DE69933661T3

DE69933661T3 - Genomische sequenz des 5-lipoxygenase-aktivierenden proteins (flap), polymorphische marker und ihre anwendung in der diagnose von asthma

Info

Publication number: DE69933661T3
Application number: DE69933661T
Authority: DE
Inventors: Marta Blumenfeld; Ilya Chumakov; Lydie Bougueleret
Original assignee: Merck Serono Biodevelopment SAS
Current assignee: Merck Biodevelopment SAS
Priority date: 1998-04-15
Filing date: 1999-04-15
Publication date: 2012-01-26
Anticipated expiration: 2019-04-16
Also published as: JP4472173B2; DE69933661T2; DE69933661D1; WO1999052942A2; EP1071710A2; US20050196752A1; US20070003971A1; DK1071710T4; EP1071710B2; DK1071710T3; ATE342918T1; EP1071710B1; US20090155806A1; US7494777B2; US6531279B1; CA2321226A1; ES2272061T5; AU3164499A; PT1071710E; AU768721B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft biallelische Marker eines FLAP-Gens sowie die zwischen diesen Markern und Erkrankungen, in denen der Leukotrien-Signalweg involviert ist, wie beispielsweise Asthma, etablierte Assoziation. Die Erfindung stellt Mittel zur Bestimmung der Prädisposition von Individuen in Bezug auf Krankheiten, in denen der Leukotrien-Signalweg involviert ist, wie beispielsweise Asthma, bereit.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das Fortschreiten von entzündlichen Erkrankungen, in welchen die Synthese von Leukotrienen eine aktive Rolle spielt, wie beispielsweise bei Asthma und bei Arthritis, stellt in den westlichen Gesellschaften ein Hauptgesundheitsproblem dar. So hat sich beispielsweise die Prävalenz von Asthma in Abendländern über das letzte Jahrhundert stetig erhöht, was etwa 10% der Bevölkerung betrifft. Im Jahr 1994 waren davon allein in den Vereinigten Staaten mehr als 14 Millionen Menschen betroffen (einschließlich 4.8 Millionen (6.9%) mit einem Alter von weniger als 18 Jahren), während im Jahr 1982 lediglich 8 Millionen Menschen an der gleichen Erkrankung litten. Asthma fordert pro Jahr mehr als 5000 Menschenleben (einschließlich 342 Todesfälle bei Personen mit einem Alter von weniger als 25 Jahren im Jahr 1993). Asthma betrifft in Großbritannien eines von sieben Kindern, und verursacht in den Vereinigten Staaten ein Drittel aller Besuche in der pädiatrischen Notaufnahme. Es die am häufigsten vorkommende chronische Erkrankung während der Kindheit.
Bronchiales Asthma, welches als Atemwegsobstruktion definiert und durch entzündliche Veränderungen der Atemwege und eine übermäßige Ansprechbarkeit der Bronchien gekennzeichnet ist, stellt vielmehr ein multifaktorielles Syndrom als eine einzelne Erkrankung dar. Reize, welche die tatsächlichen Asthmaattacken verursachen, umfassen Allergene (in sensibilisierten Individuen), Anstrengungen (bei welchen ein Reiz kalte Luft sein kann), respiratorische Infektionen, sowie atmosphärische Schadstoffe wie beispielsweise Schwefeldioxid. Das asthmatische Individuum erfährt intermittierende Attacken von Dyspnoe (Schwierigkeiten beim Ausatmen), Stenoseatmung und Husten, welche lebensbedrohend oder sogar tödlich sein können.
Die Manifestation von Asthma umfasst wahrscheinlich sowohl genetische als auch umweltbedingte Faktoren, wobei die asthmatische Attacke in den meisten Individuen aus zwei Phasen besteht, welche die Pathophysiologie des Zustandes veranschaulichen:

– eine Akutphase, welche hauptsächlich aus Bronchiospasmen aufgrund von Spasmen der bronchialen glatten Muskulatur bestehen; die beteiligten Zellen sind Histamin-freisetzende Mastzellen, jedoch auch Leukotriene, Prostaglandine und Thrombozyten-aktivierende Faktoren freisetzende Eosinophile, Makrophagen und Thrombozyten. Diese Spasmogene bewirken neben Chemotaxinen und Chemokinen eine Anziehung von Leukozyten in den Bereich, wodurch das Stadium für die Spätphase vorbereitet wird;
– eine Spätphase, welche aus einer speziellen Art von Entzündung, umfassend Vasodilatation, Ödem, Schleimsekretion und Bronchiospasmus, besteht. Sie wird durch Entzündungsmediatoren verursacht, welche aus aktivierten, Cytokinfreisetzenden T-Zellen und Eosinophilen freigesetzt werden, sowie möglicherweise durch Neuropeptide, welche durch Axonreflexe freigesetzt werden. Diese Mediatoren verursachen eine Schädigung und einen Verlust des bronchialen Epithels.

Der stärkste prädisponierende, identifizierbare Faktor zur Entwicklung von Asthma ist Atopie, die Prädisposition zur Entwicklung einer IgE-vermittelten Reaktion auf übliche Aeroallergene. Bindet IgE an die auf den Zellen befindlichen IgE-Rezeptoren, so wird das System in Gang gesetzt, so dass eine nachfolgende erneute Exposition gegenüber dem relevanten Allergen eine asthmatische Attacke auslöst. Die meisten Asthmafälle (95%) sind mit Atopie assoziiert.
Über ihre vorstehend erwähnte Rolle bei Asthma hinaus sind die Leukotriene allgemein an Wirtsabwehrreaktionen beteiligt und spielen eine wichtige Rolle bei akuter Überempfindlichkeit sowie bei sich von Asthma unterscheidenden entzündlichen Erkrankungen, wie beispielsweise entzündlicher Darmerkrankung, Psoriasis und Arthritis.
Der Leukotrien-Signalweg
Leukotriene stellen Produkte des Lipoxygenase-Signalwegs dar. Lipoxygenasen sind lösliche Enzyme, welche im Cytosol lokalisiert sind und sich in der Lunge, in den Thrombozyten, in Mastzellen sowie in den weißen Blutzellen finden. Das Hauptenzym dieser Gruppe ist 5-Lipoxygenase, welches das erste Enzym der Biosynthese von Leukotrienen darstellt.
Der erste Schritt der Biosynthese von Leukotrienen ist die Freisetzung von Arachidonsäure aus Membranphospholipiden infolge Zellstimulierung (beispielsweise durch Immunkomplexe und Calciumionophore). Arachidonsäure wird anschließend mittels einer 5-Lipoxygenase (5-LO) in Leukotrien A4 umgewandelt, welches an die Zellmembran wandert, wo es an ein als „Fünf-Lipoxygenase-aktivierendes Protein” (FLAP) bezeichnetes Protein assoziiert, das in intakten Zellen für die Leukotriensynthese erforderlich ist. 5-LO besitzt auch eine Leukotrien A4-Hydrolaseaktivität.
Leukotrien A4 (LTA4), eine instabile Epoxidzwischenstufe, wird anschließend zu Leukotrien B4 (LTA4-Hydrolaseaktivität) hydrolisiert oder wird mit Glutathion konjugiert, um Leukotrien C4 (LTC4-Synthaseaktivität) und dessen Metaboliten, Leukotrien D4 und Leukotrien E4 zu ergeben. LTB4 wird hauptsächlich von Neutrophilen gebildet, während die Cysteinyl-Leukotriene (LTC4, LTD4 und LTE4) hauptsächlich von Eosinophilen, Mastzellen, Basophilen und Makrophagen gebildet werden.
LTB4 stellt ein leistungsfähiges, chemotaktisches Mittel sowohl für Neutrophile als auch für Makrophagen dar. Bei Neutrophilen verursacht es eine. Hochregulierung von Membranadhäsionsmolekülen und erhöht die Produktion toxischer Sauerstoffprodukte sowie die Freisetzung granulärer Enzyme. Bei Makrophagen und Lymphozyten stimuliert es die Proliferation sowie die Freisetzung von Cytokin. Somit steift LTB4 bei allen Arten von Entzündungen einen wichtigen Mediator dar.
Cysteinyl-Leukotriene wirken auf die respiratorischen und kardiovaskulären Systeme. Im respiratorischen System stellen sie starke Spasmogene dar, welche eine Kontraktion des bronchialen Muskels und eine Erhöhung der Schleimsekretion verursachen. im kardiovaskulären System verursachen sie in den meisten Gefäßen eine Vasodilatation, können jedoch auch als koronare Vasokonstriktoren wirken. Die Cysteinyl-Leukotriene sind bei Asthma von besonderer Bedeutung.
FLAP (5-Lipoxygenase-aktivierendes Protein)
FLAP stellt ein membrangebundenes Polypeptid mit 18 kD dar, welches spezifisch an Arachidonsäure bindet und 5-LO aktiviert, indem es als Arachidonsäure-Transferprotein fungiert. Das FLAP-Gen überspannt mehr als 31 kb und besteht aus fünf kleinen Exons und vier großen Exons (siehe Genbank 182657; Kennedy et al. 1991, auf welches hiermit Bezug genommen wird; Genbank M60470 für Exon 1; Genbank M63259 für Exon 2; Genbank M63260 für Exon 3; Genbank M63261 für Exon 4; und Genbank M6322 für Exon 5).
Die Kernhülle stellt die intrazelluläre Stelle dar, an welcher 5-LO und FLAP Arachidonsäure metabolisieren, wobei die ionophore Aktivierung von Neutrophilen und Monozyten zur Translokation von 5-LO von einem nicht-sedimentierbaren Ort zur Kernhülle führt. Inhibitoren der FLAP-Funktion verhindern die Translokation von 5-LO aus dem Cytosol zur Membran und hemmen die Aktivierung von 5-LO. Sie stellen daher interessante antiinflammatorische Arzneimittelkandidaten dar. In der Tat können Antagonisten von FLAP allergeninduzierte bronchokonstriktorische Reaktionen abschwächen, was eine wichtige. Rolle von Cysteinyl-Leukotrienen bei der Vermittlung dieser asthmatischen Reaktionen belegt.
Pharmakogenomik
Um die Ursprünge individueller Schwankungen in Bezug auf die Erkrankungsempfänglichkeit oder die Arzneimittelansprechbarkeit zu evaluieren, nutzt die Pharmakogenomik die Genomtechnologien zur Identifizierung von Polymorphismen in Genen, welche Teile biologischer Signalwege sind, die bei der Erkrankungsempfänglichkeit, -ätiologie und -entwicklung, oder insbesondere an Signalwegen in Bezug auf die Arzneimittelansprechbarkeit, welche für die Wirksamkeit, Verträglichkeit oder Toxizität eines Arzneimittels verantwortlich sind, beteiligt sind, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, Kaskaden des Arzneimittelmetabolismus.
In dieser Hinsicht bieten die in zahlreichen Erkrankungen involvierten inflammatorischen Phänomene sowohl aufgrund dessen, dass sie den Kern vieler weit verbreiteter, schwerwiegender Erkrankungen darstellen, als auch aufgrund dessen, dass ein zielgerichtetes Ansteuern inflammatorischer Signalwege im Hinblick auf das Entwerfen neuer wirksamer Arzneimittel zahlreiche Risiken in Bezug auf eine Potenzierung schwerwiegender Nebenwirkungen umfasst, eine hohe Relevanz für die Pharmakogenomik. Der Leukotrien-Signalweg ist besonders interessant, da seine Produkte leistungsfähige inflammatorische Moleküle darstellen.
Die überwiegende Mehrheit allgemein verbreiteter Erkrankungen, wie beispielsweise Krebs, Bluthochdruck und Diabetes, ist polygener Natur (umfasst verschiedene Gene). Zusätzlich werden diese Erkrankungen durch umweltbedingte Faktoren, wie beispielsweise Schadstoffe, Chemikalien und Ernährungsgewohnheiten, moduliert. Dies ist die Ursache dafür, dass viele Erkrankungen als multifaktoriell bezeichnet werden; sie resultieren aus einer synergistischen Kombination von Faktoren, welche sowohl genetisch als auch umweltbedingt sind.
So haben beispielsweise Häufungsmuster und Segregationsanalysen in asthmatischen Familien neben dem nachgewiesenen Einfluss von umweltbedingten Faktoren auf die Entwicklung von Asthma eine genetische Komponente von Asthma nahegelegt. Der Mangel an einem definierten und spezifischen Asthma-Phänotyp erweist sich jedoch als ein Haupthindernis für eine verlässliche Detektion von Asthma-assoziierten Genen.
Asthma wird üblicherweise durch klinische Untersuchungen und biologische Tests diagnostiziert. Die das Asthma begleitende unspezifische bronchiale Hyperreaktivität wird durch Schwankungen des Luftstromes gemessen, welcher in einem Patienten durch Verabreichung eines Bronchokonstriktors, wie beispielsweise Histamin oder Methacholin, ausgelöst wird. Eine Atopie wird mittels Haut-Prick-Tests detektiert, welche die IgE-Titer im Serum messen. Fragebögen betreffend Standardsymptome werden üblicherweise ebenfalls verwendet, um Symptome zu detektieren, welche charakteristisch, jedoch nicht einzigartig für Asthma sind (wie nächtliches Keuchen und Atemlosigkeit).
Es gibt jedoch keinen einfachen physiologischen oder biologischen Bluttest für den asthmatischen Zustand. Trotz Fortschritten im Verständnis der Pathophysiologie von Asthma und dessen Entwicklung legen Beweise nahe, dass die Prävalenz des asthmatischen Zustandes und die Schwere von Asthmaattacken unterschätzt werden. Infolgedessen findet eine angemessene Behandlung des Asthmas häufig verzögert statt, wodurch es dem Entzündungsprozess ermöglicht wird, sich besser zu etablieren. Folglich besteht ein Bedarf an einem wirksamen und verlässlichen Diagnosetest für Asthma.
Arzneimittelwirksamkeit und -toxizität können ebenfalls als multifaktorielle Merkmale angesehen werden, bei welchen genetische Komponenten auf fast dieselbe Art und Weise beteiligt sind wie bei komplexen Erkrankungen. In dieser Hinsicht gibt es drei Hauptkategorien von Genen, von welchen theoretisch angenommen wird, dass sie mit der Arzneimittelansprechbarkeit assoziiert sind, nämlich Gene, welche mit der Zielerkrankung gekoppelt sind, Gene, welche mit dem Wirkmechanismus des Arzneimittels in Beziehung stehen, sowie Gene, welche an der Metabolisierung des Arzneimittels beteiligt sind.
Das primäre Ziel der Pharmakogenomik bei der Untersuchung von Asthma ist es, nach Genen zu suchen, welche mit der Arzneimittelansprechbarkeit in Beziehung stehen. Sie kann zunächst Hilfsmittel zur Verfeinerung des Entwurfs der Arzneimittelentwicklung bereitstellen, indem das Auftreten unerwünschter Ereignisse in Studien zur Arzneimittelverträglichkeit verringert wird, indem Patientensubpopulationen von in Wirksamkeitsstudien ansprechenden und nicht ansprechenden Individuen besser definiert werden, und indem durch Kombinieren der hieraus erhaltenden Ergebnisse auf Basis einer Wirksamkeits/Verträglichkeitsprognose ferner eine bessere individualisierte Arzneimittelverwendung ermöglicht wird.
Die Pharmakogenomik kann ferner Hilfsmittel zur Identifizierung von Entwürfen für neue Arzneimittelzielstrukturen sowie zur Optimierung der Verwendung von bereits vorhandenen Arzneimitteln bereitstellen, um entweder deren Ansprechrate zu erhöhen und/oder um nicht hierauf ansprechende Individuen von bestimmten Behandlungen auszuschließen, oder um unerwünschte Nebenwirkungen zu verringern und/oder um Patienten mit einem signifikanten Risiko für unerwünschte Nebenwirkungen von entsprechenden Behandlungen auszuschließen.
Für diese zweite Anwendung der Pharmakogenomik ist der Leukotrien-Signalweg ebenfalls von Nutzen, da sich viele über den Leukotrien-Signalweg wirkende antiasthmatische und antiinflammatorische Mittel in der Entwicklung befinden, von denen die meisten eine gewisses Auftreten von schwerwiegenden Nebenwirkungen zeigen.
So gibt es beispielsweise zwei Hauptkategorien von antiasthmatischen Arzneimitteln: Bronchodilatatoren und antiinflammatorische Mittel. Bronchodilatatoren sind bei der Invertierung von Bronchiospasmen in der Akutphase der Erkrankung wirksam. Als Bronchodilatatoren verwendete Arzneimittel umfassen die β₂-Adrenorezeptor-Agonisten (erweitern die Bronchien durch eine direkte Wirkung auf die glatte Muskulatur, z. B. Salbutamol), die Xanthine (z. B. Theophyllin) und die Muskarinrezeptor-Antagonisten (z. B. Ipratropiumbromid). Diese repräsentieren die symptomatische Behandlung bei Kurzzeitattacken.
Antiinflammatorische Mittel sind im Hinblick auf eine Hemmung oder Verhinderung der Produktion von inflammatorischen Komponenten in beiden asthmatischen Phasen wirksam. Sie umfassen Glucocorticoide, Natriumcromoglycat und Histamin H1-Rezeptor-Antagonisten. Diese Mittel repräsentieren die derzeitige Langzeitbehandlung des asthmatischen Zustandes.
Keines dieser derzeit verwendeten antiasthmatischen Arzneimittel ist jedoch vollkommen zufriedenstellend, da keines alle erkrankten Patienten tatsächlich „heilt”. Glucocorticoide stellen in dieser Hinsicht die interessantesten Wirkstoffe dar, besitzen jedoch potentiell schwerwiegende, unerwünschte Nebenwirkungen (oropharyngeale Candidiasis, Dysphonie und Osteoporose bei inhalierten Glucocorticoiden, sowie Stimmungsschwankungen, erhöhtes Essverlangen und Verlust der Glucoseregulierung im Falle von Diabetes bei systemischen Glucocorticoiden).
In den letzten Jahren wurden wirksamere und selektivere Inhibitoren der Leukotrienbiosynthese (z. B. 5-LO und FLAP-bindende Inhibitoren) entwickelt und als neuartige Therapien für bronchiales Asthma und andere inflammatorische Störungen verwendet. So hat sich beispielsweise gezeigt, dass Zileuton (Zyflo^®), ein von Abbott Laboratories (Abbott Park, Illinois) kommerziell vertriebener Inhibitor von 5-LO, die Atemwegsfunktion verbessert und mit Asthma in Beziehung stehende Symptome verringert.
Unglücklicherweise wurde in klinischen Studien mit Zileuton über unerwünschte Nebenwirkungen, wie beispielsweise eine akute Exazerbation von Asthma, Dyspepsie sowie erhöhte Leberenzymwerte, berichtet. Es bestehen ferner Bedenken in Bezug auf Arzneimittelwechselwirkungen mit hepatisch metabolisierten Medikamenten.
Folglich besteht neben dem Bedarf zur Entwicklung eines wirksamen und verlässlichen Diagnosetests für Asthma auch ein Bedarf zur Entwicklung wirksamerer und in höherem Maße zielgerichteter therapeutischer Strategien, welche bei verminderten Nebenwirkungen und geringerer Toxizität für den Verbraucher auf den Leukotrien-Signalweg wirken. Ein Weg, dies relativ kurzfristig zu erreichen, ist, durch Verwendung von Ergebnissen der Pharmakogenomik die Verwendung vorhandener Arzneimittel oder Arzneimittelkandidaten besser zu definieren, um das Nutzen/Risiko-Verhältnis in Zielsubpopulationen von Patienten zu erhöhen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung entstammt der Isolierung und Charakterisierung von Nukleinsäuresequenzen, umfassend ein Nukleotid bei einem mit Asthma assoziierten, mit FLAP in Beziehung stehenden biallelischen Marker. Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht aus rekombinanten Vektoren, welche eine beliebige Nukleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung umfassen, sowie aus Wirtzellen, welche die Nukleinsäuresequenzen oder rekombinanten Vektoren umfassen. Die Erfindung umfasst ferner die 127-Ile-Variante des FLAP-Proteins und eine Antikörperzusammensetzung, welche zu einer selektiven Bindung an die Variante befähigt ist.
Die Erfindung ist ferner auf die Verwendung von genomischen FLAP-Sequenzen zur Bestimmung der Identität des Nukleotids bei diesen mit Asthma assoziierten, mit FLAP in Beziehung stehenden biallelischen Markern, sowie auf ein Verfahren zur Identifizierung einer statistisch signifikanten Assoziation zwischen spezifischen Allelen des FLAP-Gens und Asthma gerichtet.
Insbesondere entstammt die vorliegende Erfindung der Identifizierung genetischer Assoziationen zwischen Allelen von biallelischen Markern des FLAP-Gens und Asthma, wie in einer Gruppe menschlicher Individuen bestätigt und charakterisiert wurde.
Es werden Verfahren und Produkte für die molekulare Detektion einer genetischen Empfänglichkeit von Menschen für Asthma bereitgestellt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Diagramm des FLAP-Gens mit einer Angabe der relativen Position der biallelischen Marker der vorliegenden Erfindung.
2 zeigt die Ergebnisse einer Assoziationsstudie zwischen den biallelischen FLAP-Markern und Asthma mit 290 asthmatischen Individuen und 280 kaukasischen US-Kontrollen. 2 ist eine graphische Darstellung, welche die Assoziation zwischen einigen der biallelischen Marker der Erfindung und Asthma demonstriert, wobei der Absolutwert des Logarithmus (zur Basis 10) des P-Wertes der Chi-Quadrat-Werte jedes Markers auf der y-Achse und eine grobe Abschätzung der Position jedes Markers in Bezug auf die Elemente des FLAP-Gens auf der x-Achse gezeigt ist.
3 ist eine Tabelle, welche die Ergebnisse einer Haplotyp-Assoziationsanalyse zwischen Asthma und Haplotypen demonstriert, welche aus biallelischen Markern der Erfindung bestehen (297 Fälle verglichen mit 286 kaukasischen US-Kontrollen).
4 ist eine Tabelle, welche die Ergebnisse einer Haplotyp-Häufigkeitsanalyse, umfassend Permutationstests mit mehr als 1000 Iterationen, demonstriert.
KURZE BESCHREIBUNG DER IM SEQUENZPROTOKOLL BEREITGESTELLTEN SEQUENZEN
SEQ ID Nr. 1 enthält eine genomische Sequenz von FLAP, umfassend die 5'-regulatorische Region (stromaufwärts der nicht-transkribierten Region), die Exons und Introns, und die 3'-regulatorische Region (stromabwärts der nicht-transkribierten Region).
SEQ ID Nr. 2 enthält eine vollständige humane FLAP-cDNA mit 5'- und 3'-UTRs.
SEQ ID Nr. 3 enthält das durch die cDNA von SEQ ID Nr. 2 kodierte FLAP-Protein.
SEQ ID Nr. 4 und 5 enthalten entweder Allel 1 oder 2 des biallelischen Markers A14, sowie die diesen umgebende Sequenz.
SEQ ID Nr. 6 und 7 enthalten die Sequenz von Amplifikationsprimern für den biallelischen Marker A14.
SEQ ID Nr. 8 enthält die Sequenz eines Mikrosequenzierungsprimers des biallelischen Markers A14.
SEQ ID Nr. 9 und 10 enthalten entweder Allel 1 oder 2 des biallelischen Markers A19, sowie die diesen umgebende Sequenz.
SEQ ID Nr. 11 und 12 enthalten die Sequenz von Amplifikationsprimern für den biallelischen Marker A19.
SEQ D Nr. 13 enthält die Sequenz eines Mikrosequenzierungsprimers des biallelischen Markers A19.
SEQ ID Nr. 14 enthält einen Primer, welcher die weiterhin in Beispiel 2 beschriebene zusätzliche PU 5'-Sequenz enthält.
SEQ ID Nr. 15 enthält einen Primer, welcher die weiterhin in Beispiel 2 beschriebene zusätzliche RP 5'-Sequenz enthält.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
5-LO ist für die Leukotriensynthese mit FLAP assoziiert. in der Tat scheint es, dass die Regulierung der Produktion von Leukotrienen entweder durch Einwirken direkter 5-LO-Inhibitoren oder durch indirekte Inhibitoren der Leukotrienbiosynthese, welche an FLAP binden, erzielt werden kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifizierung und Charakterisierung von mit Asthma assoziierten, biallelischen Markers in einem für FLAP kodierenden Gen, sowie die Identifizierung von mit Asthma assoziierten, signifikanten Polymorphismen.
Die identifizierten Polymorphismen werden zum Entwerfen von Assays für eine verlässliche Detektion einer genetischen Empfänglichkeit für Asthma verwendet. Sie können ferner zur Entwicklung von Protokollen zum Durchmustern auf Arzneimittel verwendet werden, um eine genaue und effiziente Evaluierung des therapeutischen Potentials und des Nebenwirkungspotentials von neuen oder bereits vorhandenen Medikamenten bereitzustellen.
I. Definitionen
Bevor die Erfindung ausführlicher beschrieben wird, werden die nachfolgenden Definitionen dargelegt, um die Bedeutung und den Umfang der zur Beschreibung der Erfindung hierin verwendeten Begriffe zu veranschaulichen und zu definieren.
Der Begriff „FLAP-Gen”, wenn er hierin verwendet wird, umfasst für das FLAP-Protein kodierende genomische Sequenzen, mRNA- und cDNA-Sequenzen. im Falle einer genomischen Sequenz umfasst das FLAP-Gen ferner native regulatorische Regionen, welche die Expression der kodierenden Sequenz des FLAP-Gens kontrollieren.
Die Begriffe „Oligonukleotide” und „Polynukleotide”, wie sie hierin untereinander austauschbar verwendet werden, umfassen RNA, DNA oder RNA/DNA-Hybridsequenzen von mehr als einem Nukleotid entweder in einer einzelnen Kette oder in Duplexform. Der Begriff „Nukleotid”, wie er hierin als Adjektiv zur Beschreibung von Molekülen verwendet wird, umfasst RNA, DNA oder RNA/DNA-Hybridsequenzen beliebiger Länge in Einzelstrang- oder Duplexform. Der Begriff „Nukleotid” wird hierin auch als Substantiv verwendet und bezeichnet einzelne Nukleotide oder eine Vielzahl von Nukleotiden, welche die Bedeutung eines Moleküls oder einer einzelnen Einheit in einem größeren Nukleinsäuremolekül besitzen, umfassend ein Purin oder ein Pyrimidin, einen Ribose- oder Desoxyribose-Zuckerrest und eine Phosphatgruppe, oder im Falle von Nukleotiden innerhalb eines Oligonukleotids oder Polynukleotids eine Phosphodiesterbindung. Der Begriff „Nukleotid”, wie er hierin verwendet wird, umfasst ferner „modifizierte Nukleotide”, welche mindestens eine Modifikation in Form von (a) einer alternativen Verknüpfungsgruppe, (b) einer analogen Form von Purin, (c) einer analogen Form von Pyrimidin oder (d) einem analogen Zucker umfassen. Für Beispiele analoger Verknüpfungsgruppen, Purine, Pyrimidine und Zucker siehe beispielsweise PCT-Veröffentlichungs-Nr. WO 95/04064 . Die erfindungsgemäßen Polynukleotide umfassen jedoch bevorzugt mehr als 50% herkömmlicher Desoxyribose-Nukleotide, und am stärksten bevorzugt mehr als 90% herkömmlicher Desoxyribose-Nukleotide. Die erfindungsgemäßen Polynukleotidsequenzen können mittels eines beliebigen bekannten Verfahrens, umfassend eine synthetische Erzeugung, rekombinante Erzeugung, ex vivo-Erzeugung oder eine Kombination hiervon, als auch unter Verwendung beliebiger im Fachbereich bekannter Reinigungsverfahren hergestellt werden.
Der Begriff „gereinigt” wird hierin zur Beschreibung eines erfindungsgemäßen Polynukleotids oder Polynukleotidvektors verwendet, welches/welcher von anderen Verbindungen, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, andere Nukleinsäuren, Kohlenhydrate, Lipide und Proteine (wie beispielsweise die zur Synthese des Polynukleotids verwendeten Enzyme) abgetrennt wurde, oder zur Abtrennung kovalent geschlossener Polynukleotide aus linearen Polynukleotiden. Ein Polynukleotid ist im Wesentlichen rein, wenn mindestens etwa 50, bevorzugt 60 bis 75% einer Probe eine einzelne Polynukleotidsequenz und Konformation (linear im Vergleich zu kovalent geschlossen) aufweist. Ein im Wesentlichen reines Polynukleotid, umfasst typischerweise etwa 50, bevorzugt 60 bis 90% Gewicht/Gewicht einer Nukleinsäureprobe, in erhöhtem Maße üblicherweise etwa 95%, und ist bevorzugt über etwa 99% rein. Die Reinheit oder Homogenität eines Polynukleotids kann durch eine Reihe von im Fachbereich bekannten Mitteln, wie beispielsweise Agarose- oder Polyacrylamid-Gelelektrophorese einer Probe, gefolgt von einem Sichtbarmachen einer einzelnen Polynukleotidbande durch Anfärben des Gels, angezeigt werden. Für bestimmte Zwecke kann durch Verwendung von HPLC oder anderen im Fachbereich bekannten Mitteln eine höhere Auflösung bereitgestellt werden.
Der Begriff „isoliert”, wie er hierin verwendet wird, erfordert, dass das Material aus seiner ursprünglichen Umgebung entfernt wird (z. B. die natürliche Umgebung, wenn es natürlich vorkommt). So gilt beispielsweise ein in einem lebenden Tier vorhandendes, natürlich vorkommendes Polynukleotid oder Polypeptid als nicht isoliert; das gleiche Polynukleotid oder die gleiche DNA oder das gleiche Polypeptid, welches aus einem Teil oder der Gesamtheit der coexistierenden Materialien in dem natürlichen System abgetrennt wird, jedoch als isoliert. Ein derartiges Polynukleotid kann Teil eines Vektors und/oder ein derartiges Polynukleotid oder Polypeptid kann Teil einer Zusammensetzung sein und trotzdem isoliert werden, indem der Vektor oder die Zusammensetzung nicht Teil seiner/ihrer natürlichen Umgebung ist.
Der Begriff „Polypeptid” bezeichnet ein Aminopolymer ohne Rücksicht auf die Länge des Polymers; somit sind Peptide, Oligopeptide und Proteine durch die Definition von Polypeptid umfasst. Dieser Begriff stellt ferner keine Spezifizierung von Polypeptiden dar oder schießt postexpressionale Modifikationen von Polypeptiden aus. So sind beispielsweise Polypeptide, welche kovalent gebundene Glycosylgruppen, Acetylgruppen, Phosphatgruppen, Lipidgruppen, und dergleichen umfassen, vom Begriff Polypeptid ausdrücklich umfasst. Von der Definition sind ferner Polypeptide umfasst, welche ein Analogon oder mehrere Analoga einer Aminosäure enthalten (umfassend beispielsweise nicht natürlich vorkommende Aminosäuren, lediglich in einem damit nicht in Beziehung stehenden biologischen System natürlich vorkommende Aminosäuren, modifizierte Aminosäuren aus Säugersystemen, etc.), Polypeptide mit substituierten Verknüpfungen, sowie andere im Fachbereich bekannte Modifikationen, welche sowohl natürlich als auch nicht natürlich vorkommen.
Der Begriff „gereinigt” wird hierin zur Beschreibung eines erfindungsgemäßen Polypeptids verwendet, welches von anderen Verbindungen, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, Nukleinsäuren, Lipide, Kohlenhydrate und andere Proteine, abgetrennt wurde. Ein Polypeptid ist im Wesentlichen rein, wenn mindestens etwa 50%, bevorzugt 60 bis 75% einer Probe eine einzelne Polypeptidsequenz aufweisen. Ein im Wesentlichen reines Polypeptid umfasst typischerweise etwa 50%, bevorzugt 60 bis 90% Gewicht/Gewicht einer Proteinprobe, in erhöhtem Maße üblicherweise etwa 95%, und ist bevorzugt über etwa 99% rein. Die Reinheit oder Homogenität des Polypeptids wird durch eine Reihe von im Fachbereich wohlbekannten Mitteln, wie beispielsweise Agarose- oder Polyacrylamid-Gelelektrophorese einer Probe, gefolgt von einem Sichtbarmachen einer einzelnen Polypeptidbande durch Anfärben des Gels, angezeigt. Für bestimmte Zwecke kann durch Verwendung von HPLC oder anderen im Fachbereich wohlbekannten Mitteln eine höhere Auflösung bereitgestellt werden.
Der Begriff „rekombinantes Polypeptid” wird hierin zur Bezeichnung von Polypeptiden verwendet, welche künstlich entworfen wurden und mindestens zwei Polypeptidsequenzen umfassen, die nicht als aufeinanderfolgende Polypeptidsequenzen in ihrer ursprünglichen natürlichen Umgebung vorkommen, oder wird zur Bezeichnung von Polypeptiden verwendet, welche aus einem rekombinanten Polynukleotid exprimiert wurden.
Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff „Antikörper” ein Polypeptid oder eine Gruppe von Polypeptiden, welches/welche mindestens eine Bindungsdomäne umfasst/umfassen, wobei eine Antikörper-Bindungsdomäne durch die Faltung variabler Domänen eines Antikörpermoleküls gebildet wird, um dreidimensionale Bindungsräume mit einer inneren Oberflächenform und -ladungsverteilung, welche zu den Merkmalen einer antigenen Determinante eines Antigens komplementär sind, auszubilden, was eine immunologische Reaktion mit dem Antigen ermöglicht. Antikörper umfassen die Bindungsdomänen umfassende rekombinante Proteine sowie Fragmente, einschließlich Fab-, Fab'-, F(ab)₂-, und F(ab')₂-Fragmente.
Wie hierin verwendet, ist eine „antigene Determinante” der Teil eines Antigenmoleküls, in diesem Fall eines FLAP-Polypeptids, welcher die Spezifizität der Antigen-Antikörper-Reaktion bestimmt. Ein „Epitop” bezeichnet eine antigene Determinante eines Polypeptids. Ein Epitop kann eine Untergrenze an Aminosäuren von bis zu 3 Aminosäuren in einer räumlichen Konformation umfassen, welche für das Epitop einzigartig ist. Im Allgemeinen besteht ein Epitop aus mindestens 6 derartigen Aminosäuren, und in erhöhtem Maße gewöhnlich aus mindestens 8 bis 10 derartigen Aminosäuren. Verfahren zur Bestimmung der ein Epitop bildenden Aminosäuren umfassen Röntgenkristallographie, zweidimensionale kernmagnetische Resonanz sowie Epitop-Kartierung, z. B. das von H. Mario Geysen et al. 1984, PCT Veröffentlichungs-Nr. WO 84/03564 und PCT Veröffentlichungs-Nr. WO 84/03506 beschriebene Pepscan-Verfahren.
Über die vorliegende Beschreibung hinweg kann der Ausdruck „Nukleotidsequenz” zur indifferenten Bezeichnung eines Polynukleotids oder einer Nukleinsäure verwendet werden. Genauer gesagt umfasst der Ausdruck „Nukleotidsequenz” das Nukleinmaterial selbst und ist somit nicht auf die Sequenzinformation beschränkt (d. h. die Abfolge an Buchstaben, welche aus den Buchstaben der vier Basen ausgewählt wird), welche ein spezifisches DNA- oder RNA-Molekül biochemisch charakterisiert.
Der Begriff „stromaufwärts” wird hierin zur Bezeichnung eines Orts verwendet, welcher sich in Richtung des 5'-Endes des Polynukleotids von einem bestimmten Referenzpunkt aus befindet.
Die Begriffe „basengepaart” und „Watson & Crick-basengepaart” werden hierin untereinander austauschbar zur Bezeichnung von Nukleotiden verwendet, welche aufgrund ihrer Sequenzidentitäten in einer Art und Weise über Wasserstoff aneinander gebunden sein können, welche der in doppelhelikaler DNA vorkommenden entspricht, wobei Thymin- oder Uracilreste über zwei Wasserstoffbrücken mit Adeninresten verknüpft sind, und Cytosin- und Guaninreste über drei Wasserstoffbrücken verknüpft sind (siehe Stryer, L., 1995).
Die Begriffe „komplementär” oder „Komplement hiervon” werden hierin zur Bezeichnung der Sequenzen Von Polynukleotiden verwendet, welche befähigt sind, über die gesamte komplementäre Region hinweg mit einem anderen spezifischen Polynukleotid eine Watson & Crick-Basenpaarung auszubilden. Dieser Begriff wird auf Polynukleotidpaare lediglich auf Basis ihrer Sequenzen und nicht aufgrund einer bestimmten Reihe von Bedingungen angewendet, unter welchen die beiden Polynukleotide tatsächlich binden.
Der Begriff „Allel” wird hierin zur Bezeichnung von Varianten einer Nukleotidsequenz verwendet. Diploide Organismen können in Bezug auf eine Allelform homozygot oder heterozygot sein.
Ein „Promotor” bezeichnet eine DNA-Sequenz, welche von der Synthesemaschinerie der Zelle erkannt wird und zur Initiierung der spezifischen Transkription eines Gens erforderlich ist.
Eine Sequenz, welche mit einer regulatorischen Sequenz, wie beispielsweise einem Promotor, „operativ verknüpft” ist, bedeutet, dass sich das regulatorische Element im Verhältnis zur Nukleinsäure am richtigen Ort und in der richtigen Orientierung befindet, um die Initiierung von RNA-Polymerase sowie die Expression der Nukleinsäure von Interesse zu kontrollieren. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff „operativ verknüpft” eine Verknüpfung von Polynukleotidelementen in einer funktionellen Beziehung. So ist beispielsweise ein Promotor oder Enhancer operativ mit einer kodierenden Sequenz verknüpft, wenn er die Transkription der kodierenden Sequenz beeinflusst. Genauer gesagt werden zwei DNA-Moleküle (wie beispielsweise ein eine Promotorregion enthaltendes Polynukleotid und ein für ein gewünschtes Polypeptid oder Polynukleotid kodierendes Polynukleotid) dann als „operativ verknüpft” bezeichnet, wenn die Art der Verknüpfung zwischen den beiden Polynukleotiden (1) nicht zur Einführung einer das Leseraster verschiebenden Mutation (Frameshift-Mutation) führt, oder (2) die Fähigkeit des den Promotor enthaltenden Polynukleotids, die Transkription des kodierenden Polynukleotids zu steuern, nicht beeinträchtigt.
Der Begriff „Primer” bezeichnet eine spezifische Oligonukleotidsequenz, welche zu einer Zielnukleotidsequenz komplementär ist und zur Hybridisierung an die Zielnukleotidsequenz verwendet wird. Ein Primer dient als Initiierungsstelle für die entweder von DNA-Polymerase, RNA-Polymerase oder reverser Transkriptase katalysierte Nukleotidpolymerisierung.
Der Begriff „Sonde” bezeichnet ein definiertes Nukleinsäuresegment (oder ein nukleotidanaloges Segment, z. B. ein Polynukleotid, wie es nachstehend definiert ist), welches zur Identifizierung einer in Proben vorhandenen spezifischen Polynukleotidsequenz verwendet werden kann, wobei das Nukleinsäuresegment eine Nukleotidsequenz umfasst, welche zu der zu identifizierenden spezifischen Polynukleotidsequenz komplementär ist.
Der Begriff „Heterozygositätsrate” wird hierin zur Bezeichnung der Häufigkeit von Individuen in einer Population verwendet, welche in Bezug auf ein bestimmtes Allel heterozygot sind. in einem biallelischen System beträgt die Heterozygositätsrate durchschnittlich gleich 2P_a(1 – P_a), wobei P_a die Häufigkeit des am seltensten vorkommenden Allels ist. Um in genetischen Studien von Nutzen zu sein, sollte ein genetischer Marker ein angemessenes Niveau an Heterozygosität aufweisen, um eine sinnvolle Wahrscheinlichkeit zu ermöglichen, dass eine zufällig ausgewählte Person heterozygot ist.
Der Begriff „Genotyp” wird hierin zur Bezeichnung der Identität der in einem Individuum oder in einer Probe vorhandenen Allele verwendet. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet ein Genotyp bevorzugt die Beschreibung der in einem Individuum oder in einer Probe vorhandenen biallelischen Markerallele. Der Begriff „Genotypisieren” einer Probe oder eines Individuums auf einen biallelischen Marker besteht aus der Bestimmung des von einem Individuum getragenen spezifischen Allels oder spezifischen Nukleotids an einem biallelischen Marker.
Der Begriff „Mutation” wird hierin zur Bezeichnung eines Unterschiedes in der DNA-Sequenz zwischen oder unter verschiedenen Genomen oder Individuen verwendet, welche eine Häufigkeit von unter 1% besitzt.
Der Begriff „Haplotyp” bezeichnet eine Kombination von Allelen, welche in einem Individuum oder in einer Probe vorliegt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet ein Haplotyp bevorzugt eine Kombination von biallelischen Markerallelen, welche in einem vorgegebenen Individuum vorkommen und mit einem Phänotyp assoziiert werden können.
Der Begriff „Polymorphismus” wird hierin zur Bezeichnung des Auftretens von zwei oder mehreren alternativen genomischen Sequenzen oder Allelen zwischen oder unter verschiedenen Genomen oder Individuen verwendet. „Polymorph” bezeichnet den Zustand, in welchem zwei oder mehrere Varianten einer spezifischen genomischen Sequenz in einer Population vorkommen können. Eine „polymorphe Stelle” ist der Locus, an welchem die Variation auftritt. Ein Einzelnukleotidpolymorphismus ist der Austausch eines einzelnen Basenpaares. Typischerweise handelt es sich bei einem Einzelnukleotidpolymorphismus um den Austausch eines Nukleotids durch ein anderes Nukleotid an der polymorphen Stelle. Die Deletion eines einzelnen Nukleotids oder die Insertion eines einzelnen Nukleotids haben ebenfalls Einzelnukleotidpolymorphismen zur Folge. im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet „Einzelnukleotidpolymorphismus” bevorzugt die Substitution eines einzelnen Nukleotids. Typischerweise kann die polymorphe Stelle in unterschiedlichen Genomen oder in unterschiedlichen Individuen von zwei unterschiedlichen Nukleotiden besetzt sein.
„Biallelische Marker” bestehen aus einem Einzelbasenpolymorphismus. Jeder biallelische Marker entspricht daher zwei Formen einer in einem Gen umfassten Polynukleotidsequenz, welche, wenn sie miteinander verglichen werden, an einer Position eine Nukleotidmodifikation zeigen. Üblicherweise umfasst die Nukleotidmodifikation die Substitution eines Nukleotids durch ein anderes (beispielsweise C anstelle von T). Es hat sich bestätigt, dass die Häufigkeit des weniger häufig vorkommenden Allels der biallelischen Marker der vorliegenden Erfindung typischerweise mehr als 1% beträgt. Bevorzugt beträgt die Häufigkeit mehr als 10%, stärker bevorzugt beträgt die Häufigkeit mindestens 20% (d. h. eine Heterozygositätsrate von mindestens 0.32), noch stärker bevorzugt beträgt die Häufigkeit mindestens 30% (d. h. eine Heterozygositätsrate von mindestens 0.42). Ein biallelischer Marker, bei welchem die Häufigkeit des weniger häufig vorkommenden Allels 30% oder mehr beträgt, wird als „biallelischer Hochqualitätsmarker” bezeichnet.
Wie hierin verwendet, bedeutet die Terminologie „Definieren eines biallelischen Markers”, dass eine Sequenz eine polymorphe Base aus einem biallelischen Marker umfasst. Die einen biallelischen Marker definierenden Sequenzen können in Übereinstimmung mit ihrer beabsichtigten Verwendung von beliebiger Länge sein, unter der Voraussetzung, dass sie eine polymorphe Base aus einem biallelischen Marker enthalten. Die Sequenz besitzt eine Länge zwischen 1 und 500 Nukleotiden, bevorzugt zwischen 5, 10, 15, 20, 25 oder 40 und 200 Nukleotiden, und stärker bevorzugt eine Länge zwischen 30 und 50 Nukleotiden. Bevorzugt umfassen die einen biallelischen Marker definierenden Sequenzen eine polymorphe Base, welche aus der Gruppe bestehend aus den biallelischen Markern A1 bis A28 ausgewählt wird. In einigen Ausführungsformen umfassen die einen biallelischen Marker definierenden Sequenzen eine der Sequenzen, welche aus der Gruppe bestehend aus P1 bis P28 ausgewählt wird. Gleichermaßen erfordert der Begriff „Marker” oder „biallelischer Marker”, dass die Sequenz eine ausreichende Länge besitzt, um das polymorphe Allel in geeigneter Weise (obwohl nicht notwendigerweise eindeutig) zu identifizieren, welches gewöhnlich eine Länge von mindestens 4, 5, 6, 10, 15, 20, 25 oder 40 Nukleotiden impliziert.
Die Erfindung betrifft ferner mit FLAP in Beziehung stehende biallelische Marker, welche mit Asthma assoziiert sind. Der Begriff „mit FLAP in Beziehung stehender biallelischer Marker” umfasst, ist jedoch nicht beschränkt auf, sowohl die in 1 beschriebenen genischen als auch nicht-genischen biallelischen Marker.
Der Begriff „nicht-genisch” wird hierin zur Beschreibung von mit FLAP in Beziehung stehenden biallelischen Markern sowie von Polynukleotiden und Primern verwendet, welche außerhalb den in der humanen genomischen FLAP-Sequenz von SEQ ID Nr. 1 gezeigten Nukleotidpositionen vorkommen. Der Begriff „genisch” wird hierin zur Bezeichnung von mit FLAP in Beziehung stehenden biallelischen Markern sowie von Polynukleotiden und Primern verwendet, welche an den in der humanen genomischen FLAP-Sequenz von SEQ ID Nr. 1 gezeigten Nukleotidpositionen vorkommen.
Die Lage von Nukleotiden in einem Polynukleotid in Bezug auf das Zentrum des Polynukleotids wird hierin auf folgende Art und Weise beschrieben. Weist ein Polynukleotid eine ungerade Anzahl von Nukleotiden auf, so wird das Nukleotid mit gleichem Abstand von den 3'- und 5'-Enden des Polynukleotids als „im Zentrum” des Polynukleotids angesehen, und jedes Nukleotid, welches zu dem Nukleotid im Zentrum unmittelbar benachbart ist oder das Nukleotid im Zentrum selbst wird als „innerhalb eines Nukleotids vom Zentrum aus betrachtet” angesehen. Bei einer ungeraden Anzahl von Nukleotiden in einem Polynukleotid wird eine beliebige der fünf Nukleotidpositionen in der Mitte des Polynukleotids als innerhalb von 2 Nukleotiden vom Zentrum aus betrachtet angesehen, usw. Weist ein Polynukleotid eine gerade Anzahl von Nukleotiden auf, so befindet sich eine Bindung und nicht ein Nukleotid im Zentrum des Polynukleotids. Folglich wird eines der beiden zentralen Nukleotide als „innerhalb eines Nukleotids vom Zentrum aus betrachtet” angesehen, und ein beliebiges der vier Nukleotide in der Mitte des Polynukleotids wird als „innerhalb von 2 Nukleotiden vom Zentrum aus betrachtet” angesehen, usw. Für Polymorphismen, welche die Substitution, Insertion oder Deletion von einem Nukleotid oder mehreren Nukleotiden umfassen, befindet sich der Polymorphismus, das Allel oder der biallelische Marker „im Zentrum” eines Polynukleotids, wenn die Differenz zwischen dem Abstand der substituierten, insertierten oder deletierten Polynukleotide des Polymorphismus vom 3'-Ende des Polynukleotids und dem Abstand der substituierten, insertierten oder deletierten Polynukleotide des Polymorphismus vom 5'-Ende des Polynukleotids Null ist oder ein Nukleotid beträgt. Beträgt die Differenz 0 bis 3, so wird der Polymorphismus als „innerhalb eines Nukleotids vom Zentrum aus betrachtet” angesehen. Beträgt die Differenz 0 bis 5, so wird der Polymorphismus als „innerhalb von 2 Nukleotiden vom Zentrum aus betrachtet” angesehen. Beträgt die Differenz 0 bis 7, so wird der Polymorphismus als „innerhalb von 3 Nukleotiden vom Zentrum aus betrachtet” angesehen, usw.
Die Begriffe „Merkmal” und „Phänotyp” werden hierin untereinander austauschbar zur Bezeichnung einer beliebigen sichtbaren, detektierbaren oder anderweitig messbaren Eigenschaft eines Organismus, wie beispielsweise Symptome einer Erkrankung oder die Empfänglichkeit für eine Erkrankung, verwendet. Typischerweise werden die Begriffe „Merkmal” oder „Phänotyp” hierin zur Bezeichnung von Symptomen einer Erkrankung oder der Empfänglichkeit für eine Erkrankung, in welcher der Leukotrien-Signalweg involviert ist, oder zur Bezeichnung der Ansprechbarkeit eines Individuums auf ein Mittel, welches auf den Leukotrien-Signalweg wirkt, oder zur Bezeichnung von Symptomen von oder der Empfänglichkeit für Nebenwirkungen auf ein Mittel hin, welches auf den Leukotrien-Signalweg wirkt, verwendet.
Der Begriff „Erkrankung, in welcher der Leukotrien-Signalweg involviert ist” bezeichnet einen Zustand, welcher mit Beeinträchtigungen der Expression, Produktion oder der zellulären Reaktion auf Leukotriene verbunden ist. Erkrankungen, in denen der Leukotrien-Signalweg involviert ist, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, beispielsweise Angina, endotoxischen Schock, Psoriasis, atopisches Ekzem, rheumatoide Arthritis, inflammatorische Darmerkrankung, Osteoarthritis, Tendinitis, Bursitis, ulzerative Kolitis, allergisches Bronchialasthma, allergische Rhinitis, allergische Konjunktivitis, Glomerulonephritis, Migränekopfschmerzen, und insbesondere Asthma.
Der Ausdruck „Ansprechbarkeit auf ein Mittel, welches auf den Leukotrien-Signalweg wirkt” bezeichnet die Arzneimittelwirksamkeit, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, die Fähigkeit, eine Verbindung zu metabolisieren, auf die Fähigkeit, die Vorstufe eines Arzneimittels in ein aktives Arzneimittel umzuwandeln, sowie die Pharmakokinetik (Absorption, Verteilung, Ausscheidung) und die Pharmakodynamik (rezeptorbezogen) eines Arzneimittels in einem Individuum. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann eine „positive Ansprechbarkeit” auf ein Medikament dahingehend definiert werden, dass eine Verringerung der Symptome, welche mit der zu behandelnden Erkrankung oder dem zu behandelnden Zustand in Beziehung stehen, umfasst ist. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann eine „negative Ansprechbarkeit” auf ein Medikament dahingehend definiert werden, dass entweder eine positive Ansprechbarkeit auf das Medikament ausbleibt, was zu keiner Verringerung der Symptome führt, oder aber eine im Anschluss an die Verabreichung des Medikaments beobachtete Nebenwirkung umfasst ist.
Der Ausdruck „Nebenwirkungen in Bezug auf ein Mittel, welches auf den Leukotrien-Signalweg wirkt” bezeichnet Nebenwirkungen einer Therapie, welche aus einer Ausweitung der hauptsächlich pharmakologischen Wirkung des Arzneimittels resultieren, oder bezeichnet idiosynkratische Nebenreaktionen, welche aus einer Wechselwirkung des Arzneimittels mit einzigartigen Wirtsfaktoren resultieren. Bei den mit der Behandlung mit Mitteln, welche auf den Leukotrien-Signalweg wirken, in Beziehung stehenden Nebenwirkungen handelt es sich bevorzugt um eine akute Exazerbation einer inflammatorischen Erkrankung wie beispielsweise Asthma, eine Infektion und Kopfschmerzen, und stärker bevorzugt um eine Erhöhung der Transaminasespiegel in der Leber.
Der Ausdruck „Mittel, welche auf den Leukotrien-Signalweg wirken” bezeichnet bevorzugt ein Arzneimittel oder eine Verbindung, welche die Aktivität oder die Konzentration eines beliebigen Enzyms oder regulatorischen Moleküls, das im Leukotrien-Signalweg einer Zelle oder eines Tieres involviert ist, moduliert. Bevorzugt können diese Mittel aus der nachfolgenden Gruppe ausgewählt werden: FLAP-Inhibitoren wie beispielsweise BAYx 1005, MK-886 und MK-0591; 5-Lipoxygenase-Inibitoren wie beispielsweise Zileuton, BAY-G576, RS-43,179, Wy-47,288, Vitamin A und BW A4C; Leukotrien-LTD4-Rezeptor-Antagonisten wie beispielsweise Zafirlukast, ICI 204,219, MK-571, MK-679, ONO-RS-411, SK&F 104,353 und Wy-48,252; Leukotrien-B4-Rezeptor-Antagonisten; Leukotrien-C4-Synthaseinhibitoren; und Leukotrien-A4-Hydrolaseinhibitoren. „Mittel, welche auf den Leukotrien-Signalweg wirken” bezeichnet weiterhin nichtsteroidale antiinflammatorische Arzneimittel (NSAIDs), Leukotrienrezeptor-Antagonisten und Leukotrienanaloga. „Mittel, welche auf den Leukotrien-Signalweg wirken” bezeichnet ferner Verbindungen, welche die Bildung und Wirkung von Leukotrienen modulieren.
Einige der vorstehend zitierten Verbindungen sind in den US Patenten 4,873,259 , 4,970,215 , 5,310,744 , 5,225,421 und 5,081,138 , oder in EP 0 419 049 beschrieben.
Der Begriff „Individuum” wird hierin zur Bezeichnung von Wirbeltieren, insbesondere von Mitgliedern der Säugerspezies, verwendet, und umfasst, ist jedoch nicht beschränkt auf, Haustiere, Sporttiere, Labortiere, Primaten und Menschen. Bevorzugt ist ein Individuum ein Mensch.
Varianten und Fragmente
Polynukleotide
Die Erfindung offenbart ferner Varianten und Fragmente der hierin beschriebenen Polynukleotide, insbesondere ein FLAP-Gen, welches einen oder mehrere der in der Erfindung beschriebenen biallelischen Marker enthält.
Varianten von Polynukleotiden, wie der Begriff hierin verwendet wird, sind Polynukleotide, welche sich von einem Referenzpolynukleotid unterscheiden. Eine Variante eines Polynukleotids kann eine natürlich vorkommende Variante, wie beispielsweise eine natürlich vorkommende Allelvariante, sein, oder sie kann eine Variante sein, für welche über ein natürliches Vorkommen nichts bekannt ist. Derartige nicht-natürlich vorkommende Varianten des Polynukleotids können mittels Mutagenesetechniken hergestellt werden, umfassend jene, welche auf Polynukleotide, Zellen oder Organismen angewendet werden. Im Allgemeinen sind die Unterschiede dahingehend beschränkt, dass die Nukleotidsequenzen der Referenz und der Variante insgesamt eine hohe Ähnlichkeit besitzen und in vielen Regionen identisch sind.
Veränderungen im Nukleotid einer Variante können still sein, was bedeutet, dass sie die durch das Polynukleotid kodierten Aminosäuren nicht verändern.
Nukleotidveränderungen können jedoch auch zu Aminosäuresubstitutionen, -additionen, -deletionen, -fusionen und -verkürzungen in dem durch die Referenzsequenz kodierten Polypeptid führen. Die Substitutionen, Deletionen oder Additionen können ein Nukleotid oder mehrere Nukleotide umfassen. Die Varianten können in kodierenden oder in nicht-kodierenden Regionen oder in beiden Regionen verändert werden. Veränderungen in den kodierenden Regionen können konservative oder nicht-konservative Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -additionen erzeugen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind besonders bevorzugte Ausführungsformen jene, in welchen die Polynukleotide für Polypeptide kodieren, die im Wesentlichen die gleiche biologische Funktion oder Aktivität wie das reife FLAP-Protein beibehalten.
Ein Polynukleotidfragment stellt ein Polynukleotid mit einer Sequenz dar, welche mit einer vorgegebenen Nukleotidsequenz, bevorzugt der Nukleotidsequenz eines FLAP-Gens und Varianten hiervon, in Bezug auf einen Teil der Nukleotidsequenz, jedoch nicht in Bezug auf die gesamte Nukleotidsequenz, vollständig übereinstimmt. Das Fragment kann ein Teil eines Exons oder eines Introns eines FLAP-Gens sein. Es kann ferner ein Teil der regulatorischen Sequenzen des FLAP-Gens sein. Bevorzugt umfassen derartige Fragmente die polymorphe Base von mindestens einem der biallelischen Marker A1 bis A28, oder des Komplements hierfür.
Derartige Fragmente können „freistehend”, d. h. nicht Teil von anderen Polynukleotiden sein oder an andere Polynukleotide fusioniert sein, oder sie können innerhalb eines einzelnen größeren Polynukleotids umfasst sein, von welchem sie einen Teil oder eine Region bilden. Es können jedoch mehrere Fragmente innerhalb eines einzelnen größeren Polynukleotids umfasst sein.
Als repräsentative Beispiele für Polynukleotidfragmente seien jene genannt, welche ein Länge von etwa 4, 6, 8, 15, 20, 25, 40, 10 bis 20, 10 bis 30, 30 bis 55, 50 bis 100, 75 bis 100 oder 100 bis 200 Nukleotide besitzen. Bevorzugt sind jene Fragmente, welche eine Länge von etwa 47 Nukleotiden besitzen, wie beispielsweise jene von P1 bis P28, und welche mindestens einen der hierin beschriebenen biallelischen Marker eines FLAP-Gens enthalten. Es versteht sich selbstredend, dass die Polynukleotide P1 bis P28 kürzer oder länger sein können, obwohl es bevorzugt ist, dass sie mindestens die polymorphe Base des biallelischen Markers, die an einem Ende des Fragments lokalisiert sein kann, enthalten.
Polypeptide
Die Erfindung offenbart Varianten, Fragmente, Analoga und Derivate der hierin beschriebenen Polypeptide, einschließlich mutierter FLAP-Proteine.
Die Variante kann 1) eine sein, in welcher ein Aminosäurerest oder mehrere Aminosäurereste mit einem konservierten oder nicht-konservierten Aminosäurerest substituiert sind (bevorzugt ein konservierter Aminosäurerest), wobei ein derartiger substituierter Aminosäurerest ein durch den genetischen Code mutierter Rest sein kann oder ein nicht durch den genetischen Code mutierter Rest sein kann, oder 2) eine sein kann, in welcher ein Aminosäurerest oder mehrere Aminosäurereste eine Substituentengruppe umfassen, oder 3) eine sein kann, in welcher das mutierte FLAP mit einer anderen Verbindung fusioniert ist, wie beispielsweise einer Verbindung zur Erhöhung der Halbwertszeit des Polypeptids (beispielsweise Polyethylenglycol), oder 4) eine ist, in welcher die zusätzlichen Aminosäuren an das mutierte FLAP fusioniert sind, wie beispielsweise eine Leadersequenz oder eine sekretorische Sequenz oder eine zur Reinigung des mutierten FLAP eingesetzte Sequenz oder einer Präproteinsequenz. Derartige Varianten werden als innerhalb der Kenntnisse eines Fachmanns liegend angesehen.
Ein Polypeptidfragment stellt ein Polypeptid mit einer Sequenz dar, welche mit einer vorgegebenen Polypeptidsequenz, bevorzugt mit einem durch ein FLAP-Gen kodierten Polypeptid und Varianten hiervon, in Bezug auf einen Teil der Polypeptidsequenz, jedoch nicht in Bezug auf die gesamte Polypeptidsequenz, vollständig übereinstimmt. Bevorzugte Fragmente umfassen jene der aktiven Region des FLAP-Proteins, welche eine Rolle in der Biosynthese von Leukotrienen spielen, sowie jene Regionen, welche antigene Eigenschaften besitzen und zur Erzeugung von Antikörpern gegen das FLAP-Protein verwendet werden können.
Derartige Fragmente können „freistehend”, d. h. nicht Teil von anderen Polypeptiden sein oder an andere Polypeptide fusioniert sein, oder sie können innerhalb eines einzelnen größeren Polypeptids umfasst sein, von welchem sie einen Teil oder eine Region bilden. Es können jedoch mehrere Fragmente innerhalb eines einzelnen größeren Polypeptids umfasst sein.
Als repräsentative Beispiele für erfindungsgemäße Polypeptidfragmente seien jene genannt, welche eine Länge von etwa 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 bis 15, 10 bis 20, 15 bis 40 oder 30 bis 45 Aminosäuren besitzen. Bevorzugt sind jene Fragmente, welche mindestens eine Aminosäuremutation im FLAP-Protein enthalten.
Stringente Hybridisierungsbedingungen
Beispielhafte und in keiner Weise beschränkende Verfahren unter Verwendung von Bedingungen hoher Stringenz sind wie folgt: eine Vorhybridisierung von DNA-enthaltenden Filtern wird für 8 h über Nacht bei 65°C in einem Puffer, welcher aus 6 × SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% BSA und 500 μg/ml denaturierter Lachssperma-DNA zusammengesetzt ist, durchgeführt. Die Filter werden für 48 h bei 65°C, der bevorzugten Hybridisierungstemperatur, in einem 100 μg/ml an denaturierter Lachssperma-DNA und 5–20 × 10⁶ cpm an ³²P-markierter Sonde enthaltendem Vorhybridisierungsgemisch hybridisiert. Alternativ kann der Hybridisierungsschritt bei 65°C in Gegenwart von SSC-Puffer durchgeführt werden, wobei 1 × SSC 0.15 M NaCl und 0.05 M Na-Citrat entspricht. Anschließend kann ein Waschen der Filter bei 37°C für 1 h in einer Lösung, welche 2 × SSC, 0.01% PVP, 0.01% Ficoll und 0.01% BSA enthält, durchgeführt werden, gefolgt von einem Waschen in 0.1 × SSC bei 50°C für 45 min. Alternativ kann das Waschen der Filter in einer Lösung, welche 2 × SSC und 0.1% SDS, oder 0.5 × SSC und 0.1% SDS, oder 0.1 × SSC und 0.1% SDS enthält, bei 68°C in Intervallen von 15 Minuten durchgeführt werden. Im Anschluss an die Waschschritte sind die hybridisierten Sonden mittels Autoradiographie detektierbar. Andere verwendbare Bedingungen hoher Stringenz sind im Fachbereich wohlbekannt, wobei auf die in Sambrook et al., 1989, und Ausubel et al., 1989, zitierten in ihrer Gesamtheit hiermit Bezug genommen wird. Diese Hybridisierungsbedingungen sind für ein Nukleinsäuremolekül mit einer Länge von etwa 20 Nukleotiden geeignet. Es bedarf keiner Erwähnung, dass die vorstehend beschriebenen Hybridisierungsbedingungen entsprechend der Länge der gewünschten Nukleinsäure in Übereinstimmung mit Techniken, welche dem Fachmann wohlbekannt sind, angepasst werden müssen. Die geeigneten Hybridisierungsbedingungen können beispielsweise entsprechend den im Buch von Hames und Higgins (1985) oder in Sambrook et al. (1989) offenbarten Lehren angepasst werden.
Identität zwischen Nukleinsäuren oder Polypeptiden
Die Begriffe „prozentuale Sequenzidentität” und „prozentuale Homologie” werden hierin untereinander austauschbar zur Bezeichnung von Vergleichen zwischen Polynukleotiden und Polypeptiden verwendet und durch Vergleich zweier optimal abgeglichener Sequenzen über ein Vergleichsfenster bestimmt, wobei der Anteil der Polynukleotid- oder Polypeptidsequenz im Vergleichsfenster Additionen oder Deletionen (d. h. Lücken) im Vergleich zur Referenzsequenz (welche keine Additionen oder Deletionen umfasst) für einen optimalen Abgleich der beiden Sequenzen umfassen kann. Der Prozentsatz wird durch Bestimmen der Anzahl von Positionen berechnet, bei welchen die identische Nukleinsäurebase oder der identische Aminosäurerest in beiden Sequenzen auftritt, wodurch die Anzahl von übereinstimmenden Positionen erhalten wird, Teilen der Anzahl von übereinstimmenden Positionen durch die Gesamtzahl an Positionen im Vergleichsfenster, sowie Multiplizieren des Ergebnisses mit 100, um die prozentuale Sequenzidentität zu erhalten. Die Homologie wird unter Verwendung eines beliebigen aus einer Vielzahl von im Fachbereich bekannten Algorithmen und Programmen für Sequenzvergleiche ausgewertet. Derartige Algorithmen und Programme umfassen, sind jedoch keinesfalls beschränkt auf, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA und CLUSTALW (Pearson und Lipman, 1988; Altschul et al., 1990; Thompson et al., 1994; Higgins et al., 1996; Altschul et al., 1990; Altschul et al., 1993). In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden Protein- und Nukleinsäuresequenzhomologien unter Verwendung des im Fachbereich wohlbekannten Basic Local Alignment Search Tool („BLAST”) ausgewertet (siehe z. B. Karlin und Altschul, 1990; Altschul et al., 1990; Altschul et al., 1993; Altschul et al., 1997). Insbesondere werden fünf spezielle BLAST-Programme zur Durchführung der nachfolgende Aufgabe verwendet:

(1) BLASTP und BLAST3 vergleichen eine gesuchte Aminosäuresequenz mit einer Proteinsequenzdatenbank;
(2) BLASTN vergleicht eine gesuchte Nukleotidsequenz mit einer Nukleotidsequenzdatenbank;
(3) BLASTX vergleicht die konzeptionalen Translationsprodukte der sechs Leserahmen einer gesuchten Nukleotidsequenz (beide Stränge) mit einer Proteinsequenzdatenbank;
(4) TBLASTN vergleicht eine gesuchte Proteinsequenz mit einer Nukleotidsequenzdatenbank, welche in allen sechs Leserahmen translatiert ist (beide Stränge); und
(5) TBLASTX vergleicht die Translationen der sechs Leserahmen einer gesuchten Nukleotidsequenz mit den Translationen der sechs Leserahmen einer Nukleotidsequenzdatenbank.

Die BLAST-Programme identifizieren homologe Sequenzen durch Identifizierung ähnlicher Segmente, welche hierin als „höchst bewertete Segmentpaare (High-Scoring Segment Pairs)” bezeichnet werden, zwischen einer gesuchten Amino- oder Nukleinsäuresequenz und einer Testsequenz, welche bevorzugt aus einer Protein- oder Nukleinsäuresequenzdatenbank erhalten wird. Höchst bewertete Segmentpaare werden bevorzugt mittels einer Bewertungsmatrix (Scoring Matrix) identifiziert (d. h. abgeglichen), von denen viele im Fachbereich bekannt sind. Bevorzugt handelt es sich bei der verwendeten Bewertungsmatrix um die BLOSUM62-Matrix (Gonnet et al., 1992; Henikoff und Henikoff, 1993). Weniger bevorzugt können auch die PAM- oder die PAM250-Matrix verwendet werden (siehe z. B. Schwartz und Dayhoff, Hrgs., 1978). Die BLAST-Programme werten die statistische Signifikanz aller identifizierten, höchst bewerteten Segmentpaare aus, und wählen bevorzugt jene Segmente aus, welche einen vom Benutzer spezifizierten Signifikanzgrenzwert erfüllen, wie beispielsweise eine vom Benutzer spezifizierte prozentuale Homologie. Bevorzugt wird die statistische Signifikanz eines höchst bewerteten Segmentpaares unter Verwendung der statistischen Signifikanzformel von Karlin ausgewertet (siehe z. B. Karlin und Altschul, 1990).
II. Genomische Sequenzen von FLAP
Obwohl das FLAP-Gen in der pharmazeutischen Forschung von hoher Relevanz ist, besitzen wir nach wie vor ein geringes Wissen in Bezug auf das Ausmaß und die Art von Sequenzvariationen in diesem Gen und in seinen regulatorischen Elementen. Die cDNA und ein Teil der genomischen Sequenz von menschlichem FLAP wurden kloniert und sequenziert (Kennedy et al., 1991; Dixon et al., 1988). Die vollständige genomische Sequenz von FLAP, einschließlich seiner regulatorischen Elemente, wurde jedoch nicht beschrieben.
Die vorliegende Erfindung offenbart die genomische Sequenz des FLAP-Gens von SEQ ID Nr. 1 oder einer Variante hiervon oder der hierzu komplementären Sequenz. Dieses Polynukleotid der Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1 oder einer Variante hiervon oder der hierzu komplementären Sequenz kann gereinigt, isoliert oder rekombinant sein. Die genomischen FLAP-Sequenzen umfassen Exons und Introns. Die aus den intronischen FLAP-Polynukleotiden stammenden Nukleinsäuren können als Oligonukieotidprimer oder -sonden verwendet werden, um die Gegenwart einer Kopie des FLAP-Gens in einer Testprobe zu detektieren, oder um alternativ eine Zielnukleotidsequenz innerhalb der FLAP-Sequenzen zu amplifizieren.
Die genomische FLAP-Nukleinsäure umfasst 5 Exons. Exon 1 beginnt mit dem Nukleotid an Position 7709 und endet mit dem Nukleotid an Position 7852 der Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1; Exon 2 beginnt mit dem Nukleotid an Position 16236 und endet mit dem Nukleotid an Position 16335 der Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1; Exon 3 beginnt mit dem Nukleotid an Position 24227 und endet mit dem Nukleotid an Position 24297 der Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1; Exon 4 beginnt mit dem Nukleotid an Position 28133 und endet mit dem Nukleotid an Position 28214 der Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1; Exon 5 beginnt mit dem Nukleotid an Position 36128 und endet mit dem Nukleotid an Position 36605 der Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1.
Die Erfindung betrifft ein isoliertes, gereinigtes oder rekombinantes Polynukleotid, umfassend einen Bereich von mindestens 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 oder 1000 aufeinanderfolgenden Nukleotiden von SEQ ID Nr. 1 oder der komplementären Sequenz hiervon, wobei der aufeinanderfolgende Bereich ein Nukleotid umfasst, welches aus der Gruppe bestehend aus einem A an Position 7445, einem A an Position 7870, einem T an Position 16288, einem A an Position 16383, einem T an Position 24361, einem G an Position 28336, einem T an Position 28368, einem A an Position 36183, und einem G an Position 36509 von SEQ ID Nr. 1 ausgewählt wird.
Regulatorische Regionen des FLAP-Gens
Die genomische Sequenz des FLAP-Gens enthält sowohl in der nicht-kodierenden 5'-flankierenden Region als auch in der nicht-kodierenden 3'-flankierenden Region, welche an die die 5 Exons dieses Gens enthaltende transkribierte Region von FLAP angrenzen, regulatorische Sequenzen. 5'-regulatorische Sequenzen des FLAP-Gens umfassen die zwischen dem Nukleotid an Position 1 und dem Nukleotid an Position 7708 der Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1 lokalisierten Polynukleotidsequenzen, stärker bevorzugt die zwischen den Positionen 1 und 7007 von SEQ ID Nr. 1 lokalisierten Polynukleotidsequenzen. 3'-regulatorische Sequenzen des FLAP-Gens umfassen die zwischen dem Nukleotid an Position 36606 und dem Nukleotid an Position 43069 der Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1 lokalisierten Polynukleotidsequenzen.
Polynukleotide, welche die sowohl am 5'-Ende als auch die am 3'-Ende der kodierenden Region von FLAP lokalisierten regulatorischen Elemente tragen, können in vorteilhafter Weise zur Kontrolle der Transkriptions- und Translationsaktivität eines heterologen Polynukleotids von Interesse verwendet werden, wobei das Polynukleotid in Bezug auf die regulatorische FLAP-Region heterolog ist.
Ein derartiges Polynukleotid kann in einem rekombinanten Expressionsvektor umfasst sein, um das gewünschte Polypeptid oder die gewünschte Nukleinsäure in einer Wirtszelle oder in einem Wirtsorganismus zu exprimieren.
III. FLAP-cDNA-Sequenzen
Die vorliegende Erfindung offenbart eine FLAP-cDNA der SEQ ID Nr. 2. Die cDNA von SEQ ID Nr. 2 umfasst ferner eine 5'-UTR-Region und eine 3'-UTR-Region. Die 5'-UTR-Region beginnt mit dem Nukleotid an Position 1 und endet mit dem Nukleotid an Position 74 von SEQ ID Nr. 2. Die 3'-UTR-Region beginnt mit dem Nukleotid an Position 561 und endet mit dem Nukleotid an Position 875 von SEQ ID Nr. 2. Die Polyadenylierungsstelle beginnt mit dem Nukleotid an Position 851 und endet mit dem Nukleotid an Position 856 von SEQ ID Nr. 2.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist ein gereinigtes, isoliertes oder rekombinantes Polynukleotid, umfassend einen Bereich von mindestens 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 oder 1000 aufeinanderfolgenden Nukleotiden von SEQ ID Nr. 2 oder einer komplementären Sequenz hierzu, wobei der aufeinanderfolgende Bereich ein A an Position 453 (A20) oder ein G an Position 779 (A21) von SEQ ID Nr. 2 umfasst.
Die meisten biallelischen Polymorphismen stellen stille Nukleotidsubstitutionen dar, wobei der biallelische Marker Atü jedoch mit einem Aminosäureaustausch von Valin gegen Isoleucin an Position 127 des entsprechenden FLAP-Polypeptids assoziiert ist.
Das vorstehend offenbarte Polynukleotid, welches die kodierende Sequenz des FLAP-Gens der Erfindung enthält, kann in einer gewünschten Wirtszelle oder in einem gewünschten Wirtsorganismus exprimiert werden, wenn dieses Polynukleotid unter die Kontrolle geeigneter Expressionssignale gebracht wird. Die Expressionssignale können entweder die in den regulatorischen Regionen des erfindungsgemäßen FLAP-Gens enthaltenen Expressionssignale sein, oder sie können exogene regulatorische Nukleinsequenzen sein. Ein derartiges Polynukleotid kann, wenn es unter geeignete Expressionssignale gebracht wird, für seine Expression auch in einen Vektor insertiert werden.
Kodierende Regionen
Der offene Leserahmen von FLAP ist in der entsprechenden mRNA von SEQ ID Nr. 2 enthalten. Genauer gesagt erstreckt sich die effektive kodierende Sequenz (CDS) von FLAP vom Nukleotid an Position 75 (erstes Nukleotid des ATG-Codons) bis zum Nukleotid an Position 560 (letztes Nukleotid des TGA-Codons) der Polynukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 2. Die vorliegende Erfindung verkörpert ferner isolierte, gereinigte und rekombinante Polynukleotide, welche für ein Polypeptid, umfassend einen Bereich von mindestens 6 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, bevorzugt von mindestens 8 oder 10 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, starker bevorzugt von mindestens 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 oder 100 aufeinanderfolgenden Aminosäuren von SEQ ID Nr. 3 kodieren, wobei der aufeinanderfolgende Bereich einen Isoleucinrest an Aminosäureposition 127 von SEQ ID Nr. 3 umfasst.
Das vorstehend offenbarte Polynukleotid, welches die kodierende Sequenz des FLAP-Gens enthält, kann in einer gewünschten Wirtszelle oder in einem gewünschten Wirtsorganismus exprimiert werden, wenn dieses Polynukleotid unter die Kontrolle geeigneter Expressionssignale gebracht wird. Die Expressionssignale können entweder die in den regulatorischen Regionen des erfindungsgemäßen FLAP-Gens enthaltenen Expressionssignale sein, oder die Signale können im Gegensatz dazu exogene regulatorische Nukleinsequenzen sein. Ein derartiges Polynukleotid kann, wenn es unter geeignete Expressionssignale gebracht wird, für seine Expression und/oder Amplifikation auch in einen Vektor insertiert werden.
IV. Polynukleotidkonstrukte
Die Begriffe „Polynukleotidkonstrukt” und „rekombinantes Polynukleotid” werden hierin untereinander austauschbar zur Bezeichnung von linearen oder ringförmigen, gereinigten oder isolierten Polynukleotiden verwendet, welche künstlich entworfen wurden und mindestens zwei Nukleotidsequenzen umfassen, die in ihrer ursprünglichen natürlichen Umgebung nicht als aufeinanderfolgende Nukleotidsequenzen vorkommen.
DNA-Konstrukt, welches eine direkte zeitliche und räumliche Genexpression von FLAP in rekombinanten Wirtszellen und in transgenen Tieren ermöglicht
Um die physiologischen und phänotypischen Konsequenzen einer fehlenden Synthese des FLAP-Proteins sowohl auf Zellebene als auch auf Ebene eines multizellulären Organismus zu untersuchen, offenbart die Erfindung ferner DNA-Konstrukte und rekombinante Vektoren, welche eine konditionale Expression eines spezifischen Allels der genomischen FLAP-Sequenz oder der FLAP-cDNA sowie ferner eine Kopie dieser genomischen Sequenz oder cDNA, die Substitutionen, Deletionen oder Additionen von einer Base oder mehreren Basen in Bezug auf die FLAP-Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1 und 2 enthält oder eines Fragments hiervon ermöglichen, wobei diese Basensubstitutionen, -deletionen oder -additionen entweder in einem Exon, in einem Intron oder in einer regulatorischen Sequenz, jedoch bevorzugt in der 5'-regulatorischen Sequenz oder in einem Exon der genomischen FLAP-Sequenz oder innerhalb der FLAP-cDNA gemäß SEQ ID Nr. 2 lokalisiert sind. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die FLAP-Sequenz einen biallelischen Marker der vorliegenden Erfindung, bevorzugt einen der biallelischen Marker A1 bis A28.
Die vorliegende Erfindung verkörpert rekombinante Vektoren, welche ein beliebiges Polynukleotid der vorliegenden Erfindung umfassen.
Es wird ein erstes DNA-Konstrukt, welches auf dem Tetracylinresistenz-Operon tet aus dem Transposon Tn110 von E. coli basiert, zur Kontrolle der Genexpression von FLAP beschrieben, wie von Gossen et al. (1992; 1995) und Furth et al. (1994) beschrieben. Ein derartiges DNA-Konstrukt enthält sieben tet-Operatorsequenzen von Tn10 (tetop), welche entweder an einen minimalen Promotor oder an eine 5'-regulatorische Sequenz des FLAP-Gens gebunden sind, wobei der minimale Promotor oder die regulatorische FLAP-Sequenz operativ mit einem Polynukleotid von Interesse verknüpft ist, welches entweder für ein Sense- oder für ein Antisense-Oligonukleotid oder für ein Polypeptid kodiert, einschließlich eines FLAP-Polypeptids oder eines Peptidfragments hiervon. Dieses DNA-Konstrukt ist als konditionales Expressionssystem für die Nukleotidsequenz von Interesse funktionell, wenn die gleiche Zelle ferner eine entweder für den Wildtyp (tTA)-Repressor oder für den mutierten (rTA)-Repressor, welcher jeweils an die aktivierende Domäne des viralen Proteins VP16 von Herpes Simplex-Virus gebunden ist, kodierende Nukleotidsequenz umfasst, die unter die Kontrolle eines Promotors, wie beispielsweise den HCMVIE1 Enhancer/Promotor oder MMTV-LTR, gebracht wird. In der Tat umfasst ein bevorzugtes DNA-Konstrukt sowohl das die tet-Operatorsequenzen enthaltende Polynukleotid als auch das Polynukleotid, welches eine für den tTA- oder den rTA-Repressor kodierende Sequenz enthält.
In einer speziellen Ausführungsform enthält das konditionale Expressions-DNA-Konstrukt die für den mutierten Tetracyclinrepressor rTA kodierende Sequenz, wobei die Expression des Polynukleotids von Interesse in Abwesenheit von Tetracyclin abgeschaltet und in dessen Gegenwart induziert wird.
DNA-Konstrukte, welche eine homologe Rekombination ermöglichen: Austauschvektoren
Es wird ein DNA-Konstrukt beschrieben, welches vom 5'-Ende zum 3'-Ende hin umfasst: (a) eine erste Nukleotidsequenz, welche in der genomischen FLAP-Sequenz umfasst ist; (b) eine Nukleotidsequenz, welche einen positiven Selektionsmarker, wie beispielsweise den Marker für Neomycinresistenz (neo), umfasst; und (c) eine zweite Nukleotidsequenz, welche in der genomischen FLAP-Sequenz umfasst ist, und welche stromabwärts der ersten FLAP-Nukleotidsequenz (a) im Genom lokalisiert ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das DNA-Konstrukt ferner einen negativen Selektionsmarker, welcher stromaufwärts der Nukleotidsequenz (a) oder stromabwärts der Nukleotidsequenz (c) lokalisiert ist. Bevorzugt besteht der negative Selektionsmarker aus dem Thymidinkinase (tk)-Gen (Thomas et al., 1986), dem Hygromycin-Beta-Gen (Te Riele et al., 1990), dem hprt-Gen (Von der Lugt et al., 1991; Reid et al., 1990) oder dem Diphterietoxin A-Fragment (Dt-A)-Gen (Nada et al., 1993; Yagi et al., 1990). Bevorzugt ist der positive Selektionsmarker innerhalb einer Exonsequenz von FLAP lokalisiert, um auf diese Weise die für ein FLAP-Protein kodierende Sequenz zu unterbrechen. Diese Austauschvektoren werden beispielsweise von Thomas et al. (1986; 1987), Mansour et al. (1988) und Koller et al. (1992) beschrieben.
Die ersten und zweiten Nukleotidsequenzen (a) und (c) können indifferent innerhalb einer regulatorischen Sequenz, einer intronischen Sequenz, einer Exonsequenz, oder einer sowohl regulatorische und/oder intronische und/oder Exonsequenzen enthaltenden Sequenz von FLAP lokalisiert sein. Die Größe der Nukleotidsequenzen (a) und (c) liegt im Bereich von 1 bis 50 kb, bevorzugt von 1 bis 10 kb, stärker bevorzugt von 2 bis 6 kb und am stärksten bevorzugt von 2 bis 4 kb.
DNA-Konstrukte, welche eine homologe Rekombination ermöglichen: Cre-LoxP-System
Diese neuen DNA-Konstrukte nutzen das ortspezifische Rekombinationssystem des P1-Phagen. Der P1-Phage besitzt eine als Cre bezeichnete Rekombinase, welche spezifisch mit einer 34 Basenpaare umfassenden loxP-Stelle wechselwirkt. Die loxP-Stelle ist aus zwei palindromen Sequenzen von 13 bp zusammengesetzt, welche durch eine konservierte Sequenz von 8 bp voneinander getrennt sind (Hoess et al., 1986). Die durch das Cre-Enzym bewirkte Rekombination zwischen den zwei eine identische Orientierung aufweisenden loxP-Stellen führt zur Deletion des DNA-Fragments.
Das in Kombination mit einer homologen Rekombinationstechnik verwendete Cre-loxP-System wurde zuerst von Gu et al. (1993; 1994) beschrieben. Kurz gesagt enthält eine an einem gezielten Ort des Genoms zu insertierende Nukleotidsequenz von Interesse mindestens zwei loxP-Stellen, welche die gleiche Orientierung besitzen und an den jeweiligen Enden einer aus dem rekombinanten Genom zu exzidierenden Nukleotidsequenz lokalisiert sind. Das Exzisionsereignis erfordert die Gegenwart des Rekombinase (Cre)-Enzyms innerhalb des Kerns der rekombinanten Wirtszelle. Das Rekombinaseenzym kann zur gewünschten Zeit entweder bereitgestellt werden durch (a) Inkubieren der rekombinanten Wirtszellen in einem dieses Enzym enthaltenden Kulturmedium, durch direktes Injizieren des Cre-Enzyms in die gewünschte Zelle, wie von Araki et al. (1995) beschrieben, oder durch Lipofektion des Enzyms in die Zellen, wie von Baubonis et al. (1993) beschrieben; (b) Transfizieren der Wirtszelle mit einem Vektor, umfassend die für Cre kodierende Sequenz in operativer Verknüpfung mit einem in der rekombinanten Wirtszelle funktionellen Promotor, wobei der Promotor gegebenenfalls induzierbar ist und wobei der Vektor in die rekombinante Wirtszelle, wie von Gu et al. (1993) und Sauer et al. (1988) beschrieben, eingebracht wird; (c) Einbringen eines Polynukleotids, umfassend die für Cre kodierende Sequenz in operativer Verknüpfung mit einem in der rekombinanten Wirtszelle funktionellen Promotor, in das Genom der Wirtszelle, wobei der Promotor gegebenenfalls induzierbar ist und wobei das Polynukleotid entweder durch ein zufälliges Insertionsereignis oder durch ein homologes Rekombinationsereignis, wie von Gu et al. (1994) beschrieben, in das Genom der Wirtszelle insertiert wird.
In einer speziellen Ausführungsform wird der die durch homologe Rekombination in das FLAP-Gen zu insertierende Sequenz enthaltende Vektor derart konstruiert, dass Selektionsmarker von loxP-Stellen mit gleicher Orientierung flankiert sind, wobei es durch Behandlung mittels des Cre-Enzyms möglich ist, die Selektionsmarker zu eliminieren, während die mittels eines homologen Rekombinationsereignises insertierten FLAP-Sequenzen von Interesse zurückbleiben. Wiederum werden zwei Selektionsmarker benötigt: ein positiver Selektionsmarker, um das Rekombinationsereignis auszuwählen, und ein negativer Selektionsmarker, um das homologe Rekombinationsereignis auszuwählen. Vektoren und Verfahren, welche das Cre-loxP-System verwenden, werden von Zou et al. (1994) beschrieben.
Somit wird ein drittes DNA-Konstrukt beschrieben, welches vom 5'-Ende zum 3'-Ende hin umfasst: (a) eine erste Nukleotidsequenz, welche in der genomischen FLAP-Sequenz umfasst ist; (b) eine Nukleotidsequenz, welche ein für einen positiven Selektionsmarker kodierendes Polynukleotid umfasst, wobei die Nukleotidsequenz zusätzlich zwei Sequenzen umfasst, welche eine für eine Rekombinase erkennbare Stelle, wie beispielsweise eine loxP-Stelle, definieren, und wobei die beiden Stellen die gleiche Orientierung besitzen; und (c) eine zweite Nukleotidsequenz, welche in der genomischen FLAP-Sequenz umfasst ist und stromabwärts der ersten FLAP-Nukleotidsequenz (a) im Genom lokalisiert ist.
Die Sequenzen, welche eine für eine Rekombinase erkennbare Stelle, wie beispielsweise eine loxP-Stelle, definieren, sind bevorzugt innerhalb der Nukleotidsequenz (b) an geeigneten Orten lokalisiert, welche an die Nukleotidsequenz, für welche die konditionale Exzision beabsichtigt ist, angrenzen. In einer speziellen Ausführungsform sind zwei loxP-Stellen auf jeder Seite der Sequenz des positiven Selektionsmarkers lokalisiert, um deren Exzision zu einer gewünschten Zeit nach Auftreten des homologen Rekombinationsereignises zu ermöglichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform eines Verfahrens unter Verwendung des vorstehend beschriebenen dritten DNA-Konstrukts wird die Exzision des von den beiden für eine Rekombinase erkennbaren Stellen, bevorzugt zwei loxP-Stellen, flankierten Polynukleotidfragments aufgrund der Gegenwart einer für das Cre-Enzym kodierenden Sequenz, welche operativ mit einer Promotorsequenz, bevorzugt mit einem induzierbaren Promotor, stärker bevorzugt mit einer gewebespezifischen Promotorsequenz, und am stärksten bevorzugt mit einer sowohl induzierbaren als auch gewebespezifischen Promotorsequenz verknüpft ist, innerhalb des Genoms der rekombinanten Wirtszelle zu einer gewünschten Zeit durchgeführt, wie von Gu et al. (1994) beschrieben.
Die Gegenwart des Cre-Enzyms innerhalb des Genoms der rekombinanten Wirtszelle kann aus dem Züchten von zwei transgenen Tieren resultieren, wobei das erste transgene Tier die von FLAP abgeleitete Sequenz von Interesse trägt, welche wie vorstehend beschrieben die loxP-Stellen enthält, und das zweite transgene Tier die operativ mit einer geeigneten Promotorsequenz verknüpfte, für Cre kodierende Sequenz trägt, wie von Gu et al. (1994) beschrieben.
Eine raumzeitliche Kontrolle der Expression des Cre-Enzyms kann auch mittels eines das Cre-Gen enthaltenden Adenovirus-basierten Vektors erzielt werden, womit eine Infektion von Zellen oder eine in vivo-Infektion von Organen für eine Zuführung des Cre-Enzyms ermöglicht wird, wie von Anton und Graham (1995) und Kanegae et al. (1995) beschrieben.
Die vorstehend beschriebenen DNA-Konstrukte können dazu verwendet werden, eine gewünschte Nukleotidsequenz der Erfindung, bevorzugt eine genomische FLAP-Sequenz oder eine FLAP-cDNA-Sequenz, und am stärksten bevorzugt eine veränderte Kopie einer genomischen FLAP-Sequenz oder einer FLAP-cDNA-Sequenz, an einen vorbestimmten Ort des Zielgenoms einzubringen, was entweder zur Erzeugung einer veränderten Kopie eines Zielgens (homologe Rekombination unter Knockout) oder zum Austausch einer Kopie des Zielgens durch eine andere Kopie, welche hinreichend homolog ist, um das Auftreten eines homologen Rekombinationsereignises zu ermöglichen (homologe Rekombination unter Knockin). In einer speziellen Ausführungsform können die vorstehend beschriebenen DNA-Konstrukte zur Einfühlung einer genomischen FLAP-Sequenz oder einer FLAP-cDNA-Sequenz, welche mindestens einen der in der Erfindung beschriebenen biallelischen Marker, bevorzugt mindestens einen aus der Gruppe bestehend aus A1 bis A28 und den Komplementen hiervon ausgewählten biallelischen Marker, umfasst, verwendet werden.
Nukleare Antisense-DNA-Konstrukte
Andere Zusammensetzungen, welche einen Vektor enthalten, der ein Oligonukleotidfragment der Nukleinsequenz der SEQ ID Nr. 2, umfassend einen biallelischen Marker, bevorzugt ein das Startcodon des FLAP-Gens umfassendes Fragment, umfasst, werden als Antisense-Hilfsmittel beschrieben, welche die Expression des entsprechenden FLAP-Gens hemmen. Bevorzugte Verfahren unter Verwendung von Antisense-Polynukleotiden sind die von Sczakiel et al. (1995) beschriebenen Verfahren, oder jene Verfahren, welche in PCT-Anmeldung Nr. WO 95/24223 beschrieben sind.
Bevorzugt werden die Antisense-Hilfsmittel unter den Polynukleotiden ausgewählt (15–200 bp lang), welche komplementär zum 5'-Ende der FLAP-mRNA sind. in einer Ausführungsform wird eine Kombination von verschiedenen Antisense-Polynukleotiden, welche zu verschiedenen Teilen des gewünschten Zielgens komplementär sind, verwendet.
Bevorzugte Antisense-Polynukleotide sind zu einer Sequenz der mRNAs von FLAP komplementär, welche entweder das Translatationsinitiationscodon ATG oder eine Spleißstelle enthalten. Weitere bevorzugte Antisense-Polynukleotide sind zur Spleißstelle der FLAP-mRNAs komplementär.
Bevorzugt besitzt das Antisense-Molekül ein 3'-Polyadenylierungssignal, welches durch eine selbstspaltende Ribozymsequenz ersetzt wurde, so dass RNA-Polymerase II-Transkripte ohne Poly(A) an ihren 3'-Enden erzeugt werden, wobei diese Antisense-Polynukleotide zum Austritt aus dem Zellkern nicht befähigt sind, wie von Liu et al. (1994) beschrieben. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen diese FLAP-Antisense-Polynukleotide ferner eine Histon-Stammschleifenstruktur innerhalb der Ribozymkassette, um gespaltene Transkripte im Hinblick auf eine 3'-5'-exonukleolytische Zersetzung zu stabilisieren, wie die von Eckner et al. (1991) beschriebene Struktur.
V. Biallelische Marker des FLAP-Gens
Die Erfindung beschreibt ferner mit FLAP in Beziehung stehende biallelische Marker, welche mit Asthma assoziiert sind. Der Begriff „mit FLAP in Beziehung stehender biallelischer Marker” umfasst die als A1 bis A28 bezeichneten biallelischen Marker. Die Erfindung beschreibt ferner Reihen dieser biallelischen Marker.
28 biallelische Marker wurden in der genomischen Sequenz von FLAP identifiziert. Diese biallelischen Marker sind in Tabelle 2 von Beispiel 3 offenbart. Ihre Position in der genomischen FLAP-Sequenz und FLAP-cDNA ist in Tabelle 2 sowie ferner als Einzelbasenpolymorphismus in den Merkmalen von SEQ ID Nr. 1 angegeben. Tabelle 2 offenbart ferner die Position der als P1 bis P28 bezeichneten Polynukleotide mit einer Länge von 47 Nukleotiden in SEQ ID Nr. 1, welche einen biallelischen Marker des FLAP-Gens enthalten und den biallelischen Marker definieren. Die Primerpaare, welche die Amplifikation einer die polymorphe Base eines biallelischen FLAP-Markers enthaltenden Nukleinsäure ermöglichen, sind in Tabelle 1 von Beispiel 2 aufgelistet. Drei biallelische Marker, nämlich A13, A20 und A21, sind in exonischen Regionen lokalisiert. Zwei von ihnen bewirken keine Modifizierung der Aminosäuresequenz des FLAP-Proteins. Der biallelische Marker A20 bewirkt im FLAP-Protein jedoch den Austausch von einem Valin gegen ein Isoleucin.
Die Erfindung offenbart ferner eine gereinigte und/oder isolierte Nukleotidsequenz, umfassend eine polymorphe Base eines in der Sequenz des FLAP-Gens lokalisierten biallelischen Markers, bevorzugt eines aus der Gruppe bestehend aus A1 bis A28 und den Komplementen hiervon ausgewählten biallelischen Markers.
Die Erfindung offenbart ferner eine einen biallelischen Marker definierende Nukleotidsequenz, welche die polymorphe Base von einem der Polynukleotide P1 bis P13, P15 und P17 bis P28 oder der Komplemente hiervon umfasst.
VI. Oligonukleotidsonden und -primer
Aus dem FLAP-Gen abgeleitete Polynukleotide werden als nützlich beschrieben, um die Gegenwart mindestens einer Kopie einer Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1 oder 2, oder eines Fragments oder einer Variante hiervon in einer Testprobe zu detektieren.
Besonders bevorzugte Sonden und Primer umfassen einen Bereich von mindestens 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 oder 1000 aufeinanderfolgenden Nukleotiden von SEQ ID Nr. 1 oder der komplementären Sequenz hiervon, wobei der aufeinanderfolgende Bereich mindestens 1, 2, 3, 4, 5 oder 10 der nachfolgenden Nukleotidpositionen von SEQ ID Nr. 1 umfasst: 1–7007, 8117–15994, 16550–24058, 24598–27872, 28413–35976 und 36927–43069. Andere bevorzugte Nukleinsäuren der Erfindung umfassen isolierte, gereinigte oder rekombinante Polynukleotide, welche einen Bereich von mindestens 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 oder 1000 aufeinanderfolgenden Nukleotiden von SEQ ID Nr. 1 oder der komplementären Sequenz hiervon umfassen, wobei der aufeinanderfolgende Bereich mindestens ein C an Position 16348 von SEQ ID Nr. 1 umfasst. Weiterhin bevorzugte Nukleinsäuren der Erfindung umfassen isolierte, gereinigte oder rekombinante Polynukleotide, welche einen Bereich von mindestens 26, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 oder 1000 aufeinanderfolgenden Nukleotiden von SEQ ID Nr. 1 oder der komplementären Sequenz hiervon umfassen, wobei der aufeinanderfolgende Bereich die nachfolgenden Nukleotidpositionen von SEQ ID Nr. 1 umfasst: 7612–7637, 24060–24061, 24067–24068, 27903–27905 und 28327–28329. Zusätzlich bevorzugte Sonden und Primer umfassen einen Bereich von mindestens 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 oder 1000 aufeinanderfolgenden Nukleotiden von SEQ ID Nr. 1 oder der komplementären Sequenz hiervon, wobei der aufeinanderfolgende Bereich ein Nukleotid umfasst, welches aus der Gruppe bestehend aus einem A an Position 7445, einem A an Position 7870, einem T an Position 16288, einem A an Position 16383, einem T an Position 24361, einem G an Position 28336, einem T an Position 28368, einem A an Position 36183, und einem G an Position 36509 von SEQ ID Nr. 1 ausgewählt wird.
Somit offenbart die Erfindung ferner Nukleinsäuresonden oder -primer, welche unter den vorstehend definierten stringenten Hybridisierungsbedingungen spezifisch mit einer Nukleinsäure hybridisieren, welche aus der Gruppe bestehend aus den Nukleotidsequenzen 1–7007, 8117–15994, 16550–24058, 24598–27872, 28413–35976 und 36927–43069 von SEQ ID Nr. 1 oder einer Variante hiervon oder einer hierzu komplementären Sequenz ausgewählt wird.
Besonders bevorzugte Sonden und Primer umfassen einen Bereich von mindestens 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 oder 1000 aufeinanderfolgenden Nukleotiden von SEQ ID Nr. 2 oder einer hierzu komplementären Sequenz, wobei der aufeinanderfolgende Bereich ein T an Position 197 (A13), ein A an Position 453 (A20) oder ein G an Position 779 (A21) von SEQ ID Nr. 2 umfasst.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ferner Oligonukleotide und Gruppen von Oligonukleotiden zur Detektion von Allelen, welche mit einem mit Asthma assoziierten Polymorphismus des FLAP-Gens assoziiert sind. Diese Oligonukleotide können mit einem FLAP-Gen, bevorzugt mit einem polymorphen FLAP-Gen, und stärker bevorzugt mit einem Bereich eines FLAP-Gens, welcher die polymorphe Stelle umfasst, aufgrund derer spezifische Allele mit Asthma assoziiert sind, hybridisieren. Die Oligonukleotide sind entweder als Primer für eine Verwendung in verschiedenen Prozessen, wie beispielsweise DNA-Amplifikation und -Mikrosequenzierung, oder als Sonden für eine DNA-Erkennung in Hybridisierungsanalysen von Nutzen. In einigen Ausführungsformen enthalten die Oligonukleotide die polymorphe Base einer Sequenz, welche aus der Gruppe bestehend aus P1 bis P28 und der hierzu komplementären Sequenz ausgewählt wird. In anderen Ausführungsformen weisen die Oligonukleotide ein 3'-Ende auf, welches unmittelbar an eine polymorphe Base im FLAP-Gen angrenzt, wie beispielsweise eine polymorphe Base in einem von P1 bis P28 und der hierzu komplementären Sequenz. In anderen Ausführungsformen ist das Oligonukleotid zur Unterscheidung zwischen verschiedenen Allelen eines biallelischen Markers im FLAP-Gen befähigt, wobei der biallelische Marker aus der Gruppe bestehend aus A1 bis A28 und den Komplementen hiervon ausgewählt wird. Beispielsweise kann das Oligonukleotid zur spezifischen Hybridisierung an ein Allel eines biallelischen Markers befähigt sein, umfassend einen der biallelischen Marker A1 bis A28 und die Komplemente hiervon. In einer anderen Ausführungsform umfassen die Oligonukleotide eine der Sequenzen B1 bis B17, C1 bis C17, D1 bis D28, E1 bis E28 und P1 bis P28 sowie die hierzu komplementäre Sequenz.
Die Erfindung offenbart isolierte, gereinigte und rekombinante Polynukleotide, welche aus einem Bereich von 8 bis 50 aufeinanderfolgenden Nukleotiden von SEQ ID Nr. 1 oder 2 oder dem Komplement hiervon bestehen oder im Wesentlichen bestehen, wobei der Bereich einen mit FLAP in Beziehung stehenden biallelischen Marker in der Sequenz umfasst; gegebenenfalls, wobei der mit FLAP in Beziehung stehende biallelische Marker aus der Gruppe bestehend aus A1 bis A28 und den Komplementen hiervon ausgewählt wird; gegebenenfalls, wobei der aufeinanderfolgende Bereich eine Länge von 18 bis 47 Nukleotiden besitzt und wobei sich der biallelische Marker innerhalb von 6, 5, 4, 3, 2 oder 1 Nukleotiden vom Zentrum des Polynukleotids aus betrachtet befindet; gegebenenfalls, wobei das Polynukleotid aus dem aufeinanderfolgenden Bereich besteht und wobei der aufeinanderfolgende Bereich eine Länge von 25 Nukleotiden besitzt und sich der biallelische Marker im Zentrum des Polynukleotids befindet; gegebenenfalls, wobei das 3'-Ende des aufeinanderfolgenden Bereichs am 3'-Ende des Polynukleotids vorliegt; und gegebenenfalls, wobei das 3'-Ende des aufeinanderfolgenden Bereichs am 3'-Ende des Polynukleotids lokalisiert ist und der biallelische Marker am 3'-Ende des Polynukleotids vorliegt.
In einer anderen Ausführungsform offenbart die Erfindung isolierte, gereinigte und rekombinante Polynukleotide, welche aus einem Bereich von 8 bis 50 aufeinanderfolgenden Nukleotiden von SEQ ID Nr. 1 oder 2 oder dem Komplement hiervon bestehen oder im Wesentlichen bestehen, wobei das 3'-Ende des aufeinanderfolgenden Bereichs am 3'-Ende des Polynukleotids lokalisiert ist. In einer Ausführungsform ist das 3'-Ende des Polynukleotids innerhalb eines oder mindestens 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 50, 100, 250, 500 oder 1000 Nukleotide stromaufwärts eines biallelischen FLAP-Markers in der Sequenz, oder an einer beliebigen anderen Position, welche für ihre beabsichtigte Verwendung zur Sequenzierung, Amplifikation oder Lokalisierung neuer Sequenzen oder Marker geeignet ist, lokalisiert. In einer besonderen Ausführungsform ist das 3'-Ende des Polynukleotids innerhalb von 20 Nukleotiden stromaufwärts eines mit FLAP in Beziehung stehenden biallelischen Markers in der Sequenz lokalisiert; gegebenenfalls, wobei der mit FLAP in Beziehung stehende biallelische Marker aus der Gruppe bestehend aus A1 bis A28 und den Komplementen hiervon ausgewählt wird; gegebenenfalls, wobei das 3'-Ende des Polynukleotids ein Nukleotid stromaufwärts des mit FLAP in Beziehung stehenden biallelischen Markers in der Sequenz lokalisiert ist; und gegebenenfalls, wobei das Polynukleotid im Wesentlichen aus einer Sequenz besteht, welche aus den nachfolgenden Sequenzen ausgewählt ist: D1 bis D28 und E1 bis E28. In einer weiteren Ausführungsform werden isolierte, gereinigte oder rekombinante Polynukleotide beschrieben, welche aus einer aus den nachfolgenden Sequenzen ausgewählten Sequenz besteht oder im Wesentlichen besteht: B1 bis B17 und C1 bis C17. An diese Primer kann, an jedem Ende hiervon, ein weiteres zur Sequenzierung nützliches Polynukleotid gebunden werden. Bevorzugt enthalten die Primer PU die zusätzliche PU 5'-Sequenz Von SEQ ID Nr. 14, und die Primer RP enthalten die RP 5'-Sequenz von SEQ ID Nr. 15.
In einer zusätzlichen Ausführungsform umfasst die Erfindung Polynukleotide, umfassend einen Bereich von mindestens 12 aufeinanderfolgenden Nukleotiden von SEQ ID Nr. 1 oder der komplementären Sequenz hierzu, für eine Verwendung insbesondere in Hybridisierungsassays, Sequenzierungsassays, Mikrosequenzierungsassays und spezifischen Amplifikationsassays zur Bestimmung der Identität des Nukleotids bei einem mit FLAP in Beziehung stehenden biallelischen Marker, wobei der mit FLAP in Beziehung stehende biallelische Marker aus der Gruppe bestehend aus den biallelischen Markern in den Positionen 3950, 4243, 4312, 4490, 4670, 4687, 4968, 5140, 5213, 5364, 5594, 6370, 6693, 6763, 7445, 7870, 16288, 16347, 16383, 16440, 24361, 28336, 28368, 36183, 36509, 38681, 42440 und 42445 von SEQ ID Nr. 1 ausgewählt wird. Ein bevorzugtes Polynukleotid kann in einem Hybridisierungsassay zur Bestimmung der Identität des Nukleotids bei einem biallelischen Marker des FLAP-Gens verwendet werden. Ein weiteres bevorzugtes Polynukleotid kann in einem Sequenzierungs- oder Mikrosequenzierungsassay zur Bestimmung der Identität des Nukleotids bei einem biallelischen Marker des FLAP-Gens verwendet werden. Ein drittes bevorzugtes Polynukleotid kann in einem enzymbasierten Basenfehlpaarungs-Nachweisassay (Mismatch-Nachweisassay) zur Bestimmung der Identität des Nukleotids bei einem biallelischen Marker des FLAP-Gens verwendet werden. Ein viertes bevorzugtes Polynukleotid kann zur Amplifikation eines Segments von Polynukleotiden, umfassend einen biallelischen Marker des FLAP-Gens, verwendet werden. Gegebenenfalls kann die Amplifikation mittels PCR oder LCR durchgeführt werden. Gegebenenfalls kann das Polynukleotid an einen festen Träger, ein Array oder ein adressierbares Array gebunden sein. Gegebenenfalls kann das Polynukleotid markiert sein.
Die synthetisierten Primer und Sonden sollen „im Wesentlichen” komplementär zu einem Strang des zu amplifizierenden FLAP-Gens sein. Die Primersequenz muss nicht die exakte Sequenz der DNA-Matrize widerspiegeln. Kleineren Fehlpaarungen kann durch Verringerung der Stringenz der Hybridisierungsbedingungen Rechnung getragen werden. Unter den verschiedenen Verfahren, welche für den Entwurf nützlicher Primer verfügbar sind, kann die OSP-Computersoftware von einem Fachmann verwendet werden (siehe Hillier & Green, 1991).
Die Ausbildung stabiler Hybride hängt von der Schmelztemperatur (Tm) der DNA ab. Die Tm hängt von der Länge des Primers oder der Sonde, der Ionenstärke der Lösung und dem G + C-Gehalt ab. Je höher der G + C-Gehalt des Primers oder der Sonde ist, desto höher ist die Schmelztemperatur, da G/C-Paare durch drei H-Brücken zusammengehalten werden, während A/T-Paare lediglich zwei aufweisen.
Der GC-Gehalt in den Primern und Sonden der Erfindung liegt gewöhnlich im Bereich zwischen 10 und 75%, bevorzugt zwischen 35 und 60%, und stärker bevorzugt zwischen 40 und 55%.
Bevorzugt kann die Länge der Primer und Sonden im Bereich von 10 bis 100 Nukleotiden, bevorzugt von 10 bis 50, 10 bis 30, oder stärker bevorzugt von 10 bis 25 Nukleotiden liegen. Kürzere Primer und Sonden tendieren zu einem Mangel an Spezifität für eine Zielnukleinsäuresequenz und erfordern zur Ausbildung hinreichend stabiler Hybridkomplexe mit der Matrize im Allgemeinen niedrigere Temperaturen. Längere Primer und Sonden sind in ihrer Herstellung kostspielig und können bisweilen unter Ausbildung von Haarnadelstrukturen mit sich selbst hybridisieren. Die geeignete Länge von Primern und Sonden unter einer bestimmten Reihe von Assaybedingungen kann von einem Fachmann empirisch bestimmt werden.
Die Sonden sind für eine Reihe von Zwecken von Nutzen. Sie können für eine Southern-Hybridisierung von genomischer DNA oder für eine Northern-Hybridisierung von mRNA verwendet werden. Die Sonden können ferner zur Detektion von PCR-Amplifikationsprodukten verwendet werden. Sie können ferner zur Detektion von Fehlpaarungen im FLAP-Gen oder in der FLAP-mRNA unter Verwendung anderer Techniken verwendet werden. Im Allgemeinen sind die Sonden zu den kodierenden Sequenzen des FLAP-Gens komplementär, obwohl Sonden für Introns und regulatorische Sequenzen ebenfalls vorgesehen sind.
Primer und Sonden können mittels eines beliebigen geeigneten Verfahrens hergestellt werden, umfassend beispielsweise Klonieren und Restriktion geeigneter Sequenzen sowie direkte chemische Synthese mittels eines Verfahrens wie beispielsweise dem Phosphodiesterverfahren gemäß Narang et al. (1979), dem Phosphodiesterverfahren gemäß Brown et al. (1979), dem Diethylphosphoramiditverfahren gemäß Beaucage et al. (1981), und dem in EP 0 707 592 beschriebenen Verfahren unter Verwendung eines festen Trägers.
Detektionssonden sind im Allgemeinen Nukleinsäuresequenzen oder ungeladene Nukleinsäureanaloga, wie etwa beispielsweise Peptidnukleinsäuren, welche in der Internationalen Patentanmeldung WO 92/20702 offenbart sind, Morpholinanaloga, welche in den U.S. Patenten mit den Nummern 5,185,444 , 5,034,506 und 5,142,047 beschrieben sind, und dergleichen. In Abhängigkeit von der Art der Markierung der Sonde wird die Sonde zum Abgangen und zur Detektion des durch die Amplifikationsreaktion erzeugten Amplikons eingesetzt. Die Sonde ist nicht an der Amplifikation der Zielsequenz beteiligt und muss daher gegebenenfalls in einem „nicht verlängerbaren” Zustand belassen werden, in welchem der Sonde keine zusätzlichen dNTPs hinzugefügt werden können. An und für sich sind Analoga gewöhnlich nicht verlängerbar, wobei Nukleinsäuresonden durch Modifizierung des 3'-Endes der Sonde in einen nicht verlängerbaren Zustand gebracht werden können, so dass die Hydroxylgruppe nicht länger zur Mitwirkung an einer Verlängerung befähigt ist. Beispielsweise kann das 3'-Ende der Sonde mit der Abfang- oder Detektionsmarkierung funktionalisiert werden, wodurch die Hydroxylgruppe verbraucht oder anderweitig blockiert wird. Alternativ kann einfach die 3'-Hydroxylgruppe gespalten, ausgetauscht oder modifiziert werden. Die am 19. April 1993 eingereichte U.S. Patentanmeldung mit der Serien-Nr. 07/049,061 beschreibt Modifikationen, welche dazu verwendet werden können, eine Sonde in einen nicht verlängerbaren Zustand zu bringen.
Die Sonden sind bevorzugt direkt markiert, wie beispielsweise mit Isotopen, Reportermolekülen oder fluoreszierenden Markierungen, oder sind indirekt markiert, wie beispielsweise mit Biotin, an welches zu einem späteren Zeitpunkt ein Streptavidinkomplex binden kann. Markierungstechniken für Sonden sind dem Fachmann wohlbekannt. Durch Untersuchen der Gegenwart der Probe kann die Gegenwart oder Abwesenheit der DNA-Zielsequenz in einer vorgegebenen Probe detektiert werden. Die gleichen Markierungen können bei Primern verwendet werden. Nützliche Markierungen umfassen beispielsweise radioaktive Substanzen (³²P, ³⁵S, ³H, ¹²⁵I), fluoreszierende Farbstoffe (5-Bromodesoxyuridin, Fluorescein, Acetylaminofluoren, Digoxigenin). Bevorzugt sind die Polynukleotide an ihren 3'- und 5'-Enden markiert. Beispiele für eine nicht-radioaktive Markierung von Nukleinsäurefragmenten sind in dem Französischen Patent Nr. FR-7810975 oder von Urdea et al. (1988) oder Sanchez-Pescador et al. (1988) beschrieben. Zusätzlich können die Sonden gemäß der vorliegenden Erfindung strukturelle Eigenschaften aufweisen, welche die Signalamplifikation ermöglichen, wobei derartige strukturelle Eigenschaften beispielsweise verzweigte DNA-Sonden wie jene sind, welche von Urdea et al. im Jahr 1991 oder im Europäischen Patent Nr. EP 0 225 807 (Chiron) beschrieben werden.
Beliebige Primer und Sonden können zweckmäßig auf einem festen Träger immobilisiert werden. Feste Träger sind dem Fachmann bekannt und umfassen die Wände von Vertiefungen einer Reaktionsplatte, Teströhrchen, Polystyrolbeads, magnetische Beads, Mikrozellulosestreifen, Membranen, Mikropartikel wie beispielsweise Latexpartikel, rote Blutzellen von Schafen (oder von anderen Tieren), Durazyten, und andere. Die „Festphase” ist unkritisch und kann von einem Fachmann ausgewählt werden. – Somit stellen Latexpartikel, Mikropartikel, magnetische oder nicht-magnetische Beads, Membranen, Plastikröhrchen, Wände von Mikrotitervertiefungen, Glas- oder Siliziumchips, rote Blutzellen von Schafen (oder von anderen geeigneten Tieren) sowie Durazyten allesamt geeignete Beispiele dar.
Geeignete Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäuren auf Festphasen umfassen ionische, hydrophobe, kovalente Wechselwirkungen, und dergleichen. Eine „Festphase”, wie hierin verwendet, bezeichnet ein beliebiges Material, welches unlöslich ist oder durch eine nachfolgende Reaktion unlöslich gemacht werden kann. Die Festphase kann aufgrund ihrer intrinsischen Fähigkeit, das Abfangreagenz anzuziehen und zu immobilisieren, ausgewählt werden.
Alternativ kann die Festphase einen zusätzlichen Rezeptor umfassen, welcher zur Anziehung und Immobilisierung des Abfangreagenzes befähigt ist. Der zusätzliche Rezeptor kann eine geladene Substanz umfassen, welche in Bezug auf das Abfangreagenz selbst oder in Bezug auf eine mit dem Abfangreagenz konjugierte geladene Substanz entgegengesetzt geladen ist.
Als noch eine andere Alternative kann das Rezeptormolekül ein beliebiges spezifisch bindendes Element sein, welches auf der festen Phase immobilisiert ist (an die Festphase gebunden ist), und welches zur Immobilisierung des Abfangreagenzes mittels einer spezifischen Bindereaktion befähigt ist. Das Rezeptormolekül ermöglicht die indirekte Bindung des Abfangreagenzes an ein Festphasenmaterial vor der Durchführung des Assays oder während der Durchführung des Assays. Die Festphase kann somit ein Kunststoff, ein derivatisierter Kunststoff, ein magnetisches oder nicht-magnetisches Metall, eine Glas- oder Siliziumoberfläche eines Teströhrchens, eine Mikrotitervertiefung, eine Folie, ein Bead, ein Mikropartikel, ein Chip, rote Blutzellen von Schafen (oder von anderen geeigneten Tieren), Durazyten, und andere dem Fachmann bekannte Konfigurationen sein.
Die erfindungsgemäßen Polynukleotide können einzeln oder in Gruppen von mindestens 2, 5, 8, 10, 12, 15, 20 oder 25 definierten Polynukleotiden der Erfindung auf einem einzelnen festen Träger an einen festen Träger gebunden oder auf diesem immobilisiert sein. Zusätzlich können andere Polynukleotide als jene der Erfindung an den gleichen festen Träger gebunden sein wie ein Polynukleotid oder mehrere Polynukleotide der Erfindung.
Die Erfindung beschreibt ferner ein Verfahren zur Detektion der Gegenwart einer Nukleinsäure, welche eine aus einer Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 und 2, einem Fragment oder einer Variante hiervon oder einer hierzu komplementären Sequenz ausgewählte Nukleotidsequenz umfasst, in einer Probe, wobei das Verfahren die nachfolgenden Schritte umfasst:

a) Inkontaktbringen einer Nukleinsäuresonde oder einer Vielzahl von Nukleinsäuresonden, welche mit einer Nukleotidsequenz hybridisieren kann/können, die in einer aus der Gruppe bestehend aus den Nukleotidsequenzen von SEQ ID Nr. 1 und 2, einem Fragment oder einer Variante hiervon oder einer hierzu komplementären Sequenz ausgewählten Nukleinsäure umfasst ist, mit der zu untersuchenden Probe;
b) Detektieren des zwischen der Sonde und einer Nukleinsäure in der Probe gebildeten Hybridkomplexes.

Die Erfindung beschreibt weiterhin ein Kit zur Detektion der Gegenwart einer Nukleinsäure, welche eine aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 und 2, einem Fragment oder einer Variante hiervon oder einer hierzu komplementären Sequenz ausgewählte Nukleotidsequenz umfasst, in einer Probe, wobei das Kit umfasst:

a) eine Nukleinsäuresonde oder eine Vielzahl von Nukleinsäuresonden, welche mit einer Nukleotidsequenz hybridisieren kann/können, die in einer aus der Gruppe bestehend aus den Nukleotidsequenzen von SEQ ID Nr. 1 und 2, einem Fragment oder einer Variante hiervon oder einer hierzu komplementären Sequenz ausgewählten Nukleinsäure umfasst ist;
b) gegebenenfalls die zur Durchführung der Hybridisierungsreaktion erforderlichen Reagenzien.

In einer ersten bevorzugten Ausführungsform des Detektionsverfahrens und Kits ist die Nukleinsäuresonde oder die Vielzahl von Nukleinsäuresonden mit einem detektierbaren Molekül markiert. In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform des Detektionsverfahrens und Kits wurde die Nukleinsäuresonde oder die Vielzahl von Nukleinsäuresonden auf einem Substrat immobilisiert. In einer dritten bevorzugten Ausführungsform des Detektionsverfahrens und Kits umfasst die Nukleinsäuresonde oder die Vielzahl von Nukleinsäuresonden entweder eine Sequenz, welche aus der Gruppe bestehend aus den Nukleotidsequenzen B1 bis B17, C1 bis C17, D1 bis D28, E1 bis E28, P1 bis P28 ausgewählt ist, oder umfasst einen biallelischen Marker, welcher aus der Gruppe bestehend aus A1 bis A28 oder den Komplementen hierzu ausgewählt ist.
Oligonukleotidarrays
Ein eine Vielzahl von Oligonukleotidprimern oder -sonden umfassendes Substrat kann entweder zur Detektion oder zur Amplifikation von Zielsequenzen im FLAP-Gen verwendet werden, und kann ferner zur Detektion von Mutationen in den kodierenden oder in den nicht-kodierenden Sequenzen des FLAP-Gens verwendet werden.
Ein beliebiges hierin bereitgestelltes Polynukleotid kann in sich überlappenden Bereichen oder an zufällig ausgewählten Orten auf dem festen Träger gebunden werden. Alternativ können die Polynukleotide der Erfindung auf einem geordneten Array gebunden sein, wobei jedes Polynukleotid in einem definierten Bereich des festen Trägers gebunden ist, welcher mit der Bindungsstelle eines beliebigen anderen Polynukleotids nicht überlappt. Bevorzugt wird ein derartiges geordnetes Array von Polynukleotiden als „adressierbar” entworfen, wobei die definierten Bereiche erfasst werden und als Teil eines Assayverfahrens angesteuert werden können. Adressierbare Polynukleotidarrays umfassen typischerweise eine Vielzahl von unterschiedlichen Oligonukleotidsonden, welche an eine Oberfläche eines Substrats an verschiedenen bekannten Orten gekoppelt sind. Das Wissen in Bezug auf die genaue Position eines jeden Polynukleotidortes bewirkt, dass diese „adressierbaren” Arrays insbesondere für Hybridisierungsassays von Nutzen sind. Eine beliebige im Fachbereich bekannte Technologie betreffend adressierbare Arrays kann für die erfindungsgemäßen Polynukleotide eingesetzt werden. Eine besondere Ausführungsform dieser Polynukleotidarrays ist als Genechips^TM bekannt und wurde allgemein in U.S. Patent 5,143,854 , sowie in den PCT-Veröffentlichungen WO 90/15070 und 92/10092 beschrieben. Diese Arrays können allgemein unter Verwendung mechanischer Syntheseverfahren oder lichtgesteuerter Syntheseverfahren hergestellt werden, welche eine Kombination von photolithographischen Verfahren und Festphasenoligonukleotidsynthese umfassen (Fodor et al., 1991). Die Immobilisierung von Oligonukleotidarrays auf festen Trägern wurde durch die Entwicklung einer allgemein als „Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis” (VLSIPS^TM) bezeichneten Technologie ermöglicht, in welcher typischerweise Sonden in einer hochdichten Anordnung auf einer festen Oberfläche eines Chips immobilisiert werden. Beispiele für VLSIPS^TM-Technologien werden in den U.S. Patenten 5,143,854 und 5,412,087 , sowie in den PCT-Veröffentlichungen WO 90/15070 , WO 92/10092 und WO 95/11995 bereitgestellt, welche Verfahren zur Erzeugung von Oligonukleotidarrays mittels Techniken wie beispielsweise Lichtgesteuerten Synthesetechniken beschreiben. Beim Entwurf von Strategien, deren Ziel die Bereitstellung von auf festen Trägern immobilisierten Nukleotidarrays ist, wurden in einem Versuch zur Maximierung von Hybridisierungsmustern und Sequenzinformationen weitere Gestaltungsstrategien entwickelt, um die Oligonukleotidarrays auf den Chips zu ordnen und darzustellen. Beispiele derartiger Gestaltungsstrategien sind in den PCT-Veröffentlichungen WO 94/12305 , WO 94/11530 , WO 97/29212 und WO 97/31256 offenbart.
In einer anderen Ausführungsform der Oligonukleotidarrays kann vorteilhafterweise eine Oligonukleotidsondenmatrix zur Detektion der im FLAP-Gen vorkommenden Mutationen verwendet werden. Zu diesem besonderen Zweck weisen die spezifisch entworfenen Sonden eine Nukleotidsequenz auf, welche die Hybridisierung der Sonden an die Gene ermöglicht, die bekannte Mutationen tragen (entweder durch Deletion, Insertion oder Substitution eines Nukleotids oder mehrerer Nukleotide). Unter bekannten Mutationen werden Mutationen des FLAP-Gens verstanden, welche beispielsweise gemäß der von Huang et al. (1996) oder Samson et al. (1996) verwendeten Technik identifiziert wurden.
Eine andere Technik, welche zur Detektion von Mutationen im FLAP-Gen verwendet wird, ist die Verwendung eines DNA-Arrays hoher Dichte. Jede ein einzelnes Element des DNA-Arrays hoher Dichte darstellende Oligonukleotidsonde wird entworfen, um zu einer spezifischen Subsequenz der genomischen FLAP-DNA oder FLAP-cDNA zu passen. Folglich wird ein aus Oligonukleotiden, welche zu Subsequenzen der Zielgensequenz komplementär sind, bestehender Array zur Bestimmung der Identität von Zielsequenz und Wildtypgensequenz, zur Messung ihrer Menge, sowie zur Detektion von Unterschieden zwischen der Zielsequenz und der als Referenz dienenden Wildtypgensequenz des FLAP-Gens verwendet. In einer derartigen Ausgestaltung, genannt 4L-Plattenarray, wird ein Satz von vier Sonden (A, C, G, T), bevorzugt Oligomere mit 15 Nukleotiden, implementiert. In jedem Satz von vier Sonden hybridisiert das ideale Komplement stärker als fehlgepaarte Sonden. Folglich wird eine Zielnukleinsäure der Länge L mittels eines 4L an Sonden enthaltenden Plattenarrays auf Mutationen hin durchmustert, wobei der gesamte Satz von Sonden alle möglichen Mutationen der bekannten, als Referenz dienenden Wildtypsequenz enthält. Die Hybridisierungssignale des 15-mer-Sondensatzes des Plattenarrays werden durch einen einzelnen Basenaustausch in der Zielsequenz gestört. Infolgedessen ergibt sich für die eine mutierte Position flankierenden Sonden ein charakteristischer Signalverlust oder ein „Fußabdruck”. Diese Technik wurde von Chee et al. im Jahr 1996 beschrieben.
Die Erfindung beschreibt ein Array von Nukleinsäuremolekülen, welches mindestens ein vorstehend als Sonde und Primer beschriebenes Polynukleotid umfasst. Bevorzugt wird ein Array von Nukleinsäuren beschrieben, welches mindestens zwei vorstehend als Sonden und Primer beschriebene Polynukleotide umfasst.
Es wird ferner ein weiterer Gegenstand beschrieben, welcher aus einem Array von Nukleinsäuresequenzen besteht, die entweder mindestens eine der Sequenzen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus P1 bis P28, B1 bis B17, C1 bis C17, D1 bis D28 und E1 bis E28 oder der hierzu komplementären Sequenzen oder eines Fragments hiervon mit mindestens 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 30 oder 40 aufeinanderfolgenden Nukleotiden hiervon umfasst, oder die mindestens eine Sequenz umfasst, welche einen biallelischen Marker ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus A1 bis A28 und den Komplementen hierzu umfasst.
VII. Identifizierung von biallelischen Markern
Es gibt zwei bevorzugte Verfahren, durch welche die in der Erfindung beschriebenen biallelischen Marker erzeugt werden können. In einem ersten Verfahren werden DNA-Proben aus nicht miteinander in Beziehung stehenden Individuen zusammengefasst, woraufhin die genomische DNA von Interesse amplifiziert und sequenziert wird. Die auf diese Weise erhaltenen Nukleotidsequenzen werden anschließend analysiert, um signifikante Polymorphismen zu identifizieren.
Einer der Hauptvorteile dieses Verfahrens besteht in der Tatsache, dass das Zusammenfassen der DNA-Proben die Anzahl von DNA-Amplifikationsreaktionen und Sequenzierungsreaktionen, welche durchgeführt werden müssen, wesentlich verringert. Darüber hinaus weist dieses Verfahren eine hinreichende Empfindlichkeit auf, so dass ein hierdurch erhaltener biallelischer Marker gewöhnlich ein hinreichendes Maß an Informationsgehalt zur Ausführung von Assoziationsstudien zeigt.
In einem zweiten Verfahren zur Erzeugung biallelischer Marker werden die DNA-Proben nicht zusammengefasst, und werden daher einzeln amplifiziert und sequenziert. Die resultierenden, auf diese Weise erhaltenen Nukleotidsequenzen werden anschließend ebenfalls analysiert, um signifikante Polymorphismen zu identifizieren.
Es ist leicht verständlich, dass, wenn dieses zweite Verfahren verwendet wird, eine wesentlich höhere Anzahl von DNA-Amplifikationsreaktionen und Sequenzierungsreaktionen durchgeführt werden muss. Darüber hinaus kann ein unter Verwendung dieses Verfahrens erhaltener biallelischer Marker ein geringeres Maß an Informationsgehalt zur Ausführung von Assoziationsstudien zeigen, z. B. wenn die Häufigkeit seines weniger häufig vorkommenden Allels weniger als etwa 10% betragen sollte. Es versteht sich weiterhin, dass das Einbringen derartiger wenig aussagekräftiger biallelischer Marker in Assoziationsstudien zur Identifizierung potentieller genetischer Assoziationen mit einem Merkmal in einigen Fällen die direkte Identifizierung kausaler Mutationen ermöglichen kann, welche, in Abhängigkeit von ihrer Penetranz, seltene Mutationen sein können. Dieses Verfahren wird gewöhnlich bevorzugt, wenn biallelische Marker zur Durchführung von Assoziationsstudien an Kandidatengenen identifiziert werden müssen.
Im Anschluss folgt eine Beschreibung der verschiedenen Parameter eines bevorzugten Verfahrens, welches von den Erfindern zur Erzeugung der Marker der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
1. DNA-Extraktion
Die genomischen DNA-Proben, aus welchen die biallelischen Marker erzeugt werden, werden bevorzugt aus nicht miteinander verwandten Individuen, was einer heterogenen Population mit bekanntem ethnischem Hindergrund entspricht.
Die Anzahl von Individuen, aus denen DNA-Proben erhalten werden, kann wesentlich variieren, bevorzugt von etwa 10 bis etwa 1000, bevorzugt von etwa 50 bis etwa 200 Individuen. Es ist gewöhnlich bevorzugt, DNA-Proben aus mindestens etwa 100 Individuen zu sammeln, um zur Identifizierung so vieler Marker wie möglich sowie zur Erzeugung statistisch signifikanter Ergebnisse eine hinreichende polymorphe Diversität in einer vorgegebenen Population zur Verfügung zu haben.
Was die Quelle der einer Analyse zu unterziehenden genomischen DNA anbetrifft, kann eine beliebige Testprobe ohne eine bestimmte Einschränkung vorgesehen sein. Diese Testproben umfassen biologische Proben, welche mittels den hierin beschriebenen Verfahren der vorliegenden Erfindung untersucht werden können, und umfassen Körperfluids aus Menschen und Tieren, wie beispielsweise Vollblut, Serum, Plasma, cerebrospinale Flüssigkeit, Urin, Lymphflüssigkeiten, sowie verschiedene äußere Sekretionen des respiratorischen, intestinalen und genitourinären Traktes, Tränen, Speichel, Milch, weiße Blutzellen, Myelome und der gleichen; biologische Fluids, wie beispielsweise Überstände von Zellkulturen; fixierte Gewebeproben, umfassend tumorales und nicht-tumorales Gewebe sowie Lymphdrüsengewebe; Knochenmarkaspirate sowie fixierte Zellproben. Die bevorzugte Quelle genomischer DNA, welche im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet wird, stellt peripheres, venöses Blut eines jeden Spenders dar.
Die Techniken der DNA-Extraktion sind dem Fachmann wohlbekannt. Einzelheiten einer bevorzugten Ausführungsform sind in Beispiel 1 bereitgestellt.
Sobald eine genomische DNA aus jedem Individuum der vorgegebenen Population extrahiert worden ist, ist es bevorzugt, dass ein Teil jeder DNA-Probe abgetrennt wird, woraufhin durch Zusammenführen äquivalenter Mengen der abgetrennten Teile zu einem einzigen Teil ein DNA-Pool erzeugt wird. Der Fachmann kann jedoch zwischen einer Amplifikation der zusammengefassten oder der nicht zusammengefassten Sequenzen wählen.
2. DNA-Amplifikation
Die Identifizierung biallelischer Marker in einer Probe genomischer DNA kann durch die Verwendung von DNA-Amplifikationsverfahren erleichtert werden. DNA-Proben können für den Amplifikationsschritt zusammengefasst werden oder nicht zusammengefasst werden.
DNA-Amplifikationstechniken sind dem Fachman wohlbekannt. Amplifikationstechniken, welche im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die in EP-A-320 308 , WO 9320227 und EP-A-439182 beschriebene Ligasekettenreaktion (LCR), die Polymerasekettenreaktion (PCR, RT-PCR) und Techniken wie beispielsweise die in Guatelli J. C. et al. (1990) und in Compton J. (1991) beschriebene sequenzbasierte Nukleinsäureamplifikation (NASBA), die Q-Beta-Amplifikation, wie sie in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 4544610 beschrieben ist, die Strangaustauschamplifikation, wie sie in Walker et al. (1996) und EP-A-684 315 beschrieben ist, sowie die Zielstruktur-vermittelte Amplifikation, wie sie in der PCT-Veröffentlichung WO 9322461 beschrieben ist.
LCR und Gap-LCR stellen exponentielle Amplifikationstechniken dar, welche beide davon abhängig sind, dass DNA-Ligase an ein DNA-Molekül gebundene, benachbarte Primer verbindet. In der Ligasekettenreaktion (LCR) werden Sondenpaare verwendet, welche zwei primäre (erste und zweite) und zwei sekundäre (dritte und vierte) Sonden umfassen, welche in Bezug auf die Zielstruktur allesamt in einem molaren Überschuss eingesetzt werden. Die erste Sonde hybridisiert an ein erstes Segment des Zielstranges und die zweite Sonde hybridisiert an ein zweites Segment des Zielstranges, wobei die ersten und zweiten Segmente aufeinanderfolgend sind, so dass die primären Sonden in einer 5'-Phosphat-3'-hydroxyl-Beziehung aneinander angrenzen, und so dass eine Ligase die beiden Sonden zu einem fusionierten Produkt kovalent fusionieren oder ligieren kann. Zusätzlich kann eine dritte (sekundäre) Sonde an einen Teil der ersten Sonde und eine vierte (sekundäre) Sonde an einen Teil der zweiten Sonde in einer ähnlich aneinander angrenzenden Art und Weise hybridisieren. Selbstverständlich hybridisieren die sekundären Sonden, wenn die Zielstruktur ursprünglich doppelsträngig ist, zunächst auch an das Komplement der Zielstruktur. Sobald der ligierte Strang primärer Sonden von dem Zielstrang abgetrennt ist, hybridisiert er mit den dritten und vierten Sonden, welche unter Ausbildung eines komplementären, sekundären ligierten Produktes ligiert werden können. Es ist von Bedeutung, zu erkennen, dass die ligierten Produkte entweder zur Zielstruktur oder zu dessen Komplement funktionell äquivalent sind. Durch wiederholte Zyklen von Hybridisierung und Ligation wird eine Amplifikation der Zielsequenz erreicht. Ein Verfahren für eine Multiplex-LCR wurde ebenfalls beschrieben ( WO 9320227 ). Gap-LCR (GLCR) stellt eine Variante von LCR dar, in welcher die Sonden nicht aneinander angrenzen, sondern durch 2 bis 3 Basen voneinander getrennt sind.
Zur Amplifikation von mRNAs liegt es im Bereich der vorliegenden Erfindung, mRNA revers in cDNA zu transkribieren, gefolgt von einer Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), oder ein einzelnes Enzym für beide Schritte zu verwenden, wie es in U.S. Patent Nr. 5,322,770 beschrieben ist, oder asymmetrische Gap-LCR (RT-AGLCR) zu verwenden, wie es von Marshall et al. (1994) beschrieben ist. AGLCR stellt eine Modifikation von GLCR dar, welche die Amplifikation von RNA ermöglicht.
Die PCR-Technologie stellt die in der vorliegenden Erfindung bevorzugt verwendete Amplifikationstechnik dar. Eine Vielzahl von PCR-Techniken sind dem Fachmann geläufig. Für einen Überblick über die PCR-Technologie siehe White (1997) sowie die Publikation mit dem Titel „PCR Methods and Applications” (1991, Cold Spring Harbor Laboratory Press). in jedem dieser PCR-Verfahren werden PCR-Primer auf beiden Seiten der zu amplifizierenden Nukleinsäuresequenzen zusammen mit dNTPs und einer thermostabilen Polymerase, wie beispielsweise Taq-Polymerase, Pfu-Polymerase oder Vent-Polymerase, zu einer in geeigneter Weise vorbereiteten Nukleinsäureprobe hinzugefügt. Die Nukleinsäure in der Probe wird denaturiert, und die PCR-Primer werden spezifisch an komplementäre Nukleinsäuresequenzen in der Probe hybridisiert. Die hybridisierten Primer werden verlängert. Anschließend wird ein weiterer Zyklus von Denaturierung, Hybridisierung und Verlängerung initiiert. Die Zyklen werden mehrere Male wiederholt, um ein die Nukleinsäuresequenz zwischen den Primerstellen enthaltendes amplifiziertes Fragment zu erzeugen. Die PCR wurde weiterhin in verschiedenen Patenten, umfassend die U.S. Patente 4,683,195 , 4,583,202 und 4,965,188 beschrieben.
Die PCR-Technologie stellt die bevorzugte Amplifikationstechnik dar, welche zur Identifizierung neuer biallelischer Marker verwendet wird. Ein typisches Beispiel einer für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeigneten PCR-Reaktion ist in Beispiel 2 bereitgestellt.
Es wird ein Verfahren zur Amplifikation des menschlichen FLAP-Gens, insbesondere der genomischen Sequenz von SEQ ID Nr. 1 oder der cDNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 2 oder eines Fragments oder einer Variante hiervon, in einer Testprobe, bevorzugt unter Verwendung der PCR-Technologie, beschrieben. Dieses Verfahren umfasst die Schritte des Inkontaktbringens einer Testprobe, von welcher vermutet wird, dass sie die für FLAP kodierende Zielsequenz oder einen Teil hiervon enthält, mit Reagenzien für die Amplifikationsreaktion, umfassend ein Paar von Aplifikationsprimern, sowie in einigen Fällen letztlich eine Detektionssonde, welche mit einer inneren Region der Amplikonsequenzen zur Bestätigung, dass die gewünschte Amplifikationsreaktion stattgefunden hat, hybridisieren kann.
Die Erfindung offenbart ferner ein Verfahren zur Amplifikation einer menschlichen FLAP-Gensequenz, insbesondere eines Teils der genomischen Sequenzen von SEQ ID Nr. 1 oder der cDNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 2 oder einer Variante hiervon, in einer Testprobe, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

a) Inkontaktbringen einer Testprobe, von welcher vermutet wird, dass die die Zielsequenz des FLAP-Gens, die in einer aus einer Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 und 2 oder Fragmenten oder Varianten hiervon ausgewählten Nukleotidsequenz umfasst ist, enthält, mit Reagenzien für eine Amplifikationsreaktion, umfassend ein Paar von Amplifikationsprimern wie es vorstehend beschrieben ist, welches auf beiden Seiten der zu amplifizierenden Polynukleotidregion lokalisiert ist, und
b) gegebenenfalls Detektieren der Amplifikationsprodukte.

Die Erfindung beschreibt ferner ein Kit zur Amplifikation einer menschlichen FLAP-Gensequenz, insbesondere eines Teils der genomischen Sequenz von SEQ ID Nr. 1 oder der cDNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 2 oder einer Variante hiervon, in einer Testprobe, wobei das Kit umfasst:

a) ein Paar von Oligonukleotidprimern, welche auf beiden Seiten der zu amplifizierenden FLAP-Region lokalisiert sind,
b) gegebenenfalls die zur Durchführung der Amplifikationsreaktion erforderlichen Reagenzien.

In einer Ausführungsform des vorstehenden Amplifikationsverfahrens und Kits wird das Amplifikationsprodukt durch Hybridisierung mit einer markierten Sonde, welche eine zur amplifizierten Region komplementäre Sequenz aufweist, detektiert. In einer anderen Ausführungsform des vorstehenden Amplifikationsverfahrens und Kits umfassen die Primer eine Sequenz, welche aus der Gruppe bestehend aus den Nukleotidsequenzen von B1 bis B17, C1 bis C17, D1 bis D28 und E1 bis E28 ausgewählt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform des vorstehenden Amplifikationsverfahrens und Kits umfasst das Amplifikationsprodukt eine polymorphe Base eines biallelischen Markers der vorliegenden Erfindung, insbesondere eine polymorphe Base eines aus der Gruppe von A1 bis A28 und den Komplementen hiervon ausgewählten biallelischen Markers. Die Primer sind insbesondere dadurch gekennzeichnet, dass sie mit einer beliebigen Sequenz eines Stranges der genomischen Sequenz in der Nähe der zu amplifizierenden Region, beispielsweise mit einer nicht-kodierenden Sequenz, welche an zu amplifizierende Exons angrenzt, hinreichend komplementär sind.
In einer ersten Ausführungsform werden die biallelischen Marker unter Verwendung der von den Erfindern erzeugten genomischen Sequenzinformationen identifiziert. Sequenzierte genomische DNA-Fragmente werden zum Entwurf von Primern für die Amplifikation von Fragmenten mit 500 bp verwendet. Diese Fragmente mit 500 bp werden aus genomischer DNA amplifiziert und auf biallelische Marker hin durchmustert. Die Primer können unter Verwendung der OSP-Software (Hillier L. und Green P., 1991) entworfen werden. Alle Primer können stromaufwärts der spezifischen Zielbasen einen gemeinsamen Oligonukleotidschwanz enthalten, welcher als Sequenzierungsprimer dient. Bern Fachmann sind Primerverlängerungen geläufig, welche für diese Zwecke verwendet werden können.
Bevorzugte Primer, welche zur Amplifikation von für die Kandidatengene kodierenden genomischen Sequenzen von Nutzen sind, konzentrieren sich auf Promotoren, Exons und Spleißstellen der Gene. Ein biallelischer Marker besitzt eine höhere Wahrscheinlichkeit, letztlich eine kausale Mutation darzustellen, wenn er in diesen funktionellen Regionen des Gens lokalisiert ist. Bevorzugte Amplifikationsprimer der Erfindung umfassen die in Beispiel 2 offenbarten Nukleotidsequenzen B1 bis B17 und die Nukleotidsequenzen C1 bis C17.
3. Sequenzierung von amplifizierter genomischer DNA und Identifizierung von Polymorphismen
Die Amplifikationsprodukte, welche wie vorstehend beschrieben mit den Primern erzeugt werden, werden anschließend unter Verwendung bekannter und dem Fachmann zur Verfügung stehender Verfahren sequenziert. Bevorzugt wird die amplifizierte DNA automatisierten Didesoxyterminator-Sequenzierungsreaktionen im Rahmen eines zyklischen Sequenzierungsprotokolls mit farbstoffmarkiertem Primer unterzogen.
Im Anschuss an eine Gel-Image-Analyse und eine Extraktion der DNA-Sequenz werden die Sequenzdaten mittels einer Software automatisch verarbeitet, um die Qualität der Sequenzen zu evaluieren.
Die wie vorstehend beschrieben erhaltenen Sequenzdaten werden auf Basis der Form des Peaks, der Auflösung zwischen den Peaks, der Anzahl von unzuverlässigen Peaks in einem bestimmten Bereich der Sequenz, sowie dem Rauschpegel einer Qualitätskontrolle und Validierungsschritten unterzogen. Sequenzdaten, welche als unzuverlässig angesehen werden, werden verworfen.
Nach dieser ersten Qualitätsanalyse der Sequenzen werden Polymorphismen in einzeln oder zusammengefasst amplifizierten Fragmentsequenzen detektiert. Die Suche nach Polymorphismen basiert auf der Gegenwart übereinander liegender Peaks im Elektrophoresemuster. Diese Peaks, welche zwei unterschiedliche Farben besitzen, entsprechen zwei verschiedenen Nukleotiden an der gleichen Position der Sequenz. Dafür, dass Peaks als signifikant angesehen werden, muss die Peakhöhe Bedingungen betreffend das Verhältnis zwischen den Peaks und Bedingungen betreffend das Verhältnis zwischen einem vorgegebenen Peak und den umliegenden Peaks gleicher Farbe erfüllen.
Da die Gegenwart zweier Peaks aufgrund von Hintergrundrauschen jedoch ein Artefakt sein kann, werden zwei Kontrollen verwendet, um diese Artefakte auszuschließen:

– die beiden DNA-Stränge werden sequenziert, und es wird ein Vergleich zwischen den Peaks durchgeführt. Für eine Validierung muss der Polymorphismus auf beiden Strängen detektiert werden.
– es werden alle sequenzierenden Elektrophoresemuster des gleichen Amplifikationsproduktes, welche aus unterschiedlichen Pools und/oder Individuen bereitgestellt werden, verglichen. Die Homogenität und das Verhältnis von homozygoter und heterozygoter Peakhöhe werden durch diese unterschiedlichen DNAs kontrolliert.

Die Detektionsgrenze für die durch Sequenzierung von Pools mit 100 Individuen detektierte Häufigkeit biallelischer Polymorphismen beträgt etwa 0.1 für das weniger häufig vorkommende Allel, wie durch Sequenzierung von Pools mit bekannten allelischen Häufigkeiten verifiziert wurde. Mehr als 90% der mittels des zusammenfassenden Verfahrens detektierten biallelischen Polymorphismen besitzen jedoch eine Häufigkeit von mehr als 0.25 für das weniger häufig vorkommende Allel. Daher besitzen die mittels dieses Verfahrens ausgewählten biallelischen Marker eine Häufigkeit von mindestens 0.1 für das weniger häufig vorkommende Allel und weniger als 0.9 für das häufiger vorkommende Allel, bevorzugt mindestens 0.2 für das weniger häufig vorkommende Allel und weniger als 0.8 für das häufiger vorkommende Allel, stärker bevorzugt mindestens 0.3 für das weniger häufig vorkommende Allel und weniger als 0.7 für das häufiger vorkommende Allel, somit eine Heterozygositätsrate von höher als 0.18, bevorzugt höher als 0.32, stärker bevorzugt höher als 0.42.
In einer anderen Ausführungsform werden die biallelischen Marker durch Sequenzierung einzelner DNA-Proben detektiert, wobei die Häufigkeit des weniger häufig vorkommenden Allels eines derartigen biallelischen Markers weniger als 0.1 sein kann.
4. Validierung der biallelischen Marker
Die Polymorphismen werden auf ihre Nutzbarkeit als genetische Marker hin durch Validierung, dass beide Allele in einer Population vorhanden sind, evaluiert. Die Validierung der biallelischen Marker erfolgt durch Genotypisieren einer Gruppe von Individuen mittels eines erfindungsgemäßen Verfahrens und Darlegung, dass beide Allele vorhanden sind. Die Mikrosequenzierung stellt ein bevorzugtes Verfahren zum Genotypisieren von Allelen dar. Die Validierung mittels eines Genotypisierungsschrittes kann an einzelnen Proben, welche von jedem Individuum der Gruppe stammen, durchgeführt werden, oder kann durch Genotypisieren einer zusammengefassten Probe, welche von mehr als einem Individuum stammt, erfolgen. Die Gruppe kann eine Untergrenze an Individuen von bis zu einem Individuum aufweisen, falls das Individuum in Bezug auf das fragliche Allel heterozygot ist. Bevorzugt enthält die Gruppe mindestens drei Individuen, stärker bevorzugt enthält die Gruppe fünf oder sechs Individuen, so dass ein einzelner Validierungstest mit höherer Wahrscheinlichkeit zur Validierung von mehreren der untersuchten biallelischen Marker führt. Es sollte jedoch beachtet werden, dass, wenn der Validierungstest bei einer kleinen Gruppe durchgeführt wird, er zu einem falsch negativen Ergebnis führen kann, falls als Ergebnis eines Probenfehlers keines der untersuchten Individuen eines der beiden Allele trägt. Folglich ist das Validierungsverfahren zur Darlegung, dass ein bestimmtes ursprüngliches Ergebnis ein Artefakt darstellt, weniger nützlich als zur Darlegung, dass ein bona fide biallelischer Marker an einer bestimmten Position einer Sequenz vorliegt.
5. Evaluierung der Häufigkeit der biallelischen Marker
Die validierten biallelischen Marker werden weiterhin auf ihre Nutzbarkeit als genetische Marker durch Bestimmung der Häufigkeit des am seltensten vorkommenden Allels an der Stelle des biallelischen Markers evaluiert. Je höher die Häufigkeit des am seltensten vorkommenden Allels ist, desto höher ist die Nutzbarkeit des biallelischen Markers in Assoziationsstudien. Die Bestimmung des am seltensten vorkommenden Allels erfolgt durch Genotypisieren einer Gruppe von Individuen mittels eines erfindungsgemäßen Verfahrens sowie Darlegung, dass beide Allele vorhanden sind. Diese Bestimmung der Häufigkeit mittels eines Genotypisierungsschrittes kann an einzelnen Proben, welche von jedem Individuum in der Gruppe stammen, durchgeführt werden, oder kann durch Genotypisieren einer zusammengefassten Probe, welche von mehr als einem Individuum stammt, erfolgen. Die Gruppe muss groß genug sein, um für die Population als ganzes repräsentativ zu sein. Bevorzugt enthält die Gruppe mindestens 20 Individuen, stärker bevorzugt enthält die Gruppe mindestens 50 Individuen, am stärksten bevorzugt enthält die Gruppe mindestens 100 Individuen. Selbstverständlich ist die Genauigkeit der Häufigkeitsbestimmung aufgrund eines verminderten Probenfehlers umso größer, je größer die Gruppe ist. Für eine Angabe der Häufigkeit des weniger häufig vorkommenden Allels eines bestimmten biallelischen Markers der Erfindung siehe Tabelle 2. Ein biallelischer Marker, in welchem die Häufigkeit des weniger häufig vorkommenden Allels 30% oder mehr beträgt, wird als „biallelischer Hochqualitätsmarker” bezeichnet.
Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Abschätzung der Häufigkeit eines Allels eines mit FLAP in Beziehung stehenden biallelischen Markers in einer Kontrollpopulation oder in einer Asthma-positiven Population, umfassend: a) Genotypisieren von Individuen aus der Population hinsichtlich des biallelischen Markers gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung, b) Bestimmen der proportionalen Repräsentanz des biallelischen Markers in der Population. Zusätzlich werden Verfahren zur Abschätzung der Häufigkeit eines Allels in einer Population beschrieben, was Verfahren mit einer beliebigen weiteren in dieser Offenbarung beschriebenen Einschränkung oder die nachfolgenden Verfahren, ob alleine oder in einer beliebigen Kombination angegeben, umfasst. Der mit FLAP in Beziehung stehende biallelische Marker kann aus der Gruppe bestehend aus A1 bis A28 und den Komplementen hiervon ausgewählt werden. Gegebenenfalls kann der mit FLAP in Beziehung stehende biallelische Marker aus der Gruppe bestehend aus A1 bis A13, A15 und A17 bis A28, und den Komplementen hiervon ausgewählt werden. Gegebenenfalls werden die biallelischen Marker aus der Gruppe bestehend aus A1 bis A10 und A22 bis A28, und den Komplementen hiervon ausgewählt. Gegebenenfalls werden die biallelischen Marker aus der Gruppe bestehend aus A11 bis A13, A15, A17 bis A21, und den Komplementen hiervon ausgewählt. Gegebenenfalls werden die biallelischen Marker aus der Gruppe bestehend aus A14 oder A16, und den Komplementen hiervon ausgewählt. Gegebenenfalls kann die Bestimmung der proportionalen Repräsentanz eines Nukleotids bei einem mit FLAP in Beziehung stehenden biallelischen Marker durch Bestimmen der Identität der Nukleotide für beide Kopien des im Genom eines jeden Individuums der Population vorhandenen biallelischen Markers, und Berechnen der proportionalen Repräsentanz des Nukleotids bei dem mit FLAP in Beziehung stehenden biallelischen Marker für die Population erfolgen. Gegebenenfalls kann die Bestimmung der proportionalen Repräsentanz durch Durchführen eines erfindungsgemäßen Genotypisierungsverfahrens an einer zusammengefassten biologischen Probe, welche aus einer repräsentativen Anzahl von Individuen oder jedem Individuum der Population stammt, und Berechnen der proportionalen Menge des Nukleotids im Vergleich zur Gesamtmenge erfolgen.
VIII. Verfahren zur Genotypisierung eines Individuums auf biallelische Marker
Es werden Verfahren zur Genotypisierung einer biologischen Probe auf einen oder mehrere biallelische Marker, wie sie in der vorliegenden Erfindung beschrieben sind, offenbart, welche allesamt in vitro durchgeführt werden können. Derartige Verfahren zur Genotypisierung umfassen das Bestimmen der Identität eines Nukleotids an einer Stelle eines biallelischen FLAP-Markers mittels eines beliebigen im Fachbereich bekannten Verfahrens. Diese Verfahren finden Anwendung bei der Genotypisierung von Fall-Kontroll-Populationen in Assoziationsstudien, sowie bei der Genotypisierung von Individuen im Rahmen der Detektion von Allelen biallelischer Marker, von denen bekannt ist, dass sie mit einem vorgegebenen Merkmal assoziiert sind, wobei in diesem Fall beide Kopien des im Genom des Individuums vorhandenen biallelischen Markers bestimmt werden, so dass ein Individuum in Bezug auf ein bestimmtes Allel als homozygot oder heterozygot klassifiziert werden kann.
Diese Genotypisierungsverfahren können an Nukleinsäureproben durchgeführt werden, welche von einem einzelnen Individuum oder von zusammengefassten DNA-Proben stammen.
Die vorab beschriebene Identifizierung biallelischer Marker ermöglicht den Entwurf geeigneter Oligonukleotide, welche als Sonden und Primer zur Amplifikation eines die polymorphe Stelle von Interesse enthaltenden FLAP-Gens sowie zur Detektion derartiger Polymorphismen verwendet werden können.
Eine Genotypisierung kann unter Verwendung ähnlicher Verfahren wie jener, welche zur Identifizierung der biallelischen Marker vorstehend beschrieben sind, oder unter Verwendung anderer Genotypisierungsverfahren wie beispielsweise jenen, welche nachstehend weiterhin beschrieben sind, durchgeführt werden. In bevorzugten Ausführungsformen wird der Vergleich von Sequenzen amplifizierter genomischer Fragmente aus verschiedenen Individuen zur Identifizierung neuer biallelischer Marker verwendet, während zur Genotypisierung bekannter biallelischer Marker in diagnostischen Anwendungen und in Anwendungen betreffend Assoziationsstudien eine Mikrosequenzierung verwendet wird.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Genotypisierung, umfassend das Bestimmen der Identität eines Nukleotids bei einem mit Asthma assoziierten, mit FLAP in Beziehung stehenden biallelischen Marker gemäß SEQ ID Nr. 1 oder der hierzu komplementären Sequenzen in einer biologischen Probe, wobei der mit FLAP in Beziehung stehende biallelische Marker aus der Gruppe bestehend aus den biallelischen Markern in den Positionen 3950, 4243, 4312, 4490, 4670, 4687, 4968, 5140, 5213, 5364, 5594, 6370, 6693, 6763, 7445, 7870, 16288, 16347, 16383, 16440, 24361, 28336, 28368, 36183, 36509, 38681, 42440 und 42445 von SEQ ID Nr. 1 ausgewählt ist. Gegebenenfalls stammt die biologische Probe aus einem einzelnen Individuum. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Identität der Nukleotide bei dem biallelischen Marker für beide Kopien des im Genom des Individuums vorhandenen biallelischen Markers bestimmt. Gegebenenfalls wird das Verfahren in vitro durchgeführt. In einer ebenfalls bevorzugten Ausführungsform stammt die biologische Probe aus mehreren Individuen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das vorstehend beschriebene Genotypisierungsverfahren weiterhin ein Amplifizieren eines Teils der den biallelischen Marker umfassenden Sequenz vor dem Bestimmungsschritt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, wobei das Amplifizieren mittels PCR, gegebenenfalls mittels LCR, oder durch Replikation eines rekombinanten Vektors, welcher einen Replikationsursprung und den genannten Teil umfasst, in einer Wirtszelle durchgeführt wird. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann der Bestimmungsschritt des vorstehenden Genotypisierungsverfahrens entweder mittels eines Hybridisierungsassays, eines Sequenzierungsassays, eines enzymbasierten Basenfehlpaarungs-Nachweisassays (Mismatch-Nachweisassay), oder mittels eines Mikrosequenzierungsassays durchgeführt werden. Zusätzlich umfassen die Genotypisierungsverfahren, wie sie in der Erfindung beschrieben sind, Verfahren mit einer beliebigen weiteren in dieser Offenbarung beschriebenen Einschränkung oder die nachfolgenden Verfahren, ob alleine oder in einer beliebigen Kombination angegeben. Der biallelische Marker wird aus der Gruppe bestehend aus A1 bis A28, und den Komplementen hiervon ausgewählt. Gegebenenfalls wird der biallelische Marker aus der Gruppe bestehend aus A1 bis A13, A15, und A17 bis A28, und den Komplementen hiervon ausgewählt. Gegebenenfalls wird der biallelische Marker aus der Gruppe bestehend aus A1 bis A10 und A22 bis A28, und den Komplementen hiervon ausgewählt. Gegebenenfalls wird der biallelische Marker aus der Gruppe bestehend aus A11 bis A13, A15, A17 bis A21, und den Komplementen hiervon ausgewählt. Gegebenenfalls ist der biallelische Marker entweder A14 oder A16, und die Komplemente hiervon.
DNA-Quelle für die Genotypisierung
Eine beliebige Nukleinsäurequelle, in gereinigter oder in nicht-gereinigter Form, kann unter der Voraussetzung, dass sie die gewünschte spezifische Nukleinsäuresequenz enthält oder vermutlich enthält, als Ausgangsnukleinsäure verwendet werden. DNA oder RNA kann, wie vorstehend beschrieben, aus Zellen, Geweben, Körperfluids, und dergleichen extrahiert werden. Während Nukleinsäuren für eine Verwendung in den erfindungsgemäßen Genotypisierungsverfahren aus einer beliebigen Säugerquelle stammen können, handelt es sich bei den Testsubjekten und Individuen, aus welchen die Nukleinsäureproben entnommen werden, nach allgemeinem Verständnis um Menschen.
Amplifikation von DNA-Fragmenten, welche biallelische Marker umfassen
Es werden Verfahren und Polynukleotide zur Amplifikation eines Segments von Nukleotiden, umfassend einen oder mehrere biallelische Marker der vorliegenden Erfindung, beschrieben. Es versteht sich, dass die Amplifikation von biallelische Marker umfassenden DNA-Fragmenten in verschiedenen Verfahren und für verschiedene Zwecke verwendet werden kann und nicht auf eine Genotypisierung beschränkt ist. Nichts desto weniger erfordern viele Genotypisierungsverfahren, wenngleich nicht alle, die vorherige Amplifikation der den biallelischen Marker von Interesse tragenden DNA-Region. Derartige Verfahren bewirken eine spezifische Erhöhung der Konzentration oder der GesamtAnzahl von Sequenzen, welche den biallelischen Marker überspannen oder jene Stelle umfassen, sowie von Sequenzen, welche entweder distal oder proximal von diesem lokalisiert sind. Diagnostische Assays können sich ferner auf eine Amplifikation von DNA-Segmenten stützen, welche einen biallelischen Marker der vorliegenden Erfindung tragen. Die Amplifikation von DNA kann durch ein beliebiges im Fachbereich bekanntes Verfahren erreicht werden. Amplifikationstechniken sind im Abschnitt mit dem Titel „Identifizierung von biallelischen Markern” VII. (2) beschrieben.
Einige dieser Amplifikationsverfahren sind besonders für die Detektion von Einzelnukleotidpolymorphismen geeignet und ermöglichen die gleichzeitige Amplifikation einer Zielsequenz und die Identifizierung des polymorphen Nukleotids, wie nachfolgend weiterhin beschrieben wird.
Die Identifizierung biallelischer Marker, wie sie vorstehend beschrieben ist, ermöglicht den Entwurf geeigneter Oligonukleotide, welche als Primer zur Amplifikation von DNA-Fragmenten, die die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen biallelischen Marker umfassen, verwendet werden können. Die Amplifikation kann unter Verwendung der ursprünglich zur Nachweis der hierin beschriebenen neuen biallelischen Marker verwendeten Primer, oder unter Verwendung eines beliebigen Satzes an Primern, welche die Amplifikation eines einen biallelischen Marker der vorliegenden Erfindung umfassenden DNA-Fragments ermöglichen, durchgeführt werden.
Die vorliegende Erfindung beschreibt Primer zur Amplifikation eines DNA-Fragments, welches einen oder mehrere biallelische Marker, wie sie in der vorliegenden Erfindung beschrieben sind, enthält. In einigen Ausführungsformen ist das Primerpaar für die Amplifikation einer Sequenz, welche die polymorphe Base einer der Sequenzen P1 bis P28, gegebenenfalls P1 bis P13, P15, P17 bis P28, und der hierzu komplementären Sequenz enthält, angepasst. Bevorzugte Amplifikationsprimer sind in Beispiel 2 aufgelistet. Es versteht sich, dass die aufgelisteten Primer lediglich exemplarisch sind und dass ein beliebiger anderer Satz von Primern Amplifikationsprodukte erzeugt, welche einen oder mehrere biallelische Marker der vorliegenden Erfindung enthalten.
Der Abstand der Primer bestimmt die Länge des zu amplifizierenden Segments. In diesem Zusammenhang können biallelische Marker tragende amplifizierte Segmente in Bezug auf ihre Größe im Bereich von mindestens etwa 25 bp bis 35 kbp liegen. Amplifikationsfragmente von 25–3000 bp sind typisch, Fragmente von 50–1000 bp sind bevorzugt, und Fragmente von 100–600 bp sind im hohem Maße bevorzugt. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Primerpaare für eine Amplifikation und Sequenzierung zu einer Region eines FLAP-Gens hinreichend komplementär, welche weniger als 500 bp, bevorzugt weniger als 100 bp, und stärker bevorzugt weniger als 50 bp von einer polymorphes Stelle, die einem der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Marker entspricht, lokalisiert ist. Amplifikationsprimer können markiert oder auf einem festen Träger immobilisiert sein, wie in „Oligonukleotidsonden und -primer” beschrieben ist.
Verfahren zur Genotypisierung von DNA-Proben auf biallelische Marker
Ein beliebiges im Fachbereich bekanntes Verfahren kann zur Identifizierung des an einer biallelischen Markerstelle vorhandenen Nukleotids verwendet werden. Da das zu detektierende biallelische Markerallel in der vorliegenden Erfindung identifiziert und spezifiziert wurde, erweist sich die Detektion für einen Fachmann bei Einsatz einer beliebiges Technik aus einer Anzahl von Techniken als einfach. Viele Genotypisierungsverfahren erfordern die vorherige Amplifikation der den biallelischen Marker von Interesse tragenden DNA-Region. Während die Amplifikation einer Zielstruktur oder eines Signals gegenwärtig häufig bevorzugt ist, sind ultraempfindliche Detektionsverfahren, welche keine Amplifikation erfordern, durch die vorliegenden Genotypisierungsverfahren ebenfalls umfasst. Verfahren, welche dem Fachmann wohlbekannt sind und zur Detektion von biallelischen Polymorphismen verwendet werden können, umfassen Verfahren wie beispielsweise herkömmliche Dot-Blot-Analysen, die von Orita et al. (1989) beschriebene Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus-Analyse (SSCP), die denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE), eine Heteroduplexanalyse, eine Fehlpaarungsspaltungsdetektion, und andere herkömmliche Techniken, wie sie in Sheffield et al. (1991), White et al. (1992) und Grompe et al. (1989 und 1993) beschrieben sind. Ein weiteres Verfahren zur Bestimmung der Identität des an einer bestimmten polymorphen Stelle vorhandenen Nukleotids verwendet ein spezialisiertes Exonuklease-resistentes Nukleotidderivat, wie es in U.S. Patent 4,656,127 beschrieben ist.
Bevorzugte Verfahren umfassen die direkte Bestimmung der Identität des an einer biallelischen Markerstelle vorhandenen Nukleotids mittels eines Sequenzierungsassays, eines enzymbasierten Basenfehlpaarungs-Detektionsassays oder eines Hybridisierungsassays. Im Anschluss folgt eine Beschreibung einiger bevorzugter Verfahren. Ein in hohem Maße bevorzugtes Verfahren ist die Mikrosequenzierungstechnik. Der Begriff „Sequenzierung” wird hierin zur Bezeichnung einer Polymeraseverlängerung von Primer/Matrize-Duplexkomplexen verwendet und umfasst sowohl herkömmliche Sequenzierung als auch Mikrosequenzierung.
1) Sequenzierungsassays
Die mit den erfindungsgemäßen Primern vorstehend erzeugten Amplifikationsprodukte können unter Verwendung von bekannten und dem Fachmann zur Verfügung stehenden Verfahren sequenziert werden. Bevorzugt wird die amplifizierte DNA automatisierten Didesoxyterminator-Sequenzierungsreaktionen im Rahmen eines zyklischen Sequenzierungsprotokolls mit farbstoffmarkiertem Primer unterzogen. Eine Sequenzanalyse kann die Identifizierung der an der polymorphen Stelle vorhandenen Base ermöglichen.
2) Mikrosequenzierungsassays
Polymorphismusanalysen von Pools oder von ausgewählten Individuen einer vorgegebenen Population können durchgeführt werden, indem Mikrosequenzierungsreaktionen an Kandidatenregionen vorgenommen werden, welche in durch PCR erhaltenen amplifizierten Fragmenten enthalten sind, wobei die PCR an aus diesen Individuen entnommenen DNA- oder RNA-Proben durchgeführt wurde.
Für diesen Zweck werden DNA-Proben einer PCR-Amplifikation der Kandidatenregionen unter ähnlichen Bedingungen wie jenen, welche vorstehend beschrieben sind, unterzogen. Diese genomischen Amplifikationsprodukte werden anschließend automatisierten Mikrosequenzierungsreaktionen unter Verwendung von ddNTPs spezifische Fluoreszenz für jedes ddNTP) und geeigneten Oligonukleotid-Mikrosequenzierungsprimern, welche unmittelbar stromaufwärts der polymorphen Base von Interesse hybridisieren können, unterzogen. Sobald er am 3'-Ende von einer DNA-Polymerase unter Verwendung eines komplementären, fluoreszierenden Didesoxynukleotidanalogons spezifisch verlängert worden ist (thermisches Cycling), wird der Primer zur Entfernung von nicht eingebauten fluoreszierenden ddNTPs präzipitiert. Die Reaktionsprodukte, in welche fluoreszierende ddNTPs eingebaut wurden, werden anschließend zur Bestimmung der Identität der eingebauten Base mittels Elektrophorese auf ABI 377-Sequenziervorrichtungen analysiert, wodurch der in der Probe vorhandene polymorphe Marker identifiziert wird.
Ein Beispiel eines typischen Mikrosequenzierungsverfahrens, welches in diesem Zusammenhang verwendet werden kann, ist in Beispiel 4 bereitgestellt. Es versteht sich, dass bestimmte Parameter dieses Verfahrens, wie beispielsweise das Elektrophoreseverfahren oder die Markierung der ddNTPs, von einem Fachmann modifiziert werden können, ohne dabei dessen Ergebnis wesentlich zu modifizieren.
Der verlängerte Primer kann auch mittels MALTI-TOF-Massenspektrometrie analysiert werden. Die Base an der polymorphen Stelle wird durch die Masse identifiziert, welche zum Mikrosequenzierungsprimer hinzuaddiert wird (siehe Haff und Smirnov, 1997).
Als weitere Alternative zum vorstehend beschriebenen Verfahren wurden verschiedene Festphasen-Mikrosequenzierungsreaktionen entwickelt. Das grundlegende Mikrosequenzierungsprotokoll ist das gleiche wie das zuvor beschriebene, mit Ausnahme dessen, dass entweder die Oligonukleotid-Mikrosequenzierungsprimer oder die PCR-amplifizierten Produkte des DNA-Fragments von Interesse immobilisiert werden. Die Immobilisierung kann beispielsweise durch eine Wechselwirkung zwischen biotinylierter DNA und Streptavidin-beschichteten Mikrotitervertiefungen oder Avidin-beschichteten Polystyrolpartikeln bewirkt werden.
In derartigen Festphasen-Mikrosequenzierungsreaktionen können eingebaute ddNTPs entweder radiomarkiert (siehe Syvänen, 1994, auf welches hiermit Bezug genommen wird) oder an Fluorescein gebunden sein (siehe Livak & Hainer, 1994, auf welches hiermit Bezug genommen wird). Die Detektion radiomarkierter ddNTPs kann mittels auf Szintillation basierenden Techniken erzielt werden. Die Detektion von Fluorescein-gebundenen ddNTPs kann auf der Bindung eines mit alkalischer Phosphatase konjugierten Antifluorescein-Antikörpers basieren, gefolgt von einer Inkubation mit einem chromogenen Substrat (wie beispielsweise p-Nitrophenylphosphat).
Andere mögliche Reporter-Detektionspaare umfassen: ddNTP, welches an Dinitrophenyl (DNP) und ein Konjugat aus Anti-DNP und alkalischer Phosphatase gebunden ist (siehe Harju et al., 1993), sowie biotinyliertes ddNTP und Meerrettichperoxidase-konjugiertes Streptavidin mit o-Phenylendiamin als Substrat (siehe WO 92/15712 ).
Ein Diagnosekit, welches auf Fluorescein-gebundenem ddNTP in Verbindung mit einem mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Antifluorescein-Antikörper basiert, wird kommerziell unter dem Namen PRONTO von GamidaGen Ltd. vertrieben.
Als noch ein anderes alternatives Mikrosequenzierungsverfahren stellten Nyren et al. (1993) das Konzept einer Festphasen-DNA-Sequenzierung vor, welches auf der Detektion von DNA-Polymeraseaktivität mittels eines enzymatischen luminometrischen anorganischen Pyrophosphat-Detektionsassays (ELIDA) beruht. Die PCR-amplifizierten Produkte werden biotinyliert und auf Beads immobilisiert. Der Mikrosequenzierungsprimer wird gebunden, und vier Aliquote dieses Gemisches werden getrennt voneinander mit DNA-Polymerase und einem der vier verschiedenen ddNTPs inkubiert. Nach der Reaktion werden die resultierenden Fragmente gewaschen und als Substrate in einer Primerverlängerungsreaktion verwendet, wobei alle vier dNTPs vorhanden sind. Das Fortschreiten der DNA-gerichteten Polymerisationsreaktionen wird mittels ELIDA überwacht. Der Einbau eines ddNTP in der ersten Reaktion verhindert die Bildung von Pyrophosphat während der nachfolgenden dNTP-Reaktion. Im Gegensatz dazu verursacht ein nicht erfolgter Einbau von ddNTP in der ersten Reaktion eine erhebliche Freisetzung von Pyrophosphat während der dNTP-Reaktion, was zur Erzeugung von Licht während den gesamten ELIDA-Reaktionen führt. Aus den ELIDA-Ergebnissen lässt sich die erste Base nach dem Primer auf einfache Art und Weise ableiten.
Pastinen et al. (1997) beschreiben ein Verfahren für die Multiplexdetektion von Einzelnukleotidpolymorphismen, in welchem das Festphasen-Minisequenzierungsprinzip auf ein Oligonukleotidarrayformat angewendet wird. Arrays mit einer hohen Dichte von DNA-Sonden, welche an einen festen Träger gebunden sind (DNA Chips), werden nachstehend weiter beschrieben.
Die vorliegende Erfindung beschreibt Polynukleotide und Verfahren zur Genotypisierung eines oder mehrerer in der vorliegenden Erfindung offenbarter biallelischer Marker mittels Durchführung eines Mikrosequenzierungsassays. Bevorzugt werden die biallelischen Marker aus der Gruppe bestehend aus A1 bis A28 und den Komplementen hiervon ausgewählt. Bevorzugte Mikrosequenzierungsprimer umfassen die Nukleotidsequenzen: D1 bis D28 und E1 bis E28. Es versteht sich, dass die in Beispiel 4 aufgelisteten Mikrosequenzierungsprimer lediglich exemplarischer Natur sind, und dass ein beliebiger Primer, dessen 3'-Ende unmittelbar an das polymorphe Nukleotid angrenzt, verwendet werden kann. Gleichermaßen versteht es sich, dass eine Mikrosequenzierungsanalyse für einen beliebigen biallelischen Marker oder für eine beliebige Kombination von biallelischen Markern, welche(r) in der vorliegenden Erfindung beschrieben ist/sind, durchgeführt werden kann. Ein Aspekt ist ein fester Träger, welcher einen oder mehrere der in Beispiel 4 aufgelisteten Mikrosequenzierungsprimer, oder Fragmente umfassend mindestens 8, 12, 15, 20, 25, 30, 40 oder 50 aufeinanderfolgende Nukleotide hievon mit einem 3'-Ende unmittelbar stromaufwärts des entsprechenden biallelischen Markers, zur Bestimmung der Identität eines Nukleotids an einer biallelischen Markerstelle umfasst.
3) Basenfehlpaarungs-Detektionsassays, welche auf Polymerasen und Ligasen basieren
In einem Aspekt offenbart die vorliegende Erfindung Polynukleotide und Verfahren zur Bestimmung des Allels eines oder mehrerer in der vorliegenden Erfindung beschriebener biallelischer Marker in einer biologischen Probe mittels allelspezifischer Amplifikationsassays. Verfahren, Primer und verschiedene Parameter zur Amplifikation von DNA-Fragmenten, welche biallelische Marker der vorliegenden Erfindung umfassen, sind vorstehend in „Amplifikation von DNA-Fragmenten, welche biallelische Marker umfassen” weiter beschrieben.
Allelspezifische Amplifikationsprimer
Die Unterscheidung zwischen den beiden Allelen eines biallelischen Markers kann auch mittels allelspezifischer Amplifikation erreicht werden, einer selektiven Strategie, bei welcher eines der Allele ohne Amplifikation des anderen Allels amplifiziert wird. Für eine allelspezifische Amplifikation ist mindestens ein Mitglied des Primerpaares zu einer Region eines die polymorphe Base eines biallelischen Markers der vorliegenden Erfindung umfassenden FLAP-Gens hinreichend komplementär, um hiermit zu hybridisieren. Derartige Primer besitzen die Fähigkeit, zwischen den beiden Allelen eines biallelischen Markers zu unterscheiden.
Dies kann dadurch erfolgen, dass die polymorphe Base am 3'-Ende eines der Amplifikationsprimer platziert wird. Derartige allelspezifische Primer tendieren aufgrund dessen, dass sich die Verlängerung vom 3'-Ende des Primers aus ausbildet, dazu, eine Amplifikations- oder Sequenzierungsreaktion so lange selektiv zu starten, wie sie mit einer Nukleinsäureprobe, welche einen der beiden bei einem biallelischen Marker vorhandenen Allele enthält, verwendet werden, wobei eine Fehlpaarung an oder in der Nähe dieser Position eine hemmende Wirkung auf die Amplifikation besitzt. Daher richten diese Primer eine Amplifikation unter geeigneten Amplifikationsbedingungen lediglich auf ihr komplementäres Allel. Die Bestimmung des genauen Ortes der Fehlpaarung und der entsprechenden Assaybedingungen sind dem Fachmann wohlvertraut.
Auf Ligation/Amplifikation basierende Verfahren
Der „Oligonukleotid-Ligationsassay” (OLA) verwendet zwei Oligonukleotide, welche dazu konzipiert sind, an aneinander angrenzende Sequenzen eines Einzelstranges von Zielmolekülen hybridisieren zu können. Eines der Oligonukleotide ist biotinyliert, und das andere ist in detektierbarer Weise markiert. Kommt die exakt komplementäre Sequenz in einem Zielmolekül vor, so hybridisieren die Oligonukleotide, so dass ihre Enden aneinander angrenzen, und bilden ein Ligationssubstrat aus, welches abgefangen und detektiert werden kann. OLA ist zur Detektion von Einzelnukleotidpolymorphismen befähigt und kann vorteilhafterweise mit PCR kombiniert werden, wie von Nickerson et al. (1990) beschrieben ist. In diesem Verfahren wird PCR dazu verwendet, die exponentielle Amplifikation von Ziel-DNA zu bewirken, welche anschließend unter Verwendung von OLA detektiert wird.
Andere Amplifikationsverfahren, welche insbesondere für die Detektion von Einzelnukleotidpolymorphismen geeignet sind, umfassen LCR (Ligasekettenreaktion) und Gap-LCR (GLCR), welche vorstehend in „Identifizierung von biallelischen Markern” (2) beschrieben sind. LCR verwendet zwei Sondenpaare, um eine spezifische Zielstruktur exponentiell zu amplifizieren. Die Sequenzen eines jeden Oligonukleotidpaares werden ausgewählt, um es dem Paar zu ermöglichen, an aneinander angrenzende Sequenzen des gleichen Stranges der Zielstruktur zu hybridisieren. Eine derartige Hybridisierung bildet ein Substrat für eine Matrizenabhängige Ligase aus. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung kann die LCR mit Oligonukleotiden durchgeführt werden, welche die proximalen und distalen Sequenzen des gleichen Stranges einer biallelischen Markerstelle aufweisen. In einer Ausführungsform ist eines der Oligonukleotide dazu konzipiert, die biallelische Markerstelle zu umfassen. In einer derartigen Ausführungsform werden die Reaktionsbedingungen derart gewählt, dass die Oligonukleotide lediglich dann aneinander legiert werden können, wenn das Zielmolekül das spezifische Nukleotid, welches zum biallelischen Marker des Oligonukleotids komplementär ist, entweder enthält oder nicht enthält. In einer alternativen Ausführungsform umfassen die Oligonukleotide den biallelischen Marker nicht, so dass, wenn sie an das Zielmolekül hybridisieren, eine „Lücke” erzeugt wird, wie in WO 90/01069 beschrieben ist. Diese Lücke wird anschließend mit komplementären dNTPs (wie durch DNA-Polymerase vermittelt) oder mittels eines zusätzlichen Oligonukleotidpaares „aufgefüllt”. Folglich weist jeder Einzelstrang am Ende eines jeden Zyklus ein Komplement auf, welches in der Lage ist, während des nächsten Zyklus als Zielstruktur zu dienen, wobei eine exponentielle allelspezifische Amplifikation der gewünschten Sequenz erhalten wird.
Ligase/Polymerase-vermittelte Genetische Bit-Analyse^TM stellt ein weiteres Verfahren zur Bestimmung der Identität eines Nukleotids an einer vorab ausgewählten Stelle in einem Nukleinsäuremolekül dar ( WO 95/21271 ). Dieses Verfahren umfasst den Einbau eines Nukleosidtriphosphats, welches zu dem an der vorab ausgewählten Steile vorhandenen Nukleotid komplementär ist, am Terminus eines Primermoleküls, und dessen anschließende Ligation an ein zweites Oligonukleotid. Die Reaktion wird durch Detektion einer spezifischen Markierung, welche an die Festphase der Reaktion gebunden ist, oder durch Detektion in Lösung überwacht.
4) Hybridisierungsassayverfahren
Die Erfindung beschreibt ferner eine Gruppe von Sonden, welche dadurch gekennzeichnet sind, dass sie bevorzugt zwischen 10 und 50 Nukleotide umfassen und zu einer polymorphen Sequenz, die durch einen in der genomischen Sequenz eines FLAP-Gens lokalisierten biallelischen Marker definiert ist, hinreichend komplementär ist, um hieran zu hybridisieren, und bevorzugt hinreichend spezifisch ist, um die Zielsequenz in Bezug auf lediglich eine Nukleotidvariation unterscheiden zu können.
Die Länge dieser Sonden kann im Bereich von 10, 15, 20, oder 30 bis 100 Nukleotiden, bevorzugt von 10 bis 50, stärker bevorzugt von 40 bis 50 Nukleotiden, liegen. Eine besonders bevorzugte Sonde besitzt eine Länge von 25 Nukleotiden. Eine andere bevorzugte Sonde besitzt eine Länge von 47 Nukleotiden. Sie umfasst ein zentrales Nukleotid, welches zu einer polymorphen Stelle des FLAP-Gens, bevorzugt einer polymorphen Stelle, welche einem der biallelischen Marker der vorliegenden Erfindung entspricht, komplementär ist, sowie eine Sequenz von 23 Nukleotiden, welche sich auf jeder Seite des zentralen Nukleotids erstreckt und im Wesentlichen komplementär zu den Nukleotidsequenzen des FLAP-Gens ist, die sich auf jeder Seite der polymorphen Stelle erstrecken. Gegebenenfalls umfassen die in der vorliegenden. Erfindung beschriebenen biallelischen Marker die polymorphen Basen in den Sequenzen von P1 bis P28 und den hierzu komplementären Sequenzen. Gegebenenfalls umfassen die biallelischen Marker die polymorphen Basen in den Sequenzen von P1 bis P13, P15, und P17 bis P28, und den hierzu komplementären Sequenzen.
Polymorphismen können durch Hybridisierungsreaktionen von amplifizierten kodierenden FLAP-Sequenzen analysiert und die Häufigkeit der entsprechenden Allele quantifiziert werden. Die Amplifikationsreaktion kann wie vorab beschrieben durchgeführt werden. Die Hybridisierungssonden, welche in derartigen Reaktionen zweckmäßig verwendet werden können, umfassen bevorzugt die vorstehend definierten Sonden, welche in Bezug auf eine polymorphe Stelle, die durch einen der in der genomischen Sequenz eines FLAP-Gens lokalisierten biallelischen Marker definiert ist, hinreichend komplementär ist, um hieran zu hybridisieren, und hinreichend spezifisch ist, um zwischen dem Zielallel und einem sich durch lediglich eine Base unterscheidenden Allel unterscheiden zu können.
Die einen biallelischen Marker umfassende Ziel-DNA kann vor der Hybridisierungsreaktion amplifiziert werden. Die Gegenwart eines spezifischen Allels in der Probe wird durch Detektieren der Gegenwart oder der Abwesenheit stabiler Hybrid-Duplexe, welche zwischen der Sonde und der Ziel-DNA ausgebildet werden, bestimmt. Die Detektion von Hybrid-Duplexen kann mittels einer Vielzahl von Verfahren durchgeführt werden. Es sind verschiedene Formate von Detektionsassays wohlbekannt, welche detektierbare Markierungen verwenden, die entweder an die Zielstruktur oder an die Sonde gebunden sind, um eine Detektion der Hybrid-Duplexe zu ermöglichen. Typischerweise werden Hybridisierungs-Duplexe von nicht hybridisierten Nukleinsäuren abgetrennt, wobei die an die Duplexe gebundenen Markierungen anschließend detektiert werden. Der Fachmann erkennt, dass Waschschritte eingesetzt werden können, um überschüssige Ziel-DNA oder Sonde sowie nicht-gebundenes Konjugat hinwegzuspülen. Weiterhin sind heterogene Standardassayformate unter Verwendung der auf den Primern und Sonden vorhandenen Markierungen zur Detektion der Hybride geeignet.
Zwei vor kurzem entwickelte Assays ermöglichen eine auf Hybridisierung basierende Unterscheidung von Allelen, welche keiner Trenn- oder Waschschritte bedürfen (siehe Landegren U. et al., 1998). Der TaqMan-Assay nutzt die 5'-Nukleaseaktivität von Taq-DNA-Polymerase, um eine spezifisch an das wachsende Amplifikationsprodukt gebundene DNA-Sonde zu verdauen. TaqMan-Sonden sind mit einem Donor-Akzeptor-Farbstoffpaar markiert, welches über einen Fluoreszenzenergietransfer wechselwirkt. Die Spaltung der TaqMan-Sonde durch die voranschreitende Polymerase während der Amplifikation bewirkt eine Trennung von Donorfarbstoff und quenchendem Akzeptorfarbstoff, wodurch sich die Fluoreszenz des Donors außerordentlich erhöht. Alle zur Detektion zweier allelischer Varianten erforderlichen Reagenzien können am Beginn der Reaktion zusammengefügt werden, und die Ergebnisse werden in Echtzeit überwacht (siehe Livak et al., 1995). In einem alternativen, auf homogener Hybridisierung basierenden Verfahren werden für die Unterscheidung von Allelen molekulare Leuchtfeuer (molekulare Beacons) verwendet. Molekulare Leuchtfeuer sind Oligonukleotidsonden in Haarnadelform, welche die Gegenwart spezifischer Nukleinsäuren in homogenen Lösungen anzeigen. Wenn sie an ihre Zielstrukturen binden, vollziehen sie eine konformative Umstrukturierung, welche die Fluoreszenz eines intern gequenchten Fluorophors wiederherstellt (Tyagi et al., 1998).
5) Hybridisierung an adressierbare Oligonukleotidarrays
Ein wirksamer Zugang zu Informationen in Bezug auf Polymorphismen wird durch eine Grundstruktur, umfassend Arrays mit einer hoher Dichte an Oligonukleotidsonden, welche an ausgewählten Positionen an amen festen Träger (den Chip) gebunden sind, erhalten. Jeder DNA-Chip kann Tausende bis Millionen einzelner synthetischer DNA-Sonden enthalten, welche in einem gitterähnlichen Muster angeordnet und auf die Größe eines 10 Cent-Stückes miniaturisiert sind. Diese DNA-Chips sind ausführlich in „Oligonukleotidprimer und -sonden”, Abschnitt „Oligonukleotidarray” erläutert.
Die Chiptechnologie wurde in zahlreichen Fällen bereits mit Erfolg angewendet. So wurde beispielsweise das Durchmustern auf Mutationen im BRCA'1-Gen, in mutierten Stämmen von S. cerevisiae, und im Proteasegen des HIV-1-Virus vorgenommen (siehe Hacia et al., 1996; Shoemaker et al., 1996; Kozal et al., 1996).
Mindestens drei Unternehmen schlagen Chips vor, welche zur Detektion biallelischer Polymorphismen befähigt sind: Affymetrix (GeneChip), Hyseq (HyChip und HyGnostics) und Protogene Laboratories.
Eine der Einschränkungen, auf welche man bei der Verwendung der DNA-Chip-Technologie stößt, ist, dass die Hybridisierung von Nukleinsäuren an die in Arrays an den Chip gebundenen Sonden keine einfache Festphasenreaktion darstellt. Eine mögliche Verbesserung besteht in der Verwendung von durch hydrophobe Bereiche voneinander getrennten Gel-Pads aus Polyacrylamid, in welchen die DNA-Sonden kovalent an eine Acrylamidmatrix gebunden sind.
Zur Detektion von Polymorphismen werden Sonden, welche mindestens einen Teil eines der biallelischen Marker, wie beispielsweise der biallelischen Marker von P1 bis P28 und der hierzu komplementären Sequenzen, enthalten, entweder in situ oder mittels herkömmlicher Synthese synthetisiert und auf einem geeigneten Chip unter Verwendung von Verfahren, welche dem Fachmann bekannt sind, immobilisiert. Die feste Oberfläche des Chips besteht häufig aus Silizium oder Glas, kann jedoch auch eine polymere Membran sein. Folglich können die Chips in einigen Ausführungsformen ein Array von Nukleinsäuresequenzen oder Fragmenten hiervon mit einer Länge von mindestens 15 Nukleotiden, bevorzugt mit einer Länge von mindestens 20 Nukleotiden, und stärker bevorzugt mit einer Länge von mindestens 25 Nukleotiden, umfassen. in weiteren Ausführungsformen kann der Chip ein Array umfassen, welches mindestens eine der aus der Gruppe bestehend aus P1 bis P28, D1 bis D28, und E1 bis E28 ausgewählten Sequenzen, oder der hierzu komplementären Sequenzen, oder einem Fragment hiervon mit mindestens 15 aufeinanderfolgenden Nukleotiden, umfasst.
Die Nukleinsäureprobe, welche die zu analysierende Kandidatenregion umfasst, wird isoliert, amplifiziert und mit einer Reportergruppe markiert. Diese Reportergruppe kann eine fluoreszierende Gruppe wie beispielsweise Phycoerythrin sein. Die markierte Nukleinsäure wird anschließend mit den auf dem Chip immobilisierten Sonden unter Verwendung einer Fluidstation inkubiert. So beschreiben beispielsweise Manz et al. (1993) die Herstellung von fluidischen Vorrichtungen und insbesondere von Mikrokapillarvorrichtungen in Silizium- und Glassubstraten.
Nachdem die Reaktion beendet ist, wird der Chip in einen Scanner eingebracht, und die Hybridisierungsmuster werden detektiert. Die Hybridisierungsdaten werden als Signal, welches von den bereits in die Nukleinsäure eingebauten Reportergruppen emittiert wird, gesammelt, wobei die Nukleinsäure nunmehr an die an den Chip gebundenen Sonden gebunden ist. Sonden, welche perfekt zu einer Sequenz der Nukleinsäureprobe passen, erzeugen im Allgemeinen stärkere Signale als jene, welche Fehlpaarungen aufweisen. Da die Sequenz und die Position einer jeden auf dem Chip immobilisierten Sonde bekannt ist, kann die Identität der an eine vorgegebene Sonde hybridisierten Nukleinsäure bestimmt werden.
Für die Analyse von Einzelnukleotidpolymorphismen werden im Allgemeinen Sätze von vier Oligonukleotidsonden (einer für jeden Basentyp), bevorzugt Sätze von zwei Oligonukleotidsonden (einer für jeden Basentyp des biallelischen Markers), entworfen, welche jede Position eines Teils der in der Nukleinsäureprobe vorkommenden Kandidatenregion überspannen und sich lediglich in der Identität der polymorphen Base unterscheiden. Die relative Intensität der Hybridisierung an jede Reihe von Sonden an einer bestimmten Position ermöglicht die Identifizierung der Base, welche der polymorphen Base der Sonde entspricht. Da die Detektion biallelischer Polymorphismen die Identifizierung von Einzelbasenfehlpaarungen in der Nukleinsäureprobe umfasst, ist eine höhere Hybridisierungsstringenz erforderlich (bei niedrigerer Salzkonzentration und höherer Temperatur über kürzere Zeiträume).
Die Verwendung einer direkten Kontrolle elektrischer Felder verbessert die Bestimmung von Einzelbasenmutationen (Nanogen). Ein positives Feld erhöht die Transportrate von negativ geladenen Nukleinsäuren und führt zu einer 10-fachen Erhöhung der Hybridisierungsraten. Unter Verwendung dieser Technik werden Fehlpaarungen einzelner Basenpaare in weniger als 15 s detektiert (siehe Sosnowski et al., 1997).
5) Integrierte Systeme
Eine weitere Technik, welche zur Analyse von Polymorphismen verwendet werden kann, umfasst integrierte Multikomponentensysteme, in welchen eine Miniaturisierung und Aufteilung von Verfahren wie beispielsweise PCR- und Kapillarelektrophorese-Reaktionen in einer einzelnen funktionellen Vorrichtung erfolgt. Ein Beispiel einer derartigen Technik ist in U.S. Patent 5,589,136 offenbart, welches die Integration von PCR-Amplifikation und Kapillarelektrophorese in Chips beschreibt.
Integrierte Systeme können hauptsächlich dann vorgesehen sein, wenn mikrofluidische Systeme verwendet werden. Diese Systeme umfassen eine Struktur von Mikrokanälen, welche auf einer auf einem Mikrochip befindlichen Glas-, Silizium-; Quarz- oder Kunststoffscheibe augebildet sind. Die Bewegungen der Proben werden durch elektrische, elektroosmotische oder hydrostatische Kräfte, welche auf verschiedene Bereiche des Mikrochips angewendet werden, kontrolliert, um funktionelle mikroskopische Ventile und Pumpen ohne bewegliche Teile zu erzeugen. Durch Variation der Spannung wird eine Kontrolle des Durchflusses an Schnittpunkten der mikrogefertigten Kanäle bewirkt und die Durchflussrate in Bezug auf das Pumpen über verschiedene Bereiche des Mikrochips hinweg verändert.
Zur Genotypisierung biallelischer Marker kann in das mikrofluidische System eine Nukleinsäureamplifikation, eine Mikrosequenzierung, eine Kapillarelektrophorese, sowie ein Detektionsverfahren wie beispielsweise laserinduzierte Fluoreszenzdetektion integriert sein. In einem ersten Schritt werden die DNA-Proben amplifiziert, insbesondere mittels PCR. Anschließend werden die Amplifikationsprodukte automatisierten Mikrosequenzierungsreaktionen unter Verwendung von ddNTPs (spezifische Fluoreszenz für jedes ddNTP) und den geeigneten Oligonukleotid-Mikrosequenzierungsprimern unterzogen, welche unmittelbar stromaufwärts der polymorphen Zielbase hybridisieren. Sobald die Verlängerung am 3'-Ende beendet ist, werden die Primer von den nicht eingebauten fluoreszierenden ddNTPs mittels Kapillarelektrophorese abgetrennt. Das für die Kapillarelektrophorese verwendete Trennmedium kann beispielsweise Polyacrylamid, Polyethylenglycol oder Dextran sein. Die in den Einzelnukleotid-Primerverlägerungsprodukten eingebauten ddNTPs werden mittels Fluoreszenzdetektion identifiziert. Dieser Mikrochip kann zur parallelen Verarbeitung von mindestens 96 bis 384 Proben verwendet werden. Er kann die übliche laserinduzierte Vierfarbfluoreszenzdetektion der ddNTPs nutzen.
IX. Assoziationsstudien
Die Identifizierung von Genen, welche mit einem bestimmten Merkmal, wie beispielsweise einer Empfänglichkeit für Asthma oder einer individuellen Ansprechbarkeit auf antiasthmatische Arzneimittel, assoziiert sind, kann mittels zwei derzeit für eine genetische Kartierung verwendeten Hauptstrategien erfolgen: Kopplungsanalyse und Assoziationsstudien. Eine Kopplungsanalyse umfasst Familienstudien mit mehreren betroffenen Individuen und ist nunmehr zur Detektion von mono- oder oligogen vererbten Merkmalen von Nutzen. Umgekehrt untersuchen Assoziationsstudien die Häufigkeit von Markerallelen in nicht miteinander verwandten, merkmalspositiven (T+) Individuen im Vergleich zu Kontrollindividuen, welche per Zufall ausgewählt werden oder bevorzugt merkmalsnegative (T–)Kontrollen darstellen, und werden im Allgemeinen zur Detektion einer polygenen Vererbung eingesetzt.
Assoziationsstudien als ein Verfahren zur Kartierung genetischer Merkmale beruhen auf dem Phänomen des Kopplungsungleichgewichts. Liegen zwei genetische Loci auf dem gleichen Chromosom, so tendieren Sätze von Allelen dieser Loci auf dem gleichen chromosomalen Segment (genannt Haplotypen) dazu, als Block von Generation zu Generation übertragen zu werden. Sofern sie nicht durch Rekombination getrennt werden, können Haplotypen nicht nur über Stammbäume sondern auch über Populationen hinweg verfolgt werden. Das resultierende Phänomen auf Populationsebene ist jenes, dass das Auftreten von Paaren spezifischer Allele an verschiedenen Loci des gleichen Chromosoms nicht zufällig ist, wobei die Abweichung vom Zufallswert Kopplungsungleichgewicht (LD) genannt wird.
Ist ein spezifisches Allel in einem vorgegebenen Gen direkt an der Verursachung eines bestimmten Merkmals T beteiligt, so erhöht sich dessen Häufigkeit in einer T(+)-Population statistisch betrachtet im Vergleich zur Häufigkeit in einer T(–)-Population. Infolge der Existenz eines Kopplungsungleichgewichts erhöht sich in T(+)-Individuen im Vergleich zu T(–)-Individuen auch die Häufigkeit aller anderen Allele, welche in dem das merkmalsverursachende Allel (TCA) tragenden Haplotyp vorhanden sind. Daher ist eine Assoziation zwischen dem Merkmal und einem beliebigen Allel im Kopplungsungleichgewicht mit dem merkmalsverursachenden Allel ausreichend, um auf die Gegenwart eines mit dem Merkmal in Beziehung stehenden Gens in diesem bestimmten Bereich des Allels hinzuweisen. Das Kopplungsungleichgewicht ermöglicht es, die relativen Häufigkeiten in T(+)- und T(–)-Populationen einer begrenzten Anzahl genetischer Polymorphismen (speziell biallelischer Marker) als Alternative zum Durchmustern aller möglichen funktionellen Polymorphismen zu analysieren, um merkmalsverursachende Allele nachzuweisen.
Zwei alternative Ansätze können zur Durchführung von Assoziationsstudien eingesetzt werden: eine genomweite Assoziationsstudie sowie eine Assoziationsstudie an Kandidatengenen. Die genomweite Assoziationsstudie beruht auf dem Durchmustern genetischer Marker, welche in gleichmäßigen Abständen vorliegen und das gesamte Genom überdecken. Der Kandidatengenansatz basiert auf der Studie genetischer Marker, welche spezifisch in potentiell an einem mit dem Merkmal von Interesse in Beziehung stehenden biologischen Signalweg beteiligten Genen lokalisiert sind. Die Kandidatengenanalyse stellt in Bezug auf die Identifizierung von mit einem bestimmten Merkmal in Beziehung stehenden Genen und Genpolymorphismen eindeutig einen Ansatz mit verkürztem Weg bereit, sofern gewisse Informationen betreffend die Biologie des Merkmals verfügbar sind.
Die allgemeine Strategie zur Durchführung von Assoziationsstudien unter Verwendung von aus einem Kandidatengen stammenden biallelischen Markern ist es, zwei Gruppen von Individuen (Merkmal(+)- und Merkmal(–)-Kontrollindividuen, welche durch einen wohldefinierten Phänotyp, wie nachstehend beschrieben, gekennzeichnet sind) zu durchmustern, um die Allelhäufigkeiten derartiger biallelischer Marker in beiden Gruppen zu messen und statistisch zu vergleichen.
Wird eine statistisch signifikante Assoziation mit einem Merkmal für mindestens einen oder mehrere der analysierten biallelischen Marker identifiziert, so kann man davon ausgehen, dass: entweder das assoziierte Allel direkt für die Verursachung des Merkmals verantwortlich ist (des assoziierte Allel ist das TCA), oder dass sich das assoziierte Allel in einem Kopplungsungleichgewicht mit dem TCA befindet. Die spezifischen Eigenschaften des assoziierten Allels in Bezug auf die Funktion des Kandidatengens ermöglichen gewöhnlich einen weiteren Einblick in die Beziehung zwischen dem assoziierten Allel und dem Merkmal (kausal oder in einem Kopplungsungleichgewicht). Deuten die Anzeichen daraufhin, dass das assoziierte Allel innerhalb des Kandidatengens höchstwahrscheinlich nicht das TCA ist, sondern sich mit dem wirklichen TCA in einem Kopplungsungleichgewicht befindet, so kann das TCA durch Sequenzierung der näheren Umgebung des assoziierten Markers gefunden werden.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Identifizierung und Charakterisierung einer Assoziation zwischen Allelen eines oder mehrerer biallelischer Marker der Sequenz des FLAP-Gens und einem Merkmal bereitzustellen. Das Verfahren zur Detektion einer Assoziation zwischen einem Genotyp und einem Phänotyp umfasst die Schritte: a) Bestimmen der Häufigkeit von mindestens einem mit FLAP in Beziehung stehenden biallelischen Marker in einer Asthma-positiven Population gemäß einem Verfahren der Erfindung, b) Bestimmen der Häufigkeit von mindestens einem mit FLAP in Beziehung stehenden biallelischen Marker in einer Kontrollpopulation gemäß einem Verfahren der Erfindung, und c) Bestimmen, ob eine statistisch signifikante Assoziation zwischen dem Genotyp und dem Phänotyp besteht. Die biallelischen Marker werden aus der Gruppe bestehend aus A1 bis A28 und den Komplementen hiervon ausgewählt. Bei dem Merkmal handelt es sich entweder um Asthma, um eine vorteilhafte Ansprechbarkeit auf eine Behandlung mit gegen Asthma wirkenden Mitteln, oder um Nebenwirkungen, welche mit einer Behandlung mit gegen Asthma wirkenden Mitteln in Beziehung stehen. Gegebenenfalls können die Genotypisierungsschritte a) und b) an einer zusammengefassten biologischen Probe, welche von jeder der Populationen stammt, durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Genotypisierungsschritte a) und b) getrennt voneinander an biologischen Proben, welche von jedem Individuum der Population stammen, oder an einer Unterprobe hiervon durchgeführt. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Kontrollindividuen um merkmalsnegative oder per Zufall ausgewählte Kontrollen.
Die Erfindung umfasst ferner Verfahren zur Abschätzung der Häufigkeit eines Haplotyps für eine Reihe von biallelischen Markern in einer Kontrollpopulation oder in einer Asthma-positiven Population, umfassend die Schritte: a) Genotypisieren mindestens eines mit FLAP in Beziehung stehenden biallelischen Markers gemäß einem Verfahren der Erfindung für jedes Individuum der Population, b) Genotypisieren eines zweiten biallelischen Markers durch Bestimmen der Identität der Nukleotide an dem zweiten biallelischen Marker für beide Kopien des im Genom jedes Individuums der Population vorhandenen zweiten biallelischen Markers, und c) Anwenden eines Haplotyp-Bestimmungsverfahrens auf die Identitäten der in den Schritten a) und b) bestimmten Nukleotide, um eine Abschätzung der Häufigkeit zu erhalten. Zusätzlich werden Verfahren zur Abschätzung der Häufigkeit eines Haplotyps gemäß der Erfindung beschrieben, was Verfahren mit einer beliebigen weiteren in dieser Offenbarung beschriebenen Einschränkung, insbesondere in „Statistische Verfahren”, oder die nachfolgenden Verfahren, ob alleine oder in einer beliebigen Kombination angegeben, umfasst. Die biallelischen Marker werden aus der Gruppe bestehend aus A1 bis A28 und den Komplementen hiervon ausgewählt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Haplotyp-Bestimmungsverfahren mittels asymmetrischer PCR-Amplifikation, doppelter PCR-Amplifikation bestimmter Allele, dem Clark-Algorithmus, oder einem Erwartungswert-Maximierungs-Algorithmus durchgeführt.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ferner ein Verfahren zur Identifizierung und Charakterisierung einer Assoziation zwischen einem Haplotyp, welcher Allele mehrerer biallelischer Marker der genomischen Sequenz des FLAP-Gens umfasst, und einem Merkmal. Das Verfahren umfasst die Schritte: a) Genotypisieren einer Gruppe erfindungsgemäßer biallelischer Marker in merkmalspositiven Individuen und Kontrollindividuen, und b) Ermitteln einer statistisch signifikanten Assoziation zwischen einem Haplotyp und dem Merkmal. Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung und Charakterisierung einer Assoziation zwischen einem Haplotyp, welcher Allele mehrerer biallelischer Marker der genomischen Sequenz des FLAP-Gens umfasst, und einem Merkmal für Asthma, umfassend die Schritte: a) Abschätzen der Häufigkeit von mindestens einem Haplotyp in einer merkmalspositiven Population gemäß einem Verfahren der Erfindung, b) Abschätzen der Häufigkeit des Haplotyps in einer Kontrollpopulation gemäß einem Verfahren der Erfindung, und c) Bestimmen, ob eine statistisch signifikante Assoziation zwischen dem Haplotyp und dem Merkmal für Asthma besteht. Zusätzlich offenbaren die Verfahren zur Detektion einer Assoziation zwischen einem Haplotyp und einem Phänotyp der Erfindung Verfahren, welche eine beliebige weitere in dieser Offenbarung beschriebene Einschränkung besitzen, oder die nachfolgenden Verfahren. Die biallelischen Marker werden aus der Gruppe bestehend aus A1 bis A28 und den Komplementen hiervon ausgewählt. Gegebenenfalls handelt es sich bei dem Merkmal um eine Erkrankung, bevorzugt um eine Erkrankung, in welcher der Leukotrien-Signalweg involviert ist, um eine vorteilhafte Ansprechbarkeit auf eine Behandlung mit auf den Leukotrien-Signalweg wirkenden Mitteln, oder um Nebenwirkungen, welche mit einer Behandlung mit auf den Leukotrien-Signalweg wirkenden Mitteln in Beziehung stehen. Gegebenenfalls handelt es sich bei den Kontrollindividuen um merkmalsnegative oder per Zufall ausgewählte Kontrollen. Gegebenenfalls umfasst das Verfahren die zusätzlichen Schritte des Bestimmens des Phänotyps in den merkmalspositiven Populationen und in den Kontrollpopulationen vor Schritt c).
Sofern das Merkmal eine vorteilhafte Ansprechbarkeit oder umgekehrt eine Nebenwirkung auf die Behandlung mit einem auf den Leukotrien-Signalweg wirkenden Mittel ist, wird ein vorstehend genanntes Verfahren beschrieben, welches weiterhin einige oder alle der nachfolgenden Schritte umfasst: a) Auswählen einer Population oder eine Gruppe von Individuen, welche gemäß einer Diagnose an einer bestimmten Erkrankung leiden, in welcher der Leukotrien-Signalweg involviert ist, b) Verabreichen eines spezifischen, auf den Leukotrien-Signalweg wirkenden Mittels an die Gruppe von Individuen, c) Überwachen des Ergebnisses der Arzneimittelverabreichung und Identifizieren jener Individuen, welche in Bezug auf die Behandlung merkmalspositiv oder merkmalsnegativ sind, d) Aufnehmen von DNA-enthaltenden biologischen Proben aus der Gruppe und Untersuchen dieser DNA auf die Gegenwart eines spezifischen Allels oder Untersuchen eines Satzes von Allelen auf biallelische Marker des FLAP-Gens, e) Analysieren der Verteilung von Allelen in Bezug auf biallelische Marker zwischen merkmalspositiven und merkmalsnegativen Individuen, und f) Durchführen einer statistischen Analyse zur Bestimmung, ob eine statistisch signifikante Assoziation zwischen der Gegenwart oder Abwesenheit von Allelen biallelischer Marker des FLAP-Gens und dem mit der Behandlung in Beziehung stehenden Merkmal besteht. Gegebenenfalls werden die biallelischen Marker aus der Gruppe bestehend aus A1 bis A28 und den Komplementen hiervon ausgewählt. Der Schritt des Untersuchens und Detektierens der Gegenwart von DNA, welche spezifische Allele eines biallelischen Markers oder eine Gruppe biallelischer Marker umfasst, kann wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben durchgeführt werden.
Die Erfindung umfasst ferner Verfahren zur Bestimmung, ob ein Individuum ein Risiko zur Entwicklung von Asthma besitzt, umfassend die Schritte: a) Genotypisieren mindestens eines mit FLAP in Beziehung stehenden biallelischen Markers gemäß einem Verfahren der vorliegenden Erfindung, und b) Korrelieren des Ergebnisses von Schritt a) mit einem Risiko zur Entwicklung von Asthma, wobei der mit FLAP in Beziehung stehende biallelische Marker aus der. Gruppe bestehend aus A1 bis A28 ausgewählt ist; gegebenenfalls, wobei der mit FLAP in Beziehung stehende biallelische Marker aus der nachfolgenden Liste von biallelischen Markern ausgewählt ist: A2, A14, A16, A18, A19, A22 und A23; und gegebenenfalls, wobei der mit FLAP in Beziehung stehende biallelische Marker der biallelische Marker A19 ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung die vorstehenden erfindungsgemäßen Verfahren, wobei der mit FLAP in Beziehung stehende biallelische Marker aus der nachstehenden Liste der biallelischen Marker in den Positionen 4670, 16347, 16440, 28336, 28368, 38681 und 42445 von SEQ ID Nr. 1 ausgewählt ist, wobei die Position 28368 stärker bevorzugt ist.
1) Sammeln von DNA-Proben aus merkmalspositiven (Merkmal +) Individuen und Kontrollindividuen (Einschlusskriterien)
Auf Populationen basierende Assoziationsstudien betreffen keine familiäre Vererbung, sondern vergleichen die Prävalenz eines bestimmten genetischen Markers oder eines Satzes von Markern in Fall-Kontroll-Populationen. Sie stellen Fall-Kontroll-Studien dar, welche auf dem Vergleich von nicht miteinander verwandten Fallindividuen (betroffene oder merkmalspositive Individuen) und nicht miteinander verwandten Kontrollindividuen (nicht betroffene oder merkmalsnegative oder per Zufall ausgewählte Individuen) basieren. Bevorzugt ist die Kontrollgruppe aus nicht betroffenen oder merkmalsnegativen Individuen zusammengesetzt. Weiterhin ist die Kontrollgruppe ethnisch an die Fallpopulation angepasst. Darüber hinaus ist die Kontrollgruppe in Bezug auf den wichtigsten bekannten Konfusionsfaktor des untersuchten Merkmals bevorzugt an die Kontrollpopulation angepasst (beispielsweise altersangepasst bei einem altersabhängigen Merkmal).
Idealerweise werden Individuen in den beiden Proben auf eine Art und Weise gepaart, dass sie sich voraussichtlich lediglich in Bezug auf ihren Erkrankungsstatus unterscheiden. Nachfolgend werden „merkmalspositive Population”, „Fallpopulation” sowie „betroffene Population” untereinander austauschbar verwendet.
Um wirksame und signifikante Assoziationsstudien wie beispielsweise jene, welche hierin beschrieben werden, durchzuführen, sollte das untersuchte Merkmal bevorzugt einer bimodalen Verteilung in der untersuchten Population folgen, wobei zwei eindeutige, nicht-überlappende Phänotypen, Merkmal(+) und Merkmal(–), dargelegt werden.
Nichts desto weniger kann selbst in Abwesenheit einer derartigen bimodalen Verteilung (wie es bei komplexeren genetischen Merkmalen tatsächlich der Fall sein kann) ein beliebiges genetisches Merkmal mittels des hier vorgeschlagenen Assoziationsverfahrens nach wie vor analysiert werden, indem die Individuen, welche in den Merkmal(+)- und Merkmal(–)-phänotypischen Gruppen umfasst sein sollen, sorgfältig ausgewählt werden. Das Auswahlverfahren umfasst das Auswählen von Individuen von entgegengesetzten Enden des nicht-bimodalen Phänotypspektrums des untersuchten Merkmals, um auf diese Weise Individuen in diese Merkmal(+)und Merkmal(–)-Populationen einzubeziehen, welche eindeutig extreme, bevorzugt nicht-überlappende Phänotypen darstellen.
Die Definition der Einschlusskriterien für die Merkmal(+)- und Merkmal(–)-Populationen stellt ein wichtigen Aspekt der vorliegenden Erfindung dar.
Typische Beispiele von Einschlusskriterien umfassen Erkrankungen, in welchen der Leukotrien-Signalweg involviert ist, wie beispielsweise Asthma, oder die Evaluierung der Lebertransaminasespiegel im Anschuss an eine Behandlung mit einem antiasthmatischen Arzneimittel wie beispielsweise Zileuton. Berücksichtigt man, dass in einer vorgegebenen Population die Lebertransaminasespiegel einer Standardverteilungskurve folgen, so entsprechen Individuen mit extremen Phänotypen, von einem statistischen Standpunkt aus betrachtet, gemäß den optimalen Einschlusskriterien jeweils den Individuen mit den geringsten Lebertransaminasespiegeln und jenen mit den höchsten Lebertransaminasespiegeln.
Die Auswahl jener äußerst unterschiedlichen, jedoch relativ einheitlichen Phänotypen ermöglicht wirksame Vergleiche in Assoziationsstudien und die mögliche Detektion merklicher Unterschiede auf genetischer Ebene unter der Voraussetzung, dass die Probengrößen der untersuchten Populationen signifikant genug sind.
Im Allgemeinen bestehen Merkmal(+)- und Merkmal(–)-Populationen, welche in Assoziationsstudien wie beispielsweise jenen, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben sind, einbezogen werden sollen, aus phänotypisch homogenen Populationen von Individuen, welche 100% des entsprechenden Merkmals repräsentieren, sofern die Merkmalsverteilung bimodal ist.
Ist die Merkmalsverteilung nicht bimodal, bestehen die Merkmal(+)- und Merkmal(–)-Populationen aus phänotypisch einheitlichen Populationen von Individuen, welche zwischen 1 und 98%, bevorzugt zwischen 1 und 80%, stärker bevorzugt zwischen 1 und 50%, und am stärksten bevorzugt zwischen 4 und 35% der untersuchten Gesamtpopulation repräsentieren, und welche aus die extremen Phänotypen der Gruppe darstellenden Individuen ausgewählt sind. Je eindeutiger der Unterschied zwischen den beiden Phänotypen des Merkmals ist, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit, eine Assoziation mit biallelischen Markern zu beobachten.
Eine erste Gruppe von zwischen 50 und 300 Merkmal(+)-Individuen, bevorzugt etwa 100 Individuen, wird gemäß klinischen Einschlusskriterien rekrutiert, welche entweder auf 1) einem Befall durch (eine) Erkrankung(en), in welcher/welchen der Leukotrien-Signalweg involviert ist, bevorzugt Asthma, 2) einem Nachweis von Nebenwirkungen, welche im Anschluss an eine Verabreichung eines auf den Leukotrien-Signalweg wirkenden Mittels, bevorzugt erhöhte Lebertransaminasespiegel im Anschluss an eine Verabreichung von Zileuton, beobachtet werden, oder 3) einem Nachweis einer bestimmten Ansprechbarkeit auf eine Behandlung mit auf den Leukotrien-Signalweg wirkenden Mitteln basieren.
In einem jeden Fall wird eine ähnliche Anzahl von merkmalsnegativen Individuen in derartige Studien einbezogen. Sie werden in Bezug auf die Abwesenheit der vorstehend definierten klinischen Kriterien untersucht. Sowohl Merkmal(+)- als auch Merkmal(–)-Individuen sollten nicht miteinander verwandte Fälle darstellen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde eine Assoziationsstudie durchgeführt. Das betrachtete Merkmal war Asthma. Das Sammeln von DNA-Proben aus Merkmal(+)- und Merkmal(–)-Individuen ist in Beispiel 5 beschrieben.
2) Genotypisieren von Merkmal(+)- und Merkmal(–)-Individuen
Allelische Häufigkeiten der biallelischen Marker in jeder der vorstehend beschriebenen Populationen können unter Verwendung eines der vorstehend unter der Überschrift „Verfahren zur Genotypisierung von DNA-Proben auf biallelische Marker” beschriebenen Verfahren bestimmt werden. Die Analysen werden bevorzugt an mittels genomischer PCR erhaltenen amplifizierten Fragmenten durchgeführt, wobei die genomische PCR an DNA-Proben eines jeden Individuums unter ähnlichen Bedingungen wie jenen, welche vorstehend für die Erzeugung von biallelischen Markern beschrieben sind, durchgeführt wurden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die amplifizierten DNA-Proben automatisierten Mikrosequenzierungsreaktionen unter Verwendung von fluoreszierenden ddNTPs (spezifische Fluoreszenz für jedes ddNTP) und den geeigneten Oligonukleotid-Mikrosequenzierungsprimern unterzogen, welche unmittelbar stromaufwärts der polymorphen Base hybridisieren. Die Genotypisierung ist weiterhin in Beispiel 5 beschrieben.
3) Einzelmarker-Assoziationsstudien und Haplotyp-Häufigkeitsanalysen
Verfahren zur Bestimmung der statistischen Signifikanz einer Korrelation zwischen einem Phänotyp und einem Genotyp, in diesem Fall einem Allel an einem biallelischen Marker oder einem aus derartigen Allelen zusammengesetzter Haplotyp, kann mittels eines beliebigen im Fachbereich bekannten statistischen Tests und mit einem beliebigen anerkannten Grenzwert an erforderlicher statistischer Signifikanz bestimmt werden. Die Anwendung bestimmter Verfahren und Grenzwerte in Bezug auf die Signifikanz liegen im Bereich der Fähigkeiten des Durchschnittsfachmanns.
Untersuchungen in Bezug auf Assoziationen werden durch Bestimmen der Häufigkeit eines biallelischen Markerallels in Fall- und Kontrollpopulationen und Vergleichen dieser Häufigkeiten mit einem statistischen Test durchgeführt, um zu bestimmen, ob ein statistisch signifikanter Unterschied der Häufigkeit vorliegt, welcher auf eine Korrelation zwischen dem Merkmal und dem untersuchten biallelischen Markerallel hinweist Auf ähnliche Weise wird eine Haplotyp-Analyse durch Abschätzen der Häufigkeiten aller möglichen Haplotypen bei einem vorgegebenen Satz von biallelischen Markern in Fall- und Kontrollpopulationen und Vergleichen dieser Häufigkeiten mit einem statistischen Test durchgeführt, um zu bestimmen, ob eine statistisch signifikante Korrelation zwischen dem Haplotyp und dem untersuchten Phänotyp (Merkmal) besteht. Es kann ein beliebiges statistisches Hilfsmittel, welches für die Untersuchung einer statistisch signifikanten Assoziation zwischen einem Genotyp und einem Phänotyp von Nutzen ist, verwendet werden. Bevorzugt handelt es sich bei dem verwendeten statistischen Test um einen Chi-Quadrat-Test mit einem Freiheitsgrad. Es wird ein P-Wert berechnet (der P-Wert stellt die Wahrscheinlichkeit dar, dass eine statistische Größe, welche genauso groß oder größer als die beobachtete ist, per Zufall auftritt).
In bevorzugten Ausführungsformen ist eine Signifikanz für diagnostische Zwecke, entweder als positive Grundlage für weitere diagnostische Tests oder als vorläufiger Ausgangspunkt für eine frühzeitige Präventivtherapie, dann gegeben, wenn der P-Wert bei der Analyse eines einzelnen biallelischen Markers in Bezug auf eine Assoziation biallelischer Marker bevorzugt etwa 1 × 10^–2 oder weniger beträgt, stärker bevorzugt etwa 1 × 10^–4 oder weniger beträgt, und bei einer zwei oder mehrere Marker umfassenden Haplotypanalyse etwa 1 × 10^–3 oder weniger beträgt, noch stärker bevorzugt 1 × 10^–6 oder weniger und am stärksten bevorzugt etwa 1 × 10^–8 oder weniger beträgt. Es wird angenommen, dass diese Werte auf beliebige Assoziationsstudien anwendbar sind, welche einzelne oder mehrere Markerkombinationen umfassen.
Der Fachmann kann die vorstehend dargelegten Wertebereiche als Ausgangspunkt zur Durchführung von Assoziationsstudien mit biallelischen Markern verwenden. Durch eine derartige Vorgehensweise können signifikante Assoziationen zwischen den biallelischen Markern der vorliegenden Erfindung und einer Erkrankung, in welcher der Leukotrien-Signalweg involviert ist, aufgedeckt und für diagnostische Zwecke sowie Zwecke betreffend das Durchmustern auf Arzneimittel verwendet werden.
Um sich des Problems falsch positiver Ergebnisse anzunehmen, können mit den gleichen Fall-Kontroll-Populationen in nach dem Zufallsprinzip ausgewählten genomischen Regionen ähnliche Analysen durchgeführt werden. Die Ergebnisse der nach dem Zufallsprinzip ausgewählten Regionen und der Kandidatenregion werden, wie in einer gleichzeitig anhängigen U.S. Provisional Patentanmeldung mit dem Titel „Methods, software and apparati for identifying genomic regions harboring a gene associated with a detectable trait”, U.S. Seriennummer 60/107,986 , eingereicht am 10. November 1998, beschrieben, miteinander verglichen.
Einzelmarkerassoziation
Assoziationsstudien werden gewöhnlich in zwei aufeinanderfolgenden Schritten durchgeführt. In einer ersten Phase werden die Häufigkeiten einer verminderten Anzahl von biallelischen Markern, gewöhnlich zwischen 2 und 10 Markern, in den Merkmal(+)- und Merkmal(–)-Populationen bestimmt. In einer zweiten Phase der Analyse wird die Position der für das vorgegebene Merkmal verantwortlichen genetischen Loci unter Verwendung eines Satzes von Markern höherer Dichte weiter verfeinert. Besitzt das untersuchte Kandidatengen jedoch eine relativ geringe Länge, was im Falle des FLAP-Gens zutrifft, so wird angenommen, dass eine einzelne Phase ausreichend ist, um signifikante Assoziationen zu begründen.
In einer bevorzugten Ausführungsform, in welcher eine Korrelation zwischen einem Satz von biallelischen Markern des FLAP-Gens und Asthma nachgewiesen wurde, scheinen Ergebnisse des ersten Schrittes der Assoziationsstudie, von welcher weitere Einzelheiten in Beispiel 7 bereitgestellt sind, darauf hinzuweisen, dass Asthma am stärksten mit dem biallelischen Marker A19 (10-35/390, Allel T) assoziiert ist. Weitere Einzelheiten betreffend diese Assoziationen sind in Beispiel 7 bereitgestellt.
Ähnliche Assoziationsstudien können auch mit anderen biallelischen Markern, bevorzugt mit biallelischen Markern in einem Kopplungsungleichgewicht mit den mit Asthma assoziierten Markern, umfassend die biallelischen Marker A1 bis A28, durchgeführt werden.
Ähnliche Assoziationsstudien können routinemäßig von einem Fachmann unter Verwendung der vorstehend definierten biallelischen Marker mit unterschiedlichen Merkmal(+)- und Merkmal(–)-Populationen durchgeführt werden. Weitere geeignete Beispiele möglicher Assoziationsstudien unter Verwendung biallelischer Marker des FLAP-Gens, umfassend die biallelischen Marker A1 bis A28, umfassen Studien betreffend die nachfolgenden Populationen:

– eine Merkmal(+)-Population, welche an einer Erkrankung leidet, in welcher der Leukotrien-Signalweg involviert ist, und eine gesunde, nicht betroffene Population, oder
– eine Merkmal(+)-Population, welche mit auf den Leukotrien-Signalweg wirkenden Mitteln behandelt wurde und an aus der Behandlung resultierenden Nebenwirkungen leidet, und eine Merkmal(–)-Population, welche mit den gleichen Mitteln ohne jegliche Nebenwirkungen behandelt wurde, oder
– eine Merkmal(+)-Population, welche mit auf den Leukotrien-Signalweg wirkenden Mitteln behandelt wurde und eine vorteilhafte Ansprechbarkeit zeigt, und eine Merkmal(–)-Population, welche mit den gleichen Mitteln ohne jegliche vorteilhafte Ansprechbarkeit behandelt wurde.

Haplotyp-Häufigkeitsanalyse
Eine Haplotypanalyse ist dahingehend von Interesse, dass sie die statistische Signifikanz einer einzelne Marker umfassenden Analyse erhöht. In der Tat erhöht sie durch Kombinieren des Informationsgehalts eines Satzes von biallelischen Markern den Wert der durch die Assoziationsanalysen erhaltenen Ergebnisse, was die Eliminierung falsch positiver und/oder falsch negativer Daten, welche aus den Einzelmarkerstudien resultieren können, ermöglicht.
In einer ersten Stufe einer Haplotyp-Häufigkeitsanalyse wird die Häufigkeit der möglichen Haplotypen basierend auf verschiedenen Kombinationen der identifizierten biallelischen Marker der Erfindung bestimmt und für unterschiedliche Populationen von Merkmal(+)- und Merkmal(–)-Individuen verglichen. Die Anzahl von Merkmal(+)-Individuen, welche dieser Analyse unterzogen werden sollten, um statistisch signifikante Ergebnisse zu erhalten, liegt gewöhnlich im Bereich zwischen 30 und 300, wobei eine bevorzugte Anzahl von Individuen im Bereich zwischen 50 und 150 liegt. Die gleichen Überlegungen gelten für die Anzahl von in der Studie verwendeten nicht betroffenen Kontrollen.
Die Ergebnisse dieser ersten Analyse stellen Haplotyphäufigkeiten für die untersuchten Merkmal(+)- und Merkmal(–)-Individuen sowie den geschätzten P-Wert für jeden evaluierten Haplotyp bereit.
Bei der Assoziation der biallelischen Marker des FLAP-Gens mit Asthma zeigte sich, dass auch verschiedene Haplotypen signifikant sind (siehe 3). Die bevorzugten Haplotypen umfassen beispielsweise das Allel T des biallelischen Markers A19 (10-35/390). Der starker bevorzugte Haplotyp (HAP 1 von 3) umfasst das Allel A des Markers A14 (10-33/234) und das Allel T des Markers A19 (10-35/390). Dieser Haplotyp wird in Bezug auf eine Assoziation mit Asthma als hochsignifikant angesehen. Die anderen signifikanten Haplotypen sind ausführlich in Beispiel 8 beschrieben.
Um die statistische Signifikanz des vorstehend beschriebenen ersten Schrittes der Haplotypanalyse zu bestätigen, kann es geeignet sein, weitere Analysen durchzuführen, in welchen Genotypisierungsdaten aus Fall-Kontroll-Individuen zusammengefasst und in Bezug auf den Phänotyp des Merkmals randomisiert werden. Die Genotypisierungsdaten eines jeden Individuums werden willkürlich zwei Gruppen zugeordnet, welche die gleiche Anzahl von Individuen wie die zur Erstellung der in der ersten Stufe erhaltenen Daten verwendeten Fall-Kontroll-Populationen enthalten. Eine zweite Stufe der Haplotypanalyse wird bevorzugt mit diesen künstlichen Gruppen bevorzugt in Bezug auf die Marker, welche im Haplotyp der in der ersten Stufe erfolgten Analyse umfasst sind und den höchsten relativen Risikokoeffizienten zeigen, durchgeführt. Dieses Experiment wird bevorzugt mindestens zwischen 100 und 10000 Mal wiederholt. Die wiederholten Iterationen ermöglichen die Bestimmung der Wahrscheinlichkeit, per Zufall den untersuchten Haplotyp zu erhalten.
Für die Assoziation zwischen Asthma und den drei betrachteten Haplotypen wurde eine randomisierte Haplotypanalyse 1000 Mal oder 10000 Mal wiederholt, wobei die Ergebnisse in 4 gezeigt sind. Diese Ergebnisse belegen, dass unter 1000 Iterationen keiner und unter 10000 Iterationen lediglich 1 der erhaltenen Haplotypen einen P-Wert aufwies, welcher dem für den Haplotyp HAP1 erhaltenen Wert vergleichbar war. Diese Ergebnisse bestätigen eindeutig die statistische Signifikanz der Assoziation zwischen diesem Haplotyp und Asthma.
Die Verwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens sowie die Evaluierung der Assoziationen für einzelne Markerallele oder Haplotypen ermöglicht eine Abschätzung des Risikos, welches ein entsprechender Träger zur Entwicklung eines vorgegebenen Merkmals, und im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere einer Erkrankung, bevorzugt einer Erkrankung, in welcher der Leukotrien-Signalweg involviert ist, stärker bevorzugt Asthma, besitzt. Signifikanzgrenzwerte des relativen Risikos müssen an die verwendete Referenzprobenpopulation angepasst werden. Die Evaluierung der Risikofaktoren ist ausführlich in „Statistische Verfahren” beschrieben.
Es erschließt sich dem Fachmann, welcher in Bezug auf die Behandlung der vorstehend aufgelisteten Erkrankungen, in welchen der Leukotrien-Signalweg involviert ist, und insbesondere Asthma, über Sachkenntnisse verfügt, selbstredend, dass die vorliegende Erfindung keine absolute Identifizierung von Individuen bereitzustellen beabsichtigt, welche ein Risiko zur Entwicklung einer bestimmten Erkrankung, in welcher der Leukotrien-Signalweg involviert ist, aufweisen könnten, oder welche auf eine Behandlung mit auf den Leukotrien-Signalweg wirkenden Mitteln ansprechen oder nicht ansprechen oder Nebenwirkungen entwickeln, sondern vielmehr auf ein bestimmtes Ausmaß oder eine bestimmte Wahrscheinlichkeit zur Entwicklung einer Erkrankung oder zur Beobachtung einer Ansprechbarkeit oder einer Nebenwirkung auf eine Behandlung mit den Mitteln in einem vorgegebenen Individuum hindeutet.
Diese Information ist jedoch äußerst wertvoll, da sie unter bestimmten Umständen dazu verwendet werden kann, Präventivbehandlungen zu initiieren, oder um es einem einen signifikanten Haplotyp tragenden Individuum zu ermöglichen, Warnzeichen wie beispielsweise geringfügige Symptome vorherzusehen. in Erkrankungen wie beispielsweise Asthma, in welchen Attacken extrem heftig und gelegentlich, sofern sie nicht rechtzeitig behandelt werden, tödlich sein können, kann das Wissen in Bezug auf eine potentielle Prädisposition in äußerst signifikanter Art und Weise zur Wirksamkeit der Behandlung beitragen, selbst wenn diese Prädisposition nicht absolut ist. In ähnlicher Art und Weise kann eine diagnostizierte Prädisposition für eine potentielle Nebenwirkung den Arzt unmittelbar zu einer Behandlung führen, für welche keine derartigen Nebenwirkungen während klinischen Studien beobachtet wurden.
X. Statistische Verfahren
Im Allgemeinen kann ein beliebiges im Fachbereich bekanntes Verfahren zur Unterprüfung, ob ein Merkmal und ein Genotyp eine statistisch signifikante Korrelation zeigen, verwendet werden.
1) Verfahren zur Abschätzung der Häufigkeiten von Haplotypen in einer Population
Die gametische Phase von Haplotypen ist unbekannt, wenn die diploiden Individuuen an mehr als nur einem Locus heterozygot sind. Durch Verwendung genealogischer Informationen aus Familien kann die gametische Phase gelegentlich erschlossen werden (Perlin et al., 1994). Wenn keine genealogischen Informationen verfügbar sind, können verschiedene Strategien verwendet werden. Eine Möglichkeit ist, dass die an mehreren Stellen heterozygoten Diploide aus der Analyse eliminiert und lediglich die homozygoten und die an einer Stelle heterozygoten Individuen beibehalten werden, wobei dieser Ansatz jedoch zu einem möglichen systematischen Fehler in der Probenzusammensetzung sowie zur Unterschätzung von Haplotypen mit geringer Häufigkeit führen kann. Eine weitere Möglichkeit ist, dass einzelne Chromosomen unabhängig voneinander untersucht werden können, beispielsweise durch asymmetrische PCR-Amplifikation (siehe Newton et al., 1989; Wu et al., 1989) oder durch Isolierung eines einzelnen Chromosoms mittels Grenzverdünnung gefolgt von PCR-Amplifikation (siehe Ruano et al., 1990). Weiterhin kann eine Probe auch in Bezug auf hinreichend nahe verwandte biallelische Marker mittels doppelter PCR-Amplifikation von spezifischen Allelen haplotypisiert werden (Sarkar G. und Sommer S. S., 1991). Diese Ansätze sind entweder aufgrund ihrer technischen Komplexität, der zusätzlichen Kosten, welche sie nach sich ziehen, ihres Mangels zur Verallgemeinerung im Großmaßstab, oder aufgrund möglicher systematischer Fehler, welche durch sie eingeführt werden, nicht vollkommen zufriedenstellend. Um diese Schwierigkeiten zu überwinden, kann ein von Clark A. G. (1990) eingeführter Algorithmus verwendet werden, aus welchem sich die Phase von PCR-amplifizierten DNA-Genotypen erschließen lässt. Kurz gesagt besteht das Prinzip darin, eine vorläufige Liste von in der Probe vorhandenen Haplotypen durch Untersuchung eindeutiger Individuen, d. h. vollständig homozygoten und an einer Stelle heterozygoten Individuen, zu füllen. Anschließend werden andere Individuen der gleichen Probe in Bezug auf ein mögliches Auftreten von vorab identifizierten Haplotypen durchmustert. Bei jeder positiven Identifizierung wird der komplementäre Haplotyp zur Liste der identifizierten Haplotypen hinzugefügt, bis die Phaseninformation für alle Individuen entweder gelöst ist oder als ungelöst identifiziert wird. Dieses Verfahren ordnet einem jeden multiheterozygoten Individuum einen einzelnen Haplotyp zu, wobei verschiedene Haplotypen möglich sind, wenn mehr als eine heterozygote Stelle vorhanden ist. Alternativ können Verfahren zur Abschätzung der Haplotyphäufigkeiten in einer Population verwendet werden, ohne einem jeden Individuum Haplotypen zuzuordnen. Bevorzugt wird ein Verfahren verwendet, welches auf einem Erwartungswert-Maximierungs (EM)-Algorithmus basiert (Dempster et al., 1977), was unter der Annahme von Hardy-Weinberg-Proportionen (Zufallspaarung) zu Maximum-Likelihood-Schätzungen der Haplotyphäufigkeiten führt (siehe Excoffier L. und Slatkin M., 1995). Der EM-Algorithmus stellt einen verallgemeinerten iterativen Maximum-Likelihood-Ansatz zur Abschätzung dar, welcher von Nutzen ist, wenn die Daten nicht eindeutig und/oder unvollständig sind. Der EM-Algorithmus wird dazu verwendet, heterozygote Individuen in Haplotypen zu unterteilen. Der EM-Algorithmus kann beispielsweise unter Verwendung des EM-HAPLO-Programms (Hawley M. E. et al., 1994) oder des Arlequin-Programms (Schneider et al., 1997) angewendet werden. Ein beliebiges andere im Fachbereich bekannte Verfahren zur Bestimmung oder zur Abschätzung der Häufigkeit eines Haplotyps in einer Population kann verwendet werden (siehe Lange K., 1997; Weir B. S., 1996). Der EM-Algorithmus wird nachstehend kurz beschrieben.
Eine Probe von N nicht miteinander verwandten Individuen wird in Bezug auf K Marker typisiert. Die beobachteten Daten stellen die Phänotypen unbekannter Phase am Locus K dar, welche in elf unterschiedliche Phänotypen eingestuft werden können. Es gilt die Annahme, dass H mögliche Haplotypen zugrunde liegen (im Falle von K biallelischen Markern ist H = 2^K).
Für den Phänotyp j gilt die Annahme, dass c_j Genotypen möglich sind. Somit ergibt sich die nachfolgende Gleichung
wobei P_j die Wahrscheinlichkeit des Phänotyps j ist, und h_k und h_l die beiden den Genotyp i konstituierenden Haplotypen sind. Im Hardy-Weinberg-Gleichgewicht ergibt sich für pr(h_k, h_l): pr(h_k, h_l) = pr(h_k)² wenn h_k = h_l, pr(h_k, h_l) = 2 pr(h_k).pr(h_l) wenn h_k ≠ h_l. Gleichung 2
Die aufeinanderfolgenden Schritte des EM-Algorithmus können wie folgt beschrieben werden:
Ausgehend von Anfangswerten der als p₁ ⁽⁰⁾, p₂ ⁽⁰⁾, ...p_H ⁽⁰⁾ notierten Haplotyphäufigkeiten dienen diese Anfangswerte zur Abschätzung der Genotyphäufigkeiten (Erwartungswertschritt) und anschließend zur Abschätzung eines weiteren, als p₁ ⁽¹⁾, p₂ ⁽¹⁾, ... p_H ⁽¹⁾ notierten Satzes von Haplotyphäufigkeiten (Maximierungsschritt), wobei diese beiden Schritte einer Iteration unterzogen werden, bis die Veränderungen in den Sätzen von Haplotyphäufigkeiten sehr gering sind.
Ein Abbruchkriterium kann sein, dass die maximale Differenz zwischen den Haplotyphäufigkeiten zwischen zwei Iterationen weniger als 10^–7 beträgt. Diese Werte können gemäß der gewünschten Präzision der Schätzungen angepasst werden.
Bei einer vorgegebenen Iteration s besteht der Erwartungswertschritt in der Berechnung der Genotyphäufigkeiten mittels der nachfolgenden Gleichung:
wobei der Genotyp i im Phänotyp j auftritt, und wobei h_k und h_l den Genotyp i konstituieren. Eine jede Wahrscheinlichkeit wird gemäß den vorstehend beschriebenen Gleichungen 1 und 2 abgeleitet.
Anschließend schätzt der Maximierungsschritt einfach einen weiteren Satz von Haplotyphäufigkeiten, welche durch die Genotyphäufigkeiten vorgegeben sind. Dieser Ansatz ist auch als Genzählverfahren bekannt (Smith, 1957).
wobei δ_it eine Indikatorvariable ist, welche die Anzahl der Male des Haplotyps t im Genotyp i zählt. Sie nimmt die Werte von 0, 1 oder 2 an.
Um sicherzustellen, dass die letztlich erhaltene Schätzung die Maximum-Likelihood-Schätzung ist, werden verschiedene Ausgangswerte benötigt. Die erhaltenen Schätzungen werden verglichen und im Falle von Unterschieden jene Schätzungen beibehalten, welche zur höchsten Wahrscheinlichkeit führen.
2) Verfahren zur Berechnung des Kopplungsungleichgewichts zwischen Markern
Eine Reihe von Verfahren kann dazu verwendet werden, das Kopplungsungleichgewicht zwischen zwei beliebigen genetischen Positionen zu berechnen, wobei das Kopplungsungleichgewicht in der Praxis durch Anwenden eines statistischen Assoziationstests auf die aus einer Population entnommenen Haplotypdaten gemessen wird.
Das Kopplungsungleichgewicht zwischen einem beliebigen Paar von biallelischen Markern, umfassend mindestens einen der biallelischen Marker der vorliegenden Erfindung (M_i, M_j) mit Allelen (a_i/b_i) am Marker M_i und den Allelen (a_j/b_j) am Marker M_j, kann für eine jede Allelkombination (a_i, a_j; a_i, b_j; b_i, a_j und b_i, b_j) gemäß der Piazza-Formel berechnet werden: Δ_aiaj = √θ4 – √(θ4 + θ3)(θ4 + θ2), wobei:

θ4 = ––: = Häufigkeit von Genotypen, welche kein Allel a_i an M_i und kein Allel a_j an M_j aufweisen
θ3 = –+: = Häufigkeit von Genotypen, welche kein Allel a_i an M_i und ein Allel a_j an M_j aufweisen
θ2= +–: = Häufigkeit von Genotypen, welche ein Allel a_i an M_i und kein Allel a_j an M_j aufweisen.

Das Kopplungsungleichgewicht (LD) zwischen Paaren von biallelischen Markern (M_i, M_j) kann ferner für jede Allelkombination (a_i, a_j; a_i, b_j; b_i, a_j und b_i, b_j) gemäß der Maximum-Likelihood-Schätzung (MLE) für Delta (den zusammengesetzten genotypischen Ungleichgewichtskoeffizienten), wie von Weir (Weir B. S., 1996) beschrieben, berechnet werden. Die MLE für das zusammengefasste Kopplungsungleichgewicht beträgt: D_aiaj = (2n₁ + n₂ + n₃ + n₄/2)/N – 2(pr(a_i).pr(a_j)) wobei n₁ = ΣPhänotyp(a_i/a_i, a_j/a_j), n₂ = ΣPhänotyp (a_i/a_i, a_j/b_j), n₃ = ΣPhänotyp(a_i/b_i, a_j/a_j), n₄ = ΣPhänotyp(a_i/b_i, a_j/b_j), und N die Anzahl von Individuen in der Probe ist.
Diese Formel ermöglicht eine Abschätzung des Kopplungsungleichgewichts zwischen Allelen, wenn lediglich Genotypdaten und keine Haplotypdaten verfügbar sind.
Ein weiteres Mittel zur Berechnung des Kopplungsungleichgewichts zwischen Markern ist das Folgende. Für ein Paar biallelischer Marker M_i(a_i/b_i) und M_j(a_j/b_j), welche das Hardy-Weinberg-Gleichgewicht erfüllen, können die vier möglichen Haplotyphäufigkeiten in einer vorgegebenen Population gemäß dem vorstehend beschriebenen Ansatz abgeschätzt werden.
Die Abschätzung des gametischen Ungleichgewichts zwischen a_i und a_j ist schlicht: D_aiaj = pr(Haplotyp(a_i, a_j)) – pr(a_i).pr(a_j) wobei pr(a_i) die Wahrscheinlichkeit des Allels a_i und pr(a_j) die Wahrscheinlichkeit des Allels a_j ist, und wobei pr(Haplotyp(a_i, a_j)) wie in der vorstehenden Gleichung 3 abgeschätzt wird.
Für ein Paar von biallelischen Markern ist lediglich eine Messung des Ungleichgewichts erforderlich, um die Assoziation zwischen M_i und M_j zu beschreiben.
Anschließend wird ein normalisierter Wert des obigen Wertes wie folgt berechnet: D_aiaj = D_aiaj/max(–pr(a_i), pr(a_j), –pr(b_i), pr(b_j)) mit D_aiaj < 0 D_aiaj = D_aiaj/max(pr(b_i), pr(a_j), pr(a_i), pr(b_j)) mit D_aiaj > 0
Der Fachmann ist sich dessen bewusst, dass andere Berechnungsverfahren zur Bestimmung des Kopplungsungleichgewichts verwendet werden können.
Das Kopplungsungleichgewicht in einem Satz biallelischer Marker mit einer angemessenen Heterozygositätsrate kann durch Genotypisieren von zwischen 50 und 1000, bevorzugt zwischen 75 und 200, stärker bevorzugt ungefähr 100 nicht miteinander verwandten Individuen bestimmt werden.
3) Evaluierung von Risikofaktoren
Die Assoziation zwischen einem Risikofaktor (in der genetischen Epidemiologie stellt der Risikofaktor die Gegenwart oder die Abwesenheit eines bestimmten Allels oder Haplotyps an Markerloci dar) und einer Erkrankung wird mittels der Odds-Ratio (OR) und des relativen Risikos (RR) gemessen. Wenn P(P⁺) die Wahrscheinlichkeit zur Entwicklung der Erkrankung für Individuen mit R und P(R^–) die Wahrscheinlichkeit für Individuen ohne den Risikofaktor darstellt, so ist das relative Risiko schlicht das Verhältnis der beiden Wahrscheinlichkeiten, das heißt: RR = P(R⁺)/P(R^–).
In Fall-Kontroll-Studien können direkte Messungen des relativen Risikos aufgrund der Ausgestaltung der Probennahme nicht erhalten werden. Die Odds-Ratio ermöglicht jedoch eine gute Annäherung des relativen Risikos für Erkrankungen mit einem geringen Auftreten und kann berechnet werden: OR = (F⁺/(1 – F⁺))/(F^–/(1 – F^–)).
F⁺ stellt die Häufigkeit der Exposition gegenüber dem Risikofaktor in Fällen dar, und F^– stellt die Häufigkeit der Exposition gegenüber dem Risikofaktor in Kontrollen dar. F⁺ und F^– werden unter Verwendung der Allel- oder Haplotyphäufigkeiten der Studie berechnet und weisen weiterhin eine Abhängigkeit vom zugrunde liegenden genetischen Modell (dominant, rezessiv, additiv, ...) auf.
Es kann weiterhin das attributable Risiko (AR) abgeschätzt werden, welches den Anteil von Individuen in einer Population beschreibt, die aufgrund eines vorgegebenen Risikofaktors ein Merkmal aufweisen. Diese Messung ist zur Quantifizierung der Rolle eines spezifischen Faktors in der Erkrankungsätiologie sowie hinsichtlich der Bedeutung eines Risikofaktors für die öffentliche Gesundheit von Wichtigkeit. Die Relevanz dieser Messung für die öffentliche Gesundheit liegt in der Abschätzung des Anteils an Erkrankungsfällen in der Population, welche. vermieden werden können, wenn die Exposition von Interesse abwesend ist. AR wird wie folgt bestimmt: AR = P_E(RR – 1)/(P_E(RR – 1) + 1)
Ar stellt das Risiko dar, welches einem biallelischen Markerallel oder einem biallelischen Markerhaplotyp zurechenbar ist. P_E stellt die Häufigkeit der Exposition gegenüber einem Allel oder einem Haplotypen innerhalb der Population als Ganzes dar, und RR stellt das relative Risiko dar, welches mittels der Odds-Ratio angenähert wird, wenn das untersuchte Merkmal ein relativ geringes Auftreten in der allgemeinen Population besitzt.
XI. Identifizierung von biallelischen Markern, welche sich mit den biallelischen Markern der vorliegenden Erfindung in einem Kopplungsungleichgewicht befinden
Sobald ein erster biallelischer Marker in einer genomischen Region von Interesse identifiziert worden ist, kann ein Durchschnittsfachmann unter Verwendung der Lehren der vorliegenden Erfindung auf einfache Art und Weise zusätzliche biallelische Marker in einem Kopplungsungleichgewicht mit diesem ersten Marker identifizieren. Wie zuvor erwähnt wurde, ist ein beliebiger Marker, welcher sich in einem Kopplungsungleichgewicht mit einem ersten, mit einem Merkmal assoziierten Marker befindet, mit dem Merkmal assoziiert. Daher ist, sobald eine Assoziation zwischen einem vorgegebenen biallelischen Marker und einem Merkmal dargelegt wurde, die Entdeckung zusätzlicher mit diesem Merkmal assoziierter biallelischer Marker von großem Interesse, um die Dichte von biallelischen Markern in dieser bestimmten Region zu erhöhen. Das ursächliche Gen oder die ursächliche Mutation befindet sich in der Nähe des Markers oder des Satzes von Markern, welcher die höchste Korrelation mit dem Merkmal zeigt.
Es wird ein Verfahren zur Identifizierung und Charakterisierung eines biallelischen Markers offenbart, welcher sich im Kopplungsungleichgewicht mit einem biallelischen Marker eines FLAP-Gens, bevorzugt mit einem biallelischen Marker eines FLAP-Gens, von dem ein Allel mit einem Merkmal assoziiert ist, befindet. In einer Ausführungsform ist der biallelische Marker, welcher sich in einem Kopplungsungleichgewicht mit einem biallelischen Marker des FLAP-Gens befindet, innerhalb der das FLAP-Gen beherbergenden Region, jedoch außerhalb des FLAP-Gens selbst lokalisiert. In einer anderen Ausführungsform ist der biallelische Marker, welcher sich in einem Kopplungsungleichgewicht mit einem biallelischen Marker des FLAP-Gens befindet, selbst innerhalb des FLAP-Gens lokalisiert. Das Verfahren umfasst die nachfolgenden Schritte: a) Amplifizieren eines genomischen Fragments, umfassend einen ersten biallelischen Marker aus einer Vielzahl von Individuen, b) Identifizieren zweiter biallelischer Marker in der den ersten biallelischen Marker beherbergenden genomischen Region, c) Ausführen einer Kopplungsungleichgewichtsanalyse zwischen dem ersten biallelischen Marker und den zweiten biallelischen Markern, und d) Auswählen der zweiten biallelischen Marker, welche sich mit dem ersten Marker in einem Kopplungsungleichgewicht befinden.
In einer Ausführungsform umfasst der Schritt des Sequenzierens und Identifizierens zweiter biallelischer Marker das Sequenzieren zweiter biallelischer Marker innerhalb des FLAP-Gens. In einer weiteren Ausführungsform umfasst der Schritt des Sequenzierens und Identifizierens zweiter biallelischer Marker das Sequenzieren zweiter biallelischer Marker innerhalb der amplifizierten Region des FLAP-Gens.
Sobald sie identifiziert worden sind, können die Sequenzen, welche sich in einem Kopplungsungleichgewicht mit einem biallelischen Marker des FLAP-Gens befinden, in einem beliebigen der hierin beschriebenen Verfahren verwendet werden, umfassend Verfahren zur Bestimmung einer Assoziation zwischen einem biallelischen Marker und einem Merkmal, Verfahren zur Identifizierung von Individuen mit einer Prädisposition für ein Merkmal, Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen, Verfahren zur Identifizierung von Individuen, welche voraussichtlich positiv oder negativ auf eine Arzneimittelbehandlung ansprechen, sowie Verfahren zur Verwendung von Arzneimitteln. Insbesondere können biallelische Marker, welche sich in einem Kopplungsungleichgewicht mit einem biallelischen Marker des FLAP-Gens befinden, zur Identifizierung von Individuen verwendet werden, welche eine Prädisposition für Asthma oder für eine positive oder negative Ansprechbarkeit auf eine Behandlung mit antiasthmatischen Arzneimitteln wie beispielsweise Zileuton besitzen.
Verfahren zur Identifizierung von biallelischen Markern sowie zur Durchführung einer Kopplungsungleichgewichtsanalyse sind hierin in „Statistische Verfahren” beschrieben und können von einem Fachmann ohne unangemessenes Experimentieren durchgeführt werden. Es werden biallelische Marker offenbart, welche sich in einem Kopplungsungleichgewicht mit den spezifischen biallelischen Markern A1 bis A28 befinden und von welchen angenommen wird, dass sie im Hinblick auf ihre jeweilige Assoziation mit einem vorgegebenen Merkmal ähnliche Eigenschaften zeigen.
XII. Identifizierung von merkmalsverursachenden Mutationen im FLAP-Gen
Mutationen im FLAP-Gen, welche für einen detektierbaren Phänotyp verantwortlich sind, können durch einen Vergleich der Sequenzen der FLAP-Gene aus merkmalspositiven und merkmalsnegativen Individuen identifiziert werden. Bevorzugt tragen zu sequenzierende Merkmal(+)-Individuen den Haplotyp, für welchen eine Assoziation mit dem Merkmal gezeigt wurde, und zu sequenzierende Merkmal(–)-Individuen tragen den mit dem Merkmal assoziierten Haplotyp nicht. Der detektierbare Phänotyp kann eine Vielzahl von Manifestationen an veränderten FLAP-Funktionen umfassen, umfassend eine Erkrankung, in welcher der Leukotrien-Signalweg involviert ist, eine Ansprechbarkeit auf ein auf den Leukotrien-Signalweg wirkendes Mittel, oder Nebenwirkungen, welche mit einer Behandlung mit diesem Mittel verbunden sind. Die Mutationen können Punktmutationen, Deletionen oder Insertionen im FLAP-Gen umfassen. Die Mutationen können innerhalb der für das FLAP-Protein kodierenden Sequenz oder innerhalb regulatorischer Regionen des FLAP-Gens liegen.
Das zur Detektion derartiger Mutationen allgemein verwendete Verfahren umfasst die nachfolgenden Schritte: a) Amplifizieren einer Region des FLAP-Gens, welche einen mit dem Merkmal assozierten biallelischen Marker oder eine mit dem Merkmal assoziierte Gruppe von biallelischen Markern umfasst, aus DNA-Proben von merkmalspositiven Patienten und merkmalsnegativen Kontrollen, b) Sequenzieren der amplifizierten Region, c) Vergleichen von DNA-Sequenzen aus merkmalspositiven Patienten und merkmalsnegativen Kontrollen, und d) Bestimmen von Mutationen, welche für merkmalspositive Patienten spezifisch sind.
Oligonukleotidprimer werden wie vorab beschrieben konstruiert, um die Sequenzen eines jeden Exons, Introns, oder der Promotorregion des FLAP-Gens zu amplifizieren.
Jedes Primerpaar wird zur Amplifikation des Exons oder der Promotorregion verwendet, aus welchem/welcher es stammt. Die Amplifikation wird an genomischen DNA-Proben aus merkmalspositiven Patienten und merkmalsnegativen Kontrollen, bevorzugt unter Verwendung der in den Beispielen beschriebenen PCR-Bedingungen, durchgeführt. Die Amplifikationsprodukte aus den genomischen PCRs werden anschließend einer Sequenzierung, bevorzugt durch automatisierte Didesoxyterminator-Sequenzierungsreaktionen und Elektrophorese, bevorzugt auf ABI 377-Sequenzierern, unterzogen. Im Anschluss an eine Gel-Image-Analyse und eine Extraktion der DNA-Sequenz werden die ABI-Sequenzdaten automatisch analysiert, um die Gegenwart von Sequenzvariationen zwischen merkmalspositiven und merkmalsnegativen Individuen zu detektieren. Die Sequenzen werden durch Bestimmung der Sequenzen beider DNA-Stränge für ein jedes Individuum überprüft.
Kandidatenpolymorphismen, von welchen angenommen wird, dass sie für den detektierbaren Phänotyp, wie beispielsweise eine Erkrankung, eine vorteilhafte Ansprechbarkeit auf ein auf den Leukotrien-Signalweg wirkendes Mittel, oder Nebenwirkungen, welche mit einer Behandlung mit diesem Mittel verbunden sind, verantwortlich sind, werden anschließend durch Durchmustern einer größeren Population merkmalspositiver und merkmalsnegativer Individuen unter Verwendung von Analysetechniken für Polymorphismen, wie beispielsweise den vorstehend beschriebenen Techniken, überprüft. Polymorphismen, welche eine statistisch signifikante Korrelation mit dem detektierbaren Phänotyp aufweisen, werden als für den detektierbaren Phänotyp verantwortlich angesehen.
Die meisten der im Rahmen der vorliegenden Erfindung beobachteten biallelischen Polymorphismen des FLAP-Gens scheinen die Aminosäuresequenz des FLAP-Proteins nicht drastisch zu modifizieren. Auch scheinen sie nicht in Spleißsequenzen lokalisiert zu sein. Sie können jedoch mit Veränderungen der Grundexpression von FLAP in einem oder mehreren Gewebe(n) assoziiert sein. Derartige Polymorphismen können letztlich die Transkriptionsrate von FLAP-DNA, die Stabilität der FLAP-mRNA, oder die Translationsrate der FLAP-mRNA modifizieren.
Die biallelischen Polymorphismen können durch Expressionsmodifikatoren ferner mit Veränderungen in der Modulation der FLAP-Expression assoziiert sein. Der Ausdruck „Expressionsmodifikator” soll chemische Mittel umfassen, welche die Wirkung von FLAP durch eine Modulation der Expression des FLAP-Gens modulieren.
Die Grundexpressionsspiegel von FLAP in unterschiedlichen Geweben können durch Analysen von Gewebeproben aus Individuen, welche in Bezug auf die Gegenwart oder Abwesenheit eines spezifischen Polymorphismus typisiert wurden, bestimmt werden. Es kann ein beliebiges zweckmäßiges Verfahren, wie beispielsweise ELISA und RIA für eine Proteinquantifizierung und wie beispielsweise Nothern-Blot oder andere Hybridisierungsanalysen sowie quantitative RT-PCR für eine mRNA-Quantifizierung, verwendet werden. Die gewebespezifische Expression kann anschließend mit dem Genotyp korreliert werden. Weitere Einzelheiten betreffend einige dieser Verfahren sind nachstehend unter der Überschrift „Durchmustern von Mitteln” bereitgestellt.
Weiterhin bestätigt die zum ersten Mal zwischen dem FLAP-Gen und Asthma beobachtete starke Assoziation das Bedürfnis, eine beliebige Mutation des FLAP-Gens zu lokalisieren und zu untersuchen, da eine derartige Mutation dafür empfänglich ist, eine Inzidenz in Bezug auf den Leukotrienmetabolismus und damit auf die therapeutischen Auswahlmöglichkeiten zu besitzen, wenn verschiedene Behandlungsalternativen für ein Individuum in einem bestimmten Zustand, in welchem der Leukotrien-Signalweg involviert ist, in Betracht gezogen werden.
Es gibt zahlreiche Möglichkeiten für kausale Mutationen innerhalb des FLAP-Gens. Eine der kausalen Mutationen kann eine Aminosäureveränderung im FLAP-Protein sein, welche zu Veränderungen in der Substratspezifität und/oder -aktivität von FLAP führen kann. Verfahren zur Analyse von Protein-Protein- oder Protein-Ligand-Wechselwirkungen sind unter der Überschrift „Durchmustern von Mitteln” nachstehend ausführlich beschrieben.
Eine weitere mögliche kausale Mutation des FLAP-Gens ist eine Modifikation in seiner regulatorischen Region, und insbesondere in der Sequenz seines nativen Promotors. Diese Art von Mutation kann durch Bestimmen der Grundexpressionsspiegel mit Hilfe von Expressionsassays für die spezielle Promotorsequenz untersucht werden. Die Assays können mit der kodierenden FLAP-Sequenz oder mit einer detektierbaren Markersequenz durchgeführt werden. Um eine Gewebespezifität zu bestimmen, wird der Assay in Zeilen aus unterschiedlichen Quellen durchgeführt. Einige Verfahren werden nachstehend unter der Überschrift „Durchmustern von Mitteln” ausführlicher behandelt.
Wenn er hierin verwendet wird, soll der Begriff „Grundexpressionsspiegel” die FLAP-Expressionsspiegel bezeichnen, welche normalerweise in Individuen beobachtet werden, die das assoziierte Allel von biallelischen Markern der vorliegenden Erfindung nicht tragen.
In einer weiteren Ausführungsform kann das einen detektierbaren Phänotyp verursachende mutierte FLAP-Allel dadurch isoliert werden, dass eine Nukleinsäureprobe, wie beispielsweise eine genomische Bibliothek oder eine cDNA-Bibliothek, aus einem den detektierbaren Phänotyp exprimierenden Individuum erhalten wird. Die Nukleinsäureprobe kann mit einer oder mehreren Sonde(n), welche in der Region des FLAP-Gens liegt/liegen, in der sich der assoziierte biallelische Marker oder die Gruppe von biallelischen Markern befinden, oder mit PCR-typisierbaren Primern, welche für die Amplifikation dieses biallelischen Markers oder dieser Gruppe von biallelischen Markern spezifisch sind, in Kontakt gebracht werden. Die Mutation kann durch Ausführen von Sequenzierungsreaktionen an den Nukleinsäuren identifiziert werden, welche an die hierin definierten Sonden hybridisieren oder welche eine Amplifikation mittels PCR zeigen. Die Region des FLAP-Gens, welche die für den detektierbaren Phänotyp verantwortliche Mutation enthält, kann für diagnostische Techniken wie beispielsweise jene, welche nachstehend beschrieben sind, verwendet werden. So kann/können beispielsweise die Mikrosequenzierung von Oligonukleotiden, oder Oligonukleotide, welche die für den detektierbaren Phänotyp verantwortliche Mutation für eine Amplifikation enthalten, oder auf Hybridisierung basierende diagnostische Mittel, wie beispielsweise die hierin beschriebenen, zur Detektion von an dem detektierbaren Phänotyp leidenden Individuen oder zur Detektion von Individuen verwendet werden, welche ein Risiko zur Entwicklung des detektierbaren Phänotyps zu einem späteren Zeitpunkt besitzen. Zusätzlich kann das für den detektierbaren Phänotyp verantwortliche FLAP-Allel in der Gentechnik verwendet werden. Das für den detektierbaren Phänotyp verantwortliche FLAP-Allel kann ferner in einen Expressionsvektor kloniert werden, um das hierin beschriebene mutierte FLAP-Protein zu exprimieren.
XIII. Bialleische Marker in genetischen Diagnoseverfahren
Die in der Erfindung offenbarten biallelischen Marker können ferner zur Entwicklung von diagnostischen Tests verwendet werden, welche eine Identifizierung von Individuen, die ein detektierbares Merkmal als Ergebnis eines spezifischen Genotyps exprimieren, oder von Individuen, deren Genotyp sie einem Risiko zur Entwicklung eines detektierbaren Merkmals zu einem späteren Zeitpunkt aussetzt, ermöglichen. Das unter Verwendung der vorliegenden Diagnostik analysierte Merkmal ist Asthma, eine vorteilhafte Ansprechbarkeit auf eine Behandlung mit gegen Asthma wirkenden Mitteln, oder Nebenwirkungen, welche mit einer Behandlung mit gegen Asthma wirkenden Mitteln in Beziehung stehen.
Die diagnostischen Techniken können zur Bestimmung, ob ein Testindividuum ein mit einem erhöhten Risiko zur Entwicklung eines detektierbaren Merkmals assoziiertes biallelisches Markermuster aufweist, oder ob das Individuum als Ergebnis einer bestimmten Mutation an einem detektierbaren Merkmal leidet, eine Vielzahl von Methoden einsetzen, umfassend Verfahren, welche die Analyse einzelner Chromosomen in Bezug auf eine Haplotypisierung ermöglichen, wie beispielsweise Familienstudien, eine Einzelspermien-DNA-Analyse oder somatische Hybride.
Die vorliegende Erfindung offenbart diagnostische Verfahren zur Bestimmung, ob ein Individuum ein Risiko zur Entwicklung einer Erkrankung besitzt oder an einer aus einer Mutation oder einem Polymorphismus im FLAP-Gen resultierenden Erkrankung leidet. Die vorliegende Erfindung offenbart ferner Verfahren zur Bestimmung, ob ein Individuum voraussichtlich positiv auf ein auf gegen Asthma wirkendes Mittel anspricht, oder ob ein Individuum ein Risiko zur Entwicklung einer Nebenwirkung auf ein gegen Asthma wirkendes Mittel besitzt.
Diese Verfahren umfassen das Erlangen einer Nukleinsäureprobe aus dem Individuum und das Bestimmen, ob die Nukleinsäureprobe mindestens ein Allel oder mindestens einen Haplotyp eines biallelischen Markers enthält, welches/welcher auf ein Risiko zur Entwicklung des Merkmals hindeutet, oder welches/welcher darauf hindeutet, dass das Individuum das Merkmal als Ergebnis des Vorliegens eines bestimmten FLAP-Polymorphismus oder einer bestimmten FLAP-Mutation exprimiert (merkmalsverursachendes Allel).
Bevorzugt wird eine Nukleinsäureprobe in derartigen diagnostischen Verfahren aus dem Individuum erlangt, wobei diese Probe unter Verwendung der vorstehend in VIII beschriebenen Verfahren genotypisiert wird. Die Diagnostik kann auf einem einzelnen biallelischen Marker oder auf einer Gruppe von biallelischen Markern basieren.
In einem jeden dieser Verfahren wird eine Nukleinsäureprobe aus dem Testindividuum erhalten, und das Muster der biallelischen Marker von einem oder mehreren der biallelischen Marker A1 bis A28, oder den Komplementen hiervon bestimmt.
In einer Ausführungsform wird an der Nukleinsäureprobe eine PCR-Amplifikation durchgeführt, um Regionen zu amplifizieren, in welchen mit einem detektierbaren Phänotyp assoziierte Polymorphismen identifizirt wurden. Die Amplifikationsprodukte werden zur Bestimmung, ob das Individuum einen oder mehrere mit einem detektierbaren Phänotyp assoziierte FLAP-Polymorphismen aufweist, sequenziert. Die zur Erzeugung der Amplifikationsprodukte verwendeten Primer können die Primer B1 bis B17 und C1 bis C17 umfassen. Alternativ wird die Nukleinsäureprobe wie vorstehend beschrieben Mikrosequenzierungsreaktionen zur Bestimmung, ob das Individuum einen oder mehrere mit einem detektierbaren Phänotyp assoziierte FLAP-Polymorphismen aufweist, welche aus einer Mutation oder einem Polymorphismus im FLAP-Gen resultieren, unterzogen. Die in den Mikrosequenzierungsreaktionen verwendeten Primer können die Primer die D1 bis D28 und E1 bis E28 umfassen. In einer anderen Ausführungsform wird die Nukleinsäureprobe mit einer oder mehreren allelspezifischen Oligonukleotidsonden in Kontakt gebracht, welche spezifisch an ein oder mehrere mit einem detektierbaren Phänotyp assoziierte FLAP-Allele hybridisieren. Die im Hybridisierungsassay verwendeten Sonden können die Sonden P1 bis P28, eine hierzu komplementäre Sequenz, oder ein die polymorphe Base umfassendes Fragment hiervon umfassen. In einer anderen Ausführungsform wird die Nukleinsäureprobe mit einem zweiten FLAP-Oligonukleotid in Kontakt gebracht, welches zur Herstellung eines Amplifikationsproduktes befähigt ist, wenn es mit dem allelspezifischen Oligonukleotid in einer Amplifikationsreaktion verwendet wird. Die Gegenwart eines Amplifikationsproduktes in der Amplifikationsreaktion deutet darauf hin, dass das individuum ein oder mehrere mit einem detektierbaren Phänotyp assoziierte FLAP-Allele aufweist.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Identität des an mindestens einem biallelischen Marker, welcher aus der Gruppe bestehend aus A2, A14, A16, A18, A19, A22 und A23, und den Komplementen hiervon ausgewählt ist, vorliegenden Nukleotids bestimmt, wobei das detektierbare Merkmal Asthma ist. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die Identität des an mindestens einer der polymorphen Stellen, welche aus der Gruppe bestehend aus A14 und A19, und den Komplementen hiervon ausgewählt sind, vorliegenden Nukleotids bestimmt. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird die Identität des an der polymorphen Stelle A19 und den Komplementen hiervon vorliegenden Nukleotids bestimmt. Diagnostische Kits, welche Polynukleotide der vorliegenden Erfindung umfassen, werden in der vorliegenden Erfindung weiterhin beschrieben.
Diese diagnostischen Verfahren sind von äußerst wertvoll, da sie unter bestimmten Umständen dazu verwendet werden können, Präventivbehandlungen zu initiieren, oder um es einem einen signifikanten Haplotyp tragenden Individuum zu ermöglichen, Warnzeichen wie beispielsweise geringfügige Symptome vorherzusehen. In Erkrankungen wie beispielsweise Asthma, in welchen Attacken äußerst heftig und gelegentlich, sofern sie nicht rechtzeitig behandelt werden, tödlich sein können, kann das Wissen in Bezug auf eine potentielle Prädisposition auf äußerst signifikante Art und Weise zur Wirksamkeit der Behandlung beitragen, selbst wenn diese Prädisposition nicht absolut ist.
Die vorliegende Erfindung offenbart ferner diagnostische Kits, umfassend ein oder mehrere Polynukleotide der Erfindung mit einem Teil oder allen erforderlichen Reagenzien und Anweisungen zur Genotypisierung eines Testindividuums durch Bestimmen der Identität eines Nukleotids bei einem mit Asthma assoziierten, mit FLAP in Beziehung stehenden biallelischen Marker. Die Polynukleotide eines Kits können gegebenenfalls an einen festen Träger gebunden sein, oder sie können Teil eines Arrays oder eines adressierbaren Arrays von Polynukleotiden sein. Das Kit kann zur Bestimmung der Identität des Nukleotids an einer Markerposition ein beliebiges im Fachbereich bekanntes Verfahren bereitstellen, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, ein Sequenzierungsassayverfahren, ein Mikrosequenzierungsassayverfahren, ein Hybridisierungsassayverfahren, oder ein an auf Polymerasen und/oder Ligasen basierenden Basenfehlpaarungs-Detektionsassay. Die diagnostischen Kits können zur Durchführung eines beliebigen der in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Genotypisierungsverfahren unter Verwendung von im Fachbereich üblichen Herstellungs- und Formulierungsverfahren hergestellt werden. Bevorzugt kann ein derartiger Kit die Bestimmung des Allels eines biallelischen Markers, welcher aus mit Asthma assoziierten, mit FLAP in Beziehung stehenden biallelischen Markern ausgewählt ist, vorsehen. Gegebenenfalls kann ein derartiger Kit Anweisungen zur Aufzeichnung der Ergebnisse der Bestimmung im Hinblick auf das Risiko des Testindividuums, Asthma, eine vorteilhafte Ansprechbarkeit auf eine Behandlung mit gegen Asthma wirkenden Mitteln, oder Nebenwirkungen, welche mit einer Behandlung mit gegen Asthma wirkenden Mitteln in Beziehung stehen, zu erfahren, umfassen.
XIV. Behandlung von Erkrankungen, in welchen der Leukotrien-Signalweg involviert ist
Die Erfindung offenbart ferner ein Verfahren zur Bestimmung, ob ein Individuum voraussichtlich positiv auf die Behandlung mit einem Medikament, welches direkt oder indirekt gegen Asthma wirkt, anspricht.
Das Verfahren umfasst das Identifizieren einer ersten Population von Individuen, welche positiv auf das Medikament ansprechen, und einer zweiten Population von Individuen, welche negativ auf das Medikament ansprechen. Es wird/werden ein oder mehrere biallelische(r) Marker in der ersten Population identifiziert, welche(r) mit einer positiven Ansprechbarkeit auf das Medikament assoziiert ist/sind, oder es wird/werden ein oder mehrere biallelische(r) Marker in der zweiten Population identifiziert, welche(r) mit einer negativen Ansprechbarkeit auf das Medikament assoziiert ist/sind. Die biallelischen Marker können unter Verwendung der hierin beschriebenen Techniken identifiziert werden.
Die DNA-Probe wird anschließend aus dem untersuchten Individuum erhalten. Die DNA-Probe wird zur Bestimmung, ob sie ein oder mehrere Allele von biallelischen Markern, welche mit einer positiven Ansprechbarkeit auf ein Medikament assoziiert sind, oder ein oder mehrere Allele von biallelischen Markern, welche mit einer negativen Ansprechbarkeit auf eine Behandlung mit dem Medikament assoziiert sind, umfasst, analysiert. in einigen Ausführungsformen wird die DNA-Probe zur Identifizierung von Individuen analysiert, deren DNA ein oder mehrere Allele von biallelischen Markern, welche mit einer positiven Ansprechbarkeit auf das Medikament assoziiert sind, umfasst, und deren DNA ein oder mehrere Allele von biallelischen Markern, welche mit einer negativen Ansprechbarkeit auf die Behandlung mit dem Medikament assoziiert sind, fehlt.
In anderen Ausführungsformen wird das Medikament dem Individuum in einem klinischen Versuch verabreicht, sofern die DNA-Probe ein oder mehrere Allele von biallelischen Markern, welche mit einer positiven Ansprechbarkeit auf das Medikament assoziiert sind, enthält und/oder wenn der DNA-Probe ein oder mehrere Allele von biallelischen Markern, welche mit einer negativen Ansprechbarkeit auf die Behandlung mit dem Medikament assoziiert sind, fehlen. In bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei dem Medikament um ein antiasthmatisches Arzneimittel wie beispielsweise Zileuton. In anderen Ausführungsformen umfasst die negative Ansprechbarkeit eine oder mehrere Nebenwirkungen, wie beispielsweise erhöhte Lebertransaminasespiegel. Durch Verwendung der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verfahren kann die Evaluierung der Arzneimittelwirksamkeit in einer Population von Individuen vorgenommen werden, welche voraussichtlich vorteilhaft auf das Medikament anspricht.
Die Erfindung offenbart ferner ein Verfahren zur klinischen Testung eines Medikaments, welches direkt oder indirekt gegen Asthma wirkt. Das Verfahren umfasst die nachfolgenden Schritte: a) Verabreichen eines Medikaments, welches direkt oder indirekt gegen Asthma wirken kann, an eine heterogene Population von Individuen, b) Identifizieren einer ersten Population von Individuen, welche positiv auf das Medikament ansprechen, und einer zweiten Population von Individuen, welche negativ auf das Medikament ansprechen, c) Identifizieren von biallelischen Markern in der ersten Population, welche mit einer positiven Ansprechbarkeit auf das Medikament assoziiert sind, und/oder von biallelischen Markern in der zweiten Population, welche mit einer negativen Ansprechbarkeit auf das Medikament assoziiert sind, d) Auswählen von Individuen, deren DNA ein oder mehrere Allele von biallelischen Markern umfasst, welche mit einer positiven Ansprechbarkeit auf das Medikament assoziiert sind, und/oder deren DNA ein oder mehrere Allele von biallelischen Markern, welche mit einer negativen Ansprechbarkeit auf das Medikament assoziiert sind, fehlt/fehlen, und d) Verabreichen des Medikaments an die Individuen.
Derartige Verfahren werden als äußerst nützlich angesehen, um das aus der Verabreichung von Medikamenten, welche unerwünschte Nebenwirkungen verursachen können und/oder bei einem Teil der Patientenpopulation, an die es normalerweise verabreicht wird, unwirksam ist, resultierende Nutzen/Risiko-Verhältnis zu erhöhen.
Sobald diagnostiziert wird, dass ein Individuum an Asthma leidet, werden Auswahltests durchgeführt, um zu bestimmen, ob die DNA dieses Individuums Allele eines biallelischen Markers oder einer Gruppe von biallelischen Markern umfasst, welche mit einer positiven Ansprechbarkeit auf die Behandlung oder mit einer negativen Ansprechbarkeit auf die Behandlung, was entweder Nebenwirkungen oder eine fehlende Ansprechbarkeit umfassen kann, assoziiert sind.
Die Auswahl des zu behandelnden Patienten unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung kann mittels der vorstehend beschriebenen Detektionsverfahren durchgeführt werden. Die auszuwählenden Individuen sind bevorzugt jene, deren DNA keine Allele eines biallelischen Markers oder einer Gruppe von biallelischen Markern umfasst, welche mit einer negativen Ansprechbarkeit auf die Behandlung assoziiert sind.
Sobald die genetischen Prädispositionen des Patienten bestimmt worden sind, kann der Arzt eine geeignete Behandlung auswählen, für welche über die bei dem Patienten beobachtete spezielle Nebenwirkung keine Berichte vorliegen oder lediglich am Rande berichtet wurde, und kann bevorzugt aus einer allelischen Assoziation auswählen, welche nicht den gleichen biallelischen Marker oder die gleichen biallelischen Marker wie jene, welche in der DNA des Patienten vorkommen, umfasst. Verschiedene Arzneimittel, welche zur Behandlung von Erkrankungen, in welcher der Leukotrien-Signalweg involviert ist, von Nutzen sind, können ausgewählt werden. Auf den Leukotrien-Signalweg wirkende Verbindungen sind beispielsweise in den U.S. Patenten 4,873,259 , 4,970,215 , 5,310,744 , 5,225,421 und 5,081,138 , oder in EP 0 419 049 beschrieben.
XV. FLAP-Proteine und -Polypeptidfragmente
Der Begriff „FLAP-Polypeptide”, wie er hierin verwendet wird, umfasst alle in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Proteine und Polypeptide. Es werden ferner Polypeptide beschrieben, welche durch die Polynukleotide der Erfindung kodiert werden, sowie Fusionspolypeptide, welche derartige Polypeptide umfassen. Die Erfindung offenbart FLAP-Proteine aus Menschen, umfassend isolierte oder gereinigte FLAP-Proteine, welche aus der Sequenz von SEQ ID Nr. 3 bestehen, im Wesentlichen bestehen oder diese umfassen, und ein Isoleucin an Position 127 in SEQ ID Nr. 3 umfassen. Es sollte beachtet werden, dass die FLAP-Proteine der Erfindung auf der natürlich vorkommenden Variante der Aminosäuresequenz von menschlichem FLAP basieren, wobei der Valinrest an Aminosäureposition 127 in SEQ ID Nr. 3 durch einen Isoleucinrest ersetzt wurde. Diese Proteinvariante und die Fragmente hiervon, welche Aminosäureposition 127 von SEQ ID Nr. 3 enthalten, werden hierin kollektiv als „127-Ile-Varianten” oder „127-Ile-FLAP-Polypeptide” bezeichnet.
Die vorliegende Erfindung verkörpert isolierte, gereinigte und rekombinante Polypeptide, welche einen Bereich von mindestens 6 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, bevorzugt von mindestens 8 bis 10 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, stärker bevorzugt von mindestens 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 oder 100 aufeinanderfolgenden Aminosäuren von SEQ ID Nr. 3 umfassen, wobei der aufeinanderfolgende Bereich einen Isoleucinrest an Aminosäureposition 127 in SEQ ID Nr. 3 umfasst. In anderen bevorzugten Ausführungsformen umfasst der aufeinanderfolgende Bereich von Aminosäuren die Stelle einer Mutation oder einer funktionellen Mutation, umfassend eine Deletion, eine Addition, einen Austausch oder eine Verkürzung der Aminosäuren in der FLAP-Proteinsequenz.
FLAP-Proteine werden bevorzugt aus menschlichen Gewebeproben oder Gewebeproben von Säugern isoliert, oder aus menschlichen Genen oder Säugergenen exprimiert. Die FLAP-Polypeptide der Erfindung können unter Verwendung von im Fachbereich bekannten routinemäßigen Expressionsverfahren hergestellt werden. Das das gewünschte Polypeptid kodierende Polynukleotid wird in einen Expressionsvektor ligiert, welcher für einen beliebigen zweckmäßigen Wirt geeignet ist. Sowohl eukaryotische als auch prokaryotische Wirtsysteme werden zur Bildung von rekombinanten Polypeptiden verwendet, sowie eine Zusammenfassung einiger der üblicheren Systeme. Das Polypeptid wird anschließend aus lysierten Zellen oder aus dem Kulturmedium isoliert, und in dem für seine beabsichtigte Verwendung erforderlichen Ausmaß gereinigt. Die Reinigung erfolgt durch eine beliebige im Fachbereich bekannte Technik, wie beispielsweise differentielle Extraktion, Salzfraktionierung, Chromatographie, Zentrifugation, und dergleichen. Im Hinblick auf eine Vielzahl von Verfahren zur Reinigung von Proteinen siehe beispielsweise „Methods in Enzymology”.
Zusätzlich werden kürzere Proteinfragmente mittels chemischer Synthese hergestellt. Alternativ werden die Proteine der Erfindung aus Zellen oder Geweben von Menschen oder nicht-menschlichen Tieren extrahiert.
Verfahren zur Reinigung von Proteinen sind im Fachbereich bekannt, und umfassen die Verwendung von Detergentien oder chaotropen Mitteln zur Spaltung von Partikeln, gefolgt von einer differentiellen Extraktion und einer Trennung der Polypeptide mittels Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, Sedimentation entsprechend der Dichte, sowie Gelelektrophorese.
Eine beliebige, SEQ ID Nr. 2 umfassende FLAP-cDNA wird zur Expression der FLAP-Proteine und -Polypeptide verwendet. Die bevorzugte FLAP-cDNA umfasst das Allel A des biallelischen Markers A21. Die Nukleinsäure, welche für das zu exprimierende FLAP-Protein oder -Polypeptid kodiert, ist unter Verwendung herkömmlicher Klonierungstechnologie in einem Expressionsvektor operativ mit einem Promotor verknüpft. Das FLAP-Insert im Expressionsvektor kann die vollständige kodierende Sequenz für das FLAP-Protein oder für einen Anteil hiervon umfassen. Beispielsweise kann das von FLAP abgeleitete Insert für ein Polypeptid kodieren, welches mindestens 10 aufeinanderfolgende Aminosäuren des FLAP-Proteins von SEQ ID Nr. 3 umfasst, wobei in den aufeinanderfolgenden Aminosäuren ein Isoleucinrest an Aminosäureposition 127 umfasst ist.
Der Expressionsvektor ist ein beliebiges im Fachbereich bekanntes Säuger-, Hefe-, Insekten- oder Bakterienexpressionssystem. Kommerziell erhältliche Vektoren und Expressionssysteme sind von einer Vielzahl von Anbietern, umfassend Genetics Institute (Cambridge, MA), Stratagene (La Jolla, Kalifornien), Promega (Madison, Wisconsin) und Invitrogen (San Diego, Kalifornien), erhältlich. Um die Expression zu erhöhen und eine ordnungsgemäße Proteinfaltung zu erleichtern, wird der Codonkontext und die Codonpaarung der Sequenz, sofern gewünscht, für den speziellen Expressionsorganismus, in welchen der Expressionsvektor eingebracht wird, optimiert, wie von Hatfield et al., U.S. Patent Nr. 5,082,767 erläutert.
In einer Ausführungsform ist die gesamte kodierende Sequenz der FLAP-cDNA im Expressionsvektor durch das Poly A-Signal der cDNA mit einem Promotor operativ verknüpft. Alternativ kann, wenn der für einen Teil des FLAP-Proteins kodierenden Nukleinsäure ein als Initiationsstelle dienendes Methionin fehlt, ein initiierendes Methionin neben dem ersten Codon der Nukleinsäure unter Verwendung herkömmlicher Techniken eingebracht werden. In ähnlicher Weise kann, wenn dem Insert aus der FLAP-cDNA ein Poly A-Signal fehlt, diese Sequenz dem Konstrukt beispielsweise durch Herausspleißen des Poly A-Signals aus pSG5 (Stratagene) unter Verwendung von Bgl I- und Sal I-Restriktionsendonukleaseenzymen und Einbringen desselben in den Säugerexpressionsvektor pXT 1 (Stratagene) hinzugefügt werden. pXT 1 enthält die LTRs und einen Teil des gag-Gens aus dem murinen Moloney-Leukämievirus. Die Position der LTRs in dem Konstrukt ermöglicht eine wirksame stabile Transfektion. Der Vektor umfasst den Thymidinkinasepromotor von Herpes Simplex sowie das Selektionsgen für Neomycin. Die für des FLAP-Protein oder einen Teil hiervon kodierende Nukleinsäure wird mittels PCR aus einem bakteriellen Vektor, welcher die FLAP-cDNA von SEQ ID Nr. 3 und Restriktionsendonukleasesequenzen für Pst I, das in den 5'-Primer eingebaut ist, und Bgl II am 5'-Ende des entsprechenden cDNA-3'-Primers enthält, unter Verwendung von Oligonukleotidprimern, welche zur FLAP-cDNA oder einem Teil hiervon komplementär sind, erhalten, wobei darauf zu achten ist, dass die für das FLAP-Protein oder einen Teil hiervon kodierende Sequenz in Bezug auf das Poly A-Signal korrekt positioniert ist. Das aus der resultierenden PCR-Reaktion erhaltene gereinigte Fragment wird mit Pst I verdaut, mit einer Exonuklease an den Enden abgestumpft, mit Bgl II verdaut, gereinigt und an pXT 1 ligiert, welches nunmehr ein Poly A-Signal enthält, und mit Bgl II verdaut.
Das ligierte Produkt wird unter Verwendung von Lipofectin (Life Technologies, Inc., Grand Island, New York) unter Bedingungen, welche in der Produktspezifikation kurz dargestellt sind, in NIH 3T3-Mauszellen transfiziert. Positive Transfektanten werden nach Anzüchten der transfizierten Zellen in 600 μg/ml G418 (Sigma, St. Louis, Missouri) ausgewählt.
Alternativ werden die für das FLAP-Protein oder einen Teil hiervon kodierenden Nukleinsäuren in pED6dpc2 (Genetics Institute, Cambridge, MA) kloniert. Die resultierenden pED6dpc2-Konstrukte werden in eine geeignete Wirtszelle, wie beispielsweise COS 1-Zellen, transfiziert. Methotrexat-resistente Zellen werden ausgewählt und expandiert.
Die obigen Verfahren können ferner dazu verwendet werden, ein für einen detektierbaren Phänotyp verantwortliches mutiertes FLAP-Protein oder einen Teil hiervon zu exprimieren.
Die exprimierten Proteine werden unter Verwendung herkömmlicher Reinigungstechniken, wie beispielsweise Ammoniumsulfat-Präzipitation oder einer auf Größe oder Ladung basierenden chromatographischen Trennung, gereinigt. Das durch das Nukleinsäureinsert kodierte Protein kann auch unter Verwendung von immunochromatographischen Standardtechniken gereinigt werden. In derartigen Verfahren wird eine das exprimierte FLAP-Protein oder einen Teil hiervon enthaltende Lösung, wie beispielsweise ein Zellextrakt, auf eine Säule aufgebracht, in welcher Antikörper gegen das FLAP-Protein oder den Teil hiervon an die Chromatographiematrix gebunden sind. Man lässt das exprimierte Protein an die immunochromatographische Säule binden. Anschließend wird die Säule gespült, um unspezifisch gebundene Proteine zu entfernen. Das spezifisch gebundene exprimierte Protein wird anschließend aus der Säule freigesetzt und unter Verwendung von Standardtechniken gewonnen.
Um die Expression des FLAP-Proteins oder eines Teils hiervon zu bestätigen, können die aus Wirtszellen, welche einen Expressionsvektor enthalten, der ein für das FLAP-Protein oder einen Teil hiervon kodierendes Insert enthält, exprimierten Proteine mit den exprimierten Proteinen aus Wirtszellen verglichen werden, welche den Expressionsvektor ohne ein Insert enthalten. Die Gegenwart einer Bande in Proben aus Zellen, welche den Expressionsvektor mit einem Insert enthalten, die in Proben aus Zellen, welche den Expressionsvektor ohne ein Insert enthalten, nicht vorhanden ist, deutet darauf hin, dass das FLAP-Protein oder ein Teil hiervon exprimiert wird. Im Allgemeinen besitzt die Bande die für das FLAP-Protein oder den Teil hiervon erwartete Mobilität. Die Bande kann jedoch eine Mobilität aufweisen, welche sich als Ergebnis von Modifikationen, wie beispielsweise einer Glycosylierung, einer Ubiquitinierung oder einer enzymatischen Spaltung, von der erwarteten Mobilität unterscheidet.
Antikörper, welche zu einer spezifischen Erkennung des exprimierten FLAP-Proteins oder einen Teils hiervon befähig sind, werden nachstehend beschrieben.
Ist eine Antikörperherstellung nicht möglich, werden die für das FLAP-Protein oder einen Teil hiervon kodierenden Nukleinsäuren in Expressionsvektoren eingebaut, welche für eine Verwendung in Reinigungsschemata unter Einsatz von chimären Polypeptiden konzipiert sind. In derartigen Strategien wird die für das FLAP-Protein oder einen Teil hiervon kodierende Nukleinsäure mit dem für die andere Hälfte der Chimäre kodierenden Gen in einen Leserahmen insertiert. Die andere Hälfte der Chimäre ist eine für β-Globin oder eine für ein an Nickel bindendes Polypeptid kodierende Sequenz. Eine Chromatographiematrix mit einem daran gebundenen Antikörper gegen β-Globin oder Nickel wird anschließend zur Reinigung des chimären Proteins verwendet. Proteasespaltungsstellen werden zwischen dem β-Globin-Gen oder dem an Nickel bindenden Polypeptid und dem FLAP-Protein oder einem Teil hiervon eingebaut. Somit sind die beiden Polypeptide der Chimäre durch Proteaseverdau voneinander getrennt.
Ein nützlicher Expressionsvektor zur Erzeugung von β-Globin-Chimären ist pSG5 (Stratagene), welcher für β-Globin aus Kaninchen kodiert. Intron II des β-Globin-Gens aus Kaninchen erleichtert das Spleißen des exprimierten Transkripts, wobei das in das Konstrukt eingebaute Polyadenylierungssignal den Expressionsspiegel erhöht. Diese Techniken sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie wohlbekannt. Standardverfahren sind in Verfahrenstexten wie beispielsweise Davis et al. (1986) publiziert, und viele der Verfahren sind von Stratagene, Life Technologies, Inc., oder von Promega verfügbar. Polypeptide können aus dem Konstrukt zusätzlich unter Verwendung von in vitro-Translationssystemen, wie beispielsweise dem in vitro Express^TM-Translationskit (Stratagene), hergestellt werden.
Antikörper, welche an FLAP-Polypeptide der Erfindung binden
Ein beliebiges FLAP-Polypeptid oder Gesamtprotein kann zur Erzeugung von Antikörpern verwendet werden, welche wie beschrieben zu einer spezifischen Bindung an ein exprimiertes FLAP-Protein oder Fragmente hiervon befähigt ist. Die Antikörperzusammensetzungen sind zu einer spezifischen Bindung befähigt oder binden spezifisch an die 127-Ile-Variante des FLAP-Proteins. Damit eine Antikörperzusammensetzung spezifisch an die 127-Ile-Variante von FLAP bindet, muss sie in einem ELISA, RIA, oder einem anderen Antikörper-basierten Bindungsassay eine mindestens 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50% oder 100% höhere Bindungsaffinität für die Volllängen-127-Ile-Variante von FLAP zeigen als für die Volllängen-127-Val-Variante von FLAP.
Die Erfindung umfasst eine isolierte oder gereinigte Antikörperzusammensetzung, welche zu einer selektiven Bindung an ein Epitop-enthaltendes Fragment eines Polypeptids, umfassend einen Bereich von mindestens 6 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, bevorzugt von mindestens 8 bis 10 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, stärker bevorzugt von mindestens 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 oder 100 aufeinanderfolgenden Aminosäuren von SEQ ID Nr. 3, befähigt ist, wobei das Epitop einen Isoleucinrest an Aminosäureposition 127 von SEQ ID Nr. 3 umfasst und wobei die Antikörperzusammensetzung gegebenenfalls entweder polyklonal oder monoklonal ist.
Die vorliegende Erfindung offenbart ferner die Verwendung von Polypeptiden, welche einen Bereich von mindestens 6 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, bevorzugt von mindestens 8 bis 10 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, stärker bevorzugt von mindestens 12, 15, 20, 25, 50 oder 100 aufeinanderfolgenden Aminosäuren eines FLAP-Polypeptids umfassen, zur Herstellung von Antikörpern, wobei der aufeinanderfolgende Bereich einen Isoleucinrest an Aminosäureposition 127 von SEQ ID Nr. 3 umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform sind derartige Polypeptide zur Herstellung von Antikörpern von Nutzen, um die Gegenwart oder Abwesenheit der 127-Ile-Variante zu detektieren.
Nicht-menschliche Tiere oder Säuger, ob vom Wildtyp oder transgen, welche eine andere Spezies von FLAP exprimieren als jene, an welche eine Bindung des Antikörpers gewünscht ist, sowie Tiere, welche FLAP nicht exprimieren (d. h. ein FLAP-Knockout-Tier, wie es hierin beschrieben ist), sind zur Herstellung von Antikörpern von besonderen Nutzen. FLAP-Knockout-Tiere erkennen alle oder die meisten der exponierten Regionen von FLAP als Fremdantigene, und produzieren daher Antikörper mit einer breiteren Auswahl an FLAP-Epitopen. Darüber hinaus können kleinere Polypeptide mit lediglich 10 bis 30 Aminosäuren von Nutzen sein, um eine spezifische Bindung an die 127-Ile-Variante zu erhalten. Zusätzlich erkennt das humorale Immunsystem von Tieren, welche eine der antigenen Sequenz ähnelnde Spezies von FLAP produzieren, bevorzugt die Unterschiede zwischen der nativen FLAP-Spezies des Tieres und der Antigensequenz und produziert Antikörper gegen diese einzigartigen Stellen in der Antigensequenz. Eine derartige Technik ist insbesondere von Nutzen, um spezifisch an die 127-Ile-Variante bindende Antikörper zu erhalten.
XVI. Rekombinante Vektoren, Wirtszellen und transgene Tiere
Rekombinante Vektoren
Der Begriff „Vektor” wird hierin zur Bezeichnung entweder eines ringförmigen oder eines linearen DNA- oder RNA-Moleküls verwendet, welches entweder doppelsträngig oder einzelsträngig ist, und welches mindestens ein Polynukleotid von Interesse umfasst, für welches ein Bestreben besteht, es in eine Wirtszelle oder in einen einzelligen oder mehrzelligen Wirtsorganismus zu überführen.
Die vorliegende Erfindung umfasst rekombinante Vektoren, welche ein Polynukleotid gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen. Die Erfindung offenbart einen rekombinanten Vektor, welcher entweder ein in der Nukleinsäure von SEQ ID Nr. 1 umfasstes regulatorisches Polynukleotid oder ein die kodierende FLAP-Sequenz umfassendes Polynukleotid, oder beide, umfasst.
Im Allgemeinen kann ein rekombinanter Vektor ein beliebiges der hierin beschriebenen Polynukleotide, umfassend regulatorische Sequenzen und kodierende Sequenzen, sowie einen beliebigen vorstehend definierten FLAP-Primer oder eine beliebige vorstehend definierte FLAP-Sonde.
In einer ersten bevorzugten Ausführungsform wird der rekombinante Vektor zur Amplifikation des insertierten Polynukleotids, welches aus einer genomischen FLAP-Sequenz von SEQ ID Nr. 1 oder aus einer FLAP-cDNA, beispielsweise der cDNA von SEQ ID Nr. 2, stammt, in einer geeignete Wirtszelle verwendet, wobei dieses Polynukleotid jedes Mal amplifiziert wird, wenn sich der rekombinante Vektor repliziert.
Eine zweite bevorzugte Ausführungsform der rekombinanten Vektoren besteht aus Expressionsvektoren, welche entweder ein regulatorisches Polynukleotid oder eine kodierende Nukleinsäure der Erfindung, oder beide, umfassen. in bestimmten Ausführungsformen werden die Expressionsvektoren zur Expression des FLAP-Polypeptids eingesetzt, welches anschließend gereinigt und beispielsweise in Assays zum Durchmustern von Liganden oder als Immunogen verwendet werden kann, um die gegen das FLAP-Protein gerichteten spezifischen Antikörper anzusprechen. In anderen Ausführungsformen werden die Expressionsvektoren zur Konstruktion von transgenen Tieren sowie ferner für die Gentherapie verwendet. Die Expression erfordert, dass geeignete Signale in den Vektoren bereitgestellt werden, wobei die Signale verschiedene regulatorische Elemente, wie beispielsweise Enhancer/Promotoren sowohl aus viralen Quellen als auch aus Säugerquellen umfassen, welche die Expression der Gene von Interesse in den Wirtszellen steuern. Dominante Arzneimittelselektionsmarker zur Etablierung dauerhafter, stabiler, die Produkte exprimierender Zellklone sind im Allgemeinen von den Expressionsvektoren der Erfindung umfasst, da sie Elemente darstellen, welche die Expression des Arzneimittelselektionsmarkers mit der Expression des Polypeptids verknüpfen.
Insbesondere offenbart die vorliegende Erfindung Expressionsvektoren, welche Nukleinsäuren umfassen, die für ein FLAP-Protein, bevorzugt für das FLAP-Protein der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 3, stärker bevorzugt für das einen Isoleucinrest an Position 127 tragende FLAP-Protein der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 3 oder Varianten oder Fragmente hiervon kodieren, unter Kontrolle einer regulatorischen Sequenz, welche aus den regulatorischen Polynukleotiden von FLAP ausgewählt ist, oder alternativ unter Kontrolle einer exogenen regulatorischen Sequenz.
Folglich werden bevorzugte Expressionsvektoren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) die hierin umfasste regulatorische FLAP-Sequenz steuert die Expression eines kodierenden Polynukleotids, welches operativ mit dieser verknüpft ist, b) die kodierende FLAP-Sequenz ist operativ mit regualtorischen Sequenzen verknüpft, welche ihre Expression in einer geeigneten Wirtszelle und/oder einem geeigneten Wirtsorganismus ermöglichen.
Rekombinante Vektoren, welche eine einen mit FLAP in Beziehung stehenden biallelischen Marker enthaltende Nukleinsäure umfassen, werden ebenfalls beschrieben. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der biallelische Marker aus der Gruppe bestehend aus A1 bis A28, und den Komplementen hievon ausgewählt. Gegebenenfalls wird der biallelische Marker aus der Gruppe bestehend aus A1 bis A13, A15, A17 bis A28, und den Komplementen hievon ausgewählt.
Einige der Elemente, welche in den Vektoren der vorliegenden Erfindung vorkommen können, werden ausführlicher in den nachfolgenden Abschnitten beschrieben.
1. Allgemeine Merkmale der Expressionsvektoren der Erfindung
Ein rekombinanter Vektor umfasst, ist jedoch nicht beschränkt auf, ein YAC (künstliches Hefechromosom), ein BAC (künstliches Bakterienchromosom), einen Phagen, ein Phagemid, ein Cosmid, ein Plasmid, oder sogar ein lineares DNA-Molekül, welches aus chromosomaler, nicht-chromosomaler, semisynthetischer und synthetischer DNA bestehen kann. Ein derartiger rekombinanter Vektor kann eine Transkriptionseinheit umfassen, umfassend eine Anordnung von:

(1) einem genetischen Element oder genetischen Elementen, welche eine regulatorische Funktion in der Genexpression besitzen, beispielsweise Promotoren oder Enhancer. Enhancer stellen cis-wirkende Elemente von DNA mit einer Länge von gewöhnlich etwa 10 bis 300 bp dar, welche zur Erhöhung der Transkription auf den Promotor wirken.
(2) einer strukturellen oder kodierenden Sequenz, welche in mRNA transkribiert und letztlich in ein Polypeptid translatiert wird, wobei die strukturelle oder kodierende Sequenz mit den in (1) beschriebenen regulatorischen Elementen operativ verknüpft ist, und
(3) geeigneten Transkriptionsinitiator- und Transkriptionsterminatorsequenzen. Strukturelle Einheiten, welche für eine Verwendung in Hefe oder in eukaryotischen Expressionssystemen vorgesehen sind, umfassen bevorzugt eine Leadersequenz, welche die extrazelluläre Sekretion von translatiertem Protein durch eine Wirtszelle ermöglicht. Alternativ kann ein rekombinantes Protein, wenn es ohne eine Leader- oder Transportsequenz exprimiert wird, einen N-terminalen Rest umfassen. Dieser Rest kann von dem exprimierten rekombinanten Protein anschließend abgespalten werden oder kann von diesem anschließend nicht abgespalten werden, um ein Endprodukt bereitzustellen.

Im Allgemeinen umfassen rekombinante Expressionsvektoren Replikationsursprünge, Selektionsmarker, welche eine Transformation der Wirtszelle ermöglichen, sowie einen aus einem in hohem Maße exprimierten Gen stammenden Promotor zur Steuerung der direkten Transkription einer stromabwärts liegenden strukturellen Sequenz. Die heterologe strukturelle Sequenz ist mit Translationsinitiator- und Translationsterminatorsequenzen, und bevorzugt mit einer Leadersequenz, welche zur Steuerung der Sekretion des translatierten Proteins in den periplasmatischen Raum oder in das extrazelluläre Medium befähigt ist, in einer geeigneten Phase zusammengesetzt. in einer speziellen Ausführungsform, in welcher der Vektor für eine Transfektion und Expression gewünschter Sequenzen in Säugerwirtszellen angepasst ist, umfassen bevorzugte Vektoren im gewünschten Wirt einen Replikationsursprung, einen geeigneten Promotor und Enhancer, und ferner beliebige erforderliche ribosomale Bindungsstellen, Polyadenylierungsstellen, Donor- und Akzeptorspleißstellen, transkriptionelle Terminatorsequenzen, sowie 5'-flankierende, nicht-transkribierte Sequenzen. Es können aus dem viralen Genom von SV40 stammende DNA-Sequenzen, beispielsweise der SV40-Ursprung, der Early-Promotor, der Enhancer, sowie Spleiß- und Polyadenylierungsstellen verwendet werden, um die erforderlichen nicht-transkribierten genetischen Elemente bereitzustellen.
Die in vivo-Expression eines FLAP-Polypeptids von SEQ ID Nr. 3 oder Fragmenten oder Varianten hiervon kann auch von Nutzen sein, um einen genetischen Defekt zu korrigieren, welcher mit der Expression des nativen Gens in einem Wirtsorganismus oder mit der Produktion eines biologisch inaktiven FLAP-Proteins in Beziehung steht.
Folglich offenbart die vorliegende Erfindung ferner rekombinante Expressionsvektoren, welche hauptsächlich für die in vivo-Produktion des FLAP-Polypeptids von SEQ ID Nr. 3 oder Fragmenten oder Varianten hiervon konzipiert sind, durch Einbringen des geeigneten genetischen Materials in den Organismus des zu behandelnden Patienten. Dieses genetische Material kann in vitro in eine Zelle eingebracht werden, welche vorab aus dem Organismus extrahiert wurde, wobei die modifizierte Zelle anschließend in den Organismus, direkt in vivo in das geeignete Gewebe, zurückgeführt wird.
2. Regulatorische Elemente
Promotoren
Die in den Expressionsvektoren verwendeten geeigneten Promotorregionen werden unter Berücksichtigung der Wirtszelle, in welcher das heterologe Gen exprimiert werden muss, ausgewählt. Man nimmt an, dass der zur Kontrolle der Expression einer Nukleinsäuresequenz von Interesse eingesetzte spezielle Promotor nicht von Bedeutung ist, solange er die Fähigkeit besitzt, die Expression der Nukleinsäure in der Zielzelle zu steuern. Somit ist es, wenn eine menschliche Zelle die Zielstruktur darstellt, bevorzugt, die kodierende Nukleinsäureregion angrenzend an einen Promotor und unter Kontrolle eines Promotors zu positionieren, welcher die Fähigkeit besitzt, in einer menschlichen Zelle exprimiert zu werden, wie etwa beispielsweise ein menschlicher oder ein viraler Promotor.
Ein geeigneter Promotor kann in Bezug auf die Nukleinsäure, deren Expression er kontrolliert, heterolog sein, oder er kann in Bezug auf das native Polynukleotid, welches die zu exprimierende kodierende Sequenz enthält, endogen sein. Zusätzlich ist der Promotor in Bezug auf die rekombinanten Vektorsequenzen, in welche das Konstrukt Promotor/kodierende Sequenz insertiert worden ist, im Allgemeinen heterolog.
Promotorregionen können unter Verwendung von beispielsweise CAT (Chloramphenicol-Transferase)-Vektoren und stärker bevorzugt von pKK232-8- und pCM7-Vektoren aus einem beliebigen gewünschten Gen ausgewählt werden.
Bevorzugte bakterielle Promotoren sind die LacI, LacZ, die T3- oder T7-Bakteriophagen RNA-Polymerase Promotoren, die gpt-, Lambda PR-, PL- und trp-Promotoren ( EP 0036776 ), der Polyhedrinpromotor, oder der p10-Proteinpromotor aus Baculovirus (Kit Novagen) (Smith et al., 1983; O'Reilly et al., 1992), der Lambda PR-Promotor oder auch der trc-Promotor.
Eukaryotische Promotoren umfassen den Immediate Early-Promotor aus CMV, den Thymidinkinasepromotor aus HSV, den Early- und den Late-Promotor aus SV40, LTRs aus Retroviren, und Metallothionein-L-Promotor aus Maus. Die Auswahl eines zweckmäßigen Vektors und Promotors liegt innerhalb der Fähigkeiten eines Durchschnittsfachmanns.
Die Wahl eines Promotors liegt innerhalb der Fähigkeiten eines Fachmanns auf dem Gebiet der Gentechnik. So kann beispielsweise auf das Buch von Sambrook et al. (1989) oder auch auf die von Fuller et al. (1996) beschriebenen Verfahren verwiesen werden.
Andere regulatorische Elemente
Wird ein cDNA-Insert eingesetzt, so besteht typischerweise der Wunsch, ein Polyadenylierungssignal einzuführen, um eine korrekte Polyadenylierung des Gentranskripts zu bewirken. Man nimmt an, dass die Natur des Polyadenylierungssignals für die erfolgreiche Anwendung der Erfindung nicht ausschlaggebend ist, wobei eine beliebige derartige Sequenz, wie beispielsweise menschliches Wachstumshormon und SV40-Polyadenylierungssignale, eingesetzt werden kann. Als ein Element der Expressionskassette ist ferner ein Terminator vorgesehen. Diese Elemente können dazu dienen, die Message-Spiegel zu erhöhen und den Read-Through aus der Kassette in andere Sequenzen zu minimieren.
Der Vektor, welcher wie vorstehend beschrieben die geeignete DNA-Sequenz, stärker bevorzugt ein regulatorisches Polynukleotid des FLAP-Gens, ein Polynukleotid, welches für das aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 oder einem Fragment oder einer Variante hiervon und SEQ ID Nr. 2 ausgewählte FLAP-Polypeptid kodiert, oder beide, enthält, kann zur Transformation eines geeigneten Wirts verwendet werden, um die Expression des gewünschten Polypeptids oder Polynukleotids zu ermöglichen.
3. Selektionsmarker
Derartige Marker verleihen der Zelle eine identifizierbare Veränderung, welche eine einfache Identifizierung von dieses Expressionskonstrukt enthaltenden Zellen ermöglicht. Bei den Selektionsmarkergenen für die Selektion von transformierten Wirtszellen handelt es sich bevorzugt um die Dihydrofolatreduktase oder eine Neomycinresistenz für eukaryotische Zellkulturen, TRP1 für S. cerevisiae, oder Tetracyclin-, Rifampicin- oder Ampicillinresistenz in E. coli, oder Levansaccharase für Mykobakterien, wobei dieser zuletzt genannte Marker ein negativer Selektionsmarker ist.
4. Bevorzugte Vektoren
Bakterielle Vektoren
Als repräsentatives, jedoch nicht beschränkendes Beispiel können nützliche Expressionsvektoren für eine bakterielle Verwendung einen Selektionsmarker und einen bakteriellen Replikationsursprung umfassen, welcher aus kommerziell erhältlichen Plasmiden, umfassend genetische Elemente von pBR322 (ATCC 37017), stammt. Derartige kommerziell erhältliche Vektoren umfassen beispielsweise pKK223-3 (Pharmacia, Uppsala, Schweden) sowie GEM1 (Promega, Biotec, Madison, WI, USA).
Eine große Anzahl von anderen geeigneten Vektoren sind einem Fachmann bekannt und sind kommerziell verfügbar, wie beispielsweise die nachfolgenden bakteriellen Vektoren: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pD10, Phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene), ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia), pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia), pQE-30 (QIAexpress).
Bakteriophagenvektoren
Der P1-Bakteriophagenvektor kann große Inserts, welche in einem Bereich von etwa 80 bis etwa 100 kb liegen, enthalten.
Die Konstruktion von P1-bakteriophagen Vektoren wie beispielsweise p158 oder p158/neo8 wird vor allem von Sternberg (1992; 1994) beschrieben. Rekombinante, FLAP-Nukleotidsequenzen umfassende P1-Klone können für eine Insertion großer Polynukleotide von mehr als 40 kb konzipiert werden (Linton et al., 1993). Um P1-DNA für transgene Experimente zu erzeugen, stellt das von McCormick et al. (1994) beschriebene Protokoll ein bevorzugtes Protokoll dar.
Baculovirusvektoren
Ein geeigneter Vektor für die Expression des FLAP-Polypeptids von SEQ ID Nr. 6 oder Fragmenten oder Varianten hiervon ist ein Baculovirusvektor, welcher in Insektenzellen und in Insektenzelllinien propagiert werden kann. Ein speziell geeignetes Wirtsvektorsystem ist der pVL1392/1393 Baculovirus-Transfervektor (Pharmingen), welcher zur Transfektion der SF9-Zelllinie (ATCC Nr. CRL 1711) verwendet wird, die aus Spodoptera frugiperda stammt.
Andere geeignete Vektoren für die Expression des FLAP-Polypeptids von SEQ ID Nr. 6 oder Fragmenten oder Varianten hiervon in einem Baculovirus-Expressionssystem umfassen jene, welche von Chai et al. (1993), Vlasak et al. (1983) und Lenhard et al. (1996) beschrieben sind.
Virale Vektoren
In einer speziellen Ausführungsform stammt der Vektor aus einem Adenovirus. Bevorzugte Vektoren aus Adenoviren gemäß der Erfindung sind jene, welche von Feldman und Steg (1996) oder Ohno et al. (1994) beschrieben sind. Ein anderer bevorzugter rekombinanter Adenovirus gemäß dieser speziellen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der menschliche Adenovirus vom Typ 2 oder 5 (Ad 2 oder Ad 5), oder ein Adenovirus tierischen Ursprungs (Französische Patentanmeldung Nr. FR-93.05954 ).
In Bezug auf retrovirale Vektoren und Adeno-assoziierte virale Vektoren wird im Allgemeinen angenommen, dass sie für den. Transfer exogener Polynukleotide in vivo, insbesondere an Säuger, umfassend Menschen, die Systeme der Wahl für die Zuführung rekombinanter Gene darstellen. Diese Vektoren bewirken eine effiziente Zuführung von Genen in Zellen, wobei die transferierten Nukleinsäuren dauerhaft in die chromosomale DNA des Wirts integriert werden.
Besonders bevorzugte Retroviren für die Herstellung oder Konstruktion von retroviralen in vitro- oder in vitro-Genzuführvehikeln der vorliegenden Erfindung umfassen Retroviren, welche aus der Gruppe bestehend aus in Nerzzellen Foci-induzierendem Virus (Mink-Cell Focus Inducing Virus), murinem Sarkomvirus, Reticuloendotheliosisvirus, und Rous-Sarkomvirus ausgewählt werden. Besonders bevorzugte murine Leukämieviren umfassen die 4070A- und 1504A-Viren, Abelson (ATCC Nr. VR-999), Friend (ATCC Nr. VR-245), Gross (ATCC Nr. VR-590), Rauscher (ATCC Nr. VR-998), und den murinen Moloney-Leukämievirus (ATCC Nr. VR 190; PCT-Anmeldungs-Nr. WO 94/24298 ). Besonders bevorzugte Rous-Sarkomviren umfassen Bryan High-Titer-Stämme (ATCC Nr. VR-334, VR-657, VR-726, VR-659 und VR-728). Andere bevorzugte retrovirale Vektoren sind jene, welche in Roth et al. (1996), PCT-Anmeldungs-Nr. WO 93/25234 , PCT-Anmeldungs-Nr. WO 94/06920 , Roux et al., 1989, Julan et al., 1992 und Neda et al., 1991 beschrieben sind.
Noch ein anderes virales Vektorsystem, welches in der Erfindung beschrieben ist, besteht aus einem Adeno-assoziierten Virus (AAV). Der Adeno-assoziierte Virus ist ein natürlich vorkommender defekter Virus, welcher einen anderen Virus, wie beispielsweise einen Adenovirus oder einen Herpesvirus, für eine effiziente Replikation und einen produktiven Lebenszyklus als Helfervirus benötigt (Muzyczka et al., 1992). Er stellt ferner einen der wenigen Viren dar, welcher seine DNA in sich nicht-teilende Zellen integrieren kann und eine hohe Häufigkeit für eine stabile Integration aufweist (Flotte et al., 1992; Samulski et al., 1989; McLaughlin et al., 1989). Ein vorteilhaftes Merkmal von AAV leitet sich aus seiner verminderten Wirksamkeit zur Transduktion von Primärzellen im Verhältnis zu transformierten Zellen ab.
BAC-Vektoren
Das künstliche Bakterienchromosom(BAC)-Klonierungssystem (Shizuya et al., 1992) wurde entwickelt, um große Fragmente genomischer DNA (100–300 kb) in E. coli stabil aufrechtzuerhalten. Ein bevorzugter BAC-Vektor besteht aus einem pBeloBAC11-Vektor, welcher von Kim et al. (1998) beschrieben wurde. BAC-Bibliotheken werden mit diesem Vektor unter Verwendung von größenselektierter genomischer DNA hergestellt, welche unter Verwendung von Enzymen, die eine Ligation entweder in die Bam HI- oder in die Hind III-Stellen des Vektors ermöglichen, teilweise verdaut wurde. Diese Klonierungsstellen sind von T7- und SP6-RNA-Polymerase-Transkriptionsinitiatorstellen flankiert, welche zur Erzeugung von Endsonden entweder mittels RNA-Transkription oder mittels PCR-Verfahren verwendet werden können. Nach der Konstruktion einer BAC-Bibliothek in E. coli wird die BAC-DNA als superspiralisierte Ringstruktur aus der Wirtszelle gereinigt. Das Umwandeln dieser ringförmigen Moleküle in eine lineare Form geht sowohl der Größenbestimmung als auch dem Einbringen der BACs in Empfängerzellen voraus. Die Klonierungsstelle ist von zwei Not I-Stellen flankiert, welche es ermöglichen, klonierte Segmente aus dem Vektor durch Not I-Verdau zu exzidieren. Alternativ kann das in dem pBeloBAC11-Vektor enthaltene DNA-Insert durch Behandlung des BAC-Vektors mit dem kommerziell erhältlichen Enzym Lambda-Terminase linearisiert werden, welches zu einer Spaltung an der einzigartigen cosN-Stelle führt, wobei dieses Spaltungsverfahren jedoch zu einem Volllängen-BAC-Klon führt, welcher sowohl die insertierte DNA als auch die BAC-Sequenzen enthält.
5. Zuführung der rekombinanten Vektoren
Um die Expression der Polynukleotide und Polynukleotidkonstrukte der Erfindung zu bewirken, müssen diese Konstrukte einer Zelle zugeführt werden. Diese Zuführung kann in vitro, wie in Laborverfahren zur Transformation von Zelllinien, oder in vivo oder ex vivo, wie bei der Behandlung bestimmter Erkrankungszustände, erfolgen.
Ein Mechanismus ist die virale Infektion, bei welcher das Expressionskonstrukt in einem infektiösen viralen Partikel verkapselt ist.
Verschiedene nicht-virale Verfahren für den Transfer von Polynukleotiden in kultivierte Sängerzellen sind von der vorliegenden Erfindung ebenfalls vorgesehen, und umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, eine Calciumphosphat-Präzipitation (Graham et al., 1973; Chen et al., 1987), DEAE-Dextran (Gopal, 1985), Elektroporation (Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984), eine direkte Mikroinjektion (Harland et al., 1985), DNA-beladene Liposomen (Nicolau et al., 1982; Fraley et al., 1979), sowie eine Rezeptor-vermittelte Transfektion (Wu und Wu, 1987; 1988). Einige dieser Techniken können erfolgreich für eine Verwendung in vivo oder ex vivo angepasst werden.
Sobald das exprimierte Polynukleotid der Zelle zugeführt werden ist, kann es in das Genom der Empfängerzelle stabil integriert werden. Diese Integration kann über eine homologe Rekombination an einem verwandten Ort und in einer verwandten Orientierung erfolgen (Genaustausch), oder sie kann an einem nach dem Zufallsprinzip ausgewählten, nicht-spezifischen Ort integriert werden (Genvermehrung). In noch weiteren Ausführungsformen kann die Nukleinsäure in der Zelle als einzelnes, episomales Segment von DNA stabil aufrechterhalten werden. Derartige Nukleinsäuresegmente oder „Episome” kodieren Sequenzen in hinreichendem Maße, um eine Aufrechterhaltung und Replikation unabhängig vom oder synchron mit dem Zyklus der Wirtszelle zu ermöglichen.
Eine spezielle Ausführungsform für ein Verfahren zur in vivo-Zuführung eines Proteins oder Peptids in das Innere einer Zelle eines Wirbeltieres umfasst den Schritt des Einbringens einer Zubereitung, umfassend einen physiologisch annehmbaren Träger und ein operativ für das Polypeptid von Interesse kodierendes nacktes Polynukleotid, in den die Zelle umfassenden Zwischenraum eines Gewebes, wobei das nackte Polynukleotid in das Innere der Zelle aufgenommen wird und eine physiologische Wirkung besitzt. Dies ist insbesondere für in vitro-Transfers geeignet, kann jedoch auch in vivo angewendet werden.
Zusammensetzungen für eine Verwendung in vitro und in vivo, umfassend ein „nacktes” Polynukleotid, sind in der PCT-Anmeldung Nr. WO 90/11092 (Vical. Inc.) und auch in der PCT-Anmeldung Nr. WO 95/11307 (Institut Pasteur, INSERM, Université d'Ottawa), sowie in den Artikeln von Tacson et al. (1996) und Huygen et al. (1996) beschrieben.
In noch einer anderen Ausführungsform kann der Transfer eines nackten Polynukleotids der Erfindung, umfassend ein Polynukleotidkonstrukt der Erfindung, in Zellen mittels Partikelbeschuss (biolistisch) erfolgen, wobei die Partikel auf eine hohe Geschwindigkeit beschleunigte, DNA-beschichtete Mikroprojektile sind, was es ihnen ermöglicht, Zellmembranen zu durchdringen und in Zellen einzutreten, ohne diese dabei zu zerstören, wie beispielsweise von Klein et al. (1987) beschrieben.
In einer weiteren Ausführungsform kann das Polynukleotid in einem Liposom eingeschlossen sein (Ghosh und Bacchawat, 1991; Wong et al, 1980; Nicolau et al., 1987).
In einer speziellen Ausführungsform wird eine Zusammensetzung für die in vivo-Herstellung des hierin beschriebenen FLAP-Proteins oder -Polypeptids offenbart. Sie umfasst ein für dieses Polypeptid operativ kodierendes nacktes Polynukleotid, welches in einem physiologisch annehmbaren Träger gelöst und für das Einbringen in ein Gewebe geeignet ist, um Zellen des Gewebes dazu zu veranlassen, das Protein oder Polypeptid zu exprimieren.
Die Menge an in den gewünschten Wirtsorganismus zu injizierendem Vektor variiert entsprechend der Injektionsstelle. Als indikative Dosis werden zwischen 0,1 und 100 μg des Vektors in einen Tierkörper, bevorzugt einen Säugerkörper, beispielsweise einen Mauskörper, injiziert.
In einer anderen Ausführungsform des Vektors kann er in vitro in eine Wirtszelle, bevorzugt in eine aus dem zu behandelnden Tier vorab geerntete Wirtszelle, und stärker bevorzugt in eine somatische Zelle wie beispielsweise eine Muskelzelle, eingebracht werden. In einem nachfolgenden Schritt wird die Zelle, welche mit dem für das gewünschte FLAP-Polypeptid oder das gewünschte Fragment hiervon kodierenden Vektor transformiert wurde, in den Tierkörper zurückgeführt, um das rekombinante Protein innerhalb des Körpers entweder lokal oder systemisch zuzuführen.
Wirtszellen
Eine weiterer Gegenstand besteht aus einer Wirtszelle, welche mit einem der hierin beschriebenen Polynukleotide transformiert oder transfiziert wurde. Es sind Wirtszellen umfasst, welche mit einem rekombinanten Vektor, wie beispielsweise einem der vorstehend beschriebenen, transformiert (prokaryotische Zellen) oder transfiziert (eukaryotische Zellen) sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Wirtszelle, welche einen rekombinanten Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst.
Eine weitere rekombinante Wirtszelle umfasst ein Polynukleotid, welches einen biallelischen Marker ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus A1 bis A28, und den Komplementen hiervon enthält. Gegebenenfalls wird der biallelische Marker aus der Gruppe bestehend aus A1 bis A13, A15, A17 bis A28, und den Komplementen hiervon ausgewählt.
Bevorzugte Wirtszellen, welche als Empfänger für die Expressionsvektoren verwendet werden, sind die nachfolgenden:

a) Prokaryotische Wirtszellen: Escherichia coli-Stämme (I. E. DH5-α-Stamm), Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, sowie Stämme von Spezies wie Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus.
b) Eukaryotische Wirtszellen: HeLa-Zellen (ATCC Nr. CCL2; Nr. CCL2.1; Nr. CCL2.2), Cv 1-Zellen (ATCC Nr. CCL70), COS-Zeilen (ATCC Nr. CRL1650; Nr. CRL1651), Sf-9-Zellen (ATCC Nr. CRL1711), C127-Zellen (ATCC Nr. CRL1804), 3T3 (ATCC Nr. CRL-6361), CHO (ATCC Nr. CCL-61), menschliche Nierenzellen 293 (ATCC Nr. 45504; Nr. CRL-1573) und BHK (ECACC Nr. 84100501; Nr. 84111301).
c) Andere Säugerwirtszellen.

Der Genexpression von FLAP in Säugerzellen, und typischerweise in menschlichen Zellen, kann ein Defekt zugefügt werden, oder sie kann alternativ durch Insertion einer genomischen FLAP-Sequenz oder einer FLAP-cDNA-Sequenz mit dem Austausch des Gegenstücks des FLAP-Gens im Genom einer Tierzelle durch ein FLAP-Polynukleotid voranschreiten. Diese genetischen Veränderungen können mittels homologer Rekombinationsereignisse unter Verwendung spezifischer DNA-Konstrukte, welche vorab beschrieben wurden, erzeugt werden.
Eine Art von Wirtszellen, welche verwendet werden können, sind Zygoten aus Säugern, wie beispielsweise murine Zygoten. So können beispielsweise murine Zygoten einer Mikroinjektion mit einem gereinigten DNA-Molekül von Interesse, beispielsweise einem gereinigten DNA-Molekül, welches vorab auf eine Konzentration im Bereich von 1 ng/ml – für BAC-Inserts – 3 ng/μl – für P1-Bakteriophagen-Inserts – in 10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 250 μM EDTA enthaltend 100 mM NaCl, 30 μM Spermin und 70 μM Spermidin, angepasst wurde, unterzogen werden. Wenn die zu mikroinjizierende DNA eine beträchtliche Größe besitzt, können Polyamine und hohe Salzkonzentrationen verwendet werden, um einen mechanischen Bruch dieser DNA zu verhindern, wie von Schedl et al. (1993b) beschrieben.
Ein jedes der Polynukleotide der Erfindung, umfassend die hierin beschriebenen DNA-Konstrukte, kann in eine embryonale Stammzelllinie (ES-Zelllinie), bevorzugt eine ES-Zelllinie aus Maus, eingebracht werden. ES-Zelllinien stammen aus pluripotenten, nicht zweckgebundenen Zellen der inneren Zellmasse von Blastozyten vor der Einpflanzung. Bevorzugte ES-Zelllinien sind die nachfolgenden: ES-E14TG2a (ATCC Nr. CRL-1821), ES-D3 (ATCC Nr. CRL1934 und Nr. CRL-11632), YS001 (ATCC Nr. CRL-11776), 36.5 (ATCC Nr. CRL-11116). Um die ES-Zellen in einem nicht-zweckgebundenen Stadium zu halten, werden sie in Gegenwart von wachstumsgehemmten Nährzellen kultiviert, welche die geeigneten Signale zur Erhaltung dieses embryonischen Phänotyps bereitstellen und als Matrix für das Anhaften der ES-Zellen dienen. Bevorzugte Nährzellen bestehen aus primären embryonischen Fibroblasten, welche aus dem Gewebe von in Kultur gehaltenen Tag 13- bis Tag 14-Embryonen eines praktisch beliebigen Mausstammes etabliert werden, wie von Abbondanzo et al. (1993) beschrieben, und welche durch Bestrahlung, wie beispielsweise von Robertson (1987) beschrieben, oder durch Gegenwart einer Hemmkonzentration an LIF, wie beispielsweise von Pease und Williams (1990) beschrieben, in ihrem Wachstum gehemmt werden.
Die Konstrukte in den Wirtszellen können auf herkömmliche Art und Weise zur Herstellung von durch die rekombinante Sequenz kodiertem Genprodukt verwendet werden.
Im Anschluss an die Transformation eines geeigneten Wirts und das Wachstum des Wirts auf eine geeignete Zelldichte wird der selektierte Promotor durch geeignete Mittel, wie beispielsweise eine Temperaturveränderung oder eine chemische Induktion, induziert, und die Zellen werden für einen zusätzlichen Zeitraum kultiviert.
Die Zellen werden typischerweise mittels Zentrifugation geerntet, durch physikalische oder chemische Mittel aufgebrochen, und der resultierende Rohextrakt für eine weitere Reinigung aufbewahrt.
Mikrobielle Zellen, welche zur Expression von Proteinen eingesetzt werden, können mittels eines beliebigen zweckmäßigen Verfahrens aufgebrochen werden, umfassend periodisches Einfrieren/Auftauen, Ultraschallbehandlung, mechanisches Aufbrechen, oder durch Verwendung von zelllysierenden Mitteln. Derartige Verfahren sind einem Fachmann wohlbekannt.
Transgene Tiere
Die Begriffe „Transgene Tiere” oder „Wirtstiere” werden hierin zur Bezeichnung von Tieren verwendet, deren Genom genetisch und künstlich manipuliert ist, um auf diese Weise eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren zu umfassen. Bevorzugte Tiere sind nicht-menschliche Säuger und umfassen jene, welche einer Gattung ausgewählt aus Mus (z. B. Mäuse), Rattus (z. B. Ratten) und Oryctogalus (z. B. Kaninchen) angehören, deren Genom durch Insertion einer in der Erfindung beschriebenen Nukleinsäure künstlich und genetisch verändert ist. In einer Ausführungsform offenbart die Erfindung nicht-menschliche Wirtssäuger und -tiere, welche einen in der Erfindung beschriebenen rekombinanten Vektor oder ein durch homologe Rekombination mit einem Knockout-Vektor gespaltenes FLAP-Gen umfassen.
Die transgenen Tiere umfassen allesamt innerhalb einer Vielzahl ihrer Zellen eine klonierte rekombinante oder synthetische DNA-Sequenz, insbesondere eine der gereinigten oder isolierten Nukleinsäuren, welche eine kodierende FLAP-Sequenz, ein regulatorisches FLAP-Polynukleotid, oder eine für ein Antisense-Polynukleotid kodierende DNA-Sequenz, wie beispielsweise in der vorliegenden Beschreibung beschrieben, umfassen.
Im Allgemeinen umfasst ein transgenes Tier ein beliebiges der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Polynukleotide, einen beliebigen der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen rekombinanten Vektoren und eine beliebige der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Wirtszellen.
Weitere transgene Tiere enthalten in ihren somatischen Zellen und/oder in ihren Keimbahnzellen ein Polynukleotid, welches einen biallelischen Marker ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus A1 bis A28, und den Komplementen hiervon umfasst. Gegebenenfalls wird der biallelische Marker aus der Gruppe bestehend aus A1 bis A13, A15, A17 bis A28, und den Komplementen hiervon ausgewählt.
In einer ersten bevorzugten Ausführungsform können diese transgenen Tiere gute experimentelle Modelle zur Untersuchung der verschiedenen mit Zelldifferenzierung in Beziehung stehenden Pathologien darstellen, was insbesondere die transgenen Tiere betrifft, in deren Genom eine oder mehrere Kopien eines für ein natives FLAP-Protein oder alternativ für ein mutiertes FLAP-Protein kodierenden Polynukleotids insertiert wurden.
In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform können diese transgenen Tiere ein gewünschtes Polypeptid von Interesse unter Kontrolle der regulatorischen Polynukleotide des FLAP-Gens exprimieren, was zu guten Ausbeuten in Bezug auf die Synthese dieses Proteins von Interesse und letztlich zu einer gewebespezifischen Expression dieses Proteins von Interesse führt.
Die Ausgestaltung der transgenen Tiere, umfassend Knockout-Tiere, kann gemäß der dem Fachmann wohlbekannten herkömmlichen Techniken erfolgen. Für nähere Einzelheiten in Bezug auf die Erzeugung von transgenen Tieren, und insbesondere von transgenen Mäusen, kann auf die U.S. Patente Nr. 4,873,191 , erteilt am 10. Oktober 1989, 5,464,764 , erteilt am 7. November 1995, 5,789,215 , erteilt am 4. August 1998, Capecchi, M. R. (1989a), Capecchi, M. R. (1989b), und Tsuzuki, T. und Rancourt, D. E. (1998) Bezug genommen werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst die neuen Polynukleotide der Erfindung umfassende Knockout-Vektoren, sowie Säugerwirtszellen und nicht-menschliche Wirtssäuger, welche ein durch homologe Rekombination mit einem derartigen Knockout-Vektor gespaltenes FLAP-Gen umfassen.
Transgene Tiere der vorliegenden Erfindung werden durch Anwendung von Verfahren erzeugt, welche zu einem Tier führen, dessen Genom das exogene genetische Material eingebaut hat. Das Verfahren umfasst das Erlangen des genetischen Materials oder eines Teils hiervon, welches entweder für eine kodierende FLAP-Sequenz, ein regulatorisches FLAP-Polynukleotid, oder eine für ein FLAP-Antisense-Polynukleotid kodierende DNA-Sequenz kodiert, wie in der vorliegenden Beschreibung beschrieben ist.
Ein in der Erfindung beschriebenes rekombinantes Polynukleotid wird in eine embryonische oder ES-Stammzelllinie insertiert. Die Insertion erfolgt bevorzugt unter Verwendung von Elektroporation, wie von Thomas et al. (1987) beschrieben. Die einer Elektroporation unterworfenen Zellen werden zur Ermittlung positiver Zellen, welche das exogene rekombinante Polynukelotid in ihr Genom, bevorzugt über ein homologes Rekombinationsereignis, integriert haben, durchmustert (z. B. mittels Selektion über Selektionsmarker, mittels PCR oder mittels Southern-Blot-Analyse). Ein veranschaulichendes Positiv-Negativ-Selektionsverfahren, welches verwendet werden kann, wird von Mansour et al. (1988) beschrieben.
Anschließend werden die positiven Zellen isoliert, kloniert und in 3,5 Tage alte Blastozyten aus Mäusen injiziert, wie von Bradley (1987) beschrieben. Die Blastozyten werden anschließend in ein weibliches Wirtstier insertiert, wobei man sie bis zur Reife wachsen lässt.
Alternativ werden die positiven ES-Zellen mit Embryos in Kontakt gebracht, welche sich im 2,5 Tage alten 8-16-Zellstadium (Morulae) befinden, wie von Wood et al. (1993) oder Nagy et al. (1993) beschrieben, wobei die ES-Zellen zur umfassenden Kolonisierung der Blastozyten, welche die die Keimbahn bildenden Zellen umfassen, internalisiert sind.
Die Nachkommen des weiblichen Wirts werden zur Bestimmung dessen, welche Tiere transgen sind, z. B. die insertierte exogene DNA-Sequenz umfassen, und welche vom Wildtyp sind, untersucht.
Rekombinante Zelllinien, welche aus den transgenen Tieren stammen
Eine weitere Aufgabe offenbart rekombinante Wirtszellen, welche aus einem hierin beschriebenen transgenen Tier erhalten werden. In einer Ausführungsform umfasst die Erfindung von nicht-menschlichen Wirtssäugern und -tieren stammende Zellen, welche einen rekombinanten Vektor der Erfindung oder ein durch homologe Rekombination mit einem Knockout-Vektor gespaltenes FLAP-Gen umfassen.
Rekombinante Zelllinien können in vitro aus Zellen etabliert werden, welche aus einem beliebigen Gewebe eines erfindungsgemäßen transgenen Tieres, beispielsweise durch Transfektion primärer Zellkulturen mit onc-Gene, wie beispielsweise das SV40 Large T-Antigen, exprimierender Vektoren, erhalten werden, wie von Chou (1989) und Shay et al. (1991) beschrieben.
XVII. Durchmustern von gegen Asthma wirkenden Mitteln
In einer weiteren Ausführungsform offenbart die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Durchmusten von neuen Mitteln oder Kandidatensubstanzen, welche gegen Asthma wirken und für die Behandlung eines Patienten geeignet sein können, dessen DNA ein mit Asthma assoziiertes Allel des FLAP-Gens umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren zum Durchmustern von Kandidatensubstanzen auf deren Fähigkeit zur Veränderung der Biosynthese von Leukotrienen, bevorzugt zur Identifizierung aktiver Kandidatensubstanzen ohne unerwünschte Nebenwirkungen, wie beispielsweise erhöhte Lebertransaminasespiegel, beschrieben. Das Verfahren umfasst die nachfolgenden Schritte: a) Bereitstellen einer Zelllinie, eines Organs oder eines Säugers, welche/welches/welcher 5'-LO und entweder ein FLAP-Gen, das Allele für einen oder mehrere mit Asthma assoziierte, mit FLAP in Beziehung stehende biallelische Marker umfasst, oder ein mutiertes FLAP-Gen, welches die unter Verwendung des vorstehend genannten Verfahrens bestimmte merkmalsverursachende Mutation umfasst, exprimiert, b) Erlangen einer Kandidatensubstanz, und c) Unterprüfen der Kandidatensubstanz auf die Fähigkeit, die Biosynthese von Leukotrienen zu modifizieren, und insbesondere mit 5'-LO und/oder dem von der Zelllinie oder den transgenen Säuger produzierten FLAP wechselzuwirken und/oder die Wechselwirkung zwischen 5'-LO und FLAP zu modifizieren und/oder die Expressionsspiegel von FLAP zu modulieren.
In einer Ausführungsform des vorstehenden Verfahrens umfasst das Verfahren das Bereitstellen einer Zelllinie, eines Organs oder eines Säugers, welche/welches/welcher 5'-LO, ein FLAP-Gen, das Allele für einen oder mehrere mit Asthma assoziierte, mit FLAP in Beziehung stehende biallelische Marker umfasst, und ein mutiertes FLAP-Gen, welches die unter Verwendung des vorstehend genannten Verfahrens merkmalsverursachende Mutation umfasst, exprimiert. Die biallelischen Marker können aus der Gruppe bestehend aus A1 bis A28 und den Komplementen hiervon ausgewählt werden. Gegebenenfalls kann der mit FLAP in Beziehung stehende biallelische Marker aus der Gruppe bestehend aus A1 bis A13, A15, und A17 bis A28, und den Komplementen hiervon ausgewählt werden. Gegebenenfalls werden die biallelischen Marker aus der Gruppe bestehend aus A1 bis A10 und A22 bis A28, und den Komplementen hiervon ausgewählt. Gegebenenfalls werden die biallelischen Marker aus der Gruppe bestehend aus A11 bis A13, A15, A17 bis A21, und den Komplementen hiervon ausgewählt. Gegebenenfalls werden die biallelischen Marker aus der Gruppe bestehend aus A14 oder A16, und den Komplementen hiervon ausgewählt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die biallelischen Marker aus der Gruppe bestehend aus A2, A14, A16, A18, A19, A22 und A23, und den Komplementen hiervon ausgewählt. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die biallelischen Marker aus der Gruppe bestehend aus A14 und A19, und den Komplementen hiervon ausgewählt. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform umfassen die biallelischen Marker den biallelischen Marker A19, und das Komplement hiervon.
Eine Kandidatensubstanz stellt eine Substanz dar, welche durch Bindung oder andere intramolekulare Wechselwirkungen mit 5'-LO oder FLAP Wechselwirken oder diese modulieren kann. Derartige Substanzen können für Patienten, welche auf vorhandene Arzneimittel nicht ansprechen, potentiell von Interesse sein. Ein Durchmustern kann unter Verwendung von entweder in vitro-Verfahren oder in vivo-Verfahren erfolgen.
In vitro-Verfahren können auf zahlreichen Wegen durchgeführt werden, wie beispielsweise mittels transformierten Zellen, welche die betrachteten Allele des FLAP-Gens exprimieren, durch Aktivierung von 5-Lipoxygenase und Messung der Leukotriensynthese, oder mittels FLAP, welches von der betrachteten allelischen Variante von FLAP kodiert wird, durch FLAP-Bindungsassays.
Durchmusterungsassays der vorliegenden Erfindung umfassen im Allgemeinen die Bestimmung der Fähigkeit einer Kandidatensubstanz, die Aktivität von 5-LO oder FLAP zu beeinflussen, wie beispielsweise das Durchmustern von Kandidatensubstanzen zur Identifizierung jener Substanzen, welche die Funktion von 5-LO oder FLAP bei Asthma hemmen oder anderweitig modifizieren.
Ein Verfahren für das Durchmustern auf Arzneimittel nutzt eukaryotische Wirtszellen, welche mit 5-LO und die betrachteten Allele des FLAP-Gens exprimierenden rekombinanten Polynukleotiden stabil transformiert sind. Derartige Zellen, entweder in entwicklungsfähiger oder in fixierter Form, können für Standardbindungsassays verwendet werden. Es kann beispielsweise die Bildung von Produkten des Leukotrien-Signalwegs, wie beispielsweise die Synthese von LTB₄, gemessen werden, oder das Ausmaß untersucht werden, zu welchem die Bildung derartiger Produkte durch das untersuchte Mittel beeinträchtigt wird.
Typischerweise umfasst dieses Verfahren die Herstellung transformierter Zellen, welche 5-LO und verschiedene Formen von FLAP, die durch bestimmte Allele eines oder mehrerer der vorstehend beschriebenen biallelischen Marker und/oder Mutationen enthaltende DNA-Sequenzen kodiert sind, exprimieren. im Anschluss daran erfolgt eine Testung der 5-LO und FLAP exprimierenden Zellen mit einer Kandidatensubstanz zur Bestimmung der Fähigkeit der Substanz, die Funktion des Leukotrien-Signalwegs zu beeinflussen, um jene Substanzen zu identifizieren, welche die enzymatische Aktivität von 5-LO oder die Aktivität von FLAP beeinflussen und somit für eine Verwendung in Menschen geeignet sein können.
Typische Beispiele derartiger Durchmusterungsassays auf Arzneimittel sind nachstehend bereitgestellt. Es versteht sich, dass die in diesen Beispielen dargelegten Parameter von einem Fachmann ohne unangemessenes Experimentieren modifiziert werden können.
Durchmustern auf 5-LO-Inhibitoren
Arzneimittelwirkungen können durch Bestimmung der von Zellen, welche sowohl das 5-LO-Gen als auch das betrachtete Allel des FLAP-Gens exprimieren, erzeugten 5-LO-Produkte evaluiert werden. Eukaryotische Zellen, welche vorab mit geeigneten Vektoren, wie sie vorab beschrieben sind, transformiert wurden und 5-LO und das untersuchte Allel des FLAP-Gens exprimieren, werden mittels Zentrifugation (300 g, 5 min, und Raumtemperatur) geerntet und mit einem geeignetem Puffer gewaschen. Die Zellen werden anschließend in Puffer resuspendiert, auf 37°C vorgewärmt, bevorzugt bei einer Zelldichte von 5 × 10⁶ Zellen/ml. Aliquote der Zellsuspension werden mit dem betrachteten Arzneimittel für bevorzugt 5 min bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von Calciumionophor A23187 und Arachidonsäure initiiert. Im Anschluss an eine Inkubation bei 37°C wird die Reaktion durch Zugabe von Methanol, welches Prostaglandin B2 als internen Standard für die HPLC-Analyse enthält, beendet. Die 5-LO-Reaktionsprodukte werden in Chloroform extrahiert, im Stickstoffstrom getrocknet, und in einem HPLC-Lösungsmittel resuspendiert. Die Proben werden mittels Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung eines bevorzugt isokratischen Lösungsmittelsystems von Methanol/Wasser/Essigsäure (75:25:0.01) analysiert. Die Elution wird bevorzugt bei 270 und 234 nm überwacht. Die 5-LO-Produkte werden durch Vergleich der Peakflächen mit jenen der Standardkurven authentischer Standards quantifiziert, und in Bezug auf kleinere Unterschiede hinsichtlich der unter Verwendung des internen Prostaglandin B2-Standards bestimmten Extraktionseffizienz korrigiert. Dieses Verfahren wird ausführlicher in Dixon et al. (1990) und Abramovitz et al. (1993) beschrieben.
Durchmustern auf FLAP-Inhibitoren
Das vorstehend beschriebene FLAP-Protein oder Teile hiervon können in Durchmusterungsverfahren auf Arzneimittel zur Identifizierung von Molekülen verwendet werden, welche Agonisten, Antagonisten oder Inhibitoren der FLAP-Aktivität sind. Das in derartigen Analysen verwendete FLAP-Protein oder ein Teil hiervon kann sich frei in Lösung befinden oder an einen festen Träger gebunden sein. Alternativ kann das FLAP-Protein oder die Teile hiervon auf einer Zelloberfläche exprimiert werden. Die Zelle kann das FLAP-Protein oder den Teil hiervon natürlich exprimieren, oder die Zeile kann das FLAP-Protein oder den Teil hiervon alternativ aus einem Expressionsvektor, wie beispielsweise den vorstehend beschriebenen, exprimieren.
In einem Verfahren zum Durchmustern auf Arzneimittel werden eukaryotische oder prokaryotische Wirtszellen, welche mit rekombinanten Polynukleotiden zur Expression des FLAP-Proteins oder eines Teils hiervon stabil transformiert sind, in herkömmlichen kompetitiven Bindungsassays oder in direkten Standardbindungsassays verwendet. So kann beispielsweise die Bildung eines Komplexes zwischen dem FLAP-Protein oder einem Teil hiervon und dem untersuchten Mittel in direkten Bindungsassays gemessen werden. Alternativ kann die Fähigkeit eines Testmittels, die Bildung eines Komplexes zwischen dem FLAP-Protein oder einem Teil hiervon und einem bekannten Liganden zu verhindern, gemessen werden.
Ein Bindungsassay für FLAP-Inhibitoren kann beispielsweise auf der Beobachtung basieren, das MK-886, ein indolischer Inhibitor der Biosynthese von Leukotrienen, mit hoher Affinität und Spezifität an FLAP bindet. Die Bindung des betrachteten Arzneimittels an FLAP kann mittels eines kompetitiven Experiments mit einem radiomarkierten Analogon von MK-886, ¹²⁵I-L-691-831, bestimmt werden. Eine bevorzugt 2 10⁷ Zellen enthaltende Suspension von Zellen, welche das betrachtete Allel von FLAP exprimieren, wird bei 500 × g für 10 min zentrifugiert. Die pelletierten Zellen werden anschließend in Lysepuffer resuspendiert. Diese Suspension wird auf Eis mittels drei Impulsen von jeweils 20 s mit Ultraschall behandelt. Die Lyse der Zellen wird visuell überprüft. Die Bindung wird durch Hinzufügen von Zelllyseproben in Vertiefungen, welche ¹²⁵I-L-691-831 und entweder das betrachtete Arzneimittel oder nichts (Kontrolle) enthalten, initiiert. Die Platte wird für 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proben werden anschließend filtriert und gewaschen. Gebundenes ¹²⁵I-L-691-831 wird in einer Zählvorrichtung bestimmt. Die spezifische Arzneimittelbindung ist als Differenz zwischen der Bindung in Abwesenheit und in Gegenwart des betrachteten Arzneimittels definiert. Dieser FLAP-Bindungsassay ist ausführlicher in Charleson et al. (1992) beschrieben.
Alternativ können die in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 84/03664 offenbarten Hochdurchsatz-Durchmusterungstechniken verwendet werden. in derartigen Techniken wird eine große Anzahl von kleinen Peptiden, welche in Bezug auf eine Bindungsaktivität für FLAP untersucht werden sollen, auf einer Oberfläche synthetisiert und hieran angebracht. Die Testpeptide werden mit dem FLAP-Protein oder einem Teil hiervon in Kontakt gebracht, gefolgt von einem Waschschritt. Die Menge des an die Testverbindung bindenden FLAP-Proteins oder des Teils hiervon wird unter Verwendung herkömmlicher Techniken quantifiziert.
In einigen Verfahren kann das FLAP-Protein oder ein Teil hiervon an eine Oberfläche fixiert und mit einer Testverbindung in Kontakt gebracht werden. Nach einem Waschschritt wird die Menge der an das FLAP-Protein oder den Teil hiervon bindenden Testverbindung gemessen.
Durchmustern auf Inhibitoren der Wechselwirkung zwischen 5-LO und FLAP Arzneimittelwirkungen können durch Bestimmung der Wechselwirkung zwischen 5-LO und FLAP-Proteinen evaluiert werden.
Eine Wechselwirkung zwischen 5-LO und FLAP-Protein kann unter Verwendung zweier Hybridsysteme, wie beispielsweise dem Matchmaker Two Hybrid System 2 Katalog-Nr. K1604-1, Clontech) bestimmt werden. Wie in dem das Matchmaker Two Hybrid System 2 (Katalog-Nr. K1604-1, Clontech) begleitenden Handbuch beschrieben ist, werden für das FLAP-Protein oder einen Teil hiervon kodierende Nukleinsäuren in einen Expressionsvektor insertiert, so dass sie sich in einem Leserahmen mit der für die DNA-Bindungsdomäne des transkriptionellen Aktivators GAL4 aus Hefe kodierenden DNA befinden. 5-LO-cDNA oder ein Teil hiervon wird in einen zweiten Expressionsvektor insertiert, so dass sie sich in einem Leserahmen mit einer für die Aktivierungsdomäne von GAL4 kodierenden DNA befinden. Die beiden Expressionsplasmide werden in Hefe transformiert, und die Hefe wird auf einem Selektionsmedium ausplattiert, welches sowohl eine Selektion in Bezug auf die Expression von Selektionsmarkern in jedem der Expressionsvektoren als auch in Bezug auf die GAL4-abhängige Expression des HIS3-Gens vornimmt. Transformanten, welche zu einem Wachstum auf Histidin-freiem Medium befähigt sind, werden auf die GAL4-abhängige Expression von lacZ hin durchmustert. Jene Zellen, welche sowohl bei der Histidinselektion als auch im lacZ-Assay positiv ansprechen, enthalten eine Wechselwirkung zwischen FLAP und 5-LO-Proteinen.
In einem anderen Verfahren können das FLAP-Protein oder ein Teil hiervon enthaltende Affinitätssäulen konstruiert werden. In einigen Varianten dieses Verfahrens enthält die Affinitätssäule chimäre Proteine, in welchen das FLAP-Protein oder ein Teil hiervon an Glutathion-S-Transferase fusioniert ist. 5-LO-Protein wird auf die Affinitätssäule aufgebracht. Das auf der Affinitätssäule zurückgehaltene 5-LO-Protein kann gemessen werden und kann eine Bestimmung der Wechselwirkung zwischen FLAP und 5-LO-Proteinen ermöglichen.
Eine Assoziation zwischen 5-LO und FLAP-Proteinen kann auch unter Verwendung eines optischen Biosensors, wie er in Edwards et Leatherbarrow (1997) beschrieben ist, bestimmt werden. Der Hauptvorteil des Verfahrens besteht dann, dass es die Bestimmung der Assoziationsrate ermöglicht. Typischerweise ist ein FLAP-Molekül an die Oberfläche des Sensors. (mittels einer Carboxymethyldextran-Matrix) gebunden, und eine Probe von 5-LO-Molekülen wird mit den FLAP-Molekülen in Kontakt gebracht. Die Bindung eines 5-LO-Moleküls an das FLAP-Molekül verursacht eine Veränderung des Brechungsindex und/oder der Brechungsstärke. Diese Veränderung wird mittels des Biosensors unter der Voraussetzung, dass sie im evaneszenten Feld (welches sich über wenige hundert Nanometer von der Oberfläche des Sensors aus erstreckt) auftritt, detektiert. Somit kann die Wirkung eines Arzneimittelkandidaten auf die Assoziation zwischen FLAP und 5-LO-Proteinen auf einfache Weise gemessen werden.
Durchmustern auf Expressionsmodifikatoren
Das Durchmustern auf Expressionsmodifikatoren ist von Bedeutung, da es zur Detektion von Modifikatoren verwendet werden kann, welche für ein Allel oder eine Gruppe von Allelen des FLAP-Gens spezifisch sind. Die Veränderung der FLAP-Expression als Reaktion auf einen Modifikator kann durch Verabreichen oder Kombinieren des Modifikatorkandidaten mit einem Expressionssystem, wie beispielsweise einem Tier oder einer Zelle, sowie in in vitro-Transkriptionsassays bestimmt werden.
Die Wirkung des Modifikators auf die FLAP-Transkription und/oder die stationären mRNA-Spiegel kann ebenfalls bestimmt werden. Genauso wie die Grundexpressionsspiegel sind auch gewebespezifische Wechselwirkungen von Interesse. Es werden Korrelationen zwischen der Fähigkeit eines Expressionsmodifikators, die FLAP-Aktivität zu beeinflussen, und der Gegenwart des Zielpolymorphismus hergestellt. Um die Wirkung unter einer Reihe verschiedener Bedingungen zu bestimmen, kann eine Gruppe unterschiedlicher Modifikatoren durchmustert werden.
Die Expressionsspiegel und -muster von FLAP können mittels einer in Lösung erfolgenden Hybridisierung mit langen Sonden, wie sie in der Internationalen Patentanmeldung Nr. WO 97/05277 beschrieben ist, analysiert werden. Kurz gesagt wird die vorstehend beschriebene FLAP-cDNA oder die genomische FLAP-DNA, oder Fragmente hiervon, an einer Klonierungsstelle unmittelbar stromabwärts eines RNA-Polymerase-Promotors aus einem Bakteriophagen (T3, T7 oder SP6) insertiert, um Antisense-RNA zu erzeugen. Bevorzugt umfasst das FLAP-Insert mindestens 100 oder mehr aufeinanderfolgende Nukleotide der genomischen DNA-Sequenz oder der cDNA-Sequenzen, und insbesondere jene, welche mindestens einen der biallelischen Marker der vorliegenden Erfindung umfassen, oder jene, welche für mutiertes FLAP kodieren. Das Plasmid wird in Gegenwart von modifizierte Ribonukleotide (d. h. Biotin-UTP und DIG-UTP) umfassenden Ribonukleotiden linearisiert und transkribiert. Ein Überschuss dieser doppelt markierten RNA wird in Lösung mit mRNA hybridisiert, welche aus Zellen oder Geweben von Interesse isoliert wurde. Die Hybridisierungen werden unter stringenten Standardbedingungen (40–50°C für 16 Stunden in einem 80% Formamid, 0.4 M NaCl-Puffer, pH 7–8) durchgeführt. Die nicht-hybridisierte Sonde wird durch Verdau mittels für Einzelstrang-RNA spezifischen Ribonukleasen entfernt (d. h. RNasen CL3, T1, Phy M, U2 oder A). Die Gegenwart der Biotin-UTP-Modifikation ermöglicht ein Abfangen des Hybrids auf einer mit Streptavidin beschichteten Mikrotiterplatte. Die Gegenwart der DIG-Modifikation ermöglicht eine Detektion des Hybrids und dessen Quantifizierung mittels ELISA unter Verwendung eines an alkalische Phosphatase gekoppelten Anti-DIG-Antikörpers.
Eine quantitative Analyse der FLAP-Genexpression kann ferner unter Verwendung von Arrays durchgeführt werden. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff Array eine eindimensionale, zweidimensionale oder multidimensionale Anordnung einer Vielzahl von Nukleinsäuren hinreichender Länge, um eine spezifische Detektion der Expression von zu einer Hybridisierung hieran befähigter mRNAs zu ermöglichen. So können die Arrays beispielsweise eine Vielzahl von Nukleinsäuren enthaften, welche aus Genen stammen, deren Expressionsspiegel bestimmt werden sollen. Die Arrays können die genomische FLAP-DNA, die FLAP-cDNA-Sequenzen oder die hierzu komplementären Sequenzen oder Fragmente hiervon umfassen, und insbesondere jene, welche mindestens einen der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen biallelischen Marker umfassen, oder jene, welche für mutiertes FLAP kodieren. Bevorzugt besitzen die Fragmente eine Länge von mindestens 15 Nukleotiden. In anderen Ausführungsformen besitzen die Fragmente eine Länge von mindestens 25 Nukleotiden. In einigen Ausführungsformen besitzen die Fragmente eine Länge von mindestens 50 Nukleotiden. Starker bevorzugt besitzen die Fragmente eine Länge von mindestens 100 Nukleotiden. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform besitzen die Fragmente eine Länge von mehr als 100 Nukleotiden. In einigen Ausführungsformen können die Fragmente eine Länge von mehr als 500 Nukleotiden besitzen.
Eine quantitative Analyse der FLAP-Genexpression kann beispielsweise mittels eines Mikroarrays mit komplementärer DNA durchgeführt werden, wie von Schena et al. (1995 und 1996) beschrieben. Volllängen-FLAP-cDNAs oder Fragmente hiervon werden mittels PCR amplifiziert und unter Verwendung von Hochgeschwindigkeitsrobotern ausgehend von einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen auf silylierten Objektträgern angeordnet. Bestückte Arrays werden in einer Feuchtkammer inkubiert, um eine Rehydratisierung der Arrayelemente zu ermöglichen, und einmal für 1 min in 0.2% SDS, zweimal für 1 min in Wasser, und einmal für 5 min in Natriumborhydrid-Lösung gewaschen. Die Arrays werden bei 95°C für 2 min in Wasser eingetaucht, für 1 min in 0.2% SDS überführt, zweimal mit Wasser gespült, an Luft getrocknet und bei 25°C im Dunkeln gelagert.
Zell- oder Gewebe-mRNA wird isoliert oder kommerziell erhalten, wobei die Sonden mittels eines einzelnen Zyklus von reverser Transkription hergestellt werden. Die Sonden werden unter einem 14 × 14 mm großen gläsernen Deckglas für 6–12 Stunden bei 60°C an 1 cm²-Mikroarrays hybridisiert. Die Arrays werden für 5 min bei 25°C in einem Waschpuffer niedriger Stringenz (1 × SSC/0.2% SDS), und anschließend für 10 min bei Raumtemperatur in einem Waschpuffer hoher Stringenz (0.1 × SSC/0.2% SDS) gewaschen. Die Arrays werden in 0.1 × SSC unter Verwendung einer mit einem speziell gefertigten Filtersatz ausermöglichten Fluoreszenz-Laserscanningvorrichtung gescannt. Genaue Messungen der differentiellen Expression werden durch Mitteln der Verhältnisse der beiden unabhängigen Hybridisierungen erhalten.
Eine quantitative Analyse der FLAP-Genexpression kann auch mit Volllängen-FLAP-cDNAs oder Fragmenten hiervon in Arrays mit komplementärer DNA durchgeführt werden, wie von Pietu et al. (1996) beschrieben. Die Volllängen-FLAP-cDNA oder Fragmente hiervon wird mittels PCR amplifiziert und punktförmig auf Membranen aufgebracht. Anschließend werden die aus verschiedenen Geweben oder Zellen stammenden mRNAs mit radioaktiven Nukleotiden markiert. Nach Hybridisierung und Waschen unter kontrollierten Bedingungen werden die hybridisierten mRNAs mittels Phosphoimaging oder Autoradiographie detektiert. Die Experimente werden in doppelter Ausführung durchgeführt, wobei anschließend eine quantitative Analyse der differentiell exprimierten mRNAs durchgeführt wird.
Alternativ kann eine Expressionsanalyse unter Verwendung der genomischen FLAP-DNA, der FLAP-cDNA, oder Fragmenten hiervon mit Hilfe von Nukleotidarrays hoher Dichte, wie von Lockhart et al. (1996) und Sosnowsky et al. (1997) beschrieben, erfolgen. Oligonukleotide von 15–50 Nukleotiden aus den Sequenzen der genomischen FLAP-DNA, den FLAP-cDNA-Sequenzen, und insbesondere jenen, welche mindestens einen der biallelischen Marker der vorliegenden Erfindung umfassen, oder jene, welche für mutiertes FLAP kodieren, oder hierzu komplementäre Sequenzen, werden direkt auf dem Chip synthetisiert (Lockhart et al., 1996) oder synthetisiert und anschließend an den Chip adressiert (Sosnowsky et al., 1997). Bevorzugt besitzen die Oligonukleotide eine Länge von etwa 20 Nukleotiden.
Die mit einer geeigneten Verbindung, wie beispielsweise Biotin, Digoxigenin oder fluoreszierendem Farbstoff markierten FLAP-cDNA-Sonden werden aus der geeigneten mRNA-Population synthetisiert und anschließend nach dem Zufallsprinzip auf eine durchschnittliche Größe von 50 bis 100 Nukleotiden fragmentiert. Die Sonden werden anschließend an den Chip hybridisiert. Nach dem wie in Lockhart et al., supra beschriebenen Waschen und Anlegen unterschiedlicher elektrischer Felder (Sosnowsky et al., 1997) werden die Farbstoffe oder Markierungsverbindungen detektiert und quantifiziert. Es werden Hybridisierungen in doppelter Ausführung durchgeführt. Eine Vergleichsanalyse der Intensität des aus cDNA-Sonden am gleichen Zieloligonukleotid in unterschiedlichen cDNA-Proben stammenden Signals deutet auf eine differentielle Expression von FLAP-mRNA hin.
Durchmustern unter Verwendung von transgenen Tieren
In vivo-Verfahren können transgene Tiere für ein Durchmustern auf Arzneimittel nutzen. Nukleinsäuren, welche mindestens einen der biallelischen Polymorphismen von Interesse umfassen, können zur Erzeugung genetisch modifizierter, nicht-menschlicher Tiere oder zur Erzeugung ortsspezifischer Genmodifikationen in Zelllinien verwendet werden. Der Begriff „transgen” soll genetisch modifizierte Tiere umfassen, welche eine Deletion oder einen anderen Knockout der Aktivität des FLAP-Gens, ein stabil in die Wirtszellen, übertragenes exogenes FLAP-Gen, oder einen mit einem Reportergen operativ verknüpften exogenen FLAP-Promotor aufweisen. Transgene Tiere können mittels homologer Rekombination erzeugt werden, wenn der FLAP-Locus verändert ist. Alternativ wird ein Nukleinsäurekonstrukt nach dem Zufallsprinzip in das Genom integriert. Vektoren für eine stabile Integration umfassen beispielsweise Plasmide, Retroviren und andere Viren aus Tieren, sowie YACs. Von Interesse sind transgene Säuger, z. B. Kühe, Schweine, Ziegen, Pferde, und insbesondere Nagetiere wie beispielsweise Ratten und Mäuse. Transgene Tiere ermöglichen es, sowohl die Wirksamkeit als auch die Toxizität des Arzneimittelkandidaten zu untersuchen.
Um den Stand der Technik, welchen diese Erfindung betrifft, vollständiger zu beschreiben, sind durch diese Anmeldung hindurch verschiedene Publikationen, Patente und veröffentlichte Patentanmeldungen in der vorliegenden Offenbarung zitiert.
BEISPIELE
Beispiel 1
Detektion von biallelischen FLAP-Markern: DNA-Extraktion
Die Spender waren nicht miteinander verwandt und gesund. Sie zeigten eine hinreichende Diversität, um für eine französische, heterogene Population repräsentativ zu sein. Die DNA von 100 Individuen wurde extrahiert und zur Detektion der biallelischen Marker untersucht.
30 ml an peripherem, venösem Blut wurden einem jeden Spender in Gegenwart von EDTA entnommen. Die Zellen (Pellet) wurden nach Zentrifugation für 10 Minuten bei 2000 U/min gesammelt. Die roten Zeilen wurden mittels einer Lyselösung (50 ml Endvolumen: 10 mM Tris, pH 7.6, 5 mM MgCl₂, 10 mM NaCl) lysiert. Die Lösung wurde so oft wie erforderlich zentrifugiert (10 Minuten, 2000 U/min), um die im Überstand vorhandenen restlichen roten Zellen nach Resuspendieren des Pellets in der Lyselösung zu entfernen.
Das Pellet der weißen Zellen wurde über Nacht bei 42°C mit 3.7 mM einer Lyselösung lysiert, welche zusammengesetzt war aus:

– 3 ml TE 10-2 (Tris-HCl 10 mM, EDTA 2 mM)/NaCl 0.4 M,
– 200 μl SDS 10%, und
– 500 μl K-Proteinase (2 mg K-Proteinase in TE 10-2/NaCl 0.4 M).

Für die Extraktion von Proteinen wurde 1 ml gesättigte NaCl (6 M) (1/3.5 v/v) hinzugefügt. Nach kräftigem Rühren wurde die Lösung für 20 Minuten bei 10000 U/min zentrifugiert.
Für die Präzipitation von DNA wurden 2 bis 3 Volumen von 100% Ethanol zu dem vorherigen Überstand hinzugefügt, und die Lösung wurde für 30 Minuten bei 2000 U/min zentrifugiert. Die DNA-Lösung wurde zum Entfernen von Salzen dreimal mit 70% Ethanol gespült, und für 20 Minuten bei 2000 U/min zentrifugiert. Das Pellet wurde bei 37°C getrocknet und in 1 ml TE 10-1 oder 1 ml Wasser resuspendiert. Die DNA-Konzentration wurde durch Messen des OD bei 260 nm (1 OD-Einheit = 50 μg/ml DNA) evaluiert.
Um die Gegenwart von Proteinen in der DNA-Lösung zu bestimmen, wurde das OD 260/OD 280-Verhältnis bestimmt. Lediglich DNA-Präparate mit einem OD 260/OD 280-Verhältnis zwischen 1.8 und 2 wurden für die nachstehend beschriebenen Beispiele verwendet.
Der Pool wurde durch Mischen äquivalenter Mengen von DNA aus einem jeden Individuum erzeugt.
Beispiel 2
Detektion der biallelischen Marker: Amplifikation von genomischer DNA mittels PCR
Die Amplifikation spezifischer genomischer Sequenzen der DNA-Proben aus Beispiel 1 wurde an dem vorab erhaltenen DNA-Pool durchgeführt. Zusätzlich wurden 50 einzelne Proben auf ähnliche Art und Weise amplifiziert.

Die PCR-Assays wurden unter Verwendung des nachfolgenden Protokolls durchgeführt:

Endvolumen	25 μl
DNA	2 ng/μl
MgCl₂	2 mM
dNTP (jeweils)	200 μM
Primer (jeweils)	2.9 ng/μl
Ampli Taq Gold DNA-Polymerase	0.05 Einheiten/μl
PCR-Puffer (10 × = 0.1 M Tris-HCl, pH 8.3, 0.5 M KCl)	1x

Ein jedes Paar von ersten Primern wurde unter Verwendung der Sequenzinformationen des FLAP-Gens (GenBank 182657, Kennedy et al., 1991, auf welches hiermit Bezug genommen wird) und der OSP-Software (Hillier & Green, 1991) entworfen. Diesen ersten Primer besaßen eine Länge von etwa 20 Nukleotiden, wobei ihre jeweiligen Sequenzen in Tabelle 1 offenbart sind. Tabelle 1

Amplikon	Bereich der Position des Amplikons in SEQ ID Nr. 1		PU	Bereich der Position des Amplifikationsprimers in SEQ ID Nr. 1		RP	Komplementärer Bereich der Position des Amplifikationsprimers in SEQ ID Nr. 1
10-517	3851	4189	B15	3851	3869	C15	4171	4189
10-518	4120	4390	B16	4120	4138	C16	4372	4390
10-253	4373	4792	B1	4373	4391	C1	4773	4792
10-499	4814	5043	B2	4814	4833	C2	5026	5043
10-500	4956	5422	B3	4956	4972	C3	5405	5422
10-522	5524	5996	B17	5524	5542	C17	5978	5996
10-503	6218	6672	B4	6218	6235	C4	6652	6672
10-504	6522	6790	B5	6522	6539	C5	6772	6790
10-204	7120	7574	B6	7120	7137	C6	7557	7574
10-32	7513	7933	B7	7513	7531	C7	7914	7933
10-33	16114	16533	B8	16114	16132	C8	16515	16533
10-34	24072	24425	B9	24072	24089	C9	24408	24425
10-35	27978	28401	B10	27978	27995	C10	28384	28401
10-36	36020	36465	B11	36020	36039	C11	36446	36465
10-498	36318	36669	B12	36318	36337	C12	36652	36669
12-629	38441	38840	B13	38441	38460	C13	38820	38840
12-628	42233	42749	B14	42233	42253	C14	42731	42749

Bevorzugt enthielten die Primer einen gemeinsamen Oligonukleotidschwanz stromaufwärts der für die Amplifikation angesteuerten spezifischen Basen, welcher für eine Sequenzierung von Nutzen war.
Die Primer PU enthalten die nachfolgende zusätzliche PU 5'-Sequenz: TGTAAAACGACGGCCAGT (SEQ ID Nr. 14); die Primer RP enthalten die nachfolgende RP 5'-Sequenz: CAGGAAACAGCTATGACC (SEQ ID Nr. 15).
Die Synthese dieser Primer wurde mittels einer GENSET UFPS 24.1-Synthesevorrichtung entsprechend dem Phosphoramiditverfahren durchgeführt.
Die DNA-Amplifikation wurde auf einem Genius II-Thermocycler durchgeführt. Nach Erwärmen für 10 min bei 94°C wurden 40 Zyklen durchgeführt. Jeder Zyklus umfasste: 30 s bei 94°C, 1 min bei 55°C, und 30 s bei 72°C. Für die abschließende Elongation beenden 7 min bei 72°C die Amplifikation. Die Mengen der erhaltenen Amplifikationsprodukte wurden auf Mikrotiterplaten mit 96 Vertiefungen unter Verwendung eines Fluorometers und Picogreen als interkalierendem Mittel (molekulare Sonden) bestimmt.
Beispiel 3
Detektion der biallelischen Marker: Sequenzierung von amplifizierter genomischer DNA und Identifizierung von Polymorphismen
Die Sequenzierung der im Beispiel 2 erhaltenen amplifizierten DNA wurde auf ABI 377-Sequenzierern durchgeführt. Die Sequenzen der Amplifikationsprodukte wurden unter Verwendung automatisierter Didesoxyterminator-Sequenzierungsreaktionen im Rahmen eines zyklischen Sequenzierungsprotokolls mit farbstoffmarkiertem Terminator bestimmt. Die Produkte der Sequenzierungsreaktionen ließ man auf Sequenziergelen laufen, und die Sequenzen wurden bestimmt.
Die Sequenzdaten wurden durch Detektieren der Gegenwart biallelischer Marker in den zusammengefassten amplifizierten Fragmenten weiterhin in Bezug auf Polymorphismen evaluiert. Die Suche nach Polymorphismen basierte auf der Gegenwart übereinander liegender Peaks im Elektrophoresemuster, welche aus unterschiedlichen, an der gleichen Position vorkommenden Basen resultieren.
17 Amplifikationsfragmente wurden analysiert. In diesen Segmenten wurden 28 biallelische Marker detektiert. Die Lokalisierung der biallelischen Marker war jene, welche in Tabelle 2 dargestellt ist.
BM bezeichnet den „biallelischen Marker”. All 1 und All 2 bezeichnen jeweils Allel 1 und Allel 2 des biallelischen Markers. „Häufigk. von All 2” bezeichnet die prozentuale Häufigkeit des Allels 2 in einer kaukasischen US-Kontrollpopulation, mit Ausnahme des biallelischen Markers 10-204/326, für welchen die Population die kaukasisch-französischen Kontrollen sind. Die Häufigkeiten entsprachen einer Population von 3 nach dem Zufallsprinzip ausgewähltes Blutspendern mit kaukasisch-französischem Ursprung.
Die Polymorphismen A14 (10-33-234) und A16 (10-33-327) wurden in Kennedy et al., 1991 beobachtet. Ihre Häufigkeiten in der Population waren jedoch unbekannt, weshalb sie als nicht validierte biallelische Marker angesehen werden können, bevor die Ergebnisse der vorliegenden Erfinder erhalten wurden.
Beispiel 4
Validierung der Polymorphismen durch Mikrosequenzierung
Die in Beispiel 3 identifizierten biallelischen Marker wurden weiterhin bestätigt und ihre jeweiligen Häufigkeiten durch Mikrosequenzierung bestimmt. Eine Mikrosequenzierung wurde für jede einzelne der in Beispiel 1 beschriebenen DNA-Proben durchgeführt.
Die Amplifikation genomischer DNA von Individuen wurde mittels PCR, wie vorstehend zur Detektion der biallelischen Marker beschrieben, unter Verwendung des gleichen Satzes an PCR-Primern durchgeführt (Tabelle 1).

Die bevorzugten in der Mikrosequenzierung verwendeten Primer wiesen eine Länge von etwa 19 Nukleotiden auf und hybridisierten unmittelbar stromaufwärts der betrachteten polymorphen Base. Ihre Sequenzen sind nachstehend in Tabelle 3 offenbart. Tabelle 3

Name des Markers	Biallelischer Marker	Mis. 1	Bereich der Position des Mikrosequenzierungsprimers Mis. 1 in SEQ ID Nr. 1		Mis. 2	Komplementärer Bereich der Position des Mikrosequenzierungsprimers Mis. 2 in SEQ ID Nr. 1
10-517-100	A25	D25	3930	3949	E25	3951	3970
10-518-125	A26	D26	4223	4242	E26	4244	4263
10-518-194	A27	D27	4292	4311	E27	4313	4332
10-253-118	A1	D1	4470	4489	E1	4491	4510
10-253-298	A2	D2	4650	4669	E2	4671	4690
10-253-315	A3	D3	4667	4686	E3	4688	4707
10-499-155	A4	D4	4948	4967	E4	4969	4988
10-500-185	A5	D5	5120	5139	E5	5141	5160
10-500-258	A6	D6	5193	5212	E6	5214	5233
10-500-410	A7	D7	5344	5363	E7	5365	5384
10-522-71	A28	D28	5574	5593	E28	5595	5614
10-503-159	A8	D8	6350	6369	E8	6371	6390
10-504-172	A9	D9	6673	6692	E9	6694	6713
10-504-243	A10	D10	6743	6762	E10	6764	6783
10-204-326	A11	D11	7425	7444	E11	7446	7465
10-32-357	A12	D12	7850	7869	E12	7871	7890
10-33-175	A13	D13	16268	16287	E13	16289	16308
10-33-234	A14	D14	16327	16346	E14	16348	16367
10-33-270	A15	D15	16363	16382	E15	16384	16403
10-33-327	A16	D16	16420	16439	E16	16441	16460
10-34-290	A17	D17	24341	24360	E17	24362	24381
10-35-358	A18	D18	28316	28335	E18	28337	28356
10-35-390	A19	D19	28348	28367	E19	28369	28388
10-36-164	A20	D20	36163	36182	E20	36184	36203
10-498-192	A21	D21	36489	36508	E21	36510	36529
12-629-241	A22	D22	38661	38680	E22	38682	38701
12-628-311	A24	D24	42420	42439	E24	42441	42460
12-628-306	A23	D23	42425	42444	E23	42446	42465

Mis 1 bzw. Mis 2 bezeichnen Mikrosequenzierungsprimer, welche an den nicht-kodierenden Strang des FLAP-Gens oder an den kodierenden Strang des FLAP-Gens hybridisierten.
Die Mikrosequenzierungsreaktion wurde wie folgt durchgeführt:
5 μl der PCR-Produkte wurden zu 5 μl Reinigungsgemisch 2U SAP (Shrimp alkalische Phosphatase) (Amersham E70092X)), 2U Exonuklease I (Amersham E70073Z), 1 μl SAP-Puffer (200 mM Tris-HCl, pH 8, 100 mM MgCl₂) in einer Mikrotiterplatte hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde für 30 Minuten bei 37°C inkubiert, und anschließend für 10 Minuten bei 94°C denaturiert. Zu jeder Vertiefung wurden anschließend 20 μl eines Mikrosequenzierungsreaktionsgemisches hinzugefügt, welches enthielt: 10 pmol Mikrosequenzierungsoligonukleotid (19-mere, GENSET, Rohsynthese, 5 OD), 1 U Thermosequenase (Amersham E79000G), 1.25 μl Thermosequenase-Puffer (260 mM Tris HCl, pH 9.5, 65 mM MgCl₂), und die beiden zu den Nukleotiden an der polymorphen Stelle komplementären, geeigneten fluoreszierenden ddNTPs, welche den beiden polymorphen Basen entsprechen (11.25 nM TAMRA-ddTTP, 16.25 nM ROX-ddCTP, 1.675 nM REG-ddATP, 1.25 nM RHO-ddGTP, Perkin Elmer, Farbstoffterminatorset 401095). Nach 4 Minuten bei 94°C wurden 20 PCR-Zyklen von 15 s bei 55°C, 5 s bei 72°C und 10 s bei 94°C in einem Tetrad PTC-225-Thermocycler (MJ Research) durchgeführt. Die Mikrotiterplatte wurde 10 s bei 1500 U/min zentrifugiert. Die nicht eingebauten Farbstoffterminatoren wurden durch Präzipitation mit 19 μl MgCl₂ 2 mM und 55 μl 100% Ethanol entfernt. Nach 15-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Mikrotiterplatte bei 3300 U/min für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Nach Verwerfen der Überstände wurde die Mikrotiterplatte unter vermindertem Druck bis zur Trockne eingedampft (Speed Vac); die Proben wurden in 2.5 μl Formamid-EDTA-Ladepuffer resuspendiert und für 2 min bei 95°C erwärmt. 10% (19:1) Polyacrylamid-Sequenziergel wurde mit 0.8 μl Mikrosequenzierungsreaktion beladen. Die Daten wurden mittels eines ABI PRISM 377 DNA-Sequenzierers gesammelt und unter Verwendung der GENESCAN-Software (Perkin Elmer) verarbeitet.
Beispiel 5
Assoziationsstudie zwischen Asthma und den biallelischen Markern des FLAP-Gens: Erfassung von DNA-Proben aus betroffenen und nicht-betroffenen Individuen
Das in dieser Assoziationsstudie verfolgte Erkrankungsmerkmal war Asthma, eine Erkrankung, in welcher der Leukotrien-Signalweg involviert ist.
Die asthmatische Population entsprach 297 Individuen, welche an einer klinischen Studie zur Evaluierung des antiasthmatischen Arzneimittels Zileuton teilnahmen. Mehr als 90% dieser 297 asthmatischen Individuen besaßen einen kaukasisch-ethnischen Hintergrund.
Die Kontrollpopulation entsprach nicht-betroffenen Individuen. In dieser Assoziationsstudie wird entweder eine kaukasisch-französische Population (190 Individuen) oder eine kaukasische US-Population (286 Individuen) als Kontrollpopulation verwendet. Die bevorzugte Kontrollpopulation ist die kaukasische US-Population, da die asthmatische Population im Wesentlichen US-Individuen umfasst.
Beispiel
Assoziationsstudie zwischen Asthma und den biallelischen Markern des FLAP-Gens: Genotypisierung von betroffenen Individuen und Kontrollindividuen
Die allgemeine Strategie zur Durchführung der Assoziationsstudien bestand darin, DNA-Proben von allen Individuen in jeder der vorstehend beschriebenen Populationen einzeln zu scannen, um die Allelhäufigkeiten der vorstehend beschriebenen biallelischen Marker in jeder dieser Populationen zu ermitteln.
Allelische Häufigkeiten der vorstehend beschriebenen biallelischen Marker in jeder Population wurden mittels Durchführung von Mikrosequenzierungsreaktionen an durch genomische PCR erhaltenen amplifizierten Fragmenten bestimmt, wobei die genomische PCR an den DNA-Proben eines jeden Individuums durchgeführt wurde. Die genomische PCR sowie die Mikrosequenzierung wurden, wie vorstehend in den Beispielen 2 und 4 ausführlich beschrieben, unter Verwendung der beschriebenen PCR- und Mikrosequenzierungsprimer durchgeführt.
Beispiel 7
Assoziationsstudie zwischen Asthma und den biallelischen Markern des FLAP-Gens
A) Assoziationsstudien in Bezug auf ein Asthma-Gen mit einer kaukasisch-französischen Kontrollpopulation
Diese Assoziationsstudie verwendet 293 asthmatische Individuen und 185 kaukasisch-französische Kontrollen.
Wie in 2(A) dargestellt ist, zeigten die Marker 10-32/357 und 10-35/390 eine starke Assoziation mit Asthma, wobei diese Assoziation hochsignifikant war (P-Wert 1.95 × 10^–3 für Marker 10-32/357 und 1.75 × 10^–3 für Marker 10-35-390). Die beiden Marker 10-32/357 und 10-35/390 können anschließend im Rahmen eines Tests, welcher auf jedem der Marker basiert, in der Diagnostik verwendet werden. Zwei andere Marker, nämlich 33/234 und 35/358, zeigten eine moderate Assoziation, wenn sie unabhängig voneinander untersucht wurden.
B) Assoziationsstudien in Bezug auf ein Asthma-Gen mit einer kaukasischen US-Kontrollpopulation
Diese Assoziationsstudie verwendet 297 asthmatische Individuen und 286 kaukasische-US-Kontrollen.
Wie in 2(B) dargestellt ist, zeigte der biallelische Marker 10-35/390 eine starke Assoziation mit Asthma, wobei diese Assoziation hochsignifikant war (P-Wert = 2.29 × 10^–3). Die beiden Marker 10-32/357 und 10-33/234 zeigten eine schwache Assoziation, wenn sie unabhängig voneinander untersucht wurden.
Der biallelische Marker 10-35/390 ist in der genomischen Sequenz von FLAP lokalisiert. Daher zeigen Ergebnisse der Assoziationsstudien, dass ein Polymorphismus des FLAP-Gens mit Asthma in Beziehung zu stehen scheint. Der biallelische Marker 10-35/390 kann anschließend im Rahmen eines Tests, welcher auf diesem Marker oder auf einer Kombination von diesen Marker umfassenden biallelischen Markern basiert, in der Diagnostik verwendet werden.
Beispiel 8
Assoziationsstudien: Haplotyp-Häufigkeitsanalyse
Eine Art, die statistische Aussagekraft einzelner Marker zu erhöhen, ist die Durchführung einer Haplotyp-Assoziationsanalyse.
Es wurde eine Haplotypanalyse für die Assoziation von FLAP-Markern und Asthma durch Abschätzen der Häufigkeiten aller möglichen Haplotypen, welche biallelische Marker ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 10-253/298, 10-321357, 10-331175, 10-33/234, 10-33/327, 10-351358, 10-35/390, 12-628/306 und 12-629/241 der in Beispiel 7 beschriebenen asthmatischen und kaukasischen US-Kontrollpopulationen umfassen, und Vergleichen dieser Häufigkeiten mittels eines statistischen Chi-Quadrat-Tests (ein Freiheitsgrad) durchgeführt. Haplotypschätzungen wurden durch Anwenden des Erwartungswert-Maximierungs(EM)-Algorithmus (Excoffier L. & Slatkin M., 1995) unter Verwendung des EM-HAPLO-Programms (Hawley M. E., Pakstis A. J. & Kidd K. K., 1994) durchgeführt.
Die signifikantesten erhaltenen Haplotypen sind in 3 dargestellt.
Die bevorzugten Zweimarker-Haplotypen, in 3 als HAP1 bis HAP 7 beschrieben, umfassen entweder den Marker 10-33/234 (Allel A) oder den Marker 10-35/390 (Allel T). Der stärker bevorzugte Zweimarker-Haplotyp HAP1 (A an 10-33/234 und T an 10-35/390) zeigte einen P-Wert von 8.2 × 10^–4 und eine Odds-Ratio von 1.61. Die geschätzten Haplotyphäufigkeiten betrugen in den Fällen 28.3% und in den US-Kontrollen 19.7%. Zwei andere Zweierhaplotypen HAP2 (A an 10-33/234 und G an 12-629/241) und HAP3 (T an 10-33/327 und T an 10-33/390) zeigten jeweils einen P-Wert von 1.6 × 10^–3 und 1.8 × 10^–3 eine Odds-Ratio von 1.65 und 1.53, und Haplotyphäufigkeiten von 0.305 und 0.307 für die asthmatische Population und von 0.210 und 0.224 für die US-Kontrollpopulation.
Bevorzugte Dreimarker-Haplotypen umfassen die Marker 10-33/234 (Allel A) und den Marker 10-35/390 (Allel T): HAP37, HAP38, HAP39 und HAP41. Der stärker bevorzugte Dreimarker-Haplotyp HAP37 (A an 10-33/234, T an 10-33/390 und C an 12-628/306) zeigte einen P-Wert von 8.6 × 10^–4 und eine Odds-Ratio von 1.76. Die geschätzten Haplotyphäufigkeiten in den Fällen betrugen 26.5% und in den US-Kontrollen 17.1%. Ein weiterer Dreimarker-Haplotyp HAP40 (A an 10-33/234, C an 12-628/306 und G an 12-629/241) ist ebenfalls signifikant.
Viermarker-Haplotypen (HAP121 bis HAP125), Fünfmarker-Haplotypen (HAP 247 und 248) und Sechsmarker-Haplotypen (HAP373) zeigten signifikante P-Werte. Sie alle umfassen den Marker 10-33/234 (Allel A) und den Marker 10-35/390 (Allel T), mit Ausnahme des Haplotyps HAP124, welcher den Marker 10-35/390 nicht umfasst. Die anderen Marker werden aus der Gruppe bestehend aus 10-235/298 (Allel C), 10-35/358 (Allel G), 12-628/306 (Allel C) und 12-629/241 (Allel G) ausgewählt.
Der ein A an 10-33/234 und T an 10-35/390 umfassende stärker bevorzugte Haplotyp (HAP1 in 3) ist auch in einer Haplotyp-Häufigkeitsanalyse mit einer asthmatischen Population und kaukasisch-französischen Kontrollen signifikant. In der Tat zeigte dieser Haplotyp einen P-Wert von 2.7 × 10^–3 und eine Odds-Ratio von 1.67. Die geschätzten Haplotyphäufigkeiten in den Fällen betrugen 28.3% und in den französischen Kontrollen 19.2% (siehe 4).
Der Haplotyp HAP1 stellt den stärker bevorzugten Haplotyp der Erfindung dar. Er kann zur Diagnose von Asthma verwendet werden. Darüber hinaus umfassen die meisten der mit Asthma assoziierten signifikanten Haplotypen den biallelischen Marker 10-35/390 (Allel A) und können ebenfalls zur Diagnose verwendet werden.
Die statistische Signifikanz der für die Haplotypanalyse erhaltenen Ergebnisse wurde mittels eines phänotypischen Permutationstests, welcher 1000 oder 10000 Mal auf einem Computer wiederholt wurde, evaluiert. Für diese Computersimulation wurden Daten der asthmatischen Individuen und der Kontrollindividuen zusammengefasst und nach dem Zufallsprinzip zwei Gruppen zugeordnet, welche die gleiche Anzahl von Individuen wie die zur Erzeugung der in 3 zusammengefassten Daten verwendeten Fall-Kontroll-Populationen enthielten. Anschließend wurde eine Haplotypanalyse dieser künstlichen Gruppen auf die im Haplotyp HAP1 umfassten 2 Marker durchgeführt, welcher die stärkste Assoziation mit Asthma zeigte. Dieses Experiment wurde 1000 und 10000 Mal wiederholt, wobei die Ergebnisse in 4 dargestellt sind. Diese Ergebnisse zeigen, dass unter 1000 Iterationen keiner und unter 10000 Iterationen lediglich 1 der erhaltenen Haplotypen einen P-Wert aufwies, welcher dem für den Haplotyp HAP1 erhaltenen Wert vergleichbar war. Diese Ergebnisse bestätigen eindeutig die statistische Signifikanz der Assoziation zwischen diesem Haplotyp und Asthma.
Beispiel 9
Herstellung von Antikörperzusammensetzungen gegen die 127-Ile-Variante von FLAP
Im Wesentlichen reines Protein oder Polypeptid wird aus transfizierten oder transformierten Zellen isoliert, welche einen für das FLAP-Protein oder einen Teil hiervon kodierenden Expressionsvektor enthalten. Die Konzentration an Protein in der endgültigen Zubereitung wird beispielsweise durch Aufkonzentration mittels einer Amicon-Filtervorrichtung auf einen Spiegel von wenigen Mikrogramm/ml eingestellt. Monoklonale oder polyklonale Antikörper gegen das Protein können anschließend wie folgt hergestellt werden:
A. Herstellung monoklonaler Antikörper durch Hybridomfusion
Monoklonale Antikörper gegen Epitope des FLAP-Proteins oder eines Teils hiervon können aus murinen Hybridomen gemäß dem klassischen Verfahren von Kohler, G. und Milstein, C. (1975) oder hiervon abgeleiteten Verfahren hergestellt werden. Siehe auch Harlow, E. und Lane, D., 1988.
Kurz gesagt wird eine Maus wiederholt mit ein paar Mikrogramm des FLAP-Proteins oder eines Teils hiervon über einen Zeitraum von einigen Wochen inokuliert. Die Maus wird anschließend geopfert, und die Antikörper-produzierenden Zellen der Milz isoliert. Die Milzzellen werden mittels Polyethylenglycol mit Myelomzellen aus Maus fusioniert, und die überschüssigen nicht-fusionierten Zellen durch Anzüchten des Systems auf einem Aminopterin umfassenden Selektionsmedium (HAT-Medium) zerstört. Die erfolgreich fusionierten Zellen werden verdünnt, und Aliquote der Verdünnung in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte platziert, in welchen sich das Wachstum der Kultur fortsetzt. Antikörper-produzierende Klone werden durch Detektion von Antikörper im überstehenden Fluid der Vertiefungen mittels Immunoassayverfahren wie beispielsweise ELISA, wie ursprünglich von Engvall, E. (1980) beschrieben, und hiervon abgeleiteten Verfahren identifiziert. Selektierte positive Klone können expandiert, und ihre monoklonalen Antikörperprodukte für eine Verwendung geerntet werden. Ausführliche Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper sind in Davis, L. et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, New York, Kapitel 21-2, beschrieben.
B. Herstellung polyklonaler Antikörper durch Immunisierung
Polyklonales Antiserum, welches Antikörper gegen heterogene Epitope des FLAP-Proteins oder eines Teils hiervon enthält, kann durch Immunisieren eines geeigneten nicht-menschlichen Tieres mit dem FLAP-Protein oder einem Teils hiervon, welches zur Erhöhung der Immunogenität nicht modifiziert oder modifiziert sein kann, hergestellt werden. Ein geeignetes nicht-menschliches Tier wird bevorzugt aus nicht-menschlichen Säugern ausgewählt, gewöhnlich einer Maus, einer Ratte, einem Kaninchen, einer Ziege oder einem Pferd. Alternativ kann eine Rohzubereitung, welche für eine Aufkonzentration von FLAP angereichert wurde, zur Erzeugung von Antikörpern verwendet werden. Derartige Proteine, Fragmente oder Zubereitungen werden in Gegenwart eines im Fachbereich bekannten geeigneten Hilfsmittels (z. B. Aluminiumhydroxid, RIBI, etc.) in den nicht-menschlichen Säuger eingebracht. Zusätzlich kann das Protein, das Fragment oder die Zubereitung mit einem die Antigenität erhöhenden Mittel vorbehandelt werden, wobei derartige Mittel im Fachbereich bekannt sind und beispielsweise methyliertes Rinderserum-Albumin (mRSA), Rinderserum-Albumin (RSA), Hepatitis B-Oberflächenantigen, und Schlüssellochschnecken-Hämocyanin (Keyhole Limpet Hämocyanin; KLH) umfassen. Das Serum aus dem immunisierten Tier wird gesammelt, behandelt und gemäß bekannten Verfahren untersucht. Enthält das Serum polyklonale Antikörper gegen unerwünschte Epitope, können die polyklonalen Antikörper mittels Immunoaffinitätschromatographie gereinigt werden.
Eine wirksame Herstellung polyklonaler Antikörper wird durch viele Faktoren, welche sowohl mit dem Antigen als auch mit der Wirtsspezies in Beziehung stehen, beeinflusst. Auch Wirtstiere variieren in ihrer Ansprechbarkeit entsprechend der Inokulationsstelle und Dosis, wobei sowohl unangemessene Dosen als auch Überdosen an Antigen zu Antiseren mit niedrigem Titer führen. Geringe Dosen (ng-Spiegel) an Antigen, welche an mehreren intradermalen Stellen verabreicht werden, scheinen am zuverlässigsten zu sein. Techniken zur Herstellung und Verarbeitung polyklonaler Antiseren sind im Fachbereich bekannt, wobei beispielsweise auf Mayer und Walker (1987) verwiesen wird. Ein wirksames Immunisierungsprotokoll für Kaninchen findet sich in Vaitukaitis, J. et al. (1971).
Booster-Injektionen können in regelmäßigen Intervallen vorgenommen und Antiserum geerntet werden, wenn der Antikörpertiter hiervon, wie semiquantitativ durch beispielsweise durch doppelte Immunodiffusion in Agar gegenüber bekannten Konzentrationen des Antigens bestimmt wird, zu fallen beginnt. Siehe beispielsweise Ouchterlony, O. et al. (1973). Die Plateaukonzentration des Antikörpers liegt gewöhnlich im Bereich von 0.1 bis 0.2 mg/ml an Serum (etwa 12 μM). Die Affinität der Antiseren für das Antigen wird durch Erzeugung kompetitiver Bindungskurven bestimmt, wie beispielsweise von Fisher, D. (1980) beschrieben.
Antikörperzubereitungen, welche entweder gemäß dem monoklonalen Protokoll oder gemäß dem polyklonalen Protokoll hergestellt wurden, sind in quantitativen Immunoassays von Nutzen, welche die Konzentrationen von Antikörger-tragenden Substanzen in biologischen Proben bestimmen. Sie werden ferner semiquantitativ oder qualitativ zur Identifizierung der Gegenwart von Antigen in einer biologischen Probe verwendet. Die Antikörper können ferner in therapeutischen Zusammensetzungen zum Abtöten von Zellen verwendet werden, welche das Protein exprimieren oder die Proteinspiegel im Körper verringern.
Während die bevorzugte Ausführungsform der Erfindung veranschaulicht und beschrieben wurde, versteht es sich, dass verschiedene Veränderungen hierin von einem Fachmann vorgenommen werden können, ohne dabei von Erfindungsgedanken und -bereich abzuweichen.
LITERATURSTELLEN

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Claims

Verfahren zur Genotypisierung, umfassend das Bestimmen der Identität eines Nukleotids bei einem mit Asthma assoziierten, mit FLAP in Beziehung stehenden biallelischen Marker gemäß SEQ ID Nr. 1 oder des Komplements hiervon in einer biologischen Probe, wobei der mit FLAP in Beziehung stehende biallelische Marker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den biallelischen Markern in den Positionen 3950, 4243, 4312, 4490, 4670, 4687, 4968, 5140, 5213, 5364, 5594, 6370, 6693, 6763, 7445, 7870, 16288, 16347, 16383, 16440, 24361, 28336, 28368, 36183, 36509, 38681, 42440 und 42445 von SEQ ID Nr. 1.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die biologische Probe aus einem einzelnen Subjekt stammt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Identität der Nukleotide bei dem biallelischen Marker für beiden Kopien des im Genom des Individuums vorhandenen biallelischen Markers bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die biologische Probe aus mehreren Subjekten stammt.
Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend das Amplifizieren eines Teils der den biallelischen Marker umfassenden Sequenz vor dem Bestimmungsschritt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Amplifizieren mittels POP durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Anspruche 1 bis 6, wobei das Bestimmen mittels eines Assays ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Hybridisierungsassay, einem Sequenzierungsassay, einem Mikrosequenzierungsassay und einem enzymbasierten Basenfehlpaarungs (Mismatch)-Nachweisassay durchgeführt wird.
Verfahren zur Abschätzung der Häufigkeit eines Allels eines mit FLAP in Beziehung stehenden biallelischen Markers in einer Kontrollpopulation oder in einer Asthma-positiven Population, umfassend: a) Genotypisieren von Individuen aus der Population bezüglich des biallelischen Markers nach einem der Ansprüche 1 bis 7, und b) Bestimmen der proportionalen Repräsentanz des biallelischen Markers in der Population.
Verfahren zum Nachweis einer Assoziation zwischen einem Genotyp und einem Phänotyp, umfassend die Schritte: a) Bestimmen der Häufigkeit von mindestens einem mit FLAP in Beziehung stehenden biallelischen Marker in einer Asthma-positiven Population gemäß dem Verfahren nach Anspruch 8; b) Bestimmen der Häufigkeit von mindestens einem mit FLAP in Beziehung stehenden biallelischen Marker in einer Kontrollpopulation gemäß dem Verfahren nach Anspruch 8, und c) Bestimmen, ob eine statistisch signifikante Assoziation zwischen dem Genotyp und dem Phänotyp besteht.
Verfahren zur Abschätzung der Häufigkeit eines Haplotyps für eine Reihe von biallelischen Markern in einer Kontrollpopulation oder in einer Asthma-positiven Population, umfassend: a) Genotypisieren mindestens eines mit FLAP in Beziehung stehenden biallelischen Markers nach Anspruch 3 für jedes Individuum der Population, b) Genotypisieren eines zweiten biallelischen Markers durch Bestimmen der Identität der Nukleotide bei dem zweiten biallelischen Marker für beide Kopien des im Genom jedes Individuums in der Population vorhandenen zweiten biallelischen Markers, und c) Anwenden eines Haplotyp-Bestimmungsverfahrens auf die Identitäten der in den Schritten a) und b) bestimmten Nukleotide, um eine Abschätzung der Häufigkeit zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Haplotyp-Bestimmungsverfahren ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus asymmetrischer PCR-Amplifizierung, doppelter PCR-Amplifizierung bestimmter Allele, dem Clark-Algorithmus, oder einem Erwartungswert-Maximierungs-Algorithmus.
Verfahren zum Nachweis einer Assoziation zwischen einem Haplotyp und einem Merkmal für Asthma, umfassend die Schritte: a) Abschätzen der Häufigkeit von mindestens einem Haplotyp in einer Asthma-positiven Population gemäß dem Verfahren nach Anspruch 10, b) Abschätzen der Häufigkeit des Haplotyps in einer Kontrollpopulation gemäß dem Verfahren nach Anspruch 10, und c) Bestimmen, ob eine statistisch signifikante Assoziation zwischen dem Haplotyp und dem Merkmal für Asthma besteht.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Genotypisierungsschritte a) und b) an einer einzelnen, zusammengefassten biologischen Probe, welche von jeder der Populationen stammt, durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Genotypisierungsschritte a) und b) an biologischen Proben, welche von jedem Individuum in den Populationen stammen, getrennt durchgeführt werden.
Verfahren nach entweder Anspruch 9 oder 12, wobei die Kontrollpopulation eine Asthma-negative Population ist.
Verfahren nach entweder Anspruch 9 oder 12, wobei die Kontrollpopulation eine nach dem Zufallsprinzip ausgewählte Population ist.
Verfahren zur Bestimmung, ob ein Individuum ein Risiko zur Entwicklung von Asthma besitzt, umfassend: a) Genotypisieren mindestens eines mit FLAP in Beziehung stehenden biallelischen Markers nach einem der Ansprüche 1 bis 7, und b) Korrelieren des Ergebnisses von Schritt a) mit einem Risiko zur Entwicklung von Asthma.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 19, wobei der mit FLAP in Beziehung stehende biallelische Marker ausgewählt wird aus der nachstehenden Liste der biallelischen Marker in den Positionen 4670, 16347, 16440, 28336, 28368, 38681 und 42445 von SEQ ID Nr. 1.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei der mit FLAP in Beziehung stehende biallelische Marker der biallelische Marker in Position 28368 von SEQ ID Nr. 1 ist.
Verwendung eines Polynukleotids, umfassend einen Bereich von mindestens 12 aufeinanderfolgenden Nukleotiden von SEQ ID Nr. 1 oder der komplementären Sequenz hierzu, zur Bestimmung der Identität des Nukleotids bei einem mit Asthma assoziierten, mit FLAP in Beziehung stehenden biallelischen Marker, wobei der mit FLAP in Beziehung stehende biallelische Marker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den biallelischen Markern in den Positionen 3950, 4243, 4312, 4490, 4670, 4687, 4968, 5140, 5213, 5364, 5594, 6370, 6693, 6763, 7445, 7870, 16288, 16347, 16383, 16440, 24361, 28336, 28368, 36183, 36509, 38681, 42440 und 42445 von SEQ ID Nr. 1.
Verwendung nach Anspruch 20 in einem Mikrosequenzierungsassay, wobei das 3'-Ende des aufeinanderfolgenden Bereichs am 3'-Ende des Polynukleotids lokalisiert ist, und wobei das 3'-Ende des Polynukleotids 1 Nukleotid stromaufwärts von dem mit FLAP in Beziehung stehenden biallelischen Marker in der Sequenz lokalisiert ist.
Verwendung nach Anspruch 20 in einem Hybridisierungsassay, wobei der Bereich den mit FLAP in Beziehung stehenden biallelischen Marker umfasst.
Verwendung nach Anspruch 20 in einem spezifischen Amplifizierungsassay, wobei das 3'-Ende des aufeinanderfolgenden Bereichs am 3'-Ende des Polynukleotids lokalisiert ist und der mit FLAP in Beziehung stehende biallelische Marker am 3'-Ende des Polynukleotids vorhanden ist.
Verwendung nach Anspruch 20 in einem Sequenzierungsassay, wobei das 3'-Ende des aufeinanderfolgenden Bereichs am 3'-Ende des Polynukleotids lokalisiert ist.
Verwendung nach Anspruch 20 bis 24, wobei der mit FLAP in Beziehung stehende biallelische Marker ein biallelischer Marker ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den biallelischen Markern in den Positionen 4670, 16347, 16440, 28336, 28368, 38681 und 42445 von SEQ ID Nr. 1 ist.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei der mit FLAP in Beziehung stehende biallelische Marker der biallelische Marker in Position 28368 von SEQ ID Nr. 1 ist.
Isoliertes, gereinigtes oder rekombinantes Polynukleotid, umfassend einen Bereich von mindestens 25 aufeinanderfolgenden Nukleotiden von SEQ ID Nr. 1 oder der komplementären Sequenz hiervon, wobei der aufeinanderfolgende Bereich umfasst: – ein Nukleotid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem A an Position 7445, einem A an Position 7870, einem A an Position 16383, einem T an Position 24361, einem G an Position 28336, einem T an Position 28368, einem A an Position 36183, und einem G an Position 36509 von SEQ ID Nr. 1.
Isoliertes, gereinigtes oder rekombinantes Polynukleotid, umfassend einen Bereich von mindestens 25 aufeinanderfolgenden Nukleotiden von SEQ ID Nr. 2 oder der komplementären Sequenz hiervon, wobei der aufeinanderfolgende Bereich ein A an Position 453 oder ein G an Position 779 von SEQ ID Nr. 2 umfasst.
Isoliertes, gereinigtes oder rekombinantes Polynukleotid, welches für ein Polypeptid, umfassend einen Bereich von mindestens 6 aufeinanderfolgenden Aminosäuren von SEQ ID Nr. 3, kodiert, wobei der aufeinanderfolgende Bereich einen Isoleucinrest an Aminosäureposition 127 in SEQ ID Nr. 3 umfasst.
Rekombinanter Vektor, umfassend ein Polynukleotid nach einem der Ansprüche 27 bis 29.
Wirtszelle, umfassend einen rekombinanten Vektor nach Anspruch 30.
Isoliertes, gereinigtes oder rekombinantes Polypeptid, umfassend einen Bereich von mindestens 6 aufeinanderfolgenden Aminosäuren von SEQ ID Nr. 3, wobei der aufeinanderfolgende Bereich einen Isoleucinrest an Aminosäureposition 127 von SEQ ID Nr. 3 umfasst.
Isolierte oder gereinigte Antikörper-Zusammensetzung, welche selektiv an ein Epitop-enthaltendes Fragment eines Polypeptids nach Anspruch 32 binden kann, wobei das Epitop einen Isoleucinrest an Aminosäureposition 127 von SEQ ID Nr. 3 umfasst.