CN105603099A - 肉鸭otxr基因单核苷酸多态性及其检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了肉鸭<i>OTXR</i>基因的单核苷酸多态性及其检测方法和应用，属于分子遗传学检测领域，基因单核苷酸多态性检测过程包括：以包含<i>OTXR</i>基因的待测肉鸭全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增肉鸭<i>OTXR</i>基因；用限制性内切酶P<i>st</i>I消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定肉鸭<i>OTXR</i>基因外显子2第946位的核苷酸碱基多态性。本发明在DNA水平上筛查和检测与肉鸭经济性状密切相关的分子遗传标记，为肉鸭快速选育提供了分子依据。

Description

肉鸭OTXR基因单核苷酸多态性及其检测方法和应用

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及以肉鸭的功能基因的单核苷酸多态性(SNP)作为分子遗传标记，特别涉及肉鸭OTXR基因的单核苷酸多态性及其检测方法和应用。

背景技术

单核苷酸多态性(SNP)就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性。因此，通常所说的SNP包括碱基的替换、插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。一个SNP表示在基因组某个位点上有一个核苷酸的变化，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起；具有转换型变异的SNP约占2/3，其他几种SNP在相似的水平上。CpG二核苷酸的胞嘧啶是基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。

在任何已知或未知的基因内或附近都可能找到数量不等的SNP，根据它们在基因组中分布的位置可分为基因编码区SNP(cSNP)、基因周边SNP(pSNP)和基因间SNP(iSNP)等三类。总的说来，cSNP比较少，因为在外显子内的变异率仅占周围序列的1/5，但它在遗传病和育种的研究中却具重要意义，因此倍受关注。根据对遗传性状的影响，cSNP又可分为两种：一种是同义cSNP，即SNP所致编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质中氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的“含义”相同；另一种是非同义cSNP，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变，从而产生蛋白质序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。因此，对编码区SNP的非同义突变来说，它们可能对基因功能有直接的重要影响。不仅如此，在群体遗传研究中，这些SNP作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。

由于SNP是二等位基因分子标记，所以，理论上在一个二倍体生物群体中，SNP可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNP很罕见，故SNP通常被简单地称为二等位基因分子标记。目前，主要采用几种不同的路线来发现SNP：即DNA序列测定方法、PCR-SSCP与DNA测序结合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些SNP检测技术中，DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；当然，利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阳性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。

PCR-RFLP方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后使用限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖或聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。PCR-RFLP方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了其费用昂贵、操作繁琐、假阳性率高的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。

OXTR(Oxytocinreceptor)是一种由389个氨基酸组成的G蛋白偶联受体，由7个跨膜区域组成，通过与G蛋白偶联，诱发细胞内外钙离子和甘油二酯浓度的变化，影响神经元细胞的兴奋性及其他生物学效应。已有的研究表明OXTR与能量代谢(食物摄入和能量消耗)相关。Takayanagi等发现催产素受体缺失的雄性小鼠(OXTR-/-)表现出迟发性肥胖(late-onsetobesity)，比如腹部脂肪增加和空腹甘油三酯的增加都比较慢。OXTR-/-小鼠与野生型小鼠相比，每日食物摄入量和自发性运动没有显著差别。相反，OXTR-/-小鼠的棕色脂肪组织中含有大量的脂滴，导致产热受损。这项研究表明，OXTR在调节能量平衡中起着重要作用。因此，研究家禽OTXR基因遗传变异和分子遗传特征具有重要理论和实践意义。

国内外关于OTXR基因遗传变异的研究多见于人、鼠等动物，而未见肉鸭OTXR基因遗传变异或SNP研究的报道。由于目前肉鸭OTXR基因遗传变异领域的研究匮乏，使该基因位点的功能研究及该基因遗传变异与经济性状关联的研究成为空白。

发明内容

本发明解决的问题在于提供肉鸭OTXR基因单核苷酸多态性检测方法及其应用，寻找与肉鸭经济性状相关的SNP作为分子标记，加快肉鸭良种繁育速度。

本发明的目的在于提供肉鸭OTXR基因的单核苷酸多态性，该基因单核苷酸多态性包括：肉鸭OTXR基因外显子2第946位为T或C的单核苷酸多态性。

本发明的另一目的在于提供肉鸭OTXR基因的单核苷酸多态性的检测方法，以包含OTXR基因的待测肉鸭全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增肉鸭OTXR基因；用限制性内切酶PstI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定肉鸭OTXR基因外显子2第946位的单核苷酸多态性；

所述的引物对P为：

上游引物P1：5′-GCTTCACGCAGCCTGCAG-3′

下游引物P2：5′-TGGCTCCTGCCCCGGTTA-3′。

所述的PCR扩增反应程序为：

94℃预变性5min；94℃变性30s，54.6℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。

所述的琼脂糖凝胶为质量浓度为2.5％的琼脂糖。

所述的根据琼脂糖凝胶电泳结果，OTXR基因外显子2第946位的碱基多态性为：TT型为1个片段：179bp；CC型为2个片段：17bp和196bp；CT型为3个片段：17bp、179bp和196bp。由于片段17bp太小，在琼脂糖凝胶不能观察到，所以在琼脂糖凝胶上，TT基因型可以观察到1条带(179bp)；CC基因型可以观察到1条带(196bp)，CT基因型可以观察到2条带(179bp和196bp)。

本发明的又一个目的在于提供肉鸭OTXR基因的单核苷酸多态性的检测方法在优化肉鸭个体育种繁殖中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明公开了与肉鸭生长发育相关的功能基因OTXR的核苷酸多态性，该核苷酸多态性能够作为一个分子遗传标记，利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计肉鸭个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。

本发明对肉鸭OTXR基因的SNP进行了基因分型和基因频率分析，结果显示OTXR基因的核苷酸多态位点能够成为分子遗传辅助育种的标记。

本发明提供的检测方法为肉鸭OTXR基因的SNP与经济性状关系的建立奠定了基础，以便用于肉鸭标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的肉鸭种群。

附图说明

图1为肉鸭OTXR基因外显子2的196bp克隆测序PCR产物电泳图；

图2为肉鸭OTXR基因外显子2的196bpPCR产物的PstI酶切电泳检测OTXR基因多态性的电泳结果图；泳道1：CT基因型个体(179bp和196bp)；泳道2：TT基因型个体(179bp)；泳道3、4：CC基因型个体(196bp)；M：Marker(2000bp)；由于片段17bp太小，在琼脂糖凝胶不能观察到，所以在琼脂糖凝胶上，TT基因型可以观察到1条带(179bp)；CC基因型可以观察到1条带(196bp)，CT基因型可以观察到2条带(179bp和196bp)。

图3为肉鸭OTXR基因SNP的不同基因型测序峰图，其中图3中由上至下三张图分别代表CT、TT和CC基因型。

具体实施方式

本发明以OTXR基因保守序列设计引物扩增OTXR基因外显子2的的196bp片段，以北京鸭的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物纯化，经测序后寻找该扩增片段的单核苷酸多态；针对发现的单核苷酸多态进行性状关联性分析，并提供其检测方法，使得OTXR基因的核苷酸多态性成为一种能够快速、方便检测的分子遗传标记，为加快建立具有优质经济性状的肉鸭种群提供依据。

a、肉鸭OTXR基因部分DNA序列的克隆及其多态性的检测

1、肉鸭血样的采集及处理

取北京鸭血样6mL，加入0.5mol/L的抗凝剂ACD1mL抗凝，缓慢颠倒3次后放入冰盒，-80℃保存备用。

本发明采用北京鸭样品，来源于中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，共随机采样188只。

2、血样基因组DNA的提取、纯化

(1)取20μL抗凝全血置于1.5mL的离心管中，再添加500μL1×STE缓冲液、15μL20％SDS和20μL0.01mg/μL蛋白酶K，置于55℃水浴锅中，过夜消化。

(2)将离心管取出，添加500μL饱和酚，于冰盒中轻摇20min，离心10min(10000r/min)。

(3)取上清，放到新的离心管中(无菌)，加入500μL饱和酚，于冰盒中轻摇20min，离心10min(10000r/min)。

(4)取上清，移入新的灭过菌的离心管中，加入500μL氯仿-异戊醇(氯仿-异戊醇体积比24：1)，于冰盒中轻摇20min，离心10min(10000r/min)。

(5)取上清，移到无菌的新的离心管中，加入1mL冰无水乙醇(-20℃)，来回颠倒沉淀物(DNA)，离心10min(10000r/min)，轻轻倒掉上清液。

(6)加入1mL70％乙醇，清洗DNA，10000r/min离心5min，弃上清液。

(7)重复步骤6。

(8)置于通风橱中，干燥2～4h，使其水分挥发。

(9)DNA完全干燥后，加入200μL灭菌后的TE溶液，在4℃冰箱中放置3天，以溶解DNA。

(10)将提取到的DNA短期(-20℃)或长期(-70℃)保存，使用前取出稀释即可。

3、DNA池的构建

(1)1％琼脂糖凝胶电泳检测

选部分DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，选择DNA样品条带均一、无拖尾、无降解的样品进行DNA池的构建。

(2)OD值测定

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD260/OD280的比值。如OD260/OD280比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。

DNA浓度(μg/mL)＝50×OD₂₆₀值×稀释倍数

(3)肉鸭DNA池的构建

DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50mg/μL，然后从50个北京鸭个体浓度为50ng/μLDNA样品中取10μL混合构建成品种DNA池。

4、克隆测序PCR扩增引物设计

由于NCBI数据库中没有鸭OXTR基因序列，而EMBL-EBI数据库中有鸭的较为完整的OXTR基因的拼接序列，并参见GenBank上的原鸡完整OXTR基因序列(Acc.No.：NC_006099.3)设计引物，利用Primer5.0设计肉鸭OXTR基因外显子2的196bp片段的PCR引物对，其引物对序列如下：

上游引物P1：5′-GCTTCACGCAGCCTGCAG-3′

下游引物P2：5′-TGGCTCCTGCCCCGGTTA-3′。

5、PCR克隆肉鸭OXTR基因

以北京鸭的DNA池为模版，用设计的克隆测序引物进行PCR扩增，PCR总反应体系为25μL，见表1；PCR总反应程序，见表2。

表1.PCR反应体系

表2.PCR反应程序

6、PCR产物纯化和测序

PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1所示，可以清楚看到196bp的条带，说明目的基因克隆成功；然后进行PCR产物的切胶回收及纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管中，然后用PCR产物回收纯化试剂盒(北京天根生物公司)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤如下：

(1)首先向吸附柱中加入500μL平衡液BL，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(2)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。

(3)向胶块中加入等体积溶液PC，60℃水浴放置10min左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

(4)将上一步所得溶液加入一个吸附柱中，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。

(5)向吸附柱中加入700μL漂洗液，12000r/min离心1min，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。

(6)向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000r/min离心1min，倒掉废液，将离心吸附柱放入收集管中，12000r/min离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温或50℃温箱数分钟，彻底晾干。

(7)将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液，室温放置2min。12000r/min离心1min收集DNA溶液。

(8)为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤7。

把以上北京鸭DNA池为模板的PCR纯化产物送上海生工生物工程有限公司进行双向测序。

对测序峰图进行分析，其中在同一位点有两个不同峰的是发生了单核苷酸突变；位于肉鸭OXTR基因外显子2第946位出现了T、C两种检测结果，即为筛查到的肉鸭OXTR基因的SNP多态性，该位点是为T或C的碱基多态性。

b、肉鸭OXTR基因T＞C突变多态性的RFLP-PCR检测

当肉鸭OXTR基因外显子2第946位发生T＞C突变时，即突变T为C，利用引物扩增的OXTR基因序列cctgc也相应地变成cccgc，从而成为PstI的限制性内切酶识别位点，由于筛查到的碱基多态性能被PstI限制性内切酶识别，所以直接用PstI酶对目的片段进行酶切，最后进行基因分型。

3、PCR扩增产物的PstI酶切

(1)20μLPstI酶切反应体系：10μLPCR产物，10×缓冲液(含BSA)2.5～3.0μL，PstI(10U/μL)为1.0μL，加灭菌纯水(H₂O)至20μL。

(2)酶切消化条件：37℃恒温培养箱中消化过夜。

(3)PstI消化PCR产物后琼脂糖凝胶电泳分析。

用质量浓度为2.5％的琼脂糖凝胶，100V电压电泳30min，染色后检测酶切结果，用BIO-RADGelDoc2000凝胶成像分析系统照相分析，并判型、记录其基因型；

由于肉鸭为二倍体动物，所以当发生T＞C的突变时，可形成3种不同的基因型，分别为TT、CT、CC，其RFLP-PCR检测的凝胶结果图如图2所示：由于c.946T>C突变使得原有的PstI限制酶的酶切位点丢失。在引物设计时把第一个突变位点(c.946T>C)后面第3个碱基C人为改成A，从而在突变位点处形成一个PstI限制性酶的酶切位点。TT型为1个片段：179bp；CC型为2个片段：17bp和196bp；CT型为3个片段：17bp、179bp和196bp。由于片段17bp太小，在琼脂糖凝胶不能观察到，所以在琼脂糖凝胶上，TT基因型可以观察到1条带(179bp)；CC基因型可以观察到1条带(196bp)，CT基因型可以观察到2条带(179bp和196bp)。根据条带的个数和条带的大小，如图2所示的凝胶电泳检测结果能够很清楚的判定是否发生了点突变，将3种基因型区分开，从而检测其SNP多态性。

(4)不同基因型个体PCR产物的测序验证

利用ABI377和ABI3730测序仪对不同基因型个体PCR产物分别进行正反双向测序；同时，进行SNP位置分析，结果表明包含17bp、179bp和196bp片段的杂合子CT基因型个体其外显子2第946位的测序图的确表示为T或C，如图3所示。

c、肉鸭OXTR基因外显子2第946位的SNP作为分子标记在不同基因型鸭群体中的应用

1、SNP位点的频率统计分析

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A＝(2N_AA+N_Aa1+N_Aa2+......+N_Aan)/2N。式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有A_ai基因型个体数量，al-an为等位基因A的n个不同的复等位基因；统计结果见表3。

表3.肉鸭OXTR基因第2外显子946位SNP位点基因型频率和基因频率分布表

3、基因效应的关联分析

基因型数据：PstI识别的基因型(TT、CT和CC)

生产数据：生长性状数据(6周胴体重、胸肌率、腿肌率、腹脂率和皮脂率)

关联分析模型：

利用SPSS(17.0)软件分析基因位点、公禽、场别效应、年龄和品种效应与生长性状的相关性。先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，利用多元线性模型分析基因型效应。模型如下：

y_ijklmn＝μ+Genotype_i+S_j+B_k+F_l+Age_m+X_n+e_ijklmn

其中：y_ijklm为个体表型记录；F_l场别效应；S_j为种公禽效应；B_k：品种效应；Age_m为年龄效应；X_n为各种二级和二级以上互作效应，如：Age×Genotype，S_j×Genotype等；e_ijklmn为随机误差；运用SPSS(17.0)软件对数据进行分析，并用最小二乘法拟合线性模型，对各基因型间体尺指标进行差异显著性检验。

结果表明(见表4)：对于PstI可识别的外显子2第946位的SNP位点，对于6周胴体重、腹脂率和皮脂率，TT、CT基因型个体的数值均显著高于CC基因型个体，这说明T等位基因对6周胴体重、腹脂率和皮脂率是一个有利基因，TT、CT基因型可以成为一个提高胴体重和皮脂率育种速度的分子遗传标记。

表4.肉鸭OXTR基因突变多态性与经济性状的关联分析

注：在同一行中标有不同字母A、B、C的数据间差异为P＜0.01；标有a、b、c为差异显著水平0.01＜P＜0.05。

需要说明的是，以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所做的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (6)

1.肉鸭OTXR基因的单核苷酸多态性，其特征在于，该基因单核苷酸多态性包括：肉鸭OTXR基因外显子2第946位为T或C的单核苷酸多态性。

2.肉鸭OTXR基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：以包含OTXR基因的待测肉鸭全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增肉鸭OTXR基因；用限制性内切酶PstI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定肉鸭OTXR基因外显子2第946位的单核苷酸多态性；

所述的引物对P为：

上游引物P1：5′-GCTTCACGCAGCCTGCAG-3′

下游引物P2：5′-TGGCTCCTGCCCCGGTTA-3′。

3.如权利要求2所述的肉鸭OTXR基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54.6℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。

4.如权利要求2所述的肉鸭OTXR基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为2.5％。

5.如权利要求2所述的肉鸭OTXR基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述的根据琼脂糖凝胶电泳结果OTXR基因外显子2第946位为：TT型为1个片段：179bp；CC型为2个片段：17bp和196bp；CT型为3个片段：17bp、179bp和196bp。

6.权利要求2-5中任意一权利要求所述的肉鸭OTXR基因的单核苷酸多态性的检测方法在优化肉鸭个体育种繁殖中的应用。