CN1777683A - 在动物中鉴别遗传性状的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了在动物中筛选下列基因中是否存在多态性的实施方案，所述基因为CKM、SCN4α、及LDHα。

Description

在动物中鉴别遗传性状的方法
研究基金参考
本发明至少在部分上由USDA/CREES Contract Nos.99-CRHF-0-6019，及98-CRHR-0-6019(IAHAEES项目编号3148)提供支持。美国政府对本发明拥有一定的权利。
发明背景
遗传突变是进化和遗传多样性的基础。遗传标记是某一物种、种群或紧密相关物种的基因组中的特异基因座，并且这些标记基因座上不同基因型抽样调查揭示了遗传变异。标记基因座的遗传变异可以被描述及应用于遗传学研究，商业育种，诊断，及遗传分类学。当遗传标记是共显性的，高度遗传的，多等位的及数量众多时它们将是用处最大的。大多数遗传标记是可遗传的，因为它们的等位基因由DNA的核苷酸序列所确定，所述核苷酸序列从一代到下一代是高度保守的，并且它们等位基因的检出不受自然环境影响。标记有多个等位基因，因为在进化过程中，界定标记基因座的DNA序列中会以很低的频率出现可稳定遗传的突变，并且同其他已经存在的等位基因一起被散布到一代又一代中。DNA高度保守的特性与稳定突变的低频率发生一起使得遗传标记可以预期并且可以区分不同的基因型。当今全部的遗传标记技术可以允许在同一个项目中同时应用多项技术。每一项新的遗传标记技术和新的DNA多态性的发明都增加了新的遗传标记的应用。现有很多遗传标记技术，例如限制性片段长度多态性(restriction-fragment-length polymorphism，RFLP)(Bostein et al.(1980)Am J Hum Genet 32：314-331)；单链构象多态性(single-strandconformation polymorphism，SSCP)(Fischer et al.(1983)Proc NatlAcad Sci USA 80：1579-1583，Orita et al.(1989)Genomics 5：874-879)；扩增片段长度多态性(amplified fragment-length polymorphism，AFLP)(Vos et al.(1995)Nucleic Acids Res 23：4407-4414)；微卫星或单序列重复(microsatellite or single-sequence repeat，SSR)(Weber J L和May P E(1989)Am J Hum Genet 44：388-396)；快速扩增的多态性DNA(rapid-amplified polymorphic DNA，RAPD)(Williams et al(1990)Nucleic Acids Res 18：6531-6535)；序列标签位点(sequence tagged site，STS)(Olson et al.(1989)Science 245：1434-1435)；遗传比特分析(genetic-bit analysis，GBA)(Nikiforov et al(1994)Nucleic Acids Res22：4167-4175)；等位基因特异性聚合酶链反应(allele-specificpolymerase chain reaction，ASPCR)(Gibbs et al.(1989)Nucleic AcidsRes 17：2437-2448，Newton et al.(1989)Nucleic Acids Res17：2503-2516)；切口翻译PCR(nick-translation PCR)(例如TAQMANTM)(Lee et al.(1993)Nucleic Acids Res 21：3761-3766)；等位基因特异性杂交(allele-specific hybridization，ASH)(Wallace et al.(1979)Nucleic Acids Res 6：3543-3557，Sheldon et al.(1993)ClinicalChemistrys 39(4)：718-719)；及其他。每一项技术有其特定的基础用来检出DNA序列的多态性。
在动物个体中及在可以利用育种技术得到的具有所希望特征的动物品种中存在遗传差别。例如，人们知道中国品种在低龄时就到达性成熟期并且胎仔数多(large litter size)，而美国品种则生长速度快及较瘦。然而，所期望的性状经常是遗传能力较低的，而标准的基于表型变化来选择个体的育种方法并没有充分考虑遗传变异性或存在的复杂基因相互作用。
限制性片段长度多态性(RFLP)分析已经被几个研究小组用来研究猪DNA。Jung等人(Theor.Appl.Genet.77：271-274(1989)，并入本文作参考)揭示了RFLP技术在展现两个猪品种间遗传变异性中的应用。这些品种中的猪白细胞抗原(SLA)I类基因的多态性得到了证实。Hoganson等人(Abstract of Annual Meeting of Midwestern Section of theAmerican Society of Animal Science，March 26-28，1990，并入本文作参考)报告了中国猪的猪主要组织相容性复合体(MHC)基因的多态性，同样由RFLP分析所证实。Jung等人(Theor.Appl Genet.77：271-274(1989)，并入本文作参考)报告了特定公猪SLAI类基因的RFLP分析。作者认为实验结果提示猪SLA/MHC I类基因和生育及行为表现性状之间可能有相关性。他们进一步认为SLA I类限制性片段作为遗传标记的应用在未来用于提高猪的生长表现是有潜力的。
追踪一个特异的有益的遗传等位基因的能力包括鉴别一个主要效应基因的DNA分子标记的新的冗长的过程。该标记可能与一个具有主要效应的单一基因连锁或是与一些具有加性效应的基因连锁。DNA标记有几个优势：分离易于明确测量，DNA标记是共显性的(即杂合体和纯合体动物可以明显鉴别)。一旦一个标记体系被建立，选择决定可以很容易的作出，因为DNA标记可以在组织或血液样品能够从动物的婴儿个体甚至胚胎中收集后的任何时候被测定。
受体基因中的遗传差异的应用已经成为一个用于选择的很有价值的标记体系。例如，授予Rothschild等人的美国专利5,550,024和5,374,526公开了猪雌激素受体基因的一个多态性，所述多态性与胎仔数多有关，该文献并入本文作参考。美国专利5,935,784公开了猪促乳素受体基因的多态性标记，这些多态性标记与胎仔数多及总体繁殖效率有关。
生猪肉的品质受大量遗传与非遗传因素影响。后者包括农场经营，运输，宰杀及加工条件。肉类科学家已经对这些因素进行了充分大量的研究，并使肉质有了相当大的提高。此类研究的一部分也专注于动物的遗传背景，并且一部分研究已经揭示了遗传因素的重要性。这已使工业上注意到了动物选择性育种和基因技术的应用可以在提高猪肉品质上具有相当重要的地位。
DNA水平的信息可以帮助确定一个特异主要基因，它还可以协助我们对已经选择的数量性状的筛选。表型数据之外的分子信息可以提高选择的准确性从而提高选择效果。这种“标记辅助选择(MarkerAssisted Selection，MAS)”程序的附加应答范围已经被许多工作者从理论角度所考虑。一般说来，MAS对于低遗传力的和表型测量昂贵的性状更加有益。尽管如肉质和/或生长这样的性状并不典型的用此方法考虑，但是在这些性状中应用标记还是有很显著的优点。例如，Meuwissen和Goddard考虑了MAS对不同类型性状的影响，最大的是对于如肉质的性状的影响，此类性状是在宰杀之后才能测量的，在动物被宰杀前引入标记信息来选择可以产生高达64％的附加应答。对于可以在活的动物中测量的生长性状来说这一数字是8％，这个数字相对来说比较小。然而，一旦这种相关性得到证明，这个标记信息可以在动物通过表型测试或选择之前就得到应用(见下)，这种情况下可以预期高达38％的应答。
确实，遗传学改良经济性状的最好的方法是直接在选择下的种群中寻找相关的DNA标记。表型测量可以在育种组织核心种群的一些动物中持续进行。由于对这些性状的大部分的全面评估只能在宰杀后完成，数据必须在挑选出来宰杀的动物身上收集，而不能从可能用来育种的动物身上获得。
收集这种表型数据以检出相关DNA标记及验证用实验种群鉴别出的标记或测试候选基因。然后显著的标记或基因可以被直接并入选择过程。分子信息的一个优势是其在育种动物的幼年时期就可以获得，这意味着动物可以在生长表现测试完成之前就基于DNA标记得到预选择，这对于总体测试及选择体系是一个极大的优点。
因而，现实中存在对用于动物中基因型测定、特征保存(identityconservation)、标记辅助选择、遗传研究及核酸定位克隆的候选基因和遗传标记的需求。
所以本发明的目的之一在于提供是有用经济特征的指征的候选基因和基于或位于这些基因内的遗传标记。这些候选基因从如下一组选出：肌肉肌酸激酶(creatine kinase muscle，CKM)、电压控制的钠离子通道IVα型基因(SCN4α)、及乳酸脱氢酶α基因(LDHα)。
本发明的另一目的是提供一种检测手段用于确定这些遗传标记的存在。
本发明的另一目的是提供一种提高选择精确性的评估动物的方法及对于所希望的性状的育种方法。
本发明的另一目的是提供一种PCR扩增测试，其可以显著加快对标记存在性的确定。
本发明的其它目的及优点将部分在下面的说明书中列出，部分可从说明书中显而易见，或者可以从本发明实践中得到。本发明的目的及优点可以通过权利要求中特别指出的手段及其组合的方法得到。
发明概述
本发明涉及在多个猪基因中的另外的基因形式的发现，所述基因对于在动物育种中识别有益的遗传性状是有用的。在某种程度上所述基因在物种和动物之间是保守的，可以预期本发明公开的不同的等位基因也将与在其他产肉或产生经济效益的动物中的所述基因的变异性相关，这些动物包括牛、羊、鸡等等。识别这些等位基因为快速确定动物的基因型提供了方法。这种准确快速确定动物基因型的能力为在大量动物育种和分析中提供了标记辅助选择的改进的方法。
根据本发明，提供了鉴别动物中是否存在多态性的方法。另一实施方案包括一种确定用于育种的动物遗传潜力的方法。进一步的一个实施方案包括一种筛选动物的方法，此筛选方法用于确定那些更可能具有有利的肉质性状的动物，那些肌肉丰富(heavy muscling)和/或那些可能有骨骼肌痉挛病的动物。这些方法包括从动物中获取遗传样品，进一步包括检测在与提高肉质、肌肉丰富和/或骨骼肌痉挛病相关的基因中是否存在多态性，其中所述基因选自由肌肉肌酸激酶(CKM)、电压控制的钠离子通道IVα型基因(SCN4α)、及乳酸脱氢酶α基因(LDHα或LDHA)组成的一组。这些检测手段可以是限制性片段长度多态性(RFLP)、异源双链分析、单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳(DGGE)及温度梯度凝胶电泳(TGGE)。
本发明的方法进一步包括设立基于动物中是否存在一种基因型而对例如肉质和肌肉丰富的性状进行的评估，所述基因型与这些性状相关。
另一个实施方案包括分析动物的基因型来确定那些具有有利的等位基因组合的动物或是排除那些携带不利等位基因组合的动物，所述有利的等位基因与如肉质、肌肉丰富和/或患有骨骼肌痉挛病可能性增加等有利性状相关。
进一步的，本发明的实施方案包括扩增一些含有多态性的基因或其一部分。
可以考虑的影响肉质的因素包括但不限于如下所列：
眼肌Minolta色度(Loin Minolta Lightness，L*)：在43-47单位(由深色到浅色)之间可以接受，但是一般说来在这个范围中L*为43更好，即具有更高经济价值(这一点可能会依赖于市场，例如深一点颜色的猪肉在日本更受欢迎)。
眼肌日本肉色评分(JCS)：在2.5-5.0单位(由浅色到深色)之间可以接受，但是JCS为3-4更好。
眼肌大理石纹(marbling)(肌内脂肪水平)：通常高一些的大理石纹评分更好，因为其与更好的肉食用质量特征相关。
眼肌pH值：(死后24小时测量的肉的终酸度，这是唯一的最重要的猪肉品质的特征)，5.50-5.80是所希望的，但是5.80更好，因为其正面影响肉的色泽和(低)失水。
后腿(ham)Minolta色度(L*)：在43-52单位之间可以接受，但是低一些(43)更好。
后腿终pH值：高一些，例如5.80，更好。
滴水损失或失水：在1％-3％之间可以接受，但是低一些更好。
这些肉质的测定是被本领域技术人员普遍接受的例子。可参考以下文献来了解肉质特征：Sosnicki，A.A.，E.R.Wilson，E.B.Sheiss，A.deVries，1998“Is there a cost effective way to produce high qualitypork？”，Reciprocal Meat Conference Proceedings，Vol.51.
生长可以用很多标准方法中的任何一个如平均日增重，宰杀时体重等等来测量。
由于一些多态性可能包括了CKM、SCN4α、及LDHα蛋白质中氨基酸组成的变化，因此测试方法甚至可以包括确定这些蛋白质的氨基酸组成。此类纯化及分析的方法典型地包括用抗体萤光标记方法分离蛋白质，分离及纯化蛋白质(即通过反相HPLC系统)，及用自动蛋白质测序仪来鉴定存在的氨基酸序列。此类测试的方案是标准的且为本领域了解，其已在Ausubel et al.(eds.)，Short Protocols in MolecularBiology 4th ed.(John Wiley and Sons 1999)公开。
在一个优选的实施方案中分析了一个遗传样品。简要来说，遗传物质样品由动物中获得，分析此样品来确定在CKM、SCN4α、或LDHα基因中是否存在与由基因形式决定的肉质、肌肉丰富、和/或骨骼肌痉挛病相关的多态性。
如本领域技术人员所熟知，很多不同的技术可以用来对比核酸分子的序列差异，包括例如限制性片段长度多态性分析、异源双链分析、单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳及温度梯度电泳等方法。
在一个优选的实施方案中，多态性是指限制性片段长度多态性，此测试包括从分离的遗传物质中鉴别动物的CKM、SCN4α、或LDHα基因，将所述基因暴露于限制酶以获取该基因的具有不同长度的限制性片段，如用电泳或HPLC分离来分离限制性片段以形成一个限制图谱，将所获得的限制图谱与已知具有或已知不具有所希望的标记的CKM、SCN4α、或LDHα基因对比。如果一个动物在测试中对优选的标记是阳性的，可考虑将此动物加入育种程序。如果一个动物在测试中对优选的标记基因型不是阳性的，此动物可从测试组中去掉用作其他用途。单元型数据也可用于筛选多等位基因以用于不同方面，如肉质，肌肉丰富，和/或骨骼肌痉挛病。
在一个最优选的实施方案中，基因通过应用引物和DNA聚合酶扩增此基因的某一包含多态性的特定区域来分离。接下来用限制酶消化此扩增的区域，再次分离所得片段。RFLP模式可以用简单的片段染色或标记在扩增中使用的引物或三磷酸核苷来看到。在另一个实施方案中，本发明包括了筛选动物来确定动物的遗传潜力。每一头猪CKM、SCN4α、或LDHα基因的多态性被识别，并且将此多态性与肉质、肌肉丰富、和/或骨骼肌痉挛病相关联。优选地，RFLP分析被用来确定此多态性。
在另一个实施方案中，本发明包括了一种在猪以外的任何特定的经济动物中鉴别肉质、肌肉丰富、和/或骨骼肌痉挛病的遗传标记的方法。基于此基因在不同动物中的高度保守特性和多态性在这些高度保守区间的位置，还可以预期基于本发明的教导，不需要本文描述的常规测试之外的任何手段，这些标记就可以用于不同的动物物种来选择肉质、肌肉丰富、和/或骨骼肌痉挛病。饲养同种系或杂交种系或有相似遗传血统的雌雄动物，确定并使每一动物产生的肉质、肌肉丰富、和/或骨骼肌痉挛病相关。对序列可以获得的其他动物，可以进行序列的BLAST对比以确定是否该特定的等位基因与本发明公开的序列之一相似。此相似的多态性应该存在于其他动物和其他紧密相关的基因中。术语“相似的多态性”应是一种多态性，其与任何本文公开的，由BLAST对比所确定的多态性相同。
下列术语用来描述两个或更多个核酸或多核苷酸序列之间的关系：(a)“参考序列(reference sequence)”，(b)“对比窗(comparisonwindow)”，(c)“序列同一性(sequence identity)”，(d)“序列同一性百分比(percentage of sequence identity)”，及(e)“实质同一性(substantialidentity)”。
(a)如本文所用，“参考序列”是指一个确定的序列，其作为序列对比的基础。在本发明中参考序列是CKM、SCN4α、及LDHα。参考序列可以是一个指定序列的部分或全部，例如某一全长cDNA或基因序列的一个片段或此完整cDNA或基因序列。
(b)如本文所用，“对比窗”是指一个多核苷酸序列的相邻指定片段，其中所述多核苷酸序列可与一个参考序列对比并且其中多核苷酸序列在对比窗中的部分相对于参考序列可能含有添加或缺失(即缺口)，这是为了将两个序列最适地排列对比(所述参考序列不含有添加或缺失)。一般地，对比窗长度至少有20个相邻的核苷酸，并任选地是30，40，50，100个核苷酸，甚至更长。本领域技术人员了解为了避免由于在多核苷酸序列中引入缺口而产生的与参考序列的高度相似性，典型地引入了缺口减分(gap penalty)概念并且将其从相匹配的核苷酸数目中减去。
序列排列对比的方法在本领域中是为人所熟知的。用于对比的序列最适排列可以通过以下算法导出：局部同源性算法(Smith andWaterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981))；同源排列算法(Needlemanand Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970))；相似性搜索方法(Pearsonand Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444(1988))；这些算法的电脑化实施，包括但不限于：PC/Gene程序的CLUSTAL(Intelligenetics，Mountain View，California)，Wisconsin Genetics Software Package中的GAP，BESTFIT，BLAST，FASTA，及TFASTA(Genetics ComputerGroup(GCG)，575 Science Dr.，Madison，Wisconsin，USA)。CLUSTAL程序的详细描述见Higgins and Sharp，Gene 73：237-244(1988)，Higginsand Sharp，CABIOS 5：151-153(1989)，Corpet，et al.，Nucleic AcidsResearch 16：10881-90(1988)，Huang，et al.，Computer Applications inthe Biosciences 8：155-65(1992)，及Peterson，et al.，Methods inMolecular Biology 24：307-331(1994)。可用于数据库相似性搜索的BLAST系列程序包括：BLASTN，用于针对核苷酸数据库序列的核苷酸查询序列；BLASTX，用于针对蛋白质数据库序列的核苷酸查询序列；BLASTP，用于针对蛋白质数据库序列的蛋白质查询序列；TBLASTN，用于针对核苷酸数据库序列的蛋白质查询序列；及TBLASTX，用于针对核苷酸数据库序列的核苷酸查询序列。参见Current Protocols in Moleculat Biology第19章(Ausubel，et al.，Eds.，Greene Publishing and Wiley-Interscience，NewYork(1995))。
除非特别指出，本文提供的序列同一性/相似性值是指用BLAST2.0一套程序及默认参数得到的值(Altschul，et al.，NucleicAcids Research 25：3389-3402(1997))。进行BLAST分析的软件是可以公开获取的，例如通过National Center for Biotechnology Information(http：//www.hcbi.nlm.nih.gov/)获取。
这种算法首先鉴定高值序列对(high scoring sequence pairs，HSPs)，这是通过鉴别查询序列中一个长度为W的短字(short word)来完成的，所述短字在与一个同样长度的来自数据库序列的字对比中要与之相配或达到某个正阈值T。T被定义为相邻字分值阈(neighborhood word score threshold)，参见如上所述Ausubel，et al.。这些起始相邻字hit引发寻找包含它们在内的更长的HSPs。所述字hit接下来沿着每一个序列在两个方向上延伸，只要累积排列值继续上升，所述延伸就会继续进行下去。对于核苷酸序列来说，累积值是用参数M和N来计算的，M是一对匹配核苷酸的奖分，总是大于0，N是一对错配核苷酸的减分，总是小于0。对于氨基酸序列来说，累积值是用一个分值矩阵来计算的。字hit在每一个方向上的延伸当遇到如下情况时停止：累积排列值由曾经达到过的最高值下降了超过数值X；累积排列值由于累积了一个或多个残基对比而下降到0或更低；或者已经到达任何一个序列的末端。BLAST算法参数W，T，X确定了序列对比的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认字长W为11，预期值E为10，截止点为100，M＝5，N＝-4，且进行双链对比。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认字长W为3，预期值E为10，及默认BLOSUM62分值矩阵(Henikoff & Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)。
除计算序列同一性百分比外，BLAST算法还对两个序列的相似性进行统计学分析(见例如Karlin & Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5877(1993))。BLAST算法提供的对相似性的一个测量方法是最小总和概率(P(N))，其提供了对两个核苷酸或氨基酸序列偶然匹配的概率的指示。
BLAST搜索假设蛋白质可以象随机序列那样被模型化。然而，许多真正的蛋白质包含非随机序列区，其可能是同聚物片段，短周期重复片段，或者富含一个或几个氨基酸的区域。这类低复杂性区域可能在两个完全无关的蛋白质间能被排列对比，尽管蛋白质的其他区域完全不同。一些低复杂性过滤程序可以用来降低这种低复杂性排列对比。例如，SEG(Wooten and Federhen，Comput.Chem.，17：149-163(1993))和XNU(Claverie and States，Comput.Chem.，17：191-201(1993))低复杂性过滤程序可以单独或组合应用。
(c)如本文所用，“序列同一性”或“同一性”在有两个核酸或多肽序列的上下文中包括指两个序列中的残基在一个指定的对比窗中为最大相符而排列时是相同的。当序列同一性百分比用来指蛋白质时，应当了解在一些位置上尽管残基不同，他们的差别也通常是保守的氨基酸取代，即这里的氨基酸残基被其他具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的氨基酸残基所取代，因而并不改变分子的功能性质。在序列差别是保守取代残基时，序列同一性百分比可以向上调整以对于取代残基的保守特性进行修正。被这种保守取代残基所区分的序列称为具有“序列相似性”或“相似性”。作出这种调整的方式对于本领域技术人员是熟知的。典型地，其包括取值时将保守取代残基作为部分错配，而不是完全错配，从而提高序列同一性百分比。因而，例如相同的氨基酸分值是1，非保守取代残基分值是0，则保守取代残基分值是介于0和1之间的。保守取代残基的评分计算通过例如Meyers and Miller的算法(Computer Applic.Biol.Sci.，4：11-17(1988))及例如程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，California，USA)所执行的那样进行。
(d)如本文所用，“序列同一性百分比”意思是通过在对比窗中对比两个最适地排列的序列而确定的值，为了将两个序列最适地排列对比，其中多核苷酸序列在对比窗中的部分相对于参考序列可能包含添加或缺失(即缺口)，所述参考序列不含有添加或缺失。所述百分比通过确定两条序列中具有相同核酸碱基或氨基酸残基的位点数目(相配位点数)来计算。将相配位点数除以对比窗中的总位点数，再乘以100，就得到了序列同一性百分比。
(e)术语多核苷酸序列的“实质同一性”意思是一个多核苷酸包括一个序列，通过用一个所描述的排列对比程序及其标准参数计算，此序列对比于参考序列具有至少70％(更希望至少是80％，90％，最好是至少95％)的序列同一性。技术人员可以认识到，通过考虑密码子简并性，氨基酸相似性，阅读框定位等情况，这些数值可被适当的调整以确定相关的由两个核苷酸序列编码的蛋白质同一性。出于这些目的，氨基酸序列的实质同一性通常的意思是达到至少60％(更希望至少是70％，80％，90％，最好是至少95％)序列同一性。
这些程序和算法可以确定一个靶基因的特定多态性与本发明所公开的序列的相似性。可以预期所述多态性在其他动物中也存在，所述多态性在除本发明所揭示的动物之外的其他动物中的应用通过使用本发明的教导进行常规的参数优化即可进行。
还可以在另外的DNA标记的特异等位基因和已知与一个已表明与一特定性状相关的特定基因相关的DNA标记的等位基因之间建立连锁。因而在目前的情况下，以CKM、SCN4α、或LDHα基因为例，至少在短期内选择有希望生产具有更高品质的肉，肌肉丰富，和/或更低的患有骨骼肌痉挛病可能性的猪是可能的，或者可以通过选择与特定CKM、SCN4α、或LDHα基因的等位基因相关的标记来间接去除可能生产具有较差品质的肉，较少肌肉，和/或可能患有骨骼肌痉挛病的猪，所述标记的选择是通过选择不同染色体标记的特异等位基因来完成的。
如本文所用，特定的多态性通常是以特定的限制酶的名称定义的。这并不是暗示应用所述限制酶是识别此位点的唯一方法。本领域技术人员有很多可用的数据库和资源可以用来识别其他限制酶，所述限制酶可以用来识别一个特定的多态性，例如http：//darwin.bio.geneseo.edu可以基于对一个序列的分析和待鉴定的多态性来提供限制酶。事实上如本文所教导的，有很多用不同方法识别一个特定多态性或等位基因的方式，这些方法甚至不一定包括限制酶，而同样可以检测基因或蛋白质组的不同形式。
在本发明另一个实施方案中，鉴别并公开了新的编码猪CKM、SCN4α、和LDHα的猪核苷酸序列。还公开了猪CKM、SCN4α、和LDHα基因的cDNA及一些内含子DNA序列。这些序列可以用来设计引物来检测本发明的SNP或生成重组CKM、SCN4α、或LDHα。本发明意在包括这些序列及其所有被保守修饰的变体，以及在高度严格条件下与所公开序列杂交的序列。本文所用的术语CKM、SCN4α、和LDHα应解释为包括所述被保守修饰的变体和所述与所公开序列杂交的序列。
术语“被保守修饰的变体”在氨基酸和核酸序列中都可以应用。对于特定的核酸序列，被保守修饰的变体是指编码相同或被保守修饰的氨基酸序列的核酸。由于遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码某一特定的蛋白质。例如密码子GCA，GCC，GCG及GCU都编码丙氨酸。因而，在每一个由密码子限定的丙氨酸的位点上，该密码子可以改为前述的相关密码子而不改变所编码的多肽。这类核酸变体称为“沉默变体”，其代表了一种被保守修饰的变体。参考遗传密码，本发明提到的每一个编码多肽的核酸序列也描述了该核酸每一种可能的沉默变体。本领域技术人员应该了解核酸中每一个密码子(除了通常是编码甲硫氨酸的唯一密码子AUG和通常是编码色氨酸的唯一密码子UGG)都可以被修饰而获得一个功能上相同的分子。因而，编码本发明多肽的核酸的每一个沉默变体都包含在所述的多肽序列中，并且在本发明的范围之内。
对于氨基酸序列，本领域技术人员应该了解如下的对核酸、肽、多肽、或蛋白质序列的单独的取代、缺失或添加属于“被保守修饰的变体”，其中通过取代、缺失或添加在所编码的序列中改变、缺失或添加一个或一小部分氨基酸，此改变结果是一个氨基酸被一个化学上相似的氨基酸取代。因而，由1-15组成的整数组中选择的任何一个数目的氨基酸残基可以被改变。因而，可以得到例如1、2、3、4、5、7、或10个改变。被保守修饰的变体典型的提供与其所衍生自的，未修饰的多肽序列相似的生物学活性。例如，底物特异性、酶活性、或配体/受体结合通常是天然蛋白质对其底物的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。提供功能性相似的氨基酸的保守取代表在本领域是为人所熟知的。
下列六组每一个包含了互相可以保守取代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)
2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)
3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)
4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)
5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)
6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)
还参见Creighton，Proteins，W.H.Freeman and Company(1994).
对于特定的核酸，“编码”或“被编码”是指将翻译信息包含进指定的蛋白质。编码蛋白质的一个核酸可以在核酸的翻译区域内部包含非翻译序列(如内含子)，也可以缺乏此类插入的非翻译序列(如在cDNA中)。编码蛋白质的信息由密码子来决定。典型地，核酸用“通用”遗传密码来编码氨基酸序列。然而，如在一些植物、动物、真菌线粒体、公山羊支原体(Mycoplasma capricolum)、或纤毛虫Macronucleus中存在的那样，当核酸在其中表达时，通用密码的变体也可以使用。
术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括探针与其靶序列杂交的条件，所述杂交应比探针与其他序列杂交达到可探测到的更高的程度(例如至少超过背景2倍)。严格条件依赖于序列，并且在不同环境下是不同的。通过控制杂交和/或漂洗条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。还可以调整严格性条件以允许一些序列中的错配，从而可以检测到较低程度的相似性(异源探测)。一般说来，探针长度小于1000个核苷酸，任选地小于500个核苷酸。
典型地，严格条件是盐浓度小于大约1.5M钠离子，典型地是在pH值7.0至8.3下大约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐类)，对于短探针(例如10至50个核苷酸)温度至少是大约30℃，对于长探针(例如大于50个核苷酸)则至少是大约60℃。严格条件还可以通过加入去稳定剂如甲酰胺来获得。举例性的低严格条件包括用含30-35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液在37℃杂交，然后在1X至2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中在50-55℃漂洗。举例性的中等严格条件包括在40-45％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS中于37℃杂交，然后在0.5X至1X SSC中于55-50℃漂洗。举例性的高严格条件包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中于37℃杂交，然后在0.1X SSC中于60-65℃漂洗。
特异性典型地是杂交后漂洗的功能，其关键因素是最终漂洗溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交物，Tm可以从方程Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L(Meinkoth and Wahl，Anal.Biochem.，138：267-284(1984))近似得到，这里M是一价阳离子的摩尔数，％GC是DNA中鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸的百分比，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分比，L是杂交体的长度，以碱基对数目表示。Tm是50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在限定的离子强度及pH值下)。每1％的错配会导致Tm下降约1℃，因此，可以调节Tm、杂交和/或漂洗条件来与具有所希望的同一性的序列杂交。例如，如果搜寻的是同一性大于等于90％的序列，Tm可以降低10℃。一般说来，为了在限定的离子强度及pH值下的特异序列及其互补物，可以选择严格条件使其比解链温度Tm低大约5℃。然而，极强严格条件可以利用比解链温度Tm低1、2、3、或4℃的杂交和/或漂洗，中等严格条件可以利用比解链温度Tm低6、7、8、9、或10℃的杂交和/或漂洗，低严格条件可以利用比解链温度Tm低11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或漂洗。利用此方程、杂交和漂洗的组合物、及所希望的Tm，本领域技术人员能够了解杂交和/或漂洗的严格性的变化已经被固有地描述出来。如果所希望的错配程度使得Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，优选的是提高SSC浓度从而可以使用更高的温度。关于核酸杂交的广泛指导参见：Tijssen，LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization withNucleic Acids Probes，Part I，Chapter 2，Ausubel，et al.，Eds.，GreenePublishing and Wilet-Interscience，New York(1995)。
附图简述
图1展示了用于计算单元型取代效应的三个单元型的结果。
优选的实施方案的详细描述
本发明涉及揭示CKM、SCN4α、和LDHα基因中是否存在多态性的方法。已经发现在这些基因中是否存在一个或多个多态性与动物的肉质、肌肉丰富、和/或骨骼肌痉挛病相关。
肌肉肌酸激酶基因在如骨骼肌这样有独特需求的组织中编码了一个对能量转移(ATP+肌酸＝ADP+磷酸肌酸)很重要的细胞质蛋白质。此基因的物理学图谱位置是SSC6。
肌酸激酶/磷酸肌酸系统是一个产能系统，其主要在大脑、肌肉、心脏、视网膜、脂肪组织及肾脏中起作用(Wallimann et al.，Biochem.J.，281：21-401(1992))。肌酸激酶(CK)是一个磷酸转移酶，其在局部细胞内位点可逆地催化一个磷酸基基团从磷酸肌酸转移到ADP来产生作为细胞中主要能量来源的ATP。CK在具有间歇性高的及波动的能量需求的细胞的能量稳态中占有重要地位，所述细胞如神经元、光受体和肌肉细胞。CK的表达具有组织特异性：CK-M(肌肉型)和CK-B(脑型)。CK定位在与产生能量(糖酵解和线粒体)或消耗能量(肌动球蛋白ATP酶和Ca++-ATP酶)的位置功能性偶联的离散的细胞器中。
电压控制的钠离子通道IVα型基因(SCN4α)在骨骼肌中编码一个整合膜蛋白，其调节用来控制兴奋收缩的可兴奋膜上的电压依赖性的Na+通透性。已经提出此基因为猪应激综合征的一个候选基因。人和马的SCN4α突变会引起高血钾性周期性瘫痪(HYPP)，这是一种以伴随着肌肉僵硬和痉挛的高度兴奋为特征的疾病。在马中，HYPP在选择出的肌肉丰富的马中出现。预期SCN4α基因位于猪的12p染色体上，此染色体与感兴趣的肉质相关。已分析的基因组PCR产物包括一个SCN4α外显子1-3的563bp(356bp来自外显子，207bp来自内含子)的PCR产物，并且在多个品种中直接测序，而且很多可能有用的SNPs也得到了鉴定。一个SNP影响外显子2中推断的氨基酸翻译(缬氨酸到异亮氨酸)。一头氟烷阴性猪的编码区已经被用来寻找导致肌肉震颤和肌肉极其丰富的突变：疑似猪和对照猪的编码区从7个重叠的cDNA产物中用RT-PCR扩增出并测序，这些猪中每一头的包括部分5’UTR和3’UTR的完整编码区(总共6279bp)也被测序。额外的疑似猪(另一头痉挛的氟烷阴性猪及Randy Schmidt的同窝出生崽(2)及应激猪的母亲(2))的由基因组DNA扩增而来的外显子24也被用来搜寻突变，所述外显子24是最大的(大约1232bp)同时可能是最感兴趣的(一些人肌肉疾病的突变和马HYPP突变就位于这里)。在猪SCN4α基因中总共找到了大量的SNPs，其中三个导致了氨基酸的改变。为这三者设计了PCR-RFLP(PstI，SalI，及BsrI)。我们相关的研究将这些SNP与肉质联系在了一起。
乳酸脱氢酶α在无氧糖酵解的最后一步将乳酸转化为丙酮酸。乳酸脱氢酶(LDH；EC 1.1.127)以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)为辅酶催化乳酸和丙酮酸的互相转化(Everse，J.，and N.O.Kaplan.1973.Lactate dehydrogenase：structure and function.Adv.Enzymol.28：61-133)。在脊椎动物中，LDH同工酶有三个不同的亚基：LDH-A(肌肉)、LDH-B(心脏)、和LDH-C(睾丸)(Market，C.L.，Shaklee，J.B.&Whitt，G.S.(1975)Science 189：102-114)。
根据本发明，申请人已经识别了CKM、SCN4α、和LDHα基因的几个不同的等位基因，所述基因与动物的肉质、肌肉丰富、和/或患有骨骼肌痉挛病的可能性相关。
应该了解本文公开的发明不限于特定的方法、草案、本文所描述的动物物种或属、及诸如此类可能变化的内容。还应该了解本文所用术语仅仅是为了描述特定的实施方案，不是为了限定本发明的范围，本发明的范围只在权利要求书中得到限定。
为了本发明的目的，如下术语被如下所述定义：
如本文所用，“等位基因”意思是一个基因座的不同的形式。
如本文所用，“基因座”是指一个核酸区域，其为多态性核酸所处的地方。
如本文所用，“探针核酸”是RNA或DNA或它们的类似物。探针可以是任何长度的。典型探针包括PCR引物、PCR扩增子、及被克隆的编码感兴趣的基因座的基因组核酸。
如本文所用，“遗传标记”意思是任何形态学的、生化的、或基于核酸的表形差异，所述差异揭示了DNA多态性。一些遗传标记的例子包括但不限于RFLP、RAPD、及AFLP。
如本文所用，“有利的肉质和/或肌肉生长”是指有利的肉质、肌肉丰富、和/或患有骨骼肌痉挛病的可能性。其意思是在许多可测量的肉质或肌肉生长性状(肌肉丰富和/或患有骨骼肌痉挛病)中的一个性状的显著增加或减少(改善)，所述改善应在一个给定种群的平均值之上，从而此信息可被用来获取一个均一的种群，所述种群对于肉质和/或肌肉生长是最优化的。依赖于所希望的特征，所述最优化可以包括对一些性状的增加或对其他性状的减少。
如本文所用，“基因型测定”意思是用候选基因和遗传标记确定个体的遗传组成的方法。
如本文所用，“基因型”意思是一个生物体的遗传结构，其区别于该生物体的物理学表观(表型)。
根据本发明，这些多态性与这些性状的相关性使得特异品种或遗传品系或动物的遗传标记可以在动物生命的早期通过肉质、肌肉丰富、和/或骨骼肌痉挛病识别。
一个根据本发明识别的单核苷酸多态性显示了位于CKM基因(SEQ ID NO：1)5’UTR的一个单核苷酸从C(等位基因1)变为T(等位基因2)。用限制酶MspA1I建立了对此多态性的测试。
本发明的另一实施方案描述了一个被鉴定的单核苷酸多态性，其中CKM基因(SEQ ID NO：2)的一个单核苷酸从G(等位基因1)变为T(等位基因2)。用限制酶BamHI建立了对此多态性的测试。
本发明的另一实施方案是一个在CKM基因的外显子2(SEQ IDNO：2)中的9个碱基对(bp)的插入/缺失。所研究的等位基因是在等位基因1中存在但在等位基因2中不存在的一段-TGAGCTTCC-核苷酸序列。
还实施了进一步的单元型分析以鉴定在CKM中已鉴定的标记的有利组合(见实施例10)。
另一实施方案是在猪SCN4α基因中找到了一个单核苷酸多态性，该多态性由如下改变所显现：(a)外显子24(SEQ ID NO：3)中一个C(等位基因1)变为G(等位基因2)；(b)外显子11(SEQ ID NO：4)中一个G变为A(G/A)；或(c)外显子2(SEQ ID NO：5)中一个G变为A(G/A)。分别用限制酶BsrI(a)，PstI(b)，和SalI(c)建立了对这些多态性的测试。此基因的物理学图谱位置是SSC12(2/3)p13-p11。
另一个根据本发明识别的单核苷酸多态性是猪LDHα基因外显子5(SEQ ID NO：6)中的一个沉默突变，其特征是一个多态性的碱基R，其中R是G或A。用限制酶AciI建立了对此多态性的测试。
本发明因此涉及对于动物中有经济价值的性状的遗传标记。所述标记代表了与肉质、肌肉丰富、和/或骨骼肌痉挛病性状显著相关的等位基因，因而其提供了一个动物基因型测定的方法以确定那些在饲养时更有可能产生肉质、肌肉丰富、和/或骨骼肌痉挛病(这些性状中一个或全部的水平)的动物，所述确定通过鉴定与这些性状相关的CKM、SCN4α、或LDHα基因中是否存在多态性来完成。
因而，本发明涉及识别一个特定动物、品种、株系、种群、或组中的动物的遗传标记和方法，其中所述动物有更高的可能性来获取肉质、肌肉丰富、和/或骨骼肌痉挛病的肉。
任何鉴定是否存在这些标记的方法都可以应用，包括例如单链构象多态性分析(SSCP)、碱基切除序列扫描(BESS)、RFLP分析、异源双链分析、变性梯度凝胶电泳，及温度梯度电泳、等位基因PCR、连接酶链式反应指导测序、微量测序、核酸杂交、CKM、SCN4α、或LDHα基因或其他CKM、SCN4α、或LDHα基因相关序列的生物芯片类型探测。同样在本发明的范围中还包括检测在此多态性存在下发生的蛋白质构象或序列改变。此多态性可能是也可能不是引起所述改变的突变，但其可以暗示存在所述改变，并且人们可以检测导致表型差异的基因或蛋白质基础。
下面是一个关于可以用来检测多态性的本发明的技术的一般概述。
在本发明中，从动物身上获得一个遗传物质样品。样品可以获自血液、组织、精液等等。一般说来，外周血细胞作为样品来源，遗传物质是DNA。需获得足够量的细胞以提供足够量的DNA用于分析。此数量应是已知的或本领域技术人员很容易确定的。DNA用本领域技术人员所熟知的技术从血细胞中分离。
核酸分离及扩增
基因组DNA样品可从任何方便的来源获取，例如唾液、口腔细胞、发根、血液、脐带血、羊水、组织液、腹水、绒毛膜绒毛、及其他任何合适的、具有完整分裂间期细胞核或分裂中期细胞的细胞或组织样品。细胞可以从固体组织、新鲜的或保存的器官、或组织样品、或活体解剖中获取。样品可以含有未与生物材料天然混和的化合物如防腐剂、抗凝血剂、缓冲溶液、固定剂、营养物质、抗体、或相似物质。
从所述不同的来源中分离基因组DNA的方法在例如Kirby，DNAFingerprinting，An Introdiction，W.H.Freeman & Co.New York(1992)中有描述。基因组DNA还可以从培养的初级或次级细胞培养物中或衍生自任何上述组织样品的转化的细胞系中获取。
动物RNA样品也可以应用。RNA可以如Sambrook et al.所述从表达基因的组织中分离。RNA可以是总的细胞RNA、mRNA、多聚A+RNA(polyA+RNA)、或它们的任何组合。为得到最好的结果，所述RNA是纯化的，但是也可以是未经纯化的细胞质RNA。RNA可以被逆转录产生DNA，接下来此DNA可被用作扩增模板，如此PCR间接地扩增一个特异的RNA转录产物群。参见例如Sambrook，见上，Kawasaki et al.，Chapter 8 in PCR Technology，(1992)，见上，及Berg etal.，Hum.Genet.85：655-658(1990)。
PCR扩增
最普通的扩增手段是聚合酶链式反应(PCR)，如在U.S.Pat.Nos.4,683,195，4,683,202和4,965,188中所描述的。其中每一项专利都并入本文作参考。如果PCR用于扩增血细胞的靶区间，肝素化的全血应被抽入一密封真空管中与其他样品分开保存并戴干净手套操作。为得到最好的结果，血液应在收集之后立即加工，如果不能这样做，其应保存在一密封容器中置于4℃直到使用。其他生理液体中的细胞也可以检测。当应用这些液体中的任何一种时，液体中的细胞应通过离心从液体成分中分离出来。
组织应用无菌的一次性解剖刀及无菌针(或两把解剖刀)在5mm培养皿中大致绞碎。从组织切片中清除石蜡的步骤在很多本领域技术人员所熟知的专业手册中都有描述。
为用PCR扩增一个样品中的靶核酸序列，所述序列必须是扩增体系中的组分可接触到的。分离靶DNA的一种方法是粗提取，其对于相对大量的样品是很有用的。简要说来，来源于血液样品的单核细胞、来源于羊水的羊膜细胞、培养的绒毛膜绒毛细胞、或诸如此类的细胞通过标准步骤在无菌Ficoll-Hypaque梯度分层得到分离。收集间期细胞并在无菌磷酸缓冲盐溶液中漂洗3次后提取DNA。如果测试从外周血液淋巴细胞中得到的DNA，建议进行一次渗透压休克(将沉淀用蒸馏水处理10秒)，如果第一次漂洗后还可见残留红细胞，再进行两次额外漂洗。这可以防止血红蛋白携带的血红素基对PCR反应的抑制效应。如果样品收集后不立即进行PCR检测，可将其等分为每份含106细胞，在无菌Eppendorf管中离心，然后将干燥沉淀在-20℃冷冻保存直至使用。
细胞在含有50mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.5％Tween 20，0.5％NP40，加入100μg/ml蛋白酶K的缓冲液中重悬(每100μl中106具核细胞)。56℃培养2小时后，细胞在95℃加热10分钟灭活蛋白酶K，然后立即移到冰上(突然受冷)。如果出现整体聚集，应在相同缓冲液中进行另一轮消化。用10μl所述提取物进行扩增。
从组织如绒毛膜绒毛细胞或铺满培养的细胞中提取DNA时，上述含有蛋白酶K的缓冲液的用量可以根据组织样品量来变化。提取物在50-60℃培养4-10小时后在95℃培养10分钟灭活蛋白酶。在更长时间的培养中，应在大约4小时后加入原始浓度新鲜蛋白酶K。
当样品中含有少量细胞时，可用如Higuchi在“Simple and RapidPreparation of Samples for PCR”，PCR Technology，Ehrlich，H.A.(ed.)，Stockton Press，New York中所描述的方法来提取，此文献并入此处作参考。PCR可以用来在衍生自骨髓和外周血液培养的单个克隆的少量细胞中(1000-5000)扩增靶区间。样品中的细胞悬浮于20μl PCR裂解缓冲液(10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，2.5mM MgCl2，0.1mg/ml明胶，0.45％NP40，0.45％Tween 20)并冷冻直至使用。当将要进行PCR时，向在PCR裂解缓冲液中的细胞加入0.6μl蛋白酶K(2mg/ml)，然后加热样品至大约60℃培养1小时。通过加热样品至95℃培养10分钟后在冰上冷却灭活蛋白酶K来停止消化。
一个相对简单的提取DNA用来进行PCR的流程是采用自Milleret al.，Nucleic Acids Res.16：1215(1988)所描述的方法的盐析流程，此文献并入此处作参考。单核细胞在Ficoll-Hypaque梯度上分离，细胞悬浮于3ml裂解缓冲液(10mM Tris-HCl，400mM NaCl，2mM Na2EDTA，pH8.2)，加入50μl的20mg/ml蛋白酶K溶液和150μl的20％SDS溶液，然后37℃过夜培养。在培养过程中摇晃试管可以提高样品的消化。如果过夜培养后蛋白酶K消化仍不完全(仍然可以看见片段)，向溶液中加入另外50μl的20mg/ml蛋白酶K溶液并混匀，在一个轻轻摇动或滚动的平台上再次37℃过夜培养。充分消化后向溶液中加入1ml的6M NaCl溶液并充分混匀。所得溶液在3000rpm离心15分钟，沉淀中含有沉淀下来的细胞蛋白质，上清液含有DNA。将上清液移入一个装有4ml异丙醇的15ml试管，将试管中物质轻轻混和至水相和醇相已混匀并形成白色DNA沉淀，转移DNA沉淀并将其浸入70％乙醇溶液，轻轻混和，然后从乙醇中移出DNA沉淀并空气干燥。最后将沉淀置于蒸馏水中溶解。
用于PCR的高分子量DNA提取试剂盒包括一个基因组分离试剂盒A.S.A.P(“Genomic Isolation Kit A.S.A.P”，Boehringer Mannheim，Indianapolis，Ind.)，基因组DNA分离系统(GIBCO BRL，Gaithersburg，Md.)，Elu-Quik DNA纯化试剂盒(“Elu-Quik DNA Purification Kit”，Schleicher & Schuell，Keene，N.H.)，DNA提取试剂盒(“DNA ExtractionKit”，Stratagene，LaJolla，Calif.)，TurboGen分离试剂盒(“TurboGenIsolation Kit”，Invitrogen，San Diego，Calif.)，诸如此类。根据生产商的指导使用这些试剂盒纯化DNA在实践本发明的方法之前是通常是被接受的。
所提取的DNA的浓度和纯度可以用稀释的小份在260nm和280nm的吸收分光光度分析来确定。在DNA提取后可以进行PCR扩增。PCR每一个循环的第一步包括分离引物延伸形成的核酸双螺旋。一旦核酸链被分离，PCR的下一步包括将分离的核酸链与在靶序列侧翼的引物杂交，然后引物延伸形成靶链的互补拷贝。对于成功的PCR扩增，引物要设计为每一个引物沿着一个双螺旋序列杂交的位置是这样的：当从模板(互补体)分离开后，由一个引物合成的一个延伸产物可以作为另一个引物延伸的模板。变性、杂交、延伸循环重复所需次数以获得所希望数量的被扩增的核酸。
在一个尤其有用的PCR扩增的实施方案中，链分离通过加热该反应至一足够高的温度并持续足够长的时间以使双螺旋变性但并不导致聚合酶的不可逆变性来实现(参见U.S.Pat.No.4,965,188，并入此处作参考)。典型的热变性包括80℃-105℃的温度范围及几秒到几分钟不等的时间范围。然而，链分离可通过任何适当的变性方法来获得，这些方法包括物理的、化学的、或酶学的方式。链分离可以由例如一种解旋酶、或一种能够表现出解旋酶活性的酶来诱导，例如RecA酶在ATP存在时有解旋酶活性。本领域熟知适合通过解旋酶进行链分离的反应条件(参见Kuhn Hoffman-Berling，1978，CSH-QuantitativeBiology，43：63-67；及Radding，1982，Ann.Rev.Genetics 16：405-436，每一篇都并入此处作参考)。
PCR中引物的模板依赖性延伸由聚合剂催化，所述催化需要在有足够量的四种三磷酸脱氧核苷酸(典型的是dATP、dGTP、dCTP、dTTP)存在的，包含适宜的盐、金属阳离子、缓冲pH系统的反应介质中完成。合适的聚合剂是熟知的催化模板依赖性DNA合成的酶。在一些情况下，靶区间可编码细胞表达的蛋白质的一部分，在这种情况下，mRNA可以用来扩增靶区间。或者，PCR可以用来由RNA制备cDNA文库用于将来的扩增，引物延伸的初始模板是RNA。适宜用来由RNA合成互补拷贝DNA(cDNA)序列的聚合剂是逆转录酶(RT)，如禽类成髓细胞瘤病毒RT、莫洛尼鼠类白血病毒RT、或Thermus thermophilus(Tth)DNA聚合酶(一种热稳定的拥有逆转录酶活性的DNA聚合酶，由Perkin Elmer Cetus，Inc.销售)。典型地，基因组RNA模板在初始逆转录步骤后的第一步变性步骤中被热降解，只剩下DNA模板。可用于DNA模板的合适的酶包括例如大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I或其Klenow片断、T4DNA聚合酶、Tth聚合酶、及Taq聚合酶(一种热稳定的DNA聚合酶，分离自Thermus aquaticus，可购自Perkin ElmerCetus，Inc.)。后一种酶在核酸扩增及测序中被广泛应用。本领域熟知应用Taq聚合酶的反应条件，其被描述于Gelfand，1989，PCRTechnology，见上。
等位基因特异性PCR
等位基因特异性PCR区分一些在变异或多态性存在或不存在两种情况下是不同的靶区域。PCR扩增引物选自那些只能结合靶序列的特定等位基因的引物。此方法被描述于Gibbs，Nucleic Acid Res.17：12427-2448(1989)。
等位基因特异性寡核苷酸筛选方法
进一步的鉴别筛选方法应用了等位基因特异性寡核苷酸(ASO)筛选方法，如Saiki et al.，Nature 324：163-166(1986)所描述的。制备有一或多个碱基对错配的寡核苷酸用于任何特定的等位基因。
ASO筛选方法检出变体靶基因组DNA或PCR扩增的DNA与非突变的寡核苷酸之间的错配，表现出寡核苷酸的减弱的结合，所述减弱的结合是相对于突变的寡核苷酸而言。寡核苷酸探针可设计为在低严格性下，其与等位基因的多态性的形式都可以结合，但是在高严格性下，只结合与其相应的等位基因。或者，严格性条件可被设计为可获得基本上为二元的反应，即与一个靶基因的变异形式相应的ASO可与所述等位基因杂交，但不与野生型等位基因杂交。
连接酶介导的等位基因检测方法
检测物DNA的靶区域可与未受影响的及受影响的家族成员的靶区域通过连接酶介导的等位基因检测进行对比。参见Landegren et al.，Science 241：1077-1080(1988)。连接酶也可以用于检测连接扩增反应(参见Wu et al.，Genomics 4：560-569(1989))中的点突变。连接扩增反应(LAR)利用的是使用连续的模板依赖性连接循环进行的特异DNA序列的扩增，如Wu，见上，及Barany，Proc.Nat.Acad.Sci.88：189-193(1990)。
变性梯度凝胶电泳
用聚合酶链反应获得的扩增产物可以通过变性梯度凝胶电泳来分析。不同的等位基因可以根据不同的序列依赖性熔解性质和溶液中的DNA电泳迁移来鉴定。DNA分子在升高的温度或变性条件下熔解为片段，称为熔解域。每一个熔解域在一个独特的碱基特异的熔解温度(Tm)协同熔解。熔解域长度至少是20个碱基对，还可以多达几百个碱基对。
基于序列特异性熔解域差异的等位基因的区分可以用聚丙烯酰胺凝胶电泳来评估，如Chapter 7，Erlich，ed.，PCR Technology，“Principles and Applications for DNA Amplification”，W.H.Freeman andCo.，NewYork(1992)中所描述的。此文献内容并入此处作参考。
一般说来，用变性梯度凝胶电泳分析的靶区域是用靶序列侧翼的PCR引物扩增出来的，扩增的PCR产物在一个具有线性变性梯度的聚丙烯酰胺凝胶上上样，如Myers et al.，Meth.Enzymol.155：501-527(1986)，及Myers et al.，Genomic Analysis，A Practical Approach，K.Davies Ed.IRL Press Limited，Oxford，pp.95-139(1988)中所描述的，所述文献的内容并入此处作参考。所述电泳系统维持在稍低于靶序列熔解域的Tm的温度下。
在另一个变性梯度凝胶电泳的方法中，靶序列可以最初附着在一段GC核苷酸上，此段核苷酸称为GC夹(如Chapter 7，Erlich所描述的，见上)。优选地，GC夹中至少80％的核苷酸是鸟嘌呤或胞嘧啶。优选地，GC夹至少有30个碱基长。此方法尤其适合具有高Tm值的靶序列。
一般说来，靶区域通过如上所描述的聚合酶链式反应扩增。一个寡核苷酸PCR引物在其5’端携带至少30个碱基的富含GC序列，即GC夹区域，此区域在扩增过程中并入靶区域的5’端。产生的经过扩增的靶区域在如上所述的变性梯度条件下进行凝胶电泳。有一个单碱基改变的DNA片段会通过凝胶迁移至不同位置，此差别可以通过溴乙锭染色显示。
温度梯度凝胶电泳
温度梯度凝胶电泳(TGGE)基于与变性梯度凝胶电泳相同的基本原理，除了变性梯度是通过温度差别而不是一种化学变性剂的浓度差别产生之外。标准TGGE使用一套在电泳过程中具有温度梯度的电泳装置。当样品在具有以均衡浓度存在的化学变性剂的凝胶中迁移时，其会遇到不断上升的温度。TGGE的另一个方法，时间性温度梯度凝胶电泳(TTGE或tTGGE)在整块电泳凝胶中使用稳定升高的温度以获取同样的结果。当样品在凝胶中迁移时，整块凝胶的温度上升，导致样品在凝胶中迁移时遇到不断上升的温度。样品制备，包括并入GC夹的PCR扩增，及产物的显色与变性梯度凝胶电泳相同。
单链构象多态性分析
在CKM、SCN4α、和LDHα基因座的靶序列或等位基因可用单链构象多态性分析区分，此分析方法通过改变单链PCR产物的电泳迁移来识别碱基差异，此方法描述于Orita et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.85：2766-2770(1989)。扩增的PCR产物可由如上所述获得，然后被加热或用其他方式变性以形成单链扩增产物。单链核酸可重新折叠或形成二级结构，其部分地依赖于碱基序列。因而，单链扩增产物的电泳迁移率可以检测等位基因或靶序列的碱基序列差异。
错配的化学或酶切割
靶序列间的差异还可通过错配碱基对的差异化学切割检测，如Grompe et al.，Am.J.Hum.Genet.48：212-222(1991)中所述。在另一个方法中，靶序列间的差异可用错配碱基对的酶切割检出，如Nelson etal.，Nature Genetics 4：11-18(1993)中所述。简要说来，动物或被影响的家族成员的遗传物质可用来获得无错配的异源杂交体DNA双螺旋。如本文所用，“异源杂交体”意思是一个DNA双螺旋链，包括从一个动物身上获得的一条链，和从通常在所感兴趣的性状的表型方面不同的另一个动物身上获得的第二条链。对不含错配的异源杂交体的正选择可以识别小的插入、缺失、或其他多态性，所述多态性可能与CKM、SCN4α、和LDHα的多态性有关。
非凝胶系统
其他可能的技术包括非凝胶系统如TAQMANTM(Perkin Elmer)。在此系统中，寡核苷酸PCR引物被设计为在所研究的突变侧翼并且可以使该区域被PCR扩增。接下来设计第三个寡核苷酸探针来与包含在该基因不同等位基因间易于改变的碱基的区域杂交，此探针在5’及3’端均用荧光染料标记，这些染料是这样选择的：其中一种染料在相互如此接近的情况下其荧光将会被另一种猝灭而无法探测到。TaqDNA聚合酶作用下的，从相对于探针的位于模板5’端的PCR引物延伸导致附着在退火后的探针5’端的染料被Taq DNA聚合酶的5’核酸酶活性裂解。所述裂解消除了猝灭效应，使探针3’端的染料所发出的荧光可以被检测。通过以下事实产生了不同DNA分子间的判别：如果探针与模板分子杂交不完全，即存在某种形式的错配，则染料的裂解不会发生。因此，只有当寡核苷酸探针的核苷酸序列完全互补于其结合的模板分子时，猝灭才会被消除。一个反应混和物可以包含两个不同的探针序列，每一个都针对可能存在的不同的等位基因设计，从而使两个等位基因在一个反应中检出。
另一个技术包括一项侵入物检测(Invader Assay)，其包括依赖于一种荧光催化释放的等温扩增，参见第三波技术(Third WaveTechnology， www.twt.com)。
基于非PCR的DNA鉴别
基于包括一只动物或一个家族成员中限制性片段长度多态性在内的众多态性，与CKM、SCN4α、和LDHα相连锁的DNA序列可以在没有扩增步骤的情况下鉴定。杂交探针通常是通过互补碱基对与一个靶核苷酸全部或部分结合的寡核苷酸。依赖于杂交条件的严格性，探针典型地结合与探针序列缺少完全互补性的靶序列。探针被优选地直接或间接标记，从而通过检测探针是否存在，人们可以检出靶序列是否存在。直接标记方法包括放射性同位素标记，如用P32或S35标记。间接标记方法包括荧光标记、可结合亲和素或链亲和素的生物素复合物、或肽或蛋白标记。显色检出方法包括光致发光、德克萨斯红(Texas red)、罗丹明(rhodamine)及其衍生物、红隐色染料(red leucodye)及3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)、荧光蛋白(fluorescein)及其衍生物、丹磺酰(dansyl)、伞形花内酯(umbelliferone)及此类物质，或用辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶及此类物质。
杂交探针包括任何可与CKM、SCN4α、和LDHα所在的猪染色体杂交的核苷酸序列，从而定义了一个与CKM、SCN4α、和LDHα连锁的遗传标记，包括一个限制性片段长度多态性、一个高变区、重复元件、或一个可变数目串联重复。杂交探针可以是任何基因或一个合适的类似物。进一步合适的杂交探针包括外显子片段或cDNA的部分或已知的位于所述染色体相关区域的基因。
优选的根据本发明可应用的串联重复杂交探针是那些在一个特异基因座在高严格性杂交条件下识别较少量片段的探针，或那些当严格性条件降低时在所述基因座识别大量片段的探针。
可以应用一个或多个附加限制酶和/或探针和/或引物。附加的酶、构建的探针和引物可以用本领域普通技术的常规实验法所识别，并且应包括在本发明的范围之内。
尽管此处描述的方法可能是根据一个单一限制酶和一组单一引物的应用来措词，但是这些方法不仅限于此。如果需要，一个或多个附加的限制酶和/或探针和/或引物也可以应用。确实，在某些情况下应用显示特异单元型的标记组合可能是更加优选的。附加的酶、构建的探针和引物可以通过常规实验法及本文提供或并入的教导确定。
根据本发明，与肉质、肌肉丰富、和/或骨骼肌痉挛病相关的CKM、SCN4α、和LDHα基因的多态性已被识别。在一个实施方案中，标记是否存在可通过用限制性核酸内切酶的PCR-RFLP分析来检测，扩增引物可以通过类似的人、猪或其他的CKM、SCN4α、和LDHα序列来设计，这是因为多态性周围的区域有很高的同源性，或者可以通过已知的如GenBank中所举例的CKM、SCN4α、和LDHα基因序列数据来设计，甚至可以基于本文的教导和参考，通过从周围紧密围绕的基因的连锁数据获得的序列来设计。围绕在所述多态性周围的序列可以协助开发可替换的PCR测试，其中一个取自与所述多态性紧密相连序列的大约4-30个相连碱基的引物被应用于聚合酶链反应，以在用所希望的限制酶消化前大量扩增所述区域。引物不需要是精确互补的，基本上相同的序列也是可以接受的。用于PCR扩增的引物序列设计对于本领域技术人员是熟知的，其被详细讨论于Ausubel(ed.)，Short Protocols in Molecular Biology，4th Edition，John Wiley andSons(1999)。
下面是一个关于引物设计的简要描述。
引物设计策略
聚合酶链反应(PCR)方法越来越多的应用促进了很多帮助寡核苷酸设计或选择的程序的发展，所述寡核苷酸被用作PCR引物。在因特网上可免费使用的此类程序的四个例子是：Whitehead Institute的Mark Daly and Steve Lincoln的PRIMER(UNIX，VMS，DOS，和Macintosh)、Washington University in St.Louis的Phil Green andLaDeana Hiller的寡核苷酸选择程序(Oligonucleotide SelectionProgram，OSP)(UNIX，VMS，DOS，和Macintosh)、Yoshi的PGEN(仅用于DOS)、和University of Wisconsin的Bill Engels的Amplify(仅用于Macintosh)。通常这些程序通过搜寻已知重复序列元件的字节然后通过分析一个推定引物长度和GC含量使Tm最优化以帮助PCR引物设计。商业软件同样可以获得，而且引物选择程序正在迅速包含进大多数序列分析软件包中。
测序及PCR引物
设计用于测序或PCR引物的寡核苷酸需要选择一个适当的序列，其特异性的识别靶，然后要测试此序列以消除所述寡核苷酸具有稳定二级结构的可能性。序列中的反向重复可以用一个重复识别程序或RNA折叠程序(如上所述)来识别，如果观察到一个可能的茎结构，此引物的序列可以在任何一个方向上移动几个核苷酸以使所预期的二级结构最小化。寡核苷酸序列还应与合适的载体及所插入DNA的两条链都进行对比。显而易见，一个测序引物应当与靶DNA仅有一个单一的相配。同时建议排除与不希望的靶DNA序列仅有一个单一错配的引物。对那些用于扩增基因组DNA的PCR引物来说，引物序列应与GenBank数据库中的序列对比以确定是否有任何显著的匹配发生。如果此寡核苷酸序列存在于某个已知的DNA序列，特别重要的是如果存在于某个已知的重复元件，则此引物序列应加以改变。
本发明的方法和材料还可以更加广泛地用来评估猪DNA、用遗传学手段测定猪个体类型、及检出猪中的基因差异。特别地，猪基因组DNA的样品可通过参考一个或多个对照来评估，进而确定是否在CKM、SCN4α、或LDHα基因中存在多态性。优选地，RFLP分析可以实施于猪CKM、SCN4α、和LDHα基因，并将结果与对照进行对比。对照是另一头CKM、SCN4α、或LDHα基因的多态性已知的猪的CKM、SCN4α、或LDHα基因的RFLP分析结果。类似地，一头猪的CKM、SCN4α、或LDHα的基因型可由获取其基因组DNA的样品、在此DNA中进行CKM、SCN4α、或LDHα基因的RFLP分析、及与对照对比所获得的结果来确定。同样，对照是另一头猪的CKM、SCN4α、或LDHα基因的RFLP分析结果。这些结果通过指明所述猪的CKM、SCN4α、或LDHα基因中的多态性来用遗传学手段测定其类型。最后，猪之间的遗传学差异可通过获取至少两头猪的基因组样品、鉴定CKM、SCN4α、和LDHα基因中是否存在多态性、及对比所获得的结果来检出。
这些检测手段对于鉴定相关于如前所述的肉质、肌肉丰富、和/或骨骼肌痉挛病的遗传标记是有用的，对于鉴定CKM、SCN4α、或LDHα基因中的其他多态性及对于一般的猪基因型和表型的科学分析同样是有用的。
本文中的实例及方法公开了特定基因，其已经被鉴定具有多态性，所述多态性与一个有利性状正或负相关，所述有利性状对于携带此多态性的动物的肉质、肌肉丰富、和/或骨骼肌痉挛病有影响。鉴别基因中多态性的存在通常是通过单碱基变化做出的，此变化导致特定等位基因形式中的一个限制性位点。然而，如本文所说明的和讨论的那样，一个特定的等位基因可能有很多与其相关的碱基改变，对于预示同样多态性(等位基因)的所述碱基改变是可检测的。进一步地，其他遗传标记或基因可能与本文公开的多态性连锁，所以检测可以包括鉴定其他基因或基因片段，但其最终还是要依赖于对于相同多态性的动物的遗传鉴定。任何基于本文公开的等位基因差异的分类和识别动物的检测方法都应包含在本发明的范围内。
一旦一个多态性被鉴定并且对于一个特殊性状的相关性被建立，本领域技术人员应该了解有很多种针对此多态性测定动物的基因型的方法。设计此类替换性的测试仅仅为了本领域技术人员熟知的参数的最优化并且应属于本发明的范围，如本文充分描述的那样。
下面所述的实施例是为了更好的阐明本文所描述的发明，并不是希望在任何方面限定本发明。本领域技术人员应该认识到有很多可以通过常规实验法改变的不同的参数，其应当属于本发明的范围。
实施例
实施例1：猪肌肉肌酸激酶(CKM)MspA1I PCR-RFLP测试方案
我们对猪肌肉肌酸激酶基因(CKM)全长编码cDNA和部分5’UTR及3’UTR进行了测序。猪编码cDNA长度是1150bp。发现了位于5’UTR的一个新的多态性，并基于此发现开发了MspA1IPCR-RFLP测试。
扩增一个CKM MspA1I的扩增产物(amplimer) ：
5’引物CK522F：5’-CAG CCC ATA CAA GGC CAT GG-3’(SEQ IDNO：7)
3’引物CKPR：5’-CTG GCT GGG CTG TGC TGG AATAT CCT GGAGGC GAC AC-3’(SEQ ID NO：8)
PCR条件
1X PCR反应：
                                            体积(μl)
10xPCR缓冲溶液B                             1.0
MgCl2(15mM)                                1.0
dNTPs(2mM)                                  1.0
CK522F(10pmol/μl)                          0.525
CKPR(10pmol/μl)                            0.525
Promega Taq聚合酶(5U/μl)                   0.07
双蒸水                                      4.88
混和物总体积                                9.0
将PCR反应混和物保存于冰上。将PCR 96孔板或PCR 0.2ml试管置于冰上。将混和物分为9.0μl的等份，加入1.0μl 12.5ng/μl的基因组DNA或1μl DNA裂解液。
热循环在如下条件下进行：
1.4分钟    94℃    1个循环
2.45秒     94℃
3.45秒     62℃
4.45秒     72℃
5.返回第2步，再进行35个循环
6.12分钟    72℃    1个循环
CKM MspA1I限制酶消化方案：
                        1X体积(μl)
缓冲液C*(10X)          1.0
BSA(10mg/ml)            0.1
MspA1I(10U/μl)         0.3
双蒸水                  5.6
混和物终体积            7.0
*Promega
将MspA1I混和物分为7μl的等份，加入3μl PCR产物。在37℃保温。
凝胶电泳：
加入2μl橘黄G加样缓冲液，在4.0％Nusieve/Me(3∶1)琼脂糖凝胶上样。在150伏特进行电泳，产物在大约30分钟内分离。
每个等位基因的片段大小：等位基因1：146bp
                        等位基因2：120bp，26bp
                        单态性片段：87bp
下面列出的是CKM MspA1I多态性附近的DNA序列。
MspA1I-c/t-5’UTR
5’...CAGCCCATACAAGGCCATGGGGCTGGGCGCAAGGCACGCC
TGGGTTCAGGGTGGGCACGGTGCCCAGGCAGCGAAGCGAGAG
CGCAGCTGCCCTCCACCCCCCTCCTGGCCAGc/tGGCCCCTCCTG
ACCAATAGCACAACCTGGGCCCCCCCTATAAAAGGCCAGGGCT
GCAGTCCTGTCCTTTGGGTCAGTGTCGCCTCCAGGATACAGACG
CCCCTTCCAGCACAGCCCAGCCAG...3’(SEQ ID NO：1)
实施例2：猪肌肉肌酸激酶(CKM)BamHI PCR-RFLP测试方案
肌肉肌酸激酶基因在如骨骼肌这样有独特需求的组织中编码了一个对能量转移(ATP+肌酸＝ADP+磷酸肌酸)很重要的细胞质蛋白质。
连锁图谱位置
CKM S0220 rec.fracs.＝0.00，lods＝22.58
CKM GPI-2 rec.fracs.＝0.01，lods＝20.48
此位置距离CRC基因座大约1cM。然而，从ResPig得到的PiGMaP文件中的CRC基因型数据是很不完善的，因为其未展示与任何其他标记的显著连锁。
扩增一个CKM BamHI的扩增产物：
正向引物(CKF7)：5’-TCT GAC CCA GAG GTG TCA AG-3’(SEQ IDNO：9)
反向引物(CKMMR)：5’-CAG CCC ACG GTC ATG ATG AA-3’(SEQID NO：10)
PCR条件
反应体积：           10μl
PCR混和物：          1.5mM MgCl2
                     0.2mM dNTP
                     2.5pmol每种引物
                     0.35单位Taq聚合酶(Promega)
                     12.5ng DNA
将PCR反应混和物保存于冰上。将PCR96孔板或PCR 0.2ml试管置于冰上。将混和物分为9.0μl的等份，加入1.0μl 12.5ng/μl的基因组DNA或1μl DNA裂解液。
热循环用PTC100(MJ Research)程序“CKF7R”在如下条件下进行：
1.1X(95℃1分钟)
2.2X(95℃1分钟，57℃30秒，72℃30秒)
3.38X(94℃30秒，57℃30秒，72℃30秒)
CKM BamHI限制酶消化方案：
                        10X NEB缓冲溶液(μl)
BamHI缓冲液             1μl
100x BSA                0.1μl
双蒸水                  6.8μl
BamHI(20U/μl)          0.1μl(1U)
PCR产物                 2μl
                        10μl
每个等位基因的片段大小：等位基因1：193bp
                        等位基因2：105bp，88bp
                        单态性片段：bp
凝胶检测方法：：4％Nusieve 3∶1或Metaphor，约100Vh
BamHI单核苷酸多态性附近的猪CKM序列
BamHI-g/t-内含子的
5’...TCCATCTGGCTTCACCCTGGACGATGTCATCCAGACAGGTG
TGGACAATCCAGGTAAGCCTCCTTGGCGGAGCATCACAGGGCC
CGGGGGCTCCGGAAGCTGCCTGCCGGGCCTTGCGCCCACTCCC
TGGGCCTCCATGTTCCCACCTGTAAAATAGGACCCTACTCACGG
GGGCTGTGGTGAGGACCGAATGAGTTGAGGTGGTGAAGGGCTT
GGGACGGGGCCCGGCACGTGGCAAACCACCCGCTAAACATACA
TGAGCATGAACGGAGGCTCCCCGAGGAAGCCCTTGATGTTCCC
GGCCTCAGTTTCCTCACCTGAAAATTGGAACAACATAGGGCTC
TAGCGCACACAGAGCGGCGCCTGGCACGCAAGCGAGCTCTTGG
ATCCTGCCAGGGGGTGTCATGTTCCAGGCCTCTGTGTCC GCTCC
TTTCTCCAGGGACACCCTGCCAGGGCGAGTGGCACTGGGGCAG
GGGGCCAGGCTCGAGCCTGAGCTTCCGACTCAAGGGGTGATT
GGACGGAGAGGCTCTTTCTCCCACCTGGGAAACAAGAGCATCT
TTCATGGCTCTTTTTATCTGTGGGGGCTGATGGTCTAAGGTTCCG
AAATTTTTTAGAAGATTCCACAATTTGGGGACTCTGAAGTAGTT
TATGTATATACACACACACACACACACACACA::TATATATA::AAA
TGCTTTTTAGGGCCGCACCTGCGGTATGTGGAGATTCCCAGGCT
AGGGGTCGAATCACAGCTGTACCTGTCAGCCTACACCACAGCT
CACGGCAACGCCAGATCCTTAACCTGCTGAGCGAGGCCAGGGA
TCAAACTCATGTCCTCATGGATCTTAGGCCAGTTTGTTCACCAC
TGAGCCACGACAGCAACTCCCGAGGTAGTAATATTTTTAGCCTC
CCGCCCCTCCCCTCCTCACCCTCGACCTTCTCCGTTCTGACCCA
GAGGTGTCAAGTGAACTCCTGTGTGCACGCACACGTGTGCCCA
CACAGACACACACACACACACACGTGTGTGGGCGCAGTCTACA
CTGGACCCAGGAg/tCCTGGCCATTCCGAGCTGCGGACAAGCAC
CTCTGACCTCAACCCCCATCCCTGCCAGGTCACCCC...3’(SEQ ID
NO：2)
实施例3：猪肌肉肌酸激酶(CKM)9bp插入/删除的PCR-RFLP测试方案
此基因在如骨骼肌这样有独特需求的组织中编码了一个对能量转移(ATP+肌酸＝ADP+磷酸肌酸)很重要的细胞质蛋白质。
连锁图位置
CKM S0220 rec.fracs.＝0.00，lods＝22.58
CKM GPI-2 rec.fracs.＝0.01，lods＝20.48
此位置距离CRC基因座大约1cM。然而，从ResPig得到的PiGMaP文件中的CRC基因型数据是很不完善的，因为其未展示对任何其他标记的显著连锁。
扩增一个9bp插入/缺失CKM的扩增产物：
正向引物(CKF5)：5’-CGA GGG CTG TTA AAG GCC AAGGCT CCTTTC TCC AGG GAC AC-3’(SEQ ID NO：11)
反向引物(CGR6)：5’-ATC ATG CGC TTC ACC GAC TGGGAG AAAGAG CCT CTC CGT CC-3’(SEQ ID NO：12)
PCR条件
反应体积：     10μl
PCR混和物：    1.5mM MgCl2
               0.2mM dNTP
               2.5pmol每种引物
               0.35单位Taq聚合酶(Promega)
               12.5ng DNA
热循环用PTC100(MJ Research)程序“CKF5R6”在如下条件下进行：
1.1X(95℃1分钟)
2.2X(95℃1分钟，58℃30秒，72℃30秒)
3.38X(94℃30秒，58℃30秒，72℃30秒)
将PCR反应混和物保存于冰上。将PCR 96孔板或PCR0.2ml试管置于冰上。将混和物分为9.0μl的等份，加入1.0μl 12.5ng/μl的基因组DNA或1μl DNA裂解液。
PCR片段大小：110bp(在已测序的等位基因1中观察到)
             101bp(在已测序的等位基因2中观察到)
             注意：异源双螺旋有时出现在杂合子中
凝胶检出方法：：4％Nusieve 3∶1或Metaphor，约100Vh
9bp缺失多态性附近的猪CKM序列
·9bp del/ins-TGAGCTTCC-
5’...TCCATCTGGCTTCACCCTGGACGATGTCATCCAGACAGGTG
TGGACAATCCAGGTAAGCCTCCTTGGCGGAGCATCACAGGGCC
CGGGGGCTCCGGAAGCTGCCTGCCGGGCCTTGCGCCCACTCCC
TGGGCCTCCATGTTCCCACCTGTAAAATAGGACCCTACTCACGG
GGGCTGTGGTGAGGACCGAATGAGTTGAGGTGGTGAAGGGCTT
GGGACGGGGCCCGGCACGTGGCAAACCACCCGCTAAACATACA
TGAGCATGAACGGAGGCTCCCCGAGGAAGCCCTTGATGTTCCC
GGCCTCAGTTTCCTCACCTGAAAATTGGAACAACATAGGGCTC
AGCGCACACAGAGCGGCGCCTGGCACGCAAGCGAGCTCTTGG
ATCCTGCCAGGGGGTGTCATGTTCCAGGCCTCTGTGTCC GCTCC
TTTCTCCAGGGACACCCTGCCAGGGCGAGTGGCACTGGGGCAG
GGGGCCAGGCTCGAGCCTGAGCTTCCGACTCAAGGGGTGATT
GGACGGAGAGGCTCTTTCTCCCACCTGGGAAACAAGAGCATCT
TTCATGGCTCTTTTTATCTGTGGGGGCTGATGGTCTAAGGTTCCG
AAATTTTTTAGAAGATTCCACAATTTGGGGACTCTGAAGTAGTT
TATGTATATACACACACACACACACACACACA::TATATATA::AAA
TGCTTTTTAGGGCCGCACCTGCGGTATGTGGAGATTCCCAGGCT
AGGGGTCGAATCACAGCTGTACCTGTCAGCCTACACCACAGCT
CACGGCAACGCCAGATCCTTAACCTGCTGAGCGAGGCCAGGGA
TCAAACTCATGTCCTCATGGATCTTAGGCCAGTTTGTTCACCAC
TGAGCCACGACAGCAACTCCCGAGGTAGTAATATTTTTAGCCTC
CCGCCCCTCCCCTCCTCACCCTCGACCTTCTCCGTTCTGACCCA
GAGGTGTCAAGTGAACTCCTGTGTGCACGCACACGTGTGCCCA
CACAGACACACACACACACACACGTGTGTGGGCGCAGTCTACA
CTGGACCCAGGAGCCTGGCCATTCCGAGCTGCGGACAAGCACC
TCTGACCTCAACCCCCATCCCTGCCAGGTCACCCC...3’(SEQ IDNO：2)
实施例4：猪电压控制的钠离子通道IVα型(SCN4α)BsrI PCR-RFLP测试方案
电压控制的钠离子通道IVα型基因(SCN4α)在骨骼肌中编码一个整合膜蛋白，其调节用来控制兴奋收缩的可兴奋膜上的电压依赖性Na+通透性。已经提出此基因为猪应激综合征的一个候选基因。人和马的SCN4α突变会引起高血钾性周期性瘫痪(HYPP)，这是一种以伴随着肌肉僵硬和痉挛的高度兴奋为特征的疾病。
扩增一个262bp SCN4αBsrI的扩增产物
PCR-RFLP信息
引物序列：
正向引物SCF23：5’-ACG AGG AGG TGT GCG CCA TCA AG-3’(SEQ ID NO：13)
反向引物SCR35：5’-ATG AGC ACG AGC CCC ATG GCA G-3’(SEQID NO：14)
PCR条件
反应体积：        10μl
PCR混和物：       1.5mM MgCl2
                  0.2mM dNTP
                  2.5pmol每种引物
          最后加入5％DMSO。在加热器上融化100％DMSO，
边用移液器混和边加入，以避免沉淀。
          0.35U Taq聚合酶(Promega)
          12.5ng DNA
热循环用PTC100(MJ Research)程序“SCF23R35”(Bugs)在如下条件下 进行：
1.1X(95℃1分钟)
2.2X(95℃1分钟，64℃30秒，72℃30秒)
3.38X(94℃1分钟，64℃30秒，72℃30秒)
将PCR反应混和物保存于冰上。将PCR 96孔板或PCR 0.2ml试管置于冰上。将混和物分为9.0μl的等份，加入1.0μl 12.5ng/μl的基因组DNA或1μl DNA裂解液。
SCN4αBsrI限制酶消化方案：
10XNEB 3            1μl
100X BSA            0.1μl
双蒸水              6.7μl
BsrI(5U/μl)        0.2μl(1U)
PCR产物             2μl
                    10μl
在37℃保温。
每个等位基因的片段大小：等位基因1：262bp
                        等位基因2：190bp，72bp
凝胶检测方法：：3％Nusieve 3∶1琼脂糖，约150Vh
BsrI单核苷酸多态性附近的猪SCN4α序列
·BsrI-c/g，外显子24；序列-外显子24。
GCCTCGCCCTCTCCGACCTGATCCAGAAATACTTCGTGTCCCCC
ACGCTGTTTCGTGTGATCCGCCTGGCCAGGATCGGTCGCGTCCT
GCGGCTGATCCGCGGGGCCAAGGGCATCCGGACGCTGCTCTTT
GCCCTCATGATGTCGCTGCCCGCCCTCTTCAACATCGGCCTGCT
CCTCTTCCTGGTCATGTTCATCTACTCCATCTTCGGCATGTCCAA
CTTCGCCTACGTCAAGAAGGAGTCGGGCATCGACGACATGTTC
AACTTCGAGACCTTCGGCAACAGCATCATCTGCCTCTTCGAGAT
CACGACGTCGGCGGGCTGGGACGGGCTGCTCAACCCCATCCTC
AACAGCGGGCCCCCCGACTGCGACCCCACGCTGGAGAACCCG
GGCACCAGCGTCCGGGGCGACTGCGGCAACCCGTCCATCGGCA
TCTGCTTCTTCTGCAGCTACATCATCATCTCCTTCCTCATCGTGG
TCAACATGTACATCGCCATCATCCTGGAGAACTTCAACGTGGCC
ACGGAGGAGAGCAGCGAGCCCCTCGGGGAGGACGACTTCGAG
ATGTTCTACGAGACGTGGGAGAAGTTCGACCCCGACGCCACGC
AGTTCATCGACTACAGCCGCCTCTCGGACTTCGTGGACACCCTG
CAGGAGCCGCTGAGGATCGCCAAGCCCAACAAGATCAAGCTCA
TCACCATGGACCTGCCCATGGTGCCGGGGGACAAGATCCACTG
CCTGGACATCCTCTTCGCCCTGACCAAGGAGGTCCTGGGCGAC
TCTGGGGAGATGGACGCCCTCAAGGAGACCATGGAGGAGAAG
TTCATGGCTGCCAACCCCTCCAAGGTCTCCTACGAGCCCATCAC
CACCACGCTCAAGAGGAAGCACGAGGAGGTGTGCGCCATCAA
GATCCAGAGGGCCTACCGCCGGCACCTGCTCCAGCGCTCCGTG
AAGCAGGCGTCCTACATGTACCGCCAGAGCCACGACGGCGGTG
GCGGCGGGGACGGGGCCCCCGAGAAGGAGGGGCTGATTGCCG
ACACCATGAGCAAGATGTACGGCCAGGAGAACGGGAACAc/gCA
GTGCGCAGAGCCAGGGGGAGGCGAGGGGCTGGACAGGGGCCC
CCGAACCTGCCATGGGGCTCGTGCTCATCAGCCCCTCAGAGGC
CGCCCTCCCGCCCACCCCACCCCTGGGGCAGACTGTGCGCCCC
GGGGTCAAAGAGTCACTTGTCTAG(SEQ ID NO：3)
实施例5：猪电压控制的钠离子通道IVα型(SCN4α)PstI PCR-RFLP测试方案
此基因在骨骼肌中编码一个整合膜蛋白，其调节用来控制兴奋收缩的可兴奋膜上的电压依赖性Na+通透性。已经提出此基因为猪应激综合征的一个候选基因。人和马的SCN4α突变会引起高血钾性周期性瘫痪(HYPP)，这是一种以伴随着肌肉僵硬和痉挛的高度兴奋为特征的疾病。
PCR片段大小：236bp
扩增一个236bp SCN4αPstI扩增产物
正向引物SCF17：5’-GGA AGA GGC CCA CCA GAA G-3’(SEQ IDNO：15)
反向引物SCR18：5’-CAA GTT GCC CAC GGT GAG G-3’(SEQ IDNO：16)
1X PCR反应
反应体积：        10μl
PCR混和物：       1.5mM MgCl2
                  0.2mM dNTP
                  2.5pmol每种引物
                  0.35U Taq聚合酶(Promega)
          12.5ng DNA
将PCR反应混和物保存于冰上。将PCR 96孔板或PCR 0.2ml试管置于冰上。将混和物分为9.0μl的等份，加入1.0μl 12.5ng/μl的基因组DNA或1μl DNA裂解液。
热循环用MJ Research，Inc.PTC200或PTC100热循环仪在如下条件下 进行：
PTC100(MJ Research)程序“CKF5R6”
1.1X(95℃1分钟)
2.2X(95℃1分钟，58℃30秒，72℃30秒)
3.38X(94℃1分钟，58℃30秒，72℃30秒)
SCN4αPstI限制酶消化方案：
10X NEB缓冲液          1μl
100X BSA               0.1μl
双蒸水                 6.8μl
PstI(20U/μl)          0.1μl(2U)
PCR产物                2μl
                       10μl
在37℃保温。
每个等位基因的片段大小：等位基因1：236bp
                        等位基因2：162bp，74bp
凝胶检出方法：：3％Nusieve 3∶1琼脂糖，约150Vh
PstI单核苷酸多态性附近的猪SCN4α序列如下所示：
·PstI-g/a，外显子11；序列-外显子11
AGCTGGAAGAGGCCCACCAGAAGTGCCCACCGTGGTGGTACA
AGTGCTCCCACAAAGTGCTCATATGGAACTGCTGCg/aGCCCCTG
GATGAAGTTCAAGAACATCATCCACCTGATTGTCATGGACCCCT
TCGTGGACCTGGGCATCACCATCTGCATCGTGCTCAACACCCTC
TTCATGGCCATGGAGCATTACCCCATGACCGAGGAGTTTGACGC
CGTCCTCACCGTGGGCAACTTG(SEQ ID NO：4)
实施例6：猪电压控制的钠离子通道IVα型(SCN4α)SalI PCR-RFLP测试方案
此基因在骨骼肌中编码一个整合膜蛋白，其调节用来控制兴奋收缩的可兴奋膜上的电压依赖性Na+通透性。已经提出此基因为猪应激综合征的一个候选基因。人和马的SCN4α突变会引起高血钾性周期性瘫痪(HYPP)，这是一种以伴随着肌肉僵硬和痉挛的高度兴奋为特征的疾病。
PCR片段大小：153bp
扩增一个153bp SCN4αSalI的扩增产物
正向引物SCF29：5’-CGT CGT CAT CTG TCT GCC TG-3’(SEQ IDNO：17)
反向引物SCR30：5’-ATG GCG CTG CGC CTG TCG A-3’(SEQ IDNO：18)
PCR条件
反应体积：        10μl
PCR混和物：       1.5mM MgCl2
                  0.2mM dNTP
          2.5pmol每种引物
          0.35U Taq聚合酶(Promega)
          12.5ng DNA
将PCR反应混和物保存于冰上。将PCR 96孔板或PCR 0.2ml试管置于冰上。将混和物分为9.0μl的等份，加入1.0μl 12.5ng/μl的基因组DNA或1μl DNA裂解液。
热循环用PTC100(MJ Research)程序“SCF29R30”在如下条件下进行：
1.1X(95℃1分钟)
2.2X(95℃1分钟，59℃30秒，72℃30秒)
3.38X(94℃1分钟，59℃30秒，72℃30秒)
SCN4αSalI限制酶消化方案：
10X D缓冲液(Promega)1μl
双蒸水              6.9μl
SalI(10U/μl)       0.1μl(1U)
PCR产物             2μl
                    10μl
或：
10X NEB SalI缓冲液  1μl
100X BSA            0.1μl
双蒸水              6.9μl
SalI(20U/μl)       0.05μl(1U)
PCR产物             2μl
                    10μl
在37℃保温。
每个等位基因的片段大小：等位基因1：153bp
                        等位基因2：134bp，19bp
凝胶检测方法：：3％Nusieve 3∶1琼脂糖，约150Vh
SalI单核苷酸多态性附近的猪SCN4α序列如下所示：
·SalI-g/a，外显子2；限制性位点在反向引物中引入；序列-外显子1及外显子3之间。
GGCCCCGAGAGCCTGCGCCCCTTCACCCGGGAGTCCCTGGCTG
CCATAGAGCAGCGGGTGGTGGAGGAGGAGGCCCGGCAGCAGC
GGAACAAGCAGATGGAGATCGAGGAGCCAGAACGGAAGCCTC
GCAGCGACCTGGAGGCTGGCAAAAACCTGCCCCTTATCTATGG
GGACCCCCCACCCGAGGTCATCGGCATCCCTCTGGAGGACCTG
GATCCCTACTACAGCGACAAGAAGGTCAGGGCCTGGGCGGGTT
CCTCTGTCTGTCTGTCCGTCGTCATCTGTCTGCCTGTCCCGGGC
CTCACAGCTCTCTCCCTGCTTCAGACCTTCATCGTGCTCAACAA
GGGCAAGGCCATCTTCCGCTTCTCTGCCACGCCTGCTCTCTACG
TGCTGAGCCCCTTCAGCg/aTCGTCAGGCGCAGCGCCATCAAGG
TGCTCATCCACTCATATCCTGCCAGAGTCGGGCGAGCGCCGGGC
TGGGAAAAGGCAGGGGAGGGGTTTGGGGACAGGCCAAACGGG
GTGCTCTGGCCGGGGAGCACCTCCCTCCCCACCTGCTCTCTCCC
TTTCCTTGACCCCCCCCCCAACGCTGTTCAGCATGTTCATCATGA
TCACGATCCTGACCAA(SEQ ID NO：5)
实施例7：猪LDH-α外显子5 AciI PCR-RFLP测试方案
我们检出了猪乳酸脱氢酶α基因外显子5的一个SNP。这是一个沉默突变。随后开发了针对此多态性的AciI PCR-RFLP。用下面所述的PCR方案制备了一个518bp的扩增产物。AciI限制酶消化产生两个单态性片段(分别为16bp和8bp)和如下所列的多态性模式：一个494bp片段代表基因型11，三个片段(494bp、415bp和79bp)代表基因型12，两个片段(415bp和79bp)代表基因型22。
扩增一个518bp LDH-α外显子5/内含子5的扩增产物
LDH-α外显子5引物：
5’引物LDH-αF：5’-GTG TGG AGC GGA GTA AAT GT-3’(SEQ IDNO：19)
3’引物LDH-αR：5’-CCC CAG ATC CGA GCC GCG TTG-3’(SEQ IDNO：20)
1X PCR反应：
                                   体积(μl)
10xPCR缓冲溶液B                     1.0
MgCl2(25mM)                        0.6
dNTPs(2mM)                          1.0
LDH-αF(5’)(10pmol/μl)            0.52
LDH-αR(3’)(10pmol/μl)            0.52
Promega Taq聚合酶(5U/μl)           0.1
水                                  5.26
混和物总体积                        9.0
将PCR反应混和物保存于冰上。将PCR 96孔板或PCR 0.2ml试管置于冰上。将混和物分为9.0μl的等份，加入1.0μl 12.5ng/μl的基因组DNA或1μl DNA裂解液。
热循环用MJ Research，Inc.PTC200或PTC100热循环仪在如下条件下 进行：
1.3分钟    94℃    1个循环
2.30秒     94℃
3.30秒     54℃
4.30秒     72℃
5.返回第2步，再进行35个循环
6.5分钟    72℃    1个循环
7.σ5分钟  4℃     1个循环
8.σ       25℃
LDH-αAciI限制酶消化方案：
                     1X
                     体积(μl)
NEB*310X缓冲液      1.0
10X BSA              1.0
NEB*AciI(10U/μl)   0.3
水                   2.7
混和物终体积         5.0
*NEB＝New England Biolabs
将AciI混和物分为5μl的等份，加入5μl PCR产物，在37℃保温。
凝胶电泳：
加入2μl橘黄G加样缓冲液，在1.8％Nusieve/Me(3∶1)或常规琼脂糖凝胶上样。在150伏特进行电泳，产物在大约30分钟内分离。
每个等位基因的片段大小：等位基因1：494bp
                        等位基因2：415bp，79bp
                        单态性片段：16bp和8bp
16bp和8bp片段在1.8％琼脂糖凝胶上无法看到。
内含子4/外显子5/内含子5序列；外显子5多态性的碱基R(G/A)以粗体字母表示。
AciI PCR-RFLP
GTGCCT GTGTGGAGCGGAGTAAATGTTGCTGGTGTCTCCCTGA
AGAATCTGCACCCTGAATTAGGCACTGATGCAGATAAGGAACA
CTGGAAAGCRGTTCACAAACAGGTGGTGGACAGGTAATAGATC
TCATAATTTGTAATGTGAAAGGTTAAAATTTATTATTTTATTTAAA
AAACTAAAAGTTTAATAATATTTGCATTCGATTTACTCTGTCAGA
AAACTTGTTTTCTAAAGCTTTTTAAAATATCATACTATAAAAAGG
TAAAGGCATTAAAAATTACAGACATTTATAAATGCTACAGTCTAT
CTTTATTTGCTGTAATTCTCTATAGTATGATAAATCTTTGTGTTTGT
AATGTAAACTAATAAGATAAAAGAGGAGTTCCTGTCGTGGCTCA
GTGGAAACTATTCTGACTAGTATCCATGAGGATGTAAGTTTGATC
CCTGACCTTGCTCAGTGGATTAAGGATCAGGCATTGCTGTGAGC
TGTGGTGTAGGTTA CAACGCGGCTCGGATCTGGGG(SEQ IDNO：6)R＝G或A
实施例8
Malek et al.(2001)Mammalian Genome，12：637-645(付印中)基于Berkshire x Yorkshire(BxY)三代参考家族揭示了一个针对后腿pH的SSC6上的数量性状位点(QTL)。此QTL在BxY图谱上定位于一个应该是CKM基因位置的区域。由于这些原因，我们认为CKM是一个对于所述QTL、一般也对于猪肉质的感兴趣的候选基因。我们测定了整个BxY参考家族的基因型并且用MspA1I多态性在BxY图谱上定位了此QTL。效应范围列于表1。
表1.对于猪6号染色体上后腿pH的显著QTL的数据。
性状 F-值a   位置(cM)   加性(Additive)效应b    (S.E.)   显性(Dominance)效应    (S.E.)
  后腿pH   6.88   53   -0.032    0.013   0.052    0.019
a染色体相关F-统计学阈值设在5％水平，如排列检验确定的是5.14。
b对于遗传了两个Berkshire等位基因的个体、杂合子、及有两个Yorkshire等位基因的个体，加性(a)和显性(d)QTL效应分别相应于基因型值+a、d、-a。正加性效应表示Berkshire等位基因加强了所述性状，负加性效应表示Berkshire等位基因减弱了所述性状。显性效应是相对于两个纯合子的平均值。
*在5％基因组相关水平显著(F＞8.22)
**在1％基因组相关水平显著(F＞9.96)II
我们用此标记测定了几种商业种群的基因型并估算了CKMMspA1I等位基因和几种肉质及繁殖性状的相关性。基因型类别的频率列在表2。
表2.对于猪CKM MspA1I PCR-RFLP位点的基因型频率
  基因型  Berkshire   Duroc 1  Duroc 2   DurocSynthetic   Hampshire   HampshireSynthetic   Pietrain
  1/1  9   30  19   0   11   4   0
  1/2  57   111  51   15   128   23   3
  2/2  42   152  51   108   341   64   85
  n  108   293  121   123   480   91   88
几种CKM MspA1I等位基因和我们考虑的例如肉色、结实性、pH等性状之间的显著相关性已被揭示，列于表3作为总结。
表3.CKM MspA1I等位基因和几种商业品系种群肉质性状之间的相关性分析结果(概率)总结
  商业种群   结实程度   滴水prct   眼肌Minl   眼肌Minb   DG   肌肉厚度   后腿Minl   后腿Mina   后腿pH   终重量   Hprorib
  Berkshire   0.04   0.003
  Duroc 1   0.008   0.0001   0.05   0.03
  Duroc 2
  Duroc   0.02   0.05
  Synthetic
  Hampshire   0.01   0.05
  Pietrain
  Hampshire   0.05
  Synthetic
性状：DG-终生日增重，Min-肉色Minolta测量，HproRib-Hennessy probe肋骨
实施例9：基因分型频率
两组在商业化条件下长大的猪(品系间杂交A，品系间杂交B)被在商业化屠宰场商业化宰杀并收集。应用几种测量方法测量肉质(pH，肉色及滴水损失)和胴体特征(胴体重量、后腿、腹肉和眼肌含量、眼肌面积及深度及瘦肉百分比及第10肋骨的脂肪)。从这些猪身上提取样品用于标记的基因型测定。此两组展现出两种不同的基因型，由每组不同的公种畜品系和每组不同的亲代母猪基因型产生。
p-概率
下列值用于本实施例中的全部表格。
最小平方平均值(LSmeans)显著水平：α和δ显著水平：
a-b p＜.3                         a p＜.3
c-d p＜.1                         b p＜.1
e-f p＜.05                        c p＜.05
g-h p＜.01                        d p＜.01
i-j p＜.005                       e p＜.005
k-l p＜.001                       f p＜.001
m-n p＜.0005                      g p＜.0005
o-p p＜.0001                      h p＜.0001
1)CKM中，此基因有三个多态性(标记)可用，它们在屠宰猪中被用于估计标记效应
a)CKM MspA1I
基因型：品系间杂种A-n＝548
 A   最小平方平均值(LSmeans)(s.e.)   geno          α        δ
 性状   11   12   22   p   性状(s.e.)   p   性状(s.e.)  p
 pH45分钟   5.99(0.13)a   6.14(0.02)b   6.14(0.01)b   .50   0.08(0.07)   a   0.05(0.05)  a
 pH3小时   6.05(0.12)ac   5.87(0.02)b   5.83(0.01)ad   .09   -0.11(0.06)   0.08   -0.05(0.04)  a
 pH24小时   5.80(0.09)a   5.72(0.01)m   5.66(0.01)bn   .0007   -0.07(0.05)   a   -0.01(0.03)
 MinoltaL   41.22(1.84)a   43.10(0.30)g   43.98(0.15)bh   .01   1.38(0.92)   a   0.33(0.65)
 Minoltaa   0.48(0.56)   0.83(0.12)a   1.01(0.05)b   .27   0.26(0.28)   0.06(0.20)
 Minoltab   8.00(0.71)a   8.54(0.12)i   8.95(0.06)bj   .003   0.48(0.35)   a   0.04(0.25)
 滴水_％   0.72(1.05)a   1.76(0.17)i   2.33(0.09)bj   .005   0.80(0.53)   a   0.16(0.37)
品系间杂种基因型A的pH、肉色(MinL&b)及滴水的测量中观察到了显著的效应。具有等位基因1(基因型11或12)的动物对于肉质(pH和肉色)及降低的滴水损失是优选的。(在缺乏基因型22的品系间杂种基因型B中未观察到显著效应。)
b)CKM BamHI
品系间杂种基因型A-n＝601
  A   geno
  性状   11   12
  pH 45分钟   6.14(0.01)   6.14(0.02)
  pH 3小时   5.83(0.01)a   5.87(0.02)b
  PH 24小时   5.66(0.01)o   5.72(0.01)p
  Minolta L   43.96(0.15)e   43.25(0.27)f
 Minolta a   0.98(0.05)   0.89(0.11)
 Minolta b   8.96(0.06)o   8.51(0.10)p
 滴水_％   2.35(0.09)i   1.82(0.15)j
宰杀的动物中没有基因型22的动物，因为此等位基因在公种畜品系中的出现率较低。pH(3小时及24小时)、肉色(MinL&b)及滴水的两次测量中观察到了显著效应(在缺乏基因型22的品系间杂种基因型B中未观察到显著效应，并且基因型12同样具有低出现率)。
c)CKM 9bp插入/缺失
品系间杂种基因型A-n＝604
  A   最小平方平均值(LSmeans)(s.e.)   geno           α        δ
  性状   11   12   22   p   性状(s.e.)   p   性状(s.e.)  p
  胴体重量   196.9(2.25)a   193.3(0.93)b   193.0(0.85)b   .26   -1.93(1.18)   a   -1.10(0.99)  a
  后腿_％   11.71(0.09)e   11.80(0.04)e   11.90(0.03)f   .03   0.09(0.05)   0.04   -0.00(0.04)
  眼肌_％   7.60(0.11)a   7.68(0.05)a   7.77(0.04)b   .19   0.09(0.06)   a   0.00(0.05)
  眼肌面积   6.55(0.12)c   6.68(0.05)a   6.76(0.04)db   .15   0.10(0.06)   0.09   0.01(0.05)
  眼肌深度   2.51(0.04)   2.53(0.01)   2.55(0.01)   .46   0.02(0.02)   -0.00(0.02)
  瘦肉_％   56.07(0.46)   56.23(0.19)   56.42(0.17)   .62   0.18(0.24)   -0.02(0.20)
  pH45分钟   6.11(0.03)   6.14(0.01)   6.14(0.01)   .64   0.01(0.02)   0.01(0.01)
  pH3小时   5.87(0.03)   5.86(0.01)e   5.82(0.01)bf   .04   -0.02(0.02)   a   0.01(0.01)
  pH24小时   5.72(0.02)ae   5.69(0.01)   5.66(0.01)f   .01   -0.03(0.01)   0.01   -0.00(0.01)
  MinoltaL   42.94(0.46)c   43.86(0.20)d   43.79(0.19)d   .17   0.42(0.25)   0.09   0.33(0.21)  a
  Minoltaa   0.80(0.20)   0.93(0.08)   1.01(0.06)   .50   0.10(0.10)   0.02(0.09)
  Minoltab   8.41(0.17)eI   8.80(0.08)fa   8.95(0.07)bj   .01   0.27(0.09)   0.004   0.08(0.08)
  滴水_％   1.80(0.26)ac   2.18(0.12)b   2.32(0.11)d   .16   0.26(0.14)   0.06   0.08(0.12)
品系间杂种基因型B-n＝541
B 最小平方平均值(LSmeans)(s.e.) geno α δ
  性状   11   12   22   p   性状(s.e.)   p   性状(s.e.)  p
  胴体重量   197.1(9.87)   196.4(1.43)c   199.5(0.99)d   .18   1.22(4.94)   -1.26(3.42)
  后腿_％   12.48(0.28)a   12.09(0.04)ba   12.02(0.03)b   .09   -0.23(0.14)   a   -0.10(0.10)  a
  眼肌_％   8.42(0.34)a   8.03(0.05)bc   7.92(0.03)bd   .08   -0.25(0.17)   a   -0.09(0.12)
  眼肌面积   7.89(0.38)ce   7.21(0.06)de   7.07(0.04)f   .01   -0.41(0.19)   0.03   -0.18(0.13)  a
  眼肌深度   2.77(0.11)a   2.66(0.02)e   2.62(0.01)bf   .04   -0.07(0.05)   a   -0.02(0.04)
  瘦肉_％   58.39(1.39)a   56.94(0.20)c   56.51(0.14)b   .09   -0.94(0.70)   a   -0.34(0.48)
  第10肋骨   0.81(0.10)a   6.14(0.01)bc   0.95(0.01)bd   .07   0.07(0.05)   a   0.02(0.04)
品系间杂种基因型A和B胴体组成性状-后腿和眼肌％及相关性状如眼肌面积和眼肌深度中观察到了显著的效应。高产量与品系间杂种基因型A的等位基因2和品系间杂种基因型B的等位基因1相关。然而，等位基因2同样与较低的肉质相关，这可由更高的24小时pH值、更浅色的肉及更高的滴水损失判断。这些对肉质的影响在品系间杂种基因型B中未观察到，尽管其对于在第10肋骨测量到的脂肪有影响，这也符合从后腿及眼肌关节(loin joint)得到的结果。针对品系间杂种基因型B工作的生产者和育种者会希望选择等位基因1，同时针对品系间杂种基因型A工作的生产者和育种者会使用依赖于他们所工作的市场上不同性状的经济价值的标记。
本领域技术人员应认识到可以针对CKM基因中的标记构建标记单元型，并且这些单元型可用于相关性分析及接下来作为个体标记的替代物用作标记辅助选择的工具。
2)LDHα(外显子5AciI)
品系间杂种基因型A-n＝583
  A   最小平方平均值(LSmeans)(s.e.)   geno          α          δ
  性状   11   12   22   p   性状(s.e.)   p   性状(s.e.)   p
  后腿_％   11.88(0.05)c   11.88(0.03)c   11.77(0.05)d   .14   -0.06(0.03)   0.10   0.04(0.03)   a
  眼肌_％   7.77(0.06)e   7.76(0.04)e   7.57(0.06)f   .02   -0.10(0.04)   0.02   0.06(0.04)   a
  眼肌面积   6.77(0.06)e   6.72(0.05)c   6.58(0.07)fd   .10   -0.09(0.04)   0.04   0.03(0.04)
  眼肌深度   2.56(0.02)e   2.54(0.01)e   2.49(0.02)f   .04   -0.03(0.01)   0.02   0.01(0.01)
  pH45分钟   6.16(0.02)e   6.14(0.01)a   6.10(0.02)fb   .10   -0.03(0.01)   0.03   0.01(0.01)
  pH3小时   5.85(0.02)c   5.85(0.01)e   5.80(0.02)df   .08   -0.02(0.01)   0.06   0.02(0.01)   a
  pH24小时   5.66(0.01)e   5.69(0.01)f   5.66(0.01)b   .09   0.00(0.01)   0.02(0.01)   0.03
  MinoltaL   44.03(0.25)ac   43.70(0.19)b   43.37(0.29)d   .23   -0.33(0.19)   0.09   -0.00(0.18)
  Minoltaa   1.03(0.09)a   0.98(0.07)a   0.83(0.11)b   .38   -0.10(0.07)   a   0.03(0.06)
  Minoltab   8.99(0.10)ce   8.77(0.07)d   8.67(0.11)f   .07   -0.16(0.07)   0.03   -0.04(0.07)
基因型B-n＝508
  最小平方平均值(LSmeans)(s.e.)   geno            α           δ
  性状   11   12   22   p   性状(s.e.)   p   性状(s.e.)   p
  后腿_％   12.02(0.04)e   12.02(0.03)e   12.17(0.06)f   .08   0.08(0.04)   0.04   -0.05(0.03)   a
  眼肌_％   7.92(0.05)c   7.94(0.04)c   8.09(0.08)d   .15   0.09(0.04)   0.05   -0.04(0.04)   a
  眼肌面积   7.08(0.05)c   7.09(0.05)c   7.27(0.09)d   .13   0.10(0.05)   0.05   -0.06(0.04)   a
  眼肌深度   2.62(0.01)c   2.63(0.01)a   2.68(0.03)db   .18   0.03(0.01)   0.06   -0.01(0.01)
  pH 45分钟   6.10(0.01)ae   6.07(0.01)b   6.03(0.03)af   .03   -0.04(0.01)   0.01   0.01(0.01)
  pH 3小时   5.77(0.01)e   5.76(0.01)e   5.10(0.03)f   .04   -0.04(0.01)   0.01   0.01(0.01)   a
  PH 24小时   5.65(0.01)g   5.65(0.01)i   5.58(0.02)hj   .01   -0.03(0.01)   0.007   0.02(0.01)   0.03
  MinoltaL   44.35(0.26)i   44.57(0.24)g   45.95(0.45)jh   .007   0.80(0.26)   0.002   -0.39(0.23)   0.01
  Minoltaa   1.29(0.08)a   1.26(0.07)   1.11(0.14)b   .50   -0.09(0.08)3   a   0.04(0.07)
  Minoltab   9.21(0.09)ae   9.37(0.08)b   9.64(0.16)af   .05   0.22(0.09)   0.02   -0.04(0.08)
  滴水_％   3.02(0.17)k   2.99(0.15)k   4.14(0.29)l   .001   0.56(0.16)   0.0008   -0.39(0.15)   0.009
屠宰猪的标记基因型解释了在很多的被测量性状中的显著大量的变异(p＜0.10)。基因型22的品系间杂种A动物的后腿和眼肌产量低，以及与基因型11或12的动物相比眼肌较小(眼肌面积和眼肌深度)。另外，基因型22的动物还有一些对pH和肉色的显著效应，其倾向于拥有具有更深(更优选的)MinL评分的肉。在这种情况下杂合子类型具有最高的(更优选的)pH24值。然而，这并不引起滴水损失的任何差异(不显著)。生产者可能更希望确保他们饲养基因型11或12的动物，如果他们希望增加瘦肉产量的话。仅对深色肉感兴趣的生产者可能希望选择基因型22的动物。同样地，可以用根据顾客的偏爱选择的标记来选择良种群，用于收获上等肉或肉色。
品系间杂种B中标记基因型对于这些性状同样也有高度显著的效应。然而，在后腿产量等情况中，基因型22是优选的基因型。然而，基因型11和12对于pH值和肉色是最好的，基因型22对于滴水损失有高度显著的效应，其与显著增大的滴水损失相关。在这种情况下，考虑到较低的肉产量，希望选择具有最好肉质(及较低的滴水损失)的动物的生产者将不希望选择基因型22。仅对产量感兴趣的生产者才会选择基因型22的动物。育种者将根据不同性状的经济上的考虑来选择具有标记基因型的动物。
3)在SCN4α中，基因中有三个多态性(标记)可以使用并且已经用于估计屠宰猪中的标记效应。
a)SCN4αBsrI
品系间杂种基因型A-n＝595
 A   最小平方平均值(LSmeans)(s.e.)   geno        α           δ
 性状   11   12   22   p   性状(s.e.)  p   性状(s.e.)   p
 胴体重量   193.8(1.33)   192.9(0.85)   193.3(1.18)   .86   -0.23(0.87)   -0.04(0.79)
 后腿_％   11.95(0.05)e   11.8(0.03)fc   11.90(0.05)d   .02   -0.02(0.03)   -0.09(0.03)   0.006
 眼肌_％   7.81(0.07)c   7.67   7.76   .11   -0.02   -0.08   0.04
  (0.04)da   (0.06)b   (0.04)   (0.04)
  眼肌面积   6.84(0.07)ea   6.64(0.04)fa   6.74(0.06)b   .05   -0.05(0.05)   a   -0.10(0.04)   0.02
  眼肌深度   2.56(0.02)c   2.52(0.01)da   2.55(0.02)b   .16   -0.01(0.01)   -0.02(0.01)   0.06
  腹肉％   10.44(0.04)a   10.52(0.03)b   10.45(0.04)a   .16   0.01(0.03)   0.05(0.03)   0.06
  瘦肉_％   56.94(0.27)ia   56.03(0.17)jc   56.51(0.24)bd   .01   -0.21(0.17)   a   -0.46(0.16)   0.004
  第10肋骨   0.91(0.02)g   0.97(0.01)hc   0.94(0.02)d   .02   0.01(0.01)   0.03(0.01)   0.005
  pH45分钟   6.15(0.02)a   6.14(0.01)   6.12(0.02)b   .57   -0.01(0.01)   a   0.00(0.01)
  pH3小时   5.89(0.02)iI   5.83(0.01)j   5.82(0.02)j   .004   -0.04(0.01)   0.003   -0.02(0.01)   a
  pH24小时   5.70(0.01)ae   5.67(0.01)b   5.66(0.01)f   .12   -0.02(0.01)   0.04   -0.00(0.01)
  MinoltaL   43.32(0.27)iI   43.63(0.19)e   44.44(0.26)jf   .006   0.56(0.19)   0.003   -0.17(0.18)
  Minoltaa   0.83(0.10)a   1.02(0.07)b   0.96(0.09)   .26   0.07(0.07)   0.08(0.06)   a
  Minoltab   8.59(0.10)eII   8.85(0.07)fa   9.02(0.10)jb   .01   0.21(0.07)   0.003   0.03(0.07)
  滴水_％   1.95(0.15)ae   2.24(0.11)b   2.40(0.15)f   .10   0.23(0.11)   0.004   0.04(0.10)
品系间杂种基因型B-n＝535
  B   最小平方平均值(LSmeans)(s.e.)   geno         α        δ
  性状   11   12   22   p   性状(s.e.)   p   性状(s.e.)  p
  胴体重量   189.1(5.16)ae   197.2(1.10)be   201.0(1.26)f   .01   5.95(2.64)   0.02   1.46(1.89)
品系间杂种基因型A中，标记基因型与胴体组成及肉质性状中的改变显著相关。在胴体组份产量的情况中，基因型12通常是无益的，其与低产量的后腿及眼肌、较小的眼肌面积、眼肌深度及瘦肉％相关，尽管此基因型具有较高的腹肉产量。最高的产量(除腹肉外)与基因型11相关。令人感兴趣的是，对于肉质来说，观察到了不同的效应，所述效应与等位基因1对更高的pH值，更低的MinoltaL(肉色更深)及更低的滴水损失这些有利的评分的加合效应更加一致。与品系间杂种基因型B中标记相关的仅有的效应是对于胴体重量，其中等位基因2与更重的胴体相关。
b)SCN40αPstI
品系间杂种基因型A-n＝609
  A   最小平方平均值(LSmeans)(s.e.)   geno               α        δ
  性状   11   12   22   p   性状(s.e.)   p   性状(s.e.)  p
  pH 45分钟   6.14(0.01)   6.15(0.02)   -   .56   0.02(0.03)   -
  pH 3小时   5.84(0.01)   5.87(0.02)   -   .18   0.03(0.02)   a   -
  pH 24小时   5.67(0.01)   5.72(0.02)   -   .004   0.05(0.02)   0.004   -
  Minolta L   43.99(0.14)   42.48(0.34)   -   .0001   -1.51(0.36)   0.0001   -
  Minolta b   8.89(0.05)   8.52(0.13)   -   .008   -0.38(0.14)   0.008   -
  滴水～％   2.35(0.08)   1.54(0.19)   -   .0001   -0.81(0.21)   0.0001   -
的在品系间杂种基因型A中，此标记对于pH24、Minolta L、及滴水损失有高度显著的影响(对品系间杂种基因型B无显著效应)，其中以等位基因2为优选的等位基因(未观察标记基因型22的动物)。
c)SCN40αSalI
品系间杂种基因型A-n＝609
  A   最小平方平均值(LSmeans)(s.e.)   geno            α         δ
  性状   11   12   22   p   性状(s.e.)   p   性状(s.e.)  p
  眼肌_％   -   7.67(0.05)   7.75(0.04)   .18   0.08(0.06)   a   -
  眼肌面积   -   6.66(0.05)   6.74(0.04)   .23   0.08(0.06)   a   -
  眼肌深度   -   2.52(0.02)   2.54(0.01)   .14   0.03(0.02)   a   -
  腹肉％   -   10.53(0.03)   10.48(0.03)   .21   -0.05(0.04)   a   -
  瘦肉_％   -   56.03(0.20)   56.47(0.16)   .07   0.44(0.24)   0.07   -
  第10肋骨   -   0.97(0.02)   0.94(0.01)   .09   -0.03(0.02)   0.09   -
品系间杂种基因型B-n＝548
  B   最小平方平均值(LSmeans)(s.e.)   geno           α        δ
  性状   11   12   22   p   性状(s.e.)   p   性状(s.e.)  p
  pH 3小时   5.94(0.12)a   5.80(0.02)bc   5.75(0.01)bd   .06   -0.10(0.06)   a   -0.03(0.04)
  pH 24小时   5.67(0.10)   5.68(0.02)e   5.63(0.01)f   .05   -0.02(0.05)   0.02(0.03)
这里此标记与两个基因型间不同性状相关。在品系间杂种基因型A中，基因型22与更大更瘦的眼肌及较小腹肉产量相关。在肉质测量中未发现显著效应。在品系间杂种基因型B中，等位基因2与更低的3小时和24小时pH值相关，但在滴水损失或肉色上没有相关效应。
本领域技术人员应认识到可以针对SCN4α基因中的标记构建标记单元型，并且这些单元型可用于相关性分析及接下来作为个体标记的替代物用作标记辅助选择的工具。
实施例10
三个CKM标记可用于针对不同种群产生标记基因型和单元型，以仔细研究标记效应。这方面已在一批种系中针对胴体和肉质表型应用了两个CKM标记(9bp插入/缺失和MspA1I多态性)。可以鉴定出三个单元型：1-1、1-2、2-2，第四个可能的单元型2-1未在任何种群中发现。
接下来三个单元型用于计算单元型取代效应(pH和肉色性状跨品系分析结果列于图1)。可以看到单元型1-2对于眼肌及后腿(半膜肌)的pH(更高的终pH值)和肉色(评分越低相当于肉色越深)是有利的。这些效应在单元型1-2和单元型2-2之间对于pHu大约是0.07单位，对于Minolta L大约是2单位。
因而，单元型1-2或单元型2-2的纯合体之间的预期差异对于pHu大约是0.14单位，对于Minolta L大约是4单位。当独自应用时，任何一个标记都不会展示其全部的效应(通过单元型分析鉴定)。这说明了在一些环境下通过组合标记基因型来产生单元型的价值。鉴于此，在一些情况下应用全部三个标记可能会更好。
实施例11
不同种群基因型的附加数据如下所列。
1c)CKM 9bp插入/缺失
基因型：品系间杂种(Linecross)C n＝687
  性状   最小平方平均值(LSmeans)   Geno
  11   12   22   p
  滴水24小时   2.84   1.81   1.76   0.075
  滴水48小时   3.79   3.17   3.08   0.035
  体侧脂肪   2.63   2.63   2.75   0.005
  平均背膘厚度   2.48   2.45   2.46   NS
在此独立测试中，观察到了此标记对于宰杀后24和48小时的滴水损失都有显著效应(48小时后p＜0.05)。同样在胴体体侧脂肪含量方面也有显著效应。然而，在平均背膘厚度方面没有显著效应。在此基因型组合中，希望选择能提供宰杀后较低滴水损失的动物的生产者将更倾向于基因型12或22的动物。
2)LDHα
基因型：品系间杂种C n＝732
  C   最小平方平均值(LSmeans)(s.e.)   geno
  性状   11   12   22   p
  背膘厚度-肩部   3.82   3.78   3.72   NS
  背膘厚度-腹部   2.18   2.14   2.10   ＞0.20
  背膘厚度-后腿   1.46   1.42   1.35   0.075
  平均背膘厚度   2.48   2.45   2.39   0.073
在此独立测试中，观察到了此标记对于平均胴体背膘厚度和后腿背膘厚度的显著效应(p＜0.10)。尽管此效应对于在肩部和腹部测量的背膘厚度在统计学意义上不显著，但是趋势还是相同的，即基因型22是最瘦的基因型。在此基因型组合中，希望能向屠宰场提供瘦胴体的生产者将更倾向于基因型22的动物。
基因型：特异合成品系n＝5321
具有关于日均进食量(ADF)、背膘厚度、眼肌深度及24小时pH值的表型记录的成千上万头动物基因型被测出。在此品系中，基因型11具有最小的背膘厚度(大约比基因型22少0.4mm)、最高的眼肌深度(比基因型22多0.6mm)、更高的24小时pH值(比基因型22高0.02)、及更低的日均进食量(比基因型22少0.03公斤)。在此例中，效应是用PEST程序估算出的，其对于此类型的大量数据组并不提供显著性估计。然而，基于如此大量的动物，所述效应可视为统计学意义上显著的。
本领域技术人员应认识到大量的改变和修饰可以作为本发明优选的实施方案，所述改变和修饰不用背离本发明的精神即可得到。因而我们希望下面的权利要求包含属于本发明真正的精神和范围的全部等同变化。

Claims (51)

1.一种遗传学鉴别动物的方法，所述方法包括：从所述动物中获取一份遗传物质样品；检测在一个基因中多态性的存在，所述基因选自如下一组：CKM、SCN4α、和LDHα，其中所述多态性的存在与有利的肌肉生长和/或肉质相关。
2.权利要求1的方法，其中所述动物是猪。
3.权利要求1的方法，其中所述检测选自如下一组：限制性片段长度多态性(RFLP)、异源双链分析、单链构象多态性(SSCP)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、单碱基延伸、质谱、寡核苷酸连接检测(连接酶链式反应)、DNA测序及温度梯度凝胶电泳(TGGE)。
4.权利要求1的方法，进一步包括扩增一定数量的所述基因或其包含所述多态性的一部分。
5.权利要求4的方法，其中所述扩增包括选择一个正向一个反向引物，所述引物能够扩增所述基因的一个包含至少一个多态性位点的区域。
6.权利要求1的方法，其中所述基因是CKM基因。
7.权利要求6的方法，其中所述基因包含一个多态性MspAlI位点。
8.权利要求7的方法，其中所述多态性位点由选自并基于SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8的引物扩增。
9.权利要求6的方法，其中所述基因包含一个多态性BamHI位点。
10.权利要求9的方法，其中所述多态性位点由选自并基于SEQID NO：9和SEQ ID NO：10的引物扩增。
11.权利要求6的方法，其中所述基因包含一个特征为一个9碱基对插入/缺失鉴别的多态性。
12.权利要求11的方法，其中所述多态性由选自并基于SEQ IDNO：l1和SEQ ID NO：12的引物扩增。
13.权利要求1的方法，其中所述基因是SCN4α。
14.权利要求13的方法，其中所述基因包含一个多态性BsrI位点。
15.权利要求14的方法，其中所述多态性位点由选自并基于SEQID NO：13和SEQ ID NO：14的引物扩增。
16.权利要求13的方法，其中所述基因包含一个多态性PstI位点。
17.权利要求16的方法，其中所述多态性位点由选自并基于SEQID NO：15和SEQ ID NO：16的引物扩增。
18.权利要求13的方法，其中所述基因包含一个多态性SalI位点。
19.权利要求18的方法，其中所述多态性位点由选自并基于SEQID NO：17和SEQ ID NO：18的引物扩增。
20.权利要求1的方法，其中所述基因是LDHα基因。
21.权利要求20的方法，其中所述基因包含一个多态性AciI位点。
22.权利要求21的方法，其中所述多态性位点由选自并基于SEQID NO：19和SEQ ID NO：20的一个正向引物和一个反向引物扩增。
23.权利要求7的方法，其中所述多态性位点是在所述基因5’UTR区域中一个C被取代为T的单核苷酸取代。
24.权利要求9的方法，其中所述多态性位点是在所述基因内含子2中一个G被取代为T的单核苷酸取代。
25.权利要求11的方法，其中所述9碱基对插入/缺失的特征是一个存在于等位基因1中但是不存在于等位基因2中的核苷酸序列-TGAGCTTCC-。
26.权利要求14的方法，其中所述多态性位点是在所述基因外显子24中一个C被取代为G的单核苷酸取代。
27.权利要求16的方法，其中所述多态性位点是在所述基因外显子11中一个G被取代为A的单核苷酸取代。
28.权利要求18的方法，其中所述多态性位点是在所述基因外显子2中一个G被取代为A的单核苷酸取代。
29.权利要求20的方法，其中所述多态性位点是一个多态性碱基R，其中所述碱基是在所述基因外显子5中的一个G或一个A。
30.一种筛选动物以确定所述动物用于动物育种的遗传潜力的方法，所述方法包括：从所述动物中获取一份遗传样品；鉴别所述动物的基因型，其中所述基因型在一个选自CKM、SCN4α、和LDHα的基因中具有至少一个多态性位点；以及基于所述基因中存在的与有利的育种性状相关的多态性进行遗传评估。
31.权利要求30的方法，其中鉴别至少一个多态性位点包括：扩增包含一个多态性的所述样品；在所述样品中产生或破坏一个限制性位点；确定是否一个位点被一个特异限制性核酸内切酶所切割，其中一个限制性核酸内切酶位点或者一个插入或缺失指示一个多态性的存在。
32.权利要求31的方法，进一步包括进行凝胶电泳以鉴别多态性。
33.权利要求30的方法，其中所述基因型的特征是CKM基因中的至少一个多态性。
34.权利要求33的方法，其中所述多态性由一个在由引物SEQID NO：7和SEQ ID NO：8扩增的区域中的MspAlI限制性核酸内切酶位点的切割所鉴别。
35.权利要求33的方法，其中所述多态性由一个在由引物SEQID NO：9和SEQ ID NO：10扩增的区域中的BamHI限制性核酸内切酶位点的切割所鉴别。
36.权利要求33的方法，其中所述多态性由在由引物SEQ IDNO：11和SEQ ID NO：12扩增的区域中是否存在一个9碱基对插入/缺失所鉴别。
37.权利要求30的方法，其中所述基因型的特征是SCN4α基因中的至少一个多态性位点。
38.权利要求37的方法，其中所述多态性由一个在由引物SEQID NO：13和SEQ ID NO：14扩增的区域中的BsrI限制性核酸内切酶位点的切割所鉴别。
39.权利要求37的方法，其中所述位点由一个在由引物SEQ IDNO：15和SEQ ID NO：16扩增的区域中的PstI限制性核酸内切酶位点的切割所鉴别。
40.权利要求37的方法，其中所述多态性由一个在由引物SEQID NO：17和SEQ ID NO：18扩增的区域中的SalI限制性核酸内切酶位点的切割所鉴别。
41.权利要求30的方法，其中所述基因型的特征是LDHα基因中的一个多态性。
42.权利要求41的方法，其中所述多态性由一个在由引物SEQID NO：19和SEQ ID NO：20扩增的区域中的AciI限制性核酸内切酶位点的切割所鉴别。
43.权利要求30的方法，其中所述动物是猪。
44.权利要求30的方法，其中所述育种性状包括有利的肉质、肌肉丰富、和/或骨骼肌痉挛病。
45.一种测定动物的基因型以确定其是否具有对于肌肉生长和/或肉质有益的性状组合的方法，所述方法包括：确定动物中存在的等位基因，所述等位基因包括那些包含一个或多个下列多态性位点的基因：CKM基因中的MspAlI、BamHI或9碱基对插入/缺失；SCN4α基因中的一个BsrI、PstI或SalI位点；及LDHα中的一个AciI位点。
46.权利要求45的方法，其中所述动物是猪。
47.一种在多态性基因座测定动物的基因型的方法，所述方法包括：从所述动物中获取一份遗传样品；检测多态性的存在，所述多态性的特征是：
(a)CKM基因中的多态性，所述多态性位于所述基因的5’非翻译区(SEQ ID NO：1)；
(b)CKM基因中的多态性，所述多态性位于所述基因的内含子2(SEQ ID NO：2)；
(c)CKM基因中的多态性，所述多态性的特征是所述基因的内含子2(SEQ ID NO：2)中的一个9bp插入/缺失；
(d)SCN4α基因中的多态性，所述多态性位于所述基因的外显子24(SEQ ID NO：3)；
(e)SCN4α基因中的多态性，所述多态性位于所述基因的外显子11(SEQ ID NO：4)；
(f) SCN4α基因中的多态性，所述多态性位于所述基因的外显子2(SEQ ID NO：5)；或
(g)LDHα基因中的多态性，所述多态性位于所述基因的外显子5(SEQ ID NO：6)；
48.权利要求47的方法，其中所述动物是猪。
49.一个检出单元型存在的方法，所述单元型对于确定一个与动物中有利的肉质相连锁的基因的存在有预测性，所述方法包括：
(a)分析一个取自所述动物的遗传物质样品中是否含有与肉质性状连锁的多态性，其中所述多态性选自MspAlI和9bp插入/缺失组成的一组；和
(b)在所述多态性的存在与所述单元型的存在之间建立联系，以使所述单元型被检出。
50.权利要求49的方法，其中所述单元型是1-1、1-2和2-2。
51.权利要求49的方法，其中所述动物是猪。
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