CN116004856A - 与猪脂肪沉积相关的单倍型标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种与猪脂肪沉积相关的单倍型标记及其应用。所述单倍型标记包含猪AACS基因如SEQ ID NO:1所示序列第332bp处的多态性为A/C、第408bp处的多态性为C/T以及第427bp处的多态性为A/G的核苷酸序列。本发明提供的单倍型标记可用于猪的背膘厚选育，该标记不受猪的年龄、性别等限制，可用于猪的早期选育，甚至在猪刚出生时就可准确地进行选留，可大大缩短世代间隔，加快猪的育种进程。

Description

与猪脂肪沉积相关的单倍型标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种与猪脂肪沉积相关的单倍型标记及其应用。

背景技术

猪的脂肪沉积的多少，直接影响猪肉肉质和风味。研究猪的脂肪沉积机制，提升猪肉品质一直是畜牧专家育种工作的重点。脂肪生成是一个复杂的过程，受多种转录事件的调节(Ghaben AL,Scherer PE.Adipogenesis and metabolic health.Nat Rev Mol CellBiol 2019,20(4):242-258)，作为一个数量性状，同样也受多个基因的调控。与进口猪相比，我国地方猪种大多脂肪含量高，称为脂肪型猪。脂肪沉积过多导致经济效益的降低。分子标记辅助选择技术已经广泛用于品种的选育，快捷有效，不受环境限制。挖掘寻找功能明确、效应显著的分子标记，可促进优质品种的培育。

定远猪是安徽省分布最广、数量最多的猪种，体型较大，10月龄体重达89.69kg。背膘厚度较大，肌内脂肪含量高,皆高于体重约为100kg的大白猪与长白猪(吴义景,张盼,傅延如,苏世广,田广友,张浩,李庆岗.定远猪胴体和肉质性状测定及分析[J].养猪,2019(05):78-80.)。藏猪作为我国特有的高原型猪种，有地方猪种普遍特性，生长速度慢、沉脂能力强(Yang SL,Wang ZG,Liu B,Zhang GX,Zhao SH,Yu M,Fan B,Li MH,Xiong TA,Li K:Genetic variation and relationships of eighteen Chinese indigenous pigbreeds.Genetics Selection Evolution 2003,35(6):657-671.)。以脂肪沉积能力强的地方猪种与脂肪沉积能力相对弱的瘦肉型猪大白猪与长白猪猪种为材料，可用于筛选与脂肪沉积相关的基因与分子标记位点，辅助猪的品种选育。

乙酰乙酰辅酶A合成酶，又称乙酰乙酸辅酶A(AACS)，是一种在多种脂肪生成的组织中发现的胞质酮体(乙酰乙酸)特异性连接酶(Ito M,Fukui T,Saito T,Tomita K:Acetoacetyl-CoA synthetase specific activity and concentration in rattissues.Biochim Biophys Acta 1986,876(2):280-287)，可特异性激活乙酰乙酸为乙酰乙酰辅酶A，从而合成胆固醇和脂肪酸。研究表明，在AACS启动子区域找到了CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)的结合位点(Hasegawa S,Yamasaki M,Inage T,Takahashi N,FukuiT:Transcriptional regulation of ketone body-utilizing enzyme,acetoacetyl-CoAsynthetase,by C/EBP alpha during adipocyte differentiation.Bba-Gene RegulMech 2008,1779(6-7):414-419)。在人类中，AACS启动子是过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)靶基因(Aguilo F,Camarero N,Relat J,Marrero PF,Haro D:Transcriptional regulation of the human acetoacetyl-CoA synthetase gene byPPARgamma.Biochem J2010,427(2):255-264)，AACS mRNA表达在3T3-L1细胞诱导分化后第4天显著增加，其在前脂肪细胞分化过程中的表达模式与脂肪酸合成的关键酶乙酰辅酶A羧化酶1(ACC-1)的表达模式非常相似(Yamasaki M,Hasegawa S,Suzuki H,Hidai K,SaitohY,Fukui T:Acetoacetyl-CoA synthetase gene is abundant in rat adipose,andrelated with fatty acid synthesis in mature adipocytes.Biochem Bioph Res Co2005,335(1):215-219)。

发明内容

本发明的目的是提供一种与猪脂肪沉积相关的单倍型标记及其应用。

研究表明，AACS基因可能是调控脂肪沉积的重要基因。本发明通过对不同背膘厚度的定远猪的皮下脂肪组织进行转录组，结果显示在背膘厚度高的个体的脂肪组织中，该基因低表达。在脂肪沉积能力较强藏猪的脂肪组织中，该基因表达量同样低于瘦肉型猪大约克。通过对该基因SNP位点的筛选与鉴定，为猪遗传改良提供理论支持。利用Sanger测序筛选瘦肉型猪与肥胖型猪之间的差异SNP位点，在品种内分析SNP位点与背膘厚度的相关性，明确影响猪脂肪沉积的SNP位点及基因型效应。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种与猪脂肪沉积相关的单倍型标记，所述单倍型标记包含猪AACS基因如SEQ ID NO:1所示序列第332bp处的多态性为A/C、第408bp处的多态性为C/T以及第427bp处的多态性为A/G的核苷酸序列。

进一步地，第332bp处多态性位点的基因型为AA或AC，对应的猪的脂肪沉积能力强于基因型CC；

第408bp处多态性位点的基因型为CC或CT，对应的猪的脂肪沉积能力强于基因型TT；

第427bp处多态性位点的基因型为AA或AG，对应的猪的脂肪沉积能力强于基因型GG。

第二方面，本发明提供用于扩增所述单倍型标记的引物，包括如SEQ ID NO:2所示的正向引物和如SEQ ID NO:3所示的反向引物。

第三方面，本发明提供含有所述引物的检测试剂或试剂盒。

第四方面，本发明提供一种用于评价猪脂肪沉积能力的方法，包括以下步骤：

1)提取待测猪的基因组DNA；

2)以基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO:2-3所示引物进行PCR扩增；

3)分析PCR扩增产物。

优选地，PCR反应体系为：2×PCR Mix 10μl，基因组DNA 100ng，10μmol/L正、反向引物各0.5μl，用dd H₂O补齐至20μl。

PCR反应程序为：94-95℃预变性5min；94-95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，36个循环；72℃延伸5min。

步骤3)包括：对扩增产物进行测序，根据测序结果判定如下：扩增产物第332bp处多态性位点的基因型为CC，第408bp处多态性位点的基因型为TT，且第427bp处多态性位点的基因型为GG，则判定待测猪的脂肪沉积能力弱。

第五方面，本发明提供所述单倍型标记、所述引物或所述检测试剂或试剂盒的以下任一应用：

(1)用于猪脂肪沉积能力的判定；

(2)用于猪脂肪沉积能力的早期预测；

(3)用于与猪脂肪沉积能力相关的分子标记辅助育种。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明提供的单倍型标记可用于猪的背膘厚选育。

(二)本发明提供的单倍型标记不受猪的年龄、性别等限制，可用于猪的早期选育，甚至在猪刚出生时就可准确地进行选留，可大大缩短世代间隔，加快猪的育种进程。

(三)检测方法快速、准确。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中猪背脂与背最长肌中AACS基因的mRNA表达情况。

图2为本发明较佳实施例中猪AACS基因5’侧翼区三个连锁位点的测序峰图。

图3为本发明较佳实施例中猪AACS基因5’侧翼区包括三个连锁位点扩增结果；琼脂糖胶浓度为1.2％；图中Marker为DM2000；图中各泳道片段大小均为631bp。

图4为本发明较佳实施例中猪AACS基因三个连锁位点个体测序图。图中第一行峰图表示的三个连锁位点(1759bp、1683bp、1664bp)基因型分别为AA、CC、AA型，第二行峰图表示的基因型分别为AC，CT，AG，第三行峰图表示的基因型分别为CC、TT、GG。

具体实施方式

本发明提供一种与猪脂肪沉积相关的单倍型标记的鉴定及其应用，即采用聚合酶链式反应(PCR)及PCR产物测序的方法来检测基因型，根据基因型进行猪的选育，可以改善猪肉品质，加快猪的选育进程。

本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种经过PCR测序方法筛选的猪AACS基因中与脂肪沉积性状相关的单倍型遗传标记，它的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

其中，SEQ ID NO:1所示序列中第332bp处有一个A碱基到C碱基的突变(即n为a或c)，408bp位置有一个C碱基到T碱基的突变(即n为c或t)，427bp处有一个A碱基到G碱基的突变(即n为a或g)，这三个位点的突变是完全连锁的突变。这三个位点分别位于起始密码子ATG前1759bp，1683bp，1664bp处。

其中：检测所述碱基突变的引物序列如序列表SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。

正向引物F：5'-AGGAGAAAGGAGCAGAGCCA-3'

反向引物R：5'-TTGAGCAGGGAACGGAAT-3'

一种与猪脂肪沉积相关的单倍型标记的鉴定及其应用，具体步骤如下：

从猪耳组织中提取基因组DNA，根据猪AACS基因5’侧翼区序列设计引物，得到引物序列如下：正向引物F：5'-AGGAGAAAGGAGCAGAGCCA-3'(SEQ ID NO:2)，反向引物F：5'-TTGAGCAGGGAACGGAAT-3'(SEQ ID NO:3)。用所示的引物在猪基因组DNA中进行PCR扩增，PCR产物纯化克隆测序，获得如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

本发明进一步提供利用PCR产物测序进行不同基因型个体与猪脂肪沉积性状相关分析应用。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1猪AACS基因组织表达分析

定远猪(DY)，来源于安徽省定远县安康农牧公司，依据背膘厚度分为高背脂组(HBF)与低背脂组(LBF)；藏猪(TP)、大约克猪(YH)来源于西藏自治区林芝市西藏农牧学院教学实习牧场，其中定远猪为300日龄，其余猪都为6月龄，采集背最长肌(LD)与背脂组织(BF)，利用Trizol传统法提取组织RNA，并反转录成cDNA。

用RACE实验克隆猪AACS基因mRNA序列，利用软件Primer Premier 5.0，设计以下引物：

正向引物F：5'-AAGAGCATCCGCAACGCCAT-3'

反向引物R：5'-CTTCTTGCCGTTGAGGGTGT-3'

用上述引物在定远猪、藏猪和大约克猪背部脂肪与背最长肌组织的cDNA进行实时荧光定量PCR扩增，PCR扩增使用20μl反应体系：10μl 2×SuperReal PreMix Plus，8μlddH₂O，正、反向引物各0.5μl，cDNA模板1μl；将PCR扩增反应体系在95℃预变性15min；进行如下循环40个：95℃预变性20s，55℃退火20s，72℃延伸20s。以β-actin(上游引物：5'-GGACTTCGAGCAGGAGATGG-3'；下游引物：5'-AGGAAGGAGGGCTGGAAGAG-3')为内参，利用2^–ΔΔCT法进行AACS基因在不同品种猪组织中的相对表达分析(图1)。

在脂肪组织中，藏猪的AACS基因表达量显著低于大约克猪，肌肉组织中二者无显著差异。在背膘厚度差异的定远猪中得出同样的结果，高背脂组的脂肪组中AACS基因表达量显著低于低背脂组，肌肉组织中无显著差异。推测AACS基因高表达可能对猪背部脂肪的沉积起负调控作用。

实施例2猪AACS基因SNP位点的筛选

选择中国地方品种“藏猪”(采自西藏自治区林芝市西藏农牧学院教学实习牧场)和引进品种“大约克猪”(采自安徽科鑫养猪育种有限公司)和“长白猪”(北京中顺景盛养殖有限公司)的耳组织样，采用苯酚/氯仿法提取组织基因组DNA。

从NCBI上下载猪AACS基因序列(登录号NC_010456.5)，利用软件PrimerPremier5.0，对从NCBI上下载的AACS基因的DNA序列，设计以下引物(SEQ ID NO:2-3)：

正向引物F：5'-AGGAGAAAGGAGCAGAGCCA-3'

反向引物R：5'-TTGAGCAGGGAACGGAAT-3'

用上述引物在藏猪、大约克猪、长白猪基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增一般使用20μl反应体系：2×PCR Mix用量为PCR扩增反应体系体积的一半即10μl，100ng所述待检测猪基因组DNA，10μmol/L正、反向引物各0.5μl，最后用ddH₂O补充至20μl，混匀，即得PCR扩增反应体系。将PCR扩增反应体系在94-95℃预变性5min；进行如下循环36个：94-95℃预变性30s,60℃退火30s，72℃延伸1min；72℃延伸5min,即得到PCR产物。

对上述3个猪种的PCR产物经Gel Extraction Kit试剂盒(购自上海生物工程技术有限公司，按照试剂盒说明书操作)纯化。每个猪种分别选20个个体进行PCR扩增，每个个体的PCR产物各取10μl，混池成一个样本进行测序(华大基因)。扩增产物的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。

测序结果经Chromas Pro软件比对，在SEQ ID NO:1所示的序列中332bp处有一个A碱基到C碱基的突变，408bp位置有一个C碱基到T碱基的突变，427bp处有一个A碱基到G碱基的突变，这三个位点的突变是完全连锁的突变。这三个位点分别位于5’侧翼区密码子上游第1759bp，1683bp，1664bp处(图2)。

实施例3猪AACS基因A-1759C、C-1683T、A-1664G位点基因型检测测序方法建立

为了快速方便地检测猪AACS基因A-1759C、C-1683T、A-1664G位点基因型，用实施例1中的引物对猪的基因组DNA进行PCR扩增，PCR反应体系为20μl体系：2×PCR Mix用量为PCR扩增反应体系体积的一半即10μl，100ng所述待检测猪基因组DNA，10μmol/L正、反向引物各0.5μl，最后用ddH₂O补充至20μl，混匀，即得PCR扩增反应体系。将PCR扩增反应体系在94-95℃预变性5min；进行如下循环36个：94-95℃变性30s,60℃退火30s，72℃延伸1min；72℃延伸5min,即得到PCR产物。

PCR扩增产物用添加核酸染料SYBR Green I，浓度为1.2％的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统中观察PCR扩增效果，可见到片段大小为631bp的清晰条带(图3)。对PCR产物进行测序，通过测序峰图来判断基因型(图4)。

实施例4遗传标记在不同猪群中的基因型分布检测

采集藏猪(采自西藏自治区林芝市西藏农牧学院教学实习牧场)和大约克猪(采自安徽科鑫养猪育种有限公司)和长白猪(北京中顺景盛养殖有限公司)耳组织样品，采用苯酚/氯仿法提取猪个体基因组DNA样品。

采用扩增PCR产物测序技术，测定三个品种个体AACS基因A-1759C、C-1683T、A-1664G连锁位点的基因型，检测结果如表1所示。

表1猪AACS基因A-1759C、C-1683T、A-1664G位点基因型分布

藏猪脂肪沉积能力强于引进猪种，属于脂肪型猪。表1中可见A-1759C、C-1683T、A-1664G三个位点完全连锁，形成ACA，CTG两个单倍型，ACA/ACA，ACA/CTG，CTG/CTG三种基因型。藏猪中AACS基因的ACA/ACA基因型频率明显高于大约克和长白猪，优势单倍型为ACA。而脂肪沉积较慢的猪种(大约克、长白)在该位点的优势基单倍型均为CTG。由此初步判断5’侧翼区ACA/ACA基因型为脂肪沉积能力强的基因型，CTG/CTG基因型为脂肪沉积能力弱的基因型。结果表明该基因在三个连锁位点的基因型和等位基因分布在不同脂肪沉积能力的猪群间差异明显，可能与脂肪沉积性状相关。

实施例5定远猪新品系群体中AACS基因型与猪背膘厚关联分析

定远猪新品系是由中国地方品种定远猪和引进的巴克夏猪为亲本，进行杂交选育而成。采集104头定远猪新品系(采自安徽定远县安康农牧公司)耳组织样品，所有个体测定并计算校正背膘厚(式1)与达70kg体重日龄(式2)。背膘厚测量采用B超扫描测定倒数第3～4肋间处的背膘厚，以毫米为单位。用校正背膘厚的公式对其进行校正，得到校正后的背膘厚。

式1：校正背膘厚＝实测背膘厚×[A÷{A+[B×(实测体重–70)]}]

其中，A和B值：公猪A＝12.826，B＝0.11437；母猪A＝13.983，B＝0.12601式2：达70kg体重日龄＝实际测定日龄-(实测体重-70)/(实测体重/实际测定日龄*C)

其中，公猪：C＝1.826040；母猪：C＝1.714615

采用实施例4中建立的PCR产物个体测序法判定104头定远猪新品系的AACS基因A-1759C、C-1683T、A-1664G位点的基因型，结果见表2。

表2AACS基因A-1759C、C-1683T、A-1664G位点与背膘厚度及生长性状关联分析

注：ACA/ACA、ACA/CTG、CTG/CTG代表三种基因型，n代表统计个数，相间字母表示差异极显著(P<0.01)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。表中数值为平均数±标准误。

定远猪新品系群体中该位点出现的3种基因型中ACA/ACA型频率32.7％，ACA/CTG型频率55.8％，CTG/CTG型频率为11.5％。对该群体中该位点的基因型与背膘厚进行的相关性分析结果显示，ACA/ACA型与ACA/CTG型背膘厚度均比CTG/CTG型高3mm以上，差异达极显著水平。与达70kg体重日龄进行关联分析发现，三种基因型的定远新品系达70kg体重日龄接近，未达显著水平。可见ACA/ACA、ACA/CTG是脂肪沉积快的分子标记，可以用于猪分子标记辅助育种。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.与猪脂肪沉积相关的单倍型标记，其特征在于，所述单倍型标记包含猪AACS基因如SEQ ID NO:1所示序列第332bp处的多态性为A/C、第408bp处的多态性为C/T以及第427bp处的多态性为A/G的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的单倍型标记，其特征在于，第332bp处多态性位点的基因型为AA或AC，对应的猪的脂肪沉积能力强于基因型CC；

第408bp处多态性位点的基因型为CC或CT，对应的猪的脂肪沉积能力强于基因型TT；

第427bp处多态性位点的基因型为AA或AG，对应的猪的脂肪沉积能力强于基因型GG。

3.用于扩增权利要求1或2所述单倍型标记的引物，其特征在于，包括如SEQ IDNO:2所示的正向引物和如SEQ ID NO:3所示的反向引物。

4.含有权利要求3所述引物的检测试剂或试剂盒。

5.用于评价猪脂肪沉积能力的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测猪的基因组DNA；

2)以基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO:2-3所示引物进行PCR扩增；

3)分析PCR扩增产物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR反应体系为：2×PCR Mix 10μl，基因组DNA 100ng，10μmol/L正、反向引物各0.5μl，用dd H₂O补齐至20μl；

PCR反应程序为：94-95℃预变性5min；94-95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，36个循环；72℃延伸5min。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤3)包括：对扩增产物进行测序，根据测序结果判定如下：扩增产物第332bp处多态性位点的基因型为CC，第408bp处多态性位点的基因型为TT，且第427bp处多态性位点的基因型为GG，则判定待测猪的脂肪沉积能力弱。

8.权利要求1或2所述单倍型标记、权利要求3所述引物或权利要求4所述检测试剂或试剂盒的以下任一应用：

(1)用于猪脂肪沉积能力的判定；

(2)用于猪脂肪沉积能力的早期预测；

(3)用于与猪脂肪沉积能力相关的分子标记辅助育种。

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