLP de genes Clase I SLA en ciertos verracos.

Se establece que los resultados sugieren que puede existir una asociación entre los genes Clase I de cerdo SLA/NHC y la producción y funcionamiento de rasgos. Establecen adicionalmente que el uso de fragmentos de restricción Clase I SLA, como marcadores genéticos, puede tener potencial en el futuro para mejorar el funcionamiento de crecimiento de cerdos . La habilidad para seguir un alelo genético favorable especifico involucra un proceso novedoso y tardado de la identificación de un marcador molecular de ADN para un gen de efecto principal. El marcador puede enlazarse a un gen sencillo con un efecto principal o enlazarse a un número de genes con efectos aditivos. Los marcadores de ADN tienen diversas ventajas; la segregación es fácil de medir y no es ambigua, y los marcadores de ADN son co-dominantes, es decir, pueden identificarse distintivamente animales heterocigotos y homocigotos . Una vez que un sistema marcador se establece, las decisiones de selección pueden identificarse distintivamente. Una vez que un sistema marcador se establece, las decisiones de selección pueden hacerse muy fácilmente, puesto que los marcadores de ADN pueden probarse en cualquier momento después de que pueda recolectarse una muestra de tejido o sangre del animal infante individual. El uso de diferencias genéticas en genes receptores se ha vuelto un sistema marcador valioso para la selección.

Por ejemplo, las Patentes Norteamericanas 5,550,024 y 5,374,526 expedidas para Rothschild et al. Describen un polimorfismo en el gen de receptor de estrógeno de cerdo ei cual está asociado con tamaño más grande de cría, la descripción de las cuales se incorpora en la presente para referencia. La solicitud Norteamericana no. de serie 08/812,208 describe marcadores polimórficos en el gen del receptor de prolactina de cerdo el cual está asociado con tamaño de cría y eficiencia reproductiva total mas grande. La WO-A-97/47316 describe que las mutaciones en la proteína MC4R existen en pacientes humanos extremadamente obesos y que puede determinarse una predisposición a trastornos del peso corporal probando por mutaciones en el gen MC4R. Sin embargo, Gotoda et al., Diabetologia 40 (1997) 976 describe una carencia de correlación entre una mutación punto particular en el gen MC4R (Vall0311e) y la obesidad en machos humanos blancos. Por lo tanto, no hubo indicio en la técnica de una correlación entre el gen MC4R y un medio- para seleccionar anímales con rasgos metabólicos mejorados. Puede verse de lo anterior que existe una necesidad de un método para seleccionar animales con respecto a los rasgos metabólicos mejorados de contenido de grasa, velocidad de crecimiento, y consumo de alimento. Un objeto de la presente invención es proporcionar un marcador genético basado en o dentro del gen MC4R que sea indicativo del contenido de grasa, velocidad de crecimiento, y/o consumo de alimento. Otro objeto de la invención es proporcionar una prueba para determinar la presencia de este marcador genético. Un objeto adicional de la invención es proporcionar un método para evaluar animales que incremente la precisión de los métodos de selección y cría para los rasgos deseados. Aún otro objeto de la invención es proporcionar una prueba de amplificación PCR la cual facilitará grandemente la determinación de la presencia del marcador. Un objeto adicional de la invención es proporcionar un equipo para evaluar una muestra de ADN animal para el marcador genético identificado. Éstos y otros objetos, características, y ventajas serán aparentes después de la revisión de la siguiente descripción y reivindicaciones de la invención que siguen. Esta invención se refiere al descubrimiento de un polimorfismo dentro del gen del receptor melanocortina-4 (MC4R) el cual está asociado con los rasgos de contenido de grasa, velocidad de crecimiento, y conversión de alimento en animales. De acuerdo a la invención, la asociación del polimorfismo MC4R con el rasgo (s) permite que los marcadores genéticos sean identificados para razas o líneas genéticas específicas. El patrón de restricción Taql el cual identifica el polimorfismo se usa para probar la presencia o ausencia de marcadores asociados con los rasgos metabólicos deseables. El genotipo marcador dependiente de raza (es decir, un marcador en algunas razas y un no marcador en otras) consiste de un polimorfismo dentro de MC4R, una transición de guanina en adenina en la posición 678 del producto PCR (una mutación missense del codón ácido aspártico (GAU) en el codón asparagina (AAU) en la posición de aminoácido 298 de la proteína MC4R) . La invención incluye pruebas para la detección del marcador así como la secuencia de caracterización del polimorfismo e incluye secuencias novedosas en el gen MC4R que pueden usarse para diseñar cebadores de amplificación para tal prueba. Adicionalmente, la invención incluye un método para usar la prueba en programas de cría para la selección animal y un equipo para realizar la prueba. Definiciones Como se usa en la presente, "bajo contenido de grasa" o "flacura" significa una disminución biológicamente significativa en la grasa corporal relativa a la media de una población dada. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es el listado de la secuencia para MC4R en cerdos (SEQ. ID NO. : 1) . "X" representa el sitio del polimorfismo.

La Figura 2 representa una comparación de la secuencia de ADN entre el gen MC4R humano (SEQ. DE IDENT. NO: 2) y el porcino (SEQ. DE IDENT. NO: 3) . La Figura 3 representa una comparación de la secuencia de aminoácidos entre el gen humano MC4R (SEQ. DE IDENT. NO: 4) y el porcino (SEQ. DE IDENT. NO : 5 ) . Las Figuras 4a, 4b, y 4c son reportes de enlace para MC4R desde CRI-MAP. La Figura 5 representa secuencias de nucleótidos y aminoácidos parciales (SEQ. DE IDENT. NO: 12) del gen MC4R porcino. La traducción de aminoácidos muestra una sustitución de aminoácidos en el codón 298. La Figura 6 es una electroforesis en gel de la digestión Taql del producto PCR. El marcador molecular (M) y los genotipos MC4R se indican en lo alto de cada línea. La Figura 7 representa alineaciones múltiples del dominio transmembrana séptimo putativo de porcino MC4R con otro MCR y GPCR. El "*" representa las posiciones de secuencia predichas para MC4R porcino. Las otras secuencias de aminoácidos se obtuvieron de la base de datos de GenBank (números de acceso P32245, P70596, P41983, P56451, P34974, P41968, P33033, Q01718, Q01726, Q28031, AF011466, P21554, P18089, P30680, P47211) . La variante missense en MC4R porcino aminoácido N por D sustituido en la posición marcada con una flecha. El residuo Asp (D) se conserva altamente entre los MCR, y el residuo Asn (N) se conserva bien en la mayoría de los otros GPCRs. La obesidad es un trastorno que afecta el equilibrio de energía. El control del metabolismo de energía es simple: almacenar la energía excesiva como grasa y administrar la energía para evitar _ el almacenamiento de energía superfluo, es decir, obesidad. Aunque se han implicado diversos genes y sistemas de señalamiento en la obesidad, se ha conocido poco acerca de la interconexión del mecanismo homeostático de energía y el polimorfismo genético. El receptor de melanocortina-4 (MC4R) ha mostrado ser un mediador importante de la homeostasis de peso a largo plazo. Los antagonistas de MC4R pueden incrementar la toma de alimento y el peso corporal durante la administración crónica. Skuladottir, G.V., et al., "Long term orexigenic effect of a novel melanocortin 4 receptor selective antagonist", British J. Of Pharm., 126(1) :27-34 (1999) . Lu et al. (1994) sugirió que los receptores de melanocortina están involucrados en el control de la ingestión de alimento y en el balance de energía a través de estudiar su antagonismo para el síndrome de obesidad agouti . Huszar et al. (1997) encontró que la inactivación del gen del receptor de melanocortina-4 (MC4R) resultó en una madurez del comienzo del síndrome de obesidad en ratones y demostró un papel principal de la proteína MC4R en la regulación del equilibrio de energía relacionado al síndrome de obesidad agouti . Además, la proteína MC4R medía los efectos de leptina, una de las moléculas de señalamiento importantes en la homeostasis de energía (Seeley et al. 1997) . De acuerdo a la presente invención, una variante o polimorfismo en el gen MC4R, y esta variabilidad genética está asociada con diferencias fenotípicas en los rasgos metabólicos de contenido de grasa, velocidad de crecimiento, y/o consumo de alimento. En una modalidad de la invención, se proporciona una prueba para la detección de la presencia de un genotipo deseable. La prueba involucra amplificar el ADN genómico purificado de sangre, tejido, semen, u otra fuente conveniente de material genético para el uso de cebadores y técnicas estándar, tales como la reacción en cadena de polimerasa (PCR) , digerir después el ADN con una enzima de restricción (por ejemplo, Taql) para producir fragmentos de gen de diversas longitudes, y separar al menos algunos de los fragmentos de otros (por ejemplo, usando electroforesis) . Los fragmentos también pueden detectarse hibridizando con una sonda nucleótido (por ejemplo, DNAc radio-marcadas) que contenga toda o al menos una porción de la secuencia de ADNc del gen MC4R de los fragmentos separados y comparando los resultados de la hibridización con los resultados de la prueba para una secuencia de gen conocida por tener el marcador o una secuencia conocida por no tener el marcador. La selección y el uso de sondas para la detección de secuencias MC4R basándose en las secuencias MC4R conocidas y descritas es generalmente conocida a aquellos expertos en la técnica. La sonda puede ser cualquier secuencia que hibridizará a los productos de digestión separados y permitirá la detección. Otra modalidad de la invención proporciona un equipo para probar la presencia en una secuencia de gen MC4R de un marcador genético. Siendo el marcador indicativo de rasgos heredables de contenido de grasa, velocidad de crecimiento, y/o consumo de alimento. El equipo en una modalidad preferida también incluye cebadores PCR novedosos que comprenden 4-30 bases contiguas en cualquier lado del polimorfismo para proporcionar un sistema de amplificación que permite la detección del polimorfismo Taql por PCR y digestión Taql de los productos PCR. Los cebadores preferidos son SEQ. DE IDENT. NO : 8 y SEQ. DE IDENT. NO : 9 Una modalidad adicional comprende un método de cría por el cual una prueba del tipo anterior se conduce sobre una pluralidad de secuencias de gen de diferenteaS animales o embriones animales a ser seleccionados y n base a los resultados, ciertos animales se seleccionan o retiran del programa de cría. De acuerdo a la invención, describe el polimorfismo en el gen MC4R, identificable por el patrón de restricción Taql. Como es conocido en la técnica, los patrones de restricción no son determinantes exactos del tamaño de los fragmentos y son solamente aproximados. El polimorfismo es identificable por tres bandas de una digestión Taql del producto PCR, 466, 225, y 76 pares de bases (bp) para un genotipo homocigoto (alelo 1) ; dos bandas, 542 y 225 bp para otro genotipo homocigoto (alelo 2) ; y cuatro bandas para el genotipo heterocigoto (542, 466, 225, y 76 bp) . El marcador de magres y menor ingestión de alimento es identificable por las bandas 466/225/76, excepto para los cerdos chinos, en donde el marcador de los cerdos chinos de magres es las bandas 542/225. El marcador de más rápida velocidad de ganancia es identificable por las bandas 542/225. Además, el polimorfismo asociado con el patrón se ha identificado al nivel del nucleótido. El sitio Taql polimórfíco se hizo secuencia junto con el área circundante general. Véase SEQ. DE IDENT. NO: 1. Las secuencias que rodean el polimorfismo han facilitado el desarrollo de una prueba PCR en la cual un cebador de aproximadamente 4-30 bases contiguas tomado de la secuencia inmediatamente adyacente al polimorfismo se usa en conexión con una reacción en cadena de polimerasa para amplificar grandemente la región antes del tratamiento con la enzima de restricción Taql . Los cebadores no necesitan ser el complemento exacto; son aceptables secuencias substancialmente equivalentes . De los datos de secuencia, se observó que en el alelo 2 la guanina está sustituida con una denina en la posición 678 del producto de PCR o en la posición aminoácido 298 de la proteína MC4R cambiando el codón ácido aspártico (GAU) en un codón asparagina (AAU) . La prueba PCR para el polimorfismo usó un cebador hacia delante de 5 ' -TGG CAA TAG CCA AGA ACA AG-3 ' (SEQ. DE IDENT. NO: 6) y un cebador hacia atrás de 5 * -CAG GGG ATA GCA ACA GAT GA-3' (SEQ. DE IDENT. NO: 7) . Los cebadores específicos de cerdo usados fueron un cebador hacia delante de 5 ' -TTA AGT GGA GGA AGA AGG-3 ' (SEQ. DE IDENT. NO: 8) y un cebador hacia atrás de 5 ' -CAT TAT GAC AGT TAA GCG G-3' (SEQ. DE IDENT. NO: 9) . El producto amplificado resultante de aproximadamente 750 bp, cuando se digirió con Taql, resultó en fragmentos alélicos de 466, 225, y 76 bp (alelo 1) o 542 y 225 bp (alelo 2) . El marcador puede ser identificado por cualquier método conocido para uno de experiencia común en la técnica que identifica la presencia o ausencia del marcador, que incluye por ejemplo, análisis de polimorfismo de conformación de hebra sencilla (SSCP) , análisis RFLP, análisis heteroduplex, electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante, y electroforesis con gradiente de temperatura, reacción en cadena de ligasa o aún secuenciación directa del gen MC4R y examen del patrón de reconocimiento Taql RFLP. Una o más enzimas de restricción adicionales y/o sondas y/o cebadores pueden usarse. Enzimas adicionales, sondas construidas, y cebadores pueden determinarse por experimentación rutinaria por aquéllos de experiencia común en la técnica. Otras técnicas posibles incluyen sistemas no-gel tales como TaqMan™ (Perkin Elmer) . En este sistema, se diseñan cebadores oligonucleótidos PCR que flanquean la mutación en cuestión y permiten la amplificación PCR de la región. Una tercera sonda de oligonucleótido se diseña después para hibridizarse a la región que contiene el sujeto base a cambiar entre los diferentes alelos del gen. Esta sonda se marca con colorantes fluorescentes en ambos extremos 5' y 3'. Estos colorantes se seleccionan de tal forma que en esta proximidad del uno con el otro la fluorescencia de uno de ellos se extingue, por el otro y no puede detectarse. -La extensión Taq DNA polimerasa desde el cebador PCR colocado 5 ' sobre la plantilla relativa a la sonda conduce el desdoblamiento del colorante unido en el extremo 5 ' de la sonda templado a través de la actividad de 5 ' nucleasa de la Taq DNA polimerasa. Esto elimina el efecto de extinción permitiendo la detección de la fluorescencia del colorante en el extremo 3' de la sonda. La discriminación entre diferentes secuencias de ADN surge a través del hecho de que si la hibridización de la sonda con la molécula plantilla no es completa, es decir, existe alguna forma de desajuste, el desdoblamiento del colorante no toma lugar. Así, solamente si la secuencia de nucleótidos de la sonda de oligonucleótidos es completamente complementaria a la molécula plantilla a la ei cual se une se eliminará la extinción. Una mezcla de reacción puede contener dos secuencias sonda diferente cada una diseñada en contra de alelos diferentes que pudieran estar presentes permitiendo así la detección de ambos alelos en la reacción. Aunque el uso de los RFLP es un método para detectar el polimorfismo, otros métodos conocidos a alguno de experiencia común en la técnica pueden usarse. Tales métodos incluyen unos que analizan el producto del gen polimórfico y detectan polimorfismos al detectar las diferencias que resultan en el producto del gen. Aunque el método preferido para separar fragmentos de restricción es electroforesis en gel, otros métodos alternativos conocidos a alguno de experiencia en la técnica pueden usarse para separar y determinar el tamaño de los fragmentos de restricción. Es posible seleccionar indirectamente el polimorfismo con marcadores de ADN alternativos. Es posible establecer un enlace entre alelos específicos -de marcadores de ADN alternativos y alelos de marcadores de ADN conocido por estar asociado con el gen MC4R el cual se ha mostrado previamente estar asociado con un rasgo particular. Ejemplos de marcadores sobre el mapa de cromosomas PiGMaP publicado los cuales se enlazan al gen MC4R incluyen S0331, BHT0433, y S0313. Los reactivos adecuados por aplicar los métodos de la presente invención pueden empacarse dentro de equipos convenientes. Los equipos proporcionan los materiales necesarios, empacados en recipientes adecuados. Por lo menos, el equipo contiene un reactivo que identifica el polimorfismo en el gen MC4R que está asociado con los rasgos de interés, contenido de grasa, velocidad de crecimiento, y consumo de alimento. Preferentemente, el reactivo que identifica el polimorfismo es un equipo PCR (un equipo de cebadores, ADN polimerasa, y cuatro nucleosido trifosfatos) que se hibridizan con el gen MC4R o un fragmento del mismo. Preferentemente, el conjunto PCR y la enzima de restricción que desdobla el gen MC4R en al menos un lugar se incluyen en el equipo. Preferentemente, el equipo comprende adicionalmente medios adicionales, tales como reactivos, para detectar o medir la entidad detectable o proporcionar un control. Otros reactivos usados para hibridización, prehibridización, extracción de ADN, visualización, y propósitos similares también pueden incluirse, si se desea. Los marcadores genéticos, métodos, y equipos de la invención son útiles en un programa de cría para mejorar las características de contenido de grasa, velocidad de crecimiento, y consumo de alimento en una raza, línea, o población de animales. La selección continua y cría continua de animales que son al menos heterocigotos y preferentemente los homocigotos para el polimorfismo deseado asociado con el rasgo particular conducirían a una raza, línea, o población que tiene esos rasgos deseados. Así, el marcador es una herramienta de selección. Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar pero no limitar la invención. EJEMPLO 1 Prueba PCR-RFLP del Receptor de Melanocortina 4- polimorfismo Taql y Mapeo del Enlace Genético del Gen MC4R Cebadores: Los cebadores se diseñaron de regiones homologas de secuencias MC4R humanas y de ratas (Genbank Accession No. s77415 y u67863, respectivamente) . Estos cebadores se usaron para amplificar una secuencia de 750-bp del gen MC4R porcino. MC4R1: 5' TGG CAA TAG CCA AGA ACA AG 3' (SEC. DE IDENT. NO: 6) MC4R4: 5' CAG GGG ATA GCA ACA GAT GA 3' (SEC. DE IDENT. NO: 7) Condiciones de PCR: Mezcla 1: Regulador Promega 10X 1.0 µL 25 mM de MgCl2 O .6 µL mezcla de dNTPs (2.5 mM cada una) 0.5 µL 25 pmol/µL de MC4R1 0.1 µL 25 pmol/µL de MC4R4 0.1 µL dd H20 estéril 7.5 µL Taq Polymerase (12.5 ng/µL) 0.07µL ADN Genómico (12.5 ng/µL) 1.0 µL Diez µL de Mezcla 1 y ADN se combinaron en un tubo de reacción, después se cubrió con aceite mineral. Se corrió el siguiente programa PCR: 94 °C durante 2 minutos; 35 ciclos de 94 °C jurante 30 segundos; 58 °C 1 minuto, y 72 °C 1 minuto 30 segundos; seguido por una extensión final a 72°C durante 15 minutos. Cinco µl del producto de reacción PCR se comprobó sobre un estándar de gel de agarssa al 1% para confirmar el éxito de la amplificación y limpiar el control negativo. El tamaño de producto es aproximadamente 750 pares de base. La digestión se realizó por el siguiente procedimiento. Reacción de Digestión Taql . _ reacción de 10 µL producto PCR 5.0 µL Regulador Taql NE 10X 1.0 µL BSA (lOmg/ml) 0.1 µL enzima Taql (20 U/µL) 0.5 µL dd H20 estéril 3.4 µL Se hizo un coctel del regulador, enzima, BSA, y agua. Se agregó cinco µL a cada tubo de reacción conteniendo el ADN. La mezcla se incubó después a 65 °C durante al menos 4 horas durante la noche. La carga de colorante se mezcló con la reacción de digestión y el volumen total se cargó sobre un gel de agarosa al 3%. Las bandas principales para el alelo 1 son aproximadamente 466, 225, y 76 bp . Las bandas genotipo del alelo 2 son 542 y 225 bp . El genotipo heterocigoto tiene ambos alelo 1 y alelo 2. Resultados El producto PCR amplificado es de aproximadamente 750 bp. La secuencia del producto PCR confirmó que el producto PCR es el gen MC4R con 97.6%, y 92.2% de identidades en los niveles de aminoácido y ADN, respectivamente, con las secuencias humanas correspondientes. (Véase Figuras 2 y 3) . La digestión Taql del producto PCR produjo fragmentos alélicos de 466, 225, y 76 bp (alelo 1), o 542 y 225 bp (alelo 2) . El genotipo heterocigoto tiene ambos tipos de alelos. Se observó herencia Mendeliana en tres familias de referencia internacionales de tres generaciones, las cuales se usaron para trazar un mapa de este gen por análisis de enlace . El polimorfismo entre el alelo 1 y alelo 2 que resulta de una transición G—A en la posición 678 del producto PCR reveló una mutación missense del codón Acido aspártico (GAU) en el codón Asparagina (AAU) en la posición aminoácido 298 de la proteína MC4R. (Véase Figura 1, SEQ. DE IDENT. N0:1) . Las frecuencias de alelo se determinaron por genotipo de las muestras de ADN de un pequeño número de animales de diferentes razas (Tabla 1) . El alelo se observó con una frecuencia de 1 en Meishan, pero no se observó o se observó a muy baja frecuencia en X, Hampshire y Yorkshire. Las frecuencias de alelo 1 en Landrace y Chester White fueron 0.5, respectivamente. Las Figuras 2 y 3 ilustran las diferencias entre las secuencias de ADN y aminoácido del gen MC4R humano y porcino (SEQ. ID. N0S:2-5) . TABLA 1 La Frecuencia del Alelo 1 en Diferentes Razas de Cerdo Análisis de Enlace Se realizaron análisis de enlace de dos puntos y multi-punto sobre los genotipos de las familias de referencia internacionales. Véase Figuras 4a-4c. Los datos se analizaron usando el programa CRI-MAP. El MC4R enlazó significativamente a diversos marcadores en cromosomas porcinos (SSC)l. Los marcadores más cercanamente enlazados (fracción de recombinación y marcador LOD en paréntesis) son S0331 (0.02, 21.97), BHT0433 (0.02, 21.32), y S0313 (0.00, 17.76) por análisis de enlace de dos puntos. Un análisis de enlace multi-punto produjo el mejor orden de mapa de marcadores y MC4R (con distancia en Kosambi cM) : KGF-5.8-CAPN3-2.5-MEF2A-6.1-MC4R-5.6-S0313. Se usó un panel híbrido de célula somática de cerdo y roedor para asignar MC4R a una región citogenética. Los productos PCR de cebadores específicos de cerdo se amplificaron en clones 7, 8, 16, 18, y 19. MC4R se localizó en SSClq 22-27. EJEMPLO 2 Prueba PCR-RFLP Receptor MC4R Usando Cebadores Específicos de Cerdo y Mapeo de Enlace Genético del Gen MC4R Porcino Secuencias Cebadoras Específicas de Cerdo Cebador hacia delante: 5 ' -TTA AGT GGA GGA AGA AGG-3' (SEC. DE IDENT. NO : 8 ) Cebador hacia atrás : 5 ' -CAT TAT GAC AGT TAA GCG G-3' (SEC. DE IDENT. NO:9) Método de Detección La reacción PCR se realizó usando ADN Genómico de Porcino 12.5 ng Regulador PCR lx MgCl2 1.5 mM dNTP 0.125mM Cebador hacia delante 0.3 µM Cebador hacia atrás 0.3 µM Taq DNA polimerasa (Promega) 0.35 U en un volumen final de 10 µL . El perfil PCR incluyó 2 minutos a 94°C; 35 ciclos de 30 segundos a 94°C, 1 minuto a 56°C, 1 minuto 30 segundos a 72 °C; y 15 minutos a 12 ° C en un Robocycler (Statagene, La Jolla, CA) . Un alícuota de 5.0 µL de los productos PCR se digirió en un volumen total de 10 µL con 10 U de Taql incubado durante la noche a 65 °C. Los productos de digestión se les hizo electroforesis sobre un gel de agarosa al 3%. Descripción de Polimorfismo La digestión Taql del producto PCR produjo fragmentos de 466, 225, y 76 bp en el alelo 1 y 542 y 225 bp en el alelo 2. El genotipo heterocigoto tiene fragmentos de ambos alelo 1 y alelo 2. - Patrón de Herencia Se observó segregación autosomal de herencia Mendeliana en tres familias PiGMaP europeas de tres generaciones (Archibald et al., 1995). Frecuencias de Alelo Las frecuencias de alelo se determinaron por genotipo de los animales abuelos de las familias PiGMaP europeas y anímales no relacionados de familias de referencia ISU. El alelo 1 se observó con las siguientes frecuencias. TABLA 2 La Frecuencia del Alelo 1 en Diferentes Razas de Cerdo.

Ubicación Cromosómica Se realizaron análisis de enlace de dos puntos y multi-punto sobre los fenotipos de tres familias PiGMaP usando el programa CRI-MAP (Green et al 1990.). MC4R se enlazó significativamente a diversos marcadores sobre el cromosoma 1 porcino (SSC 1) . Los marcadores más cercanamente enlazados (fracción de recombinación y marcador LOD en paréntesis) son es S0331 (0.02, 21.97), BHT0433 (0.02, 21.32), y S0313 (0.00, 17.76) de acuerdo el análisis de enlace de dos-punto. El mejor orden de mapa de MMC4R con respecto a otros marcadores enlazados producido por análisis de enlace multi-punto es como sigue (con distancia en Kosambi cM) : KGF-5.8-CAPN3-2.5-MEF2A-6.1-MC4R-5.6-S03L3. Comentarios El receptor de melanocortina-4 es una proteína G acoplada, receptor transmembrana siete expresado en el cerebro. Huszar et al. (1997) encontró que la inactivación del gen MC4R resultó en el comienzo de madurez del síndrome de obesidad en ratones y demostró un papel principal de la proteína MC4R en la regulación del equilibrio de energía. El gen MC4R ha sido formado el mapa para el cromosoma humano 18q21.3 (Gantz et al., 1993). La localización del gen MC4R a SSC ] es consistente con datos de pintura de cromosoma previos que indican synteny entre este cromosoma y HSA 18 y 15 (Goureau et al., 1996) . Sin embargo, el orden de genes de diversos genes que previamente se formó el mapa de HSA 18 y 15 a SSC 1, que incluye CAPN3, KGF, y MEF2A, no se conserva con MC4R. Por lo tanto, el mapeo de MC4R a SSC 1 puede identificar un punto de rompimiento evolucionarlo entre HSA 18 y 15 con relación a SSC 1. EJEMPLO 3 Asociación del Marcador con Características Metabólicas Incrementadas En un estudio preliminar para determinar qué alelo está asociado con qué rasgo y en qué razas, los genotipos de diversas líneas de animales se correlacionaron con días para 110 kg, mediciones de retroceso de la grasa, ganancias diarias, e ingestión de alimentación diaria promedio. Los cerdos usados en el estudio fueron de las líneas de Pig Improvement Company (PIC) . Los datos se acumularon usando la prueba PCR descrita supra para el alelo 1 y 2 del gen MC4R. Los datos recolectados se resumen en las Tablas 3-8 posteriores. Conforme a los resultados, el alelo 1 es el alelo significativamente magro (véase mediciones de P2 retroceso de la grasa) en todas las líneas excepto en cerdos chinos en donde es el alelo graso. El alelo 2 está asociado con una velocidad significativamente más rápida de ganancia (prueba de ganancia diaria) en las líneas comerciales probadas. El alelo 1 general está asociado con menor ingestión alimenticia. TABLA 3 Número de observaciones Genotipo MC4R: 11 = alelo 1 homocigoto 12 = heterocigoto 22 = alelo 2 homocigoto TABLA 4 Número de observaciones (machos/hembras,' TABLA 5 Días para llOkg Tabla 6 P2 retroceso de la grasa (mm) TABLA 7 Prueba de ganancia diaria (gm/d) TABLA 8 Ingestión alimenticia diaria promedio (kg/d), solamente verracos, excepto L95 la cual cerdas jóvenes solamente EJEMPLO 4 Una Variante Missense del Gen del Receptor melanocortina-4 (MC4R) Porcino está Asociado con Características de Gordura, Crecimiento, e Ingestión Alimenticia Para determinar si había una asociación de este polimorfismo MC4R con variación fenotípica se probó la mutación en un número grande de animales individuales de diversas líneas de cerdos diferentes. El análisis del registro de las pruebas de crecimiento y funcionamiento mostraron asociaciones significativas de genotipos MC4R con retroceso de la grasa, velocidad de crecimiento e ingestión alimenticia. Es probable que el residuo de aminoácido variable de la mutación MC4R cause un cambio significativo de la función MC4R . Estos resultados apoyan el significado funcional de una mutación MC4R de cerdo u sugiere que los genómicos comparativos basados en especie modelo pueden ser igualmente importantes para la aplicación a animales de granja como lo son para medicina humana. La identificación de mutaciones en la leptina y- el receptor leptina ha proporcionado alguna información de los componentes genéticos involucrados en la regulación del equilibrio de energía (Zhang et al. 1994; Tartaglia et al. 1995) . Los estudios genéticos usando modelos animales han facilitado la identificación de causas genéticas principales y obesidad (Andersson 1996; Pomp 1997; Giridharan 1998) . Además, diversos otros genes involucrados en la ruta de señalamiento neural de homeostasis de energía se han identificado (Flier and Maratos-Filer 1998, Schwartz et al. 1999) . De particular interés entre las moléculas de señalamiento candidatas involucradas en la, regulación de homeostasis de energía es el receptor de melanocortina-4 (MC4R) . La respuesta de MC4R al señalamiento de leptina es un enlace entre la ingestión de alimento y el peso corporal (Seeley et al. 1997; Marsh et al. 1999) . El señalamiento del neuropéptido Y (NPY) en el sistema nervioso central se medía también por la proteína MC4R (Kask et al. 1998) . Diversas mutaciones en MC4R que incluyen cambio de estructura y mutaciones sin sentido están asociadas con obesidad dominantemente heredada en humanos (Vaisse et al. 1998; Yeo et al. 1998) . Algunas otras mutaciones missense de MC4R en humanos también se han identificado (Gotoda et al. 1997; Hinney et al. 1999) pero el significado funcional de estas mutaciones no se ha caracterizado. La selección basada en las características de crecimiento ha sido de gran importancia a la industria de los cerdo debido a los costos asociados concia alimentación y la preferencia del consumidor de carne magra. La mejoría genética eficiente en estos rasgos cuantitativos puede aumentarse a través del uso de la selección asistida por marcador (MAS) usando mapas genéticos de alta densidad densidad (Dekkers and van Arendonk 1998, Rothschild and Plastow 1999) . Una herramienta importante en este proceso es la producción de mapa comparativa usando los bien desarrollados mapas de gen humano y de ratón, que asisten en la identificación de las regiones genómicas correspondientes o genes principales que controlan los rasgos de crecimiento y funcionamiento en el cerdo. El entendimiento biológico de los rasgos complejos en humanos o especies modelos ofrece una propuesta alternativa para identificar genes responsables de los rasgos de interés económico en ganado. Diversos muéstreos de sitios característicos cuantitativos (QTL) usando ratas fenotípicamente divergentes y análisis de gen candidato se han conducido exitosamente para rasgos de gordura y crecimiento (Yu et al. 1995, Casas-Carrillo et al. 1997, Knorr et al. 1997; Knott et al. 1998; Rohrer et al. 1998; Wang et al. 1998; Paszek et al. 1999), pero aún no se han establecido genes individuales con efectos principales sobre los rasgos de crecimiento y funcionamiento para poblaciones comerciales. El papel del MC4R en la ingestión alimenticia y la obesidad sugiere que puede ser un marcador genético importante para los rasgos relacionados en el crecimiento en el cerdo. Materiales y Métodos Animales . Se crecieron cerdos bajo condiciones de producción normales bajo el cuidado de empleados PIC en granjas núcleo en los Estados Unidos y Europa. Los cerdos se pusieron en la prueba de funcionamiento aproximadamente a los 70 días de edad y se retiraron de la prueba después de 13 semanas. Al final de la prueba se midió retroceso de la grasa ultrasónicamente en tiempo real (modo B) en la 10a costilla 2 cm desde la línea central. La ganancia diaria promedio (crecimiento) durante el periodo de prueba se calculó como el peso ganado dividido entre los días de la prueba. Los días para el peso comercial de 110 kg se estimó usando procedimiento estándar. La ingestión alimenticia se midió usando equipo de medición electrónico individual. Amplificación PCR de un fragmento de gen MC4R de cerdo . Los cebadores se diseñaron de regiones homologas de secuencias MC4R humanas y de ratas (número de acceso del GenBank s77415 y u67863, respectivamente) . Los cebadores fueron: cebador hacia delante: 5 ' -TGG CAA TAG CCA AGA ACA AG-3' (SEQ ID. NO: 6) y cebador hacia atrás: 5 ' -CAG GGG ATA GCA ACA GAT GA-3' (SEQ. DE IDENT. NO : 7 ) . La reacción PCR se realizó usando 12.5 ng de ADN genómico porcino, regulador PCR lx, 1.5 mM de MgCl2, 0.125 mM de dNTP, 0.3 mM de cada cebador, y 0.35 U de (Promega) Taq DNA polimerasa (Promega) en un volumen final de 10 µL . Las condiciones para PCR fueron como sigue: 2 minutos a 94 °C, 35 ciclos de 30 segundos a 94°C, 1 minuto a 56°C, 1 minuto 30 segundos a 92°C, y una extensión final de 15 minutos a 72 °C en un Robocycler (Stratagene, La Jolla, CA) . Secuencición y detección de mutaciones. La secuenciación de los productos PCR de diversos cerdos individuales de razas diferentes se condujo y las secuencias se compararon para detectar cualquier cambio de nucleótido. La secuenciacíón se realizó en un secuenciador ABl 377 (Apllied Biosystems) La secuencia MC4R porcina se ha oresentado al GenBank, y tiene número de acceso AF087937. El análisis secuencial reveló una sustitución de nucleótido situada dentro de un sitio de reconocimiento de enzima de restricción Taql (Kim et al. 1999) . S e diseñó después un conjunto de cebadores para generar un fragmento de gen MC4R más pequeño, el cual contuvo solamente un sitio de restricción Taql informativo para especificar el sitio polimórfico y facilitar la prueba PCR-RFLP. Estos cebadores fueron: hacia delante 5 ' -TAC CCT GAC CAT CTT GAT TG-3 ' (SEQ. DE IDENT. NO: 10) y hacia atrás: 5 ' -ATA GCA ACA GAT GAT CTC TTT G-3' (SEQ. DE IDENT. NO: 11) . Análisis estadístico. El análisis de procedimientos variables se usó con un patrón mezclado que tomó en cuenta los efectos fijos de granja, periodo de prueba, sexo del animal, genotipo MC4R y sitio (al azar) . Todos los animales en líneas de descendencia Americana/Europea (Líneas A-D) se reunieron para el análisis general y en este análisis se incluyó la línea de origen. Los efectos medios se estimaron para cada genotipo y se presentan en las Tablas 9-15. Las pruebas F generales se determinaron para determinar el nivel de importancia. Resultados Identificación de una mutación missense en el gene MC4R de cerdo. El gen MC4R consiste de aproximadamente 1 kb de secuencia de codificación contenida dentro de un exon sencillo. Aproximadamente 750 bp de un fragmento de gen MC4R de cerdo se produjo por PCR (Kim et al. 1999) . La secuencia del producto PCR confirmó que el producto PCR es el gen MC4R con identidades de 92.2% y 97.6% a niveles de nucleótido y aminoácido, respectivamente, para la secuencia MC4R humana. Las alineaciones múltiples de la secuencias de animales individuales de diversas razas identificaron una substitución del nucleótido sencilla (G—A; Figura 5) . El polimorfismo reveló una mutación missense que reemplaza ácido aspártico (GAU) con asparagina (AAU) en la posición idéntica al aminoácido 298 de la proteína MC4R humana. Para confirmar este cambio de base, se diseñaron cebadores específicos para cerdo que flanquean el sitio polimórfico y analizamos el polimorfismo como un gel Taql PCR-RFLP (Figura 6) . La Figura 6 muestra una digestión Taql del producto PCR analizado por electroforesis en gel-agarosa. El alelo 1 produjo fragmentos de 156 y 70 bp y el alelo 2 produjo un fragmento de 226 bp como el PCR-RFLP. El heterocigoto tiene fragmentos de alelo 1 y 2. Los genotipos del marcador molecular (M) y MC4R se indican en lo alto de cada línea. La mutación missense MC4R está dentro de una región altamente conservada entre receptores de melanocortina (MCR) . Los MCR es una familia de receptores acoplados a proteína G (GPCR) que contiene ciertos elementos estructurales conservados comunes a la mayoría de otros GPCR, pero las identidades generales de aminoácido entre MCR y otros GPCR son bajas (Tatro 1996) . Una alineación múltiple de la secuencia de aminoácidos predicha del MC4R de cerdo con proteínas MC4R de otras especies, otras proteínas MCR, o GPCR representativa mostró que el ácido aspártico encontrado en la posición 298 del séptimo dominio transmembrana se conserva muy altamente en las proteínas MCR (Figura 7) . Es interesante notar, sin embargo, que esta posición está ocupada por asparagina en la mayoría de los otros GPCR. Las proteínas MCR muestran 40-80% de identidad de aminoácidos entre sí (Tatro 1996) , pero el segundo bucle intracitoplásmico y el séptimo dominio transmembrana se conservan altamente entre las proteínas MCR (Gantz et al. 1993) . Algunas de las relaciones entre la estructura MCR y la función se ha descubierto por los estudios de mutaciones naturales y experimentales en humanos y ratones (Robbins et al. 1993; Valverde et al. 1995; Frandberg et al. 1998) . Estos estudios indican que algunas mutaciones en regiones altamente conservadas causan cambios estructurales .y alteran la función del receptor. La mutación substitución Asp298Asn pudiera tener un efecto sobre la función del receptor. Sin embargo, esto requerirá prueba adicional pero se conoce que el cambio del residuo homólogo en MC1R (Asp294His) está asociado con piel bella y pelo rojo en humanos (Valverde et al. 1995) . La mutación missense de MC4R está asociada con rasgos relacionados a la obesidad. Para investigar los efectos de la mutación missense, la relación de genotipos MC4R se analizó por los efectos de variación en la velocidad y crecimiento, retroceso de la grasa, y alimentación consumida en sobre 1,800 animales de diversas líneas comerciales de cerdos de PIC, una compañía de cerdos internacional. Los animales fueron de líneas comerciales cercanas de líneas europeas/americanas (Líneas A-D) junto con una línea originada de una cruza entre una raza europea y una china (Línea E) . En las lineas A-D se encontraron asociaciones significativas de los genotipos MC4R para todos los rasgos de funcionamiento. Los animales homocigotos del alelo 1 tuvieron en promedio retroceso de la grasa significativamente menor (P<.001), ganancia diaria menor (P<.001), e ingestión alimenticia menor (P<.01) que aquellas de los animales genotipo 22 homocigotos (Tablas 11, 13, & 15) . Los cerdos totales con el genotipo 11 tuvieron aproximadamente 9% menos de retroceso de la grasa que los cerdos con el genotipo 22 (Tabla 11), mientras que los cerdos con el genotipo 22 crecieron significativamente más rápido (37g/day) que los cerdos con el genotipo 11 (Tabla 13) . Estos resultados parecen ser una función del apetito debido a que los animales de genotipo 22 consumen considerablemente más alimento (Tabla 15) . La asociación entre la variable missense del gen MC4R y los rasgos de funcionamiento relacionados están claramente establecidas en las razas Europea/Americana. Aunque el número de animales probados es muy más pequeño, estos resultados no se vieron en la línea cruzada china considerada considerablemente más grasosa (Línea E) . Interesantemente, la línea E muestra una tendencia para retroceso de la grasa en la dirección opuesta que se observó en otras líneas (Tabla 11) .

Discusión El presente estudio demuestra claramente que la mutación missense de MC4R porcino está significativamente asociada con diversos rasgos de funcionamiento en cerdos, El alelo 1 representa Asp298, el aminoácido bien conservado dentro de otros subtipos MCR y otras especies MC4R, se asoció con menos espesor de retroceso de la grasa, velocidad de crecimiento menor, y menor ingestión de alimento y el alelo 2 representan Asn298 se asoció con animales más grasosos, ingestión de alimento más alta y crecimiento más rápido. Como los residuos altamente conservados en las proteínas receptoras de melanocortina tienen papeles importantes para enlaces ligando de transmisión de señal intracelular (Tatro 1996), las variantes MC4R pudieran ejercer habilidades funcionalmente distintas en la regulación de la ingestión de alimento y peso corporal. La prueba adicional de esta hipótesis proporcionará disernimientos importantes dentro de la base estructural de la .función MCR y un objetivo molecular para el tratamiento de la obesidad humana. El alelo 1 se asoció con los animales más grasosos en la línea E, la cual se derivó cruzando una raza China Large White con una línea de origen Meishan. Esto es sorprendente dado que la mutación causa un cambio de aminoácido significativo en una región bien conservada. El resultado puede deberse al muestreo. Sin embargo, si suponemos que este resultado será significativo cuando se agreguen más resultados existen diversas explicaciones posibles. Una posibilidad podría ser la diferencia en los efectos de gen fundamentales (epistasis) . Como el crecimiento y la gordura son rasgos poligénicos complejos, es ciertamente posible que la raza china tenga algunas interacciones alélicas distintas derivadas de varios cientos de años de aislamiento y estas interacciones putativas pudieran crear variación en los rasgos poligénicos dentro de las cruzas entre líneas ampliamente diferentes (Frankel and Schork. 1996) . Diversos análisis QTL se han conducido para los rasgos de gordura y crecimiento usando líneas divergentes (Cases-Carrillo et al. 1997; Knott et al. 1998; Rohrer et al. 1998; Wang et al. 1998; Paszek et al. 1999), pero no se ha reportado QTL cerca del sitio C4R, que produce el mapa para el cromosoma 1 a aproximadamente 80 cm del mapa de enlace (datos no mostrados) . Puede significar que los efectos epistáticos de los alelos MC4R sugeridos en la Línea E han hecho difícil observar el sitio MC4R en la mayoría de los experimentos QTL que han involucrado cruzas entre las líneas china y Europea/Americana. Es probable que el efecto de algunos alelos será variable en las raíces diferentes y difícil de detectar en experimentos QTL que involucran razas genéticamente divergentes. El efecto de la variable MC4R se explicará posiblemente por estudios adicionales sobre el efecto biológico causado por esta mutación en otras razas y líneas de cerdo. Sin embargo, dada la fuerte relación de las variables MC4R con magrez, crecimiento e ingestión alimenticia, esta mutación pudiera usarse inmediatamente para la selección asistida por marcador (Meuwissen and Goddard 1996) para desarrollar líneas de cerdos para satisfacer requerimientos particulares del cliente. Por ejemplo, en lagunas líneas en donde el apetito está normalmente disminuido después del parto, la selección del alelo MC4R 2 podría ayudar a mejorar la ingestión alimenticia. Además, en algunas líneas consideradas por ser demasiado grasosas, la selección del alelo 1 podría emplearse y en líneas que se consideraran de crecimiento demasiado lento la selección del alelo 2 podría también emplearse. Por lo tanto, el genotipo ' para la mutación MC4R en líneas de cría de puercos mejorará la eficiencia de selección de los rasgos de producción relacionados a alimento que incluye el crecimiento y magrez.

La propuesta de gen candidato también se ha usado para investigar el papel del gen leptina de porcino (Jiang and Gibson 1999) . Sin embargo, en el caso del leptina, aunque hubo evidencia de una asociación entre un polimorfismo de leptina y profundidad de retroceso de la grasa en una cruza entre una cría comercial y una línea sin probar, no hubo una asociación clara en las líneas comerciales diferentes probadas (Jiang and Gibson 1999) . Por lo tanto, no debe suponerse que desde que uno encuentra un gen uno puede suponer que existe una relación. En contraste, con MC4R se ha determinado que la variación en este gen candidato puede explicar la variación significativa de retroceso de la grasa, velocidad de crecimiento, e ingestión alimenticia en líneas comerciales de cerdo. Estos resultados con MC4R ilustran el valor potencial de análisis genético comparativo usando genes candidatos en genomas de ganado. EFECTO DEL GENOTIPO MC4R EN LA PRODUCCIÓN DE DIVERSOS RASGOS EN EL CERDO TABLA 9 Número de observaciones (machos/hembras/totales) durante los dias hasta 110 kg y retroceso de la grasa TABLA 10 Días para 110 kg TABLA 11 Retroceso de la grasa de 10a costilla (mm) TABLA 12 Número de observaciones (machos/hembras/totales para la Prueba de ganancia diaria TABLA 13 Prueba de ganancia diaria (gm/día) TABLA 14 Número de observaciones (machos/hembras/total) para el promedio de ingestión alimenticia diaria TABLA 15 Ingestión alimenticia diaria promedio (kg/día), solamente verracos excepto LINEA E la cual fue cerdas jóvenes solamente MC4 LINEA A LINEA B LINEA C LINEA D Total Linea E R 11 2.31+/-0.2 1.78+/-0.09 1 J5+/-0.06 1.94+/-0.07 2.05+/-0.10 12 2.11+/-0.3 1.90+/-0.07 1.97+/-0.10 1.90+/-0.07 2.03+/-0.06 2.03+/-0.07 22 2.15+/-0.4 1.97+/-0.06 2.00+/-0.07 1.97+/-0.08 2.11+/-0.06 2.08+/-0.08 P<.84 P<.14 P<.56 P 14 P<.01 P<.36 Habiendo descrito la invención con referencia a las composiciones particulares, teorías de efectividad, y similares, será aparente para aquellos de experiencia en la técnica que no se intenta que la invención se limite por tales modalidades ilustrativas o mecanismos, y que pueden hacerse modificaciones sin apartarse del alcance o el espíritu de la invención como se define por las reivindicaciones anexas. Se intenta que todas las modificaciones obvias mencionadas y las variaciones se incluyan dentro del alcance de la presente invención como se define en las reivindicaciones anexas. Las reivindicaciones pretenden cubrir los componentes y etapas reclamados en cualquier secuencia que sean efectivos para satisfacer los objetivos intentados ahí, a menos que el contexto indique específicamente lo contrario. Las siguientes menciones se incorporan en la presente en su totalidad para referencia: Andersson LB (1996) "Genes and obesity", Ann Med.. 28:5-7. Arden KC (1990). "The Receptors for Prolactin and Growth Hormone are Locahzed in the same Región of Human Chromosome 5", Cytogenet. Cell Genet. 53: 161-165. Barinaga M (1996). "Researchers Nail Down Leptin Receptor", Science 271:913. Bray GA (1978). Physiol. Rev. 59. 719-809. Casas-Carillo E (1997) "Mapping genomic regions associated with growth rate in pigs", J Anim Sci 75:2047-2053. Chajlani V, "Molecular Cloning of a Novel Human Melanocortin Receptor", Biochem. Biophys. Res. Commun.. 195, 866-873. Chen H (1995). "Evidence that the diabetes gene encodes the leptin receptor: Identification of a mutation in the leptin receptor gene in db/db mice", Csll 84, 491-495. Chevalet C (1996). CABIOS. In Press. Chua SC (1996). Science 271, 994-996. Chung WK (1996). Geno e Res. 6, 431-438. Cioffi JA (1996). Nature Med. 2, 585-589. Cybulsky MI (1991). "Gene Structure, Chromosomal Location, and Basis for Alternative mRNA Sphcing ofthe Human VCAM 1 Gene". Proc. Nat. Acad. Sci. 88:7859- 7863. Dekkers JCM (1998) "Optimizing selection for quantitative traits with information on an Identified locus in outbred population", Genet Res 71:257-275. F er JS (1998), "Obesity and the hypothalamus: Novel peptides for new pathways", Cell 92:437-440. Frandberg P (1997) "Glutamine235 and argine272 in human melanocortin 5 receptor determines its low affmity to MSH", Biochem Biophys Res Commun 236:489-492.

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Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para identificar un animal que posee un genotipo indicativo de los rasgos metabólicos de contenido de grasa, velocidad de crecimiento, y consumo alimenticio, caracterizado porque el método comprende: a) obtener una muestra de ácido nucleico del animal, y b) probar la presencia de un polimorfismo en el gen MC4R de la muestra, siendo el polimorfismo uno que está asociado con uno o más rasgos metabólicos seleccionado del grupo que consiste de contenido de grasa, velocidad de crecimiento, y consumo alimenticio. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polimorfismo está en la posición nucleótido 678 del gen MC4R. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el animal es un cerdo. . El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el polimorfismo en la posición de nucleótido 678 está asociada con contenido de grasa. 5. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque una guanina en la posición de nucleótido 678 está asociada con menor ingestión alimenticia. 6. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque una adenina en la posición de nucleótido 678 está asociada con una velocidad más rápida de ganancia . 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de identificar el polimorfismo es un método que emplea oligonucleótidos específicos de alelo. 8. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la etapa de identificar el polimorfismo se selecciona del grupo que consiste análisis de fragmento de restricción de longitud de polimorfismo (RFLP) , análisis heteroduplex, análisis de polimorfismo conformacional de hebra sencilla (SSCP) , electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE) , electroforesis en gel con gradiente de temperatura (TGGE) , y uso de marcadores genéticos enlazados. 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la etapa de identificar el polimorfismo comprende análisis RFLP. 10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende adicionalmente la etapa de amplificar la secuencia del gen MC4R. 11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque comprende adicionalmente la etapa de digerir la región amplificada con la enclonucleasa de restricción Taql . 12. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque los cebadores usados en la amplificación se seleccionan del grupo que consiste de SEQ. DE IDENT. NO: 6, SEQ. DE IDENT. NO : 7 , SEQ. DE IDENT. NO : 8 , SEQ. DE IDENT. NO: 9, SEQ. DE IDENT. NO: 10 SEQ. DE IDENT. NO: 11. 13. Una hebra sencilla de un cebador oligonucleótido útil para detectar el nucleótido 678 de un gen MC4R consistiendo el cebador de una secuencia de nucleótidos que tiene 4-30 bases contiguas de SEQ. DE IDENT. NO : 1. 14. El oligonucleótido de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el oligonucleótio tiene la secuencia de nucleótidos representada por SEQ. DE IDENT. NO: 6. 15. El oligonucleótido de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el oligonucleótido tiene la secuencia de nucleótidos representada por SEQ. DE IDENT. NO:7. 16. El oligonucleótido de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el oligonucleótido tiene la secuencia de nucleótidos representada por SEQ. DE IDENT. NO: 8. 17. El oligonucleótido de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el oligonucleótido tiene la secuencia de nucleótidos representada por SEQ. DE IDENT. NO: 9. 18. El oligonucleótido de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el oligonucleótido tiene la secuencia de nucleótidos representada por SEQ. DE IDENT. NO: 10. 19. El oligonucleótido de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el oligonucleótido tiene la secuencia de nucleótidos representada por SEQ. DE IDENT. NO:ll. 20. Un método para identificar un animal el cual posee un genotipo deseado indicativo de los rasgos metabólicos de contenido de grasa, velocidad de crecimiento y consumo alimenticio, caracterizado porque el método comprende a) obtener una muestra de ADN genómico, b) digerir la muestra con Taql para obtener fragmentos, c) separar los fragmentos obtenidos de la digestión, y d) identificar la presencia o ausencia de un sitio Taql en la base 678 del gen MC4R. 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque_ comprende adicionalmente la etapa de seleccionar animales con el genotipo deseado para cría. 22. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el sitio es identificable por fragmentos de 466, 225, y 76 bp cuando una guanina está presente en la base 678 y fragmentos de 542 y 226 bp cuando un adenina está presente cuando se usa una enzima de restricción la cual corta en el mismo sitio de reconocimiento • conforme Taql . 23. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la etapa de identificación comprende detectar el sitio Taql por amplificación. 24. Un equipo para evaluar una muestra de ADN animal que comprende un reactivo en un recipiente de identifica un polimorfismo en un gen MC4R. 25. El equipo de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el reactivo es un cebador que amplifica el gen MC4R o un fragmento del mismo. 26. El equipo de conformidad con la reivindicación 24, que comprende adicionalmente una ADN polimerasa la cual desdobla el gen MC4R, un cebador hacia delante, y un cebador hacia atrás, caracterizado porque los cebadores son capaces de amplificar una región del gen MC4R, la cual contiene un sitio polimórfico. 27. Un cebador para probar la presencia de un sitio Taql polimórfico en el gen MC4R, caracterizado porque el cebador comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ. DE IDENT. NO:6, SEQ. DE IDENT. NO : 7 , SEQ. DE IDENT. NO: 8, SEQ. DE IDENT. NO: 9, SEQ. DE IDENT. NO: 10, and SEQ. DE IDENT. NO: 11. 28. Un método para seleccionar animales por los rasgos deseados de menor contenido de grasa, velocidad de crecimiento más rápida o menor consumo alimenticio que comprende las etapas de a) obtener una muestra de ácido nucleico de un animal, b) identificar un polimorfismo en la posición de nucleótido 678 del gen MC4R, y c) seleccionar los animales que tienen el nucleótido asociado con los rasgos deseados en la posición 678. 29. Un método para una selección indirecta de un polimorfismo en MC4R caracterizado porque los alelos específicos de un marcador de ADN alternativo se usan para hacer la selección indirecta en donde el marcador de ADN alternativo es un marcador enlazado cerca de MC4R. 30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el marcador enlazado se selecciona del grupo que consiste de S0331, BHT0433, y S0313. 31. Un método para identificar animales que poseen un genotipo deseado indicativo de los rasgos metabólicos de o contenido de grasa, velocidad de crecimiento, y consumo alimenticio, el método comprende a) determinar una asociación entre un genotipo MC4R y un rasgo de interés obteniendo una muestra de animales de una línea o raza de interés, b) preparar ADN genómico de cada animal en la muestra, c) determinar el genotipo del gen C4R, y d) calcular la asociación entre el genotipo MG4R y el rasgo. 32. Un método para seleccionar animales que poseen un genotipo MC4R deseado indicativo de los rasgos metabólicos de contenido de grasa, velocidad de crecimiento, y consumo alimenticio, el método comprende a) obtener una muestra de ácido nucleico de un animal, b) identificar el genotipo del gen C4R del animal, y c) seleccionar aquellos animales que tengan el genotipo asociado con los rasgos deseados. 33. Un método para identificar un animal que posee un genotipo indicativo de los rasgos metabólicos de contenido de grasa, velocidad de crecimiento, y consumo alimenticio, el método comprende: a) obtener una muestra de ácido nucleico de un animal, y b) probar la presencia de un polimorfismo que comprende una mutación de un codón Asp (GAU) en uno Asn(AAU) en la posición de aminoácido 298 de la proteína MC4R, siendo el polimorfismo uno que se" "asocia con uno o más rasgos metabólicos seleccionados del grupo que consiste de contenido de grasa, velocidad de crecimiento, y consumo alimenticio.