CN1978640A - 一种猪背膘厚基因cmya1的克隆及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于动物基因工程技术领域,具体地说涉及猪背膘厚基因CMYA1的克隆及其制备方法。本发明的特征是克隆到如序列表SEQ ID NO:1所示的猪背膘厚基因CMYA1基因的cDNA和DNA序列,检测到3个影响猪背膘厚的碱基突变。本发明公开了猪CMYA1基因序列和影响猪背膘厚的碱基突变位点。进而,还公开了获得上述基因的制备方法。本发明为猪的标记辅助育种提供了新的分子标记。
Description
技术领域
本发明属于动物基因工程技术领域,具体涉及一种猪背膘厚基因CMYA1的克隆以及作为猪背膘厚相关性状的分子标记的应用。
背景技术
育种目标是由市场和消费需求而决定的。20世纪以来,人们主要的目标性状是生长速度、饲料转化率和屠宰后的胴体瘦肉率。随着国内外活猪及猪肉产品的商品市场的发展及科技水平的提高,对胴体品质评定的标准化、规格化等已成为研究热门,目前世界上公认的胴体品质评定指标具体有:胴体瘦肉率(leanpercentage in the carcass,CLP)、瘦肉量(lean content in the carcass,CLC)或可销售瘦肉分割块比率(lean cutsratio,LCR)。在实际工作中,人们试图寻找一种简便的活体评定胴体品质的方法,以减少屠宰带来的经济损失,因此大量研究致力于寻找胴体组成的最佳预测指标。活体性状与胴体瘦肉率的遗传相关分析结果表明,活体平均背膘厚与胴体瘦肉切块产量的rA最高,为-0.80,活体背膘厚与胴体瘦肉量的rA为-0.54,背膘厚的年遗传进展为:-0.35mm/年(Kennedy,1996)。因此通过对活体背膘厚的直接选择,可望使瘦肉率(量)获得相关反应(彭中镇等:《猪的遗传改良》,北京,农业出版社,1991),而目前DNA分子标记技术的发展和应用,为胴体瘦肉率的直接选择,特别是早期选择和胴体品质的快速评定开辟了新途径。
目前已研究的与猪背膘厚相关的基因有:(1)Yu等(Yu TP等,Association of PIT1 polymorphisms withgrowth and carcass traits in pigs.J Anim Sci,1995,73:1282-1288.)在一个含中国与美国猪品种“血液”的资源家系中检测到垂体转录因子(Pituitary transcription factor 1,PIT1)与平均背膘厚存在显著相关。(2)Jeon等(Joen J T等,A paternally expressed QTL affecting skeletal and muscle mass in pigs maps tothe IGF2 locus.Nature Genetics,1992,21:157-158.)和Nezer等(Nezer C等,An imprinted QTL withmajor effect on muscle mass and fat deposition maps to the IGF2 locus in pigs.Nature Genetics,1992,21:155-156.)分别用两个家系类胰岛素生长因子2(Insulin like growth factor II,IGF-II)定位于猪2号染色体上,并检测到该基因与背膘厚有显著相关。(3)黑素皮质激素受体4(Melanocortin-4 receptor,MC4R)位于猪1号染色体上(Kim K S等,Linkage and physical mapping of the porcine melanocortin-4 receptor(MC4R)gene:J Anim Sci,2000a,78:791-792),Kim等(Kim K S等,A missense variant of the porcinemelanocortin-4 receptor(MC4R)gene is association with fatness,growth,and feed intake traits.Mamm Genome,2000b,11:131-135.)在5个猪商品系中检测到MC4R基因遗传变异与背膘厚显著相关。(4)正在研究的与猪生长和胴体性状相关的候选基因还有:与生长、胴体性状可能有关的瘦素基因(Leptin,LEP)即肥胖基因和生肌因子3(myf3)(Kim K S等,A missense variant of the porcine melanocortin-4 receptor(MC4R)geneis association with fatness,growth,and feed intake traits.Mama Genome,2000,11:131-135)。对骨骼肌的生长有负调控作用的肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因,该基因又称GDF-8(Growth differentiation factor8,生长分化因子8)(Mcpherron A C等,Double muscling in cattle due to mutation in the myostatin gene:ProcNatl Acad Sci,USA,1997,94(23):12457-12461:),与背膘厚有显著相关的组织蛋白酶B(Cathepsin B,CTSB)基因(Russo V等,Investigation of candidate genes for meat quality in dry-cured ham production:theporcine cathepsin B(CTSB)and cystatin B(CSTB)genes.Anim Genet,2002,33:123-131.)等。
CMYA1(cardiomyopathy associated 1)基因编码的蛋白又称心蛋白。目前已有人、鸡、斑马鱼和小鼠CMYA1基因组织结构、表达和功能研究报道。人CMYA1基因定位在3p22.2,cDNA序列全长为645Ibp,编码1843个氨基酸。小鼠CMYA1基因在9F4,cDNA序列为5810bp,编码1133个氨基酸。
目前对该基因的研究主要表现在:1996年,人们通过差显得到,它特异地在心脏发育的早期表达(Wang等,Differential displaying of mRNAs from the atrioventricular region of developing chicken hearts at stages 15and 21.Front.Biosci.,1,1-15)。1999年,人们用心蛋白的寡聚核苷酸对培养的鸡胚胎处理可导致鸡心脏的生长形态发生异常,从而显示了心蛋白对心脏形态的生长的重要作用;对小鼠和鸡的CMYA1基因的氨基酸序列的比较分析结果表明该基因具有很高的物种之间的保守性,并分析了它们之间具有共同的核定位信号、DNA结合结构域以及SH3结合结构域,因此可以推测该基因可能是一个转录调控因子,并参与了蛋白质之间相互作用的信号传导(Wang等,Requirement of a novel gene,Xin,in cardiac morphogenesis,Development,1999,126,1281-1294),SH3结合结构域在细胞内信号传导,生长调控以及细胞骨架组织调控等方面发挥重要作用(Christopher等,Primary sequence of paxillin contains putative SH2 and SH3 domainbinding motifs and multiple LIM domains:identification of a vinculin and pp125Fak-binding region.,Journal ofCell Science,1994,107:1583-1591);SH3结合结构域起着基因与核内受体相联接的作用,进而控制细胞的生长、发育以及动态平衡(Zhou等,PNRC2 is a 16 kDa coactivator that interacts with nuclear receptorsthrough an SH3-binding motif.Nucleic Acids Research,2001,,29(19):3939-3948)。人心蛋白中含有16个氨基酸的重复序列,该重复序列是一个新的肌动蛋白的结合位点(Dirk等,Xin repeats define a novelactin-binding motif,,2004,Journal of Cell Science,117:5257-5268)。通过免疫共沉淀和荧光印记检测发现,从胚胎发生到成年的整个发育过程中都观察到Xin与β连锁蛋白(beta-catenin)的共定位(colocalization)(Haley等,Localization of the Novel Xin Protein to the Adherens Junction Complex in Cardiacand Skeletal Muscle During Development.,Developmental Dynamics,2002,225:1-13)。而在心脏发育过程中,Xin早于vinculin(alpha-actin)被检测到,并且与其共存于胚胎及出生后的心脏闰盘中,在胚胎发育的第10天,最初在体节中检测到Xin的表达,随后在肌腱接点处检测到表达;在培养的C2C12细胞中检测到Xin蛋白表达于很多斑点状和纤维丝状结构中,与原肌球蛋白共表达于压力纤维中,Xin与闰盘蛋白及细丝蛋白相关的时空表达特征表明Xin在细胞与细胞之间联系的形成中发挥作用,并可能在肌原纤维形成(Myofibrillogenesis发生)中发挥作用。通过以上资料我们可以得出CMYA1基因是一个重要的肌肉生长发育相关基因。因此将该基因运用在分子辅助标记选择中具有重要的意义。
尽管猪背膘厚侯选基因的研究取得了一些重要进展,但仍然存在不足:(1)猪的重要经济性状通常是数量性状,涉及到的生理生化过程相当复杂,即使同一个数量性状,它也受多个基因的调控,尽管已揭述其1-2个受控基因,但仍有其它具有大效应的新基因有待发现。(2)目前有关数量性状基因的研究,基本上是选用单一候选基因进行分析,忽略了基因间的相互作用。现代分子育种的内容之一是基因组育种,即根据个体所有性状的基因和基因型的组织结构及功能效应进行整体或全基因组选择、选配、保种和杂种优势分析利用等,其基础是有完整的高密度的基因图,并充分了解所有基因的组织结构、功能表达调控机理以及与性状的关联,然而目前在猪中已经遗传定位和物理定位的基因和标记仍十分有限,这方面的工作还需要进一步的加强。(3)寻找具有重要生理功能基因的方法不够全面,检测基因的数量有限,效率不高,需要创新,进一步寻找与猪重要经济性状相关新基因的工作迫在眉睫。
为此本申请人以探索猪生长发育的分子机理,了解中外猪种肌肉生长、胴体瘦肉率和肌肉品质表型差异形成的遗传本质的目的,先后采用mRNA差异显示、cDNA宏阵列技术开展了同一阶段不同品种和同一品种不同发育阶段肌肉组织中差异表达EST的筛选工作,发现了一批具有品种间差异或时空差异的EST。对于这些EST进一步获得其cDNA序列并开展功能研究是寻找猪生长相关候选基因的一条捷径。其中通过mRNA差异显示筛选并经反Northern Blot和Northern Blot验证的一条EST-ESThpl(GenBank登录号为BI596262)仅在骨骼肌和心肌中表达,且该EST在杜洛克猪肌肉组织中表达量明显高于二花脸猪(一种具有中国地方血缘的猪种)。但目前国内外对猪CMYA1基因的研究还是空白。
发明内容
本发明的目的在于克隆一种猪背膘厚基因CMYA1,利用该基因的部分突变位点作为猪背膘厚相关性状的分子标记的应用,为猪的育种提供一种标记辅助选择。
本发明通过以下技术方案实现:
一种猪背膘厚基因CMYA1,它的DNA序列如序列和cDNA序列如序列表SEQ ID NO:1所述。该cDNA序列长度为6310bp,序列中包含5421bp的开放阅读框,158bp的5’非翻译区和731bp的3’非翻译区。
其中:所获得的CMYA1基因cDNA序列中有3个碱基位点突变,即:
(1)A1552-G1552的碱基替换,该替换引起氨基酸由组氨酸变成精氨酸;
(2)A1909-G1909的碱基替换,该替换引起氨基酸由天门冬氨酸变成甘氨酸;
(3)A3448-C3448的碱基替换,该替换引起氨基酸由苏氨酸变成天门冬氨酸。
一种制备前述cDNA序列的方法,它按照以下步骤制备:
用人CMYA1基因cDNA为信息探针,作同源序列筛选,获得同源性80%以上的表达序列标签;然后拼接猪EST-重叠群,设计引物扩增中间未知片段,纯化克隆测序;设计5’和3’RACE引物;提取猪肌肉组织总RNA并做cDNA第一链反转录;RACE的PCR扩增和RACE产物的纯化克隆和测序;通过序列分析获得如序列表SEQ IDNO:1所述的cDNA序列。
制备前述的DNA序列的方法,按照以下步骤:
从猪血液基因组中提取DNA,以猪CMYA1基因cDNA序列为模扳设计引物,进行PCR扩增,PCR产物纯化和克隆测序,获得如序列表SEQ ID NO:1所述DNA序列;
作为一种成功的实施例,本申请人已经采用上述PCR-RFLP方法检测猪CMYA1基因第1552位、1909位、3448位的碱基替换。
根据本发明的基本思想和具体实施例,很显然,本发明的cDNA序列可以应用于猪多态性分析,另外本发明所述的DNA序列也可以在猪多态性分析中得到应用。
更详细的技术方案由以下所述:
1.CMYA1基因的克隆:
(1)引物设计:
用人CMYA1基因cDNA(GenBank收录号:NM_194293)为信息探针,利用NCBI中的BLAST工具在GenBank猪EST数据库中做同源序列筛选,获得一系列同源性为80%以上的ESTs(片段长度大于100bp),将这些ESTs的收录号在NCBI中用ENTREZ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Search/index.html)查询相应序列,然后用GeneTool中的ASSEMBLY程序构建猪EST-重叠群。根据EST拼接序列设计一对引物P1-F和P1-R,扩增得到一条片段F1R1
表1:用于CMYA1基因cDNA克隆的引物序列
引物标号 | 引物序列 | 退火温度 | 预期PCR产物长度(bp) | 引物设计所依据的序列 |
P-1FP-1R | GTGGGAATGTAAGCAGAGCAGAAGGGAATGCAGATGATGGACGGAACC | 63℃ | 约4200 | BX916922EST重叠群 |
P-5’RP-5’N | TGGGGATGGCTGGAAGTCCTTCTCGTCCGAGTTGCGCTAACATCAGG | 75℃61℃ | 约1500约1100 | BX916922BX916922 |
P-3’R | GTTGCCCAAGCACAGGAACAGGAC | 68℃ | 约500 | EST重叠群 |
(2)建立RACE方法:利用TRIzoL试剂盒(购自美国GIBCO公司)从成年长自肌肉组织中提取总RNA,具体操作依照试剂盒说明书进行。总RNA溶于RACE试剂盒提供的超纯水,用Beckman DU640核酸蛋白质浓度测定仪测定其A260nm值,并通过1.2%的甲醛凝胶电泳检测其完整性。
利用RACE试剂盒(购自美国CLONTECH公司)进行cDNA末端快速扩增,具体操作按试剂盒说明书进行。
(3)RACE产物的纯化、克隆和测序:RACE产物的纯化:在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶,放入1.5ml Ependorff管中,于70℃温育至凝胶完全融化,然后用PCR产物纯化试剂盒(购自Promega公司)纯化PCR产物,按照试剂盒说明书操作,具体步骤是在每300μl融化的凝胶中加入1ml Resin,混匀20s,将Resin/DNA混合物装入注射器,使浆液通过Minicolumn挤出。再在注射器中加入80%的异丙醇2ml,轻推活塞使异丙醇通过Minicolumn挤出,取下Minicolumn装入1.5ml Ependorff管中,10,000g离心2min以干燥Resin,将Minicolumn装入另一个干净的1.5ml Ependorff管中,加入30~50μl灭菌水,静置1min,10,000g离心20s,以洗脱DNA存于Ependorff管中。
连接反应:将纯化RACE产物与pGEM-T载体连接,连接反应总体积是5μl,其中包括2.5μl 2×buffer,0.5μl的T载体(购自Promega公司),0.5μl的纯化PCR产物,0.5μl的T4连接酶,最后加入1μl灭菌水置4℃水浴过夜。
感受态细胞的制备:从37℃培养了16~20h的新鲜平板上挑取一个DH5α单菌落接种于2ml LB中,于37℃振荡培养3h,转接1ml菌液于含有30ml LB的盐水瓶中,继续在37℃振荡培养约4h,待OD600达到0.3~0.4时将盐水瓶从摇床取出置冰浴冷却10~15min,然后将菌液转入离心管中于4℃ 4,000g离心10min以收集细胞,将离心管倒置以弃净培养液,用10ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬沉淀,冰浴30min,重复4℃ 4,000g离心10min一次,用4ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬沉淀,置4℃保存备用。
转化:无菌状态下取100~120μl感受态细胞于1.5ml Ependorff管中,将5μl的连接产物加入混匀,在冰上放置30min,42℃热激90s,其间不要摇动Ependorff管,取出后冰浴3~4min,加入400μl无抗生素的LB液体培养基,37℃振荡培养45min。取100μl涂布于已提前4h涂布了IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside,中文名称为异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal的琼脂平板上,37℃平放1h后倒置培养。
质粒的小量制备:挑取平板上的单菌落,接种于2-3ml LB中,37℃300r/min培养过夜。用1.5ml EP管12000r/min离心数秒收集菌体。每管加入100μl用冰预冷的溶液I[50mM葡萄糖,25mM Tris.Cl(pH8.0),10mM EDTA(pH8.0)],涡旋振荡至菌体充分悬浮。加入新配制的溶液II[0.2M NaOH,1%SDS]200μl,快速颠倒混匀,冰浴5min,然后加入预冷的溶液III[5M乙酸钾,冰乙酸11.5ml,H2O 28.5ml]150μl,混匀后冰浴5min,12000r/min离心5min,将上清转至另一EP管中,加入苯酚:氯仿:异戊醇500μl,涡旋振荡,离心后小心吸取上层水相,加入2倍体积的无水乙醇,-20℃沉淀30min,12000r/min离心5min,沉淀用70%乙醇洗涤2次,抽干,加入含有RNA酶的TE 20μl。
重组质粒的酶切鉴定:取3μl质粒DNA与适量的双蒸水混匀,使其总体积为15μl,加入2-3U限制性内酶EcoR I及2μl相应的10X限制性内切酶反应缓冲液,轻弹管壁混匀并离心,置37℃水浴1-2小时,取2-3μl反应液于琼脂糖凝胶电泳检测,酶切结果与预计完全相同者,即为目的重组质粒。重组质粒采用双脱氧末端终止法在DNA自动测序仪上进行测序,序列测定由北京奥科生物技术有限公司完成。
(4)DNA序列同源性检索鉴定:通过美国国家生物技术信息中心(NCBI,National Center forBiotechnology Information,http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)软件,将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较,以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。
2.基因定位:
(1)用于基因定位的引物序列是
CMYA1:P-MF 5′-GCTAACCAAGGTGCCCAGAC-3′
P-MR 5′-TGGGCAACTCAGGGAGCATC-3′
该引物扩增片段长度为363bp。
(2)用于基因定位的实验材料
用法国Minnesota大学构建的猪辐射杂种板(INRA-Minnesota porcine radiation hybrid panel,IMpRH)进行染色体精确定位,该杂种板由法国Martion Yerle博士(Laboratoire de Génétique Cellulaire,INRA,Castanet-Tolosan,France)惠赠。
IMpRH使用的辐射剂量是7,000-rad。IMpRH包括118个猪×仓鼠辐射杂种细胞系,以及仓鼠和猪基因组DNA阳性对照,用757个标记的鉴定结果表明IMpRH中的平均标记存留率为29.3%,包含有128个连锁群,覆盖了18对常染色体及X染色体,用于估计标记间距离的kb/cR比值是~70kb/cR(1Ray=100cR),理论分辨率是145kb。各细胞系中所包含的猪染色体及染色体片段信息可从WWW(http://www.toulouse.inra.fr/lgc/lgc.html/)获得。
(3)PCR分型条件
进行扩增的PCR反应总体积为10μl,其中模板DNA为20ng,含1×buffer(Promega),1.5mmol/LMgCl2,dNTP终浓度为150μmol/L,引物终浓度为0.4μmol/L,2U Taq DNA聚合酶(Promega)。PCR扩增程序是:94℃ 3min,循环35次94℃ 30s,66℃ 30s,然后72℃ 30s,最后72℃延伸5min。PCR反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。
3.PCR-RFLP诊断方法建立
(1)引物序列
CMYA1 P-S1F 5′-CAACTCACTCATTGGGCACG-3′
P-S1R 5′-CAGGGCTACAGGTGGATG-3′
该引物扩增片段长度291bp。
CMYA1 P-S2F 5′-CAGCCCGGCCTGATGTTAG-3′
P-S2R 5′-CCGTGCCTTGTCCTTAGTTGTG-3′
该引物扩增片段长度989bp。
CMYA1 P-S3F 5′-GACAGCAACAGCCGAAGC-3′
P-S3R 5′-TCCTGAATAGTCACCCACCC-3′
该引物扩增片段长度246bp。
(2)PCR扩增条件:PCR反应总体积20μl,其中猪基因组DNA约100ng,含1×buffer(Promega),1.5mmol/L MgCl2,dNTP终浓度为150μmol/L,引物终浓度为0.4μmol/L,2U Taq DNA聚合酶(Promega)。PCR扩增程序是:94℃ 3min,循环35次94℃ 30s,58-60℃ 30s,然后72℃ 15-40s,最后72℃延伸5min。PCR反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。
(3)RFLP检测条件:PCR产物酶切反应体积是10μl,其中1×buffer 1μl,PCR产物3~5μl,限制性内切酶HaeIII/NcoI/RsaI为0.3μl(10U),用H2O补足10μl,将样品混匀后离心,37℃水浴4h,用2%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果,记录基因型,在紫外灯下拍照。
4.标记性状关联分析:在利用申请人所在的动物分子生物学与育种实验室组建的“通城猪”(该品种属于一种公开饲养的中国地方猪品种)和其他血缘的猪群做性状关联分析,取大约200个DNA样品用于基因型检测。所分析的性状有部分生长性能和部分肉质性状。申请人建立了如下最小二乘模型:
yijk=μ+GENOTYPEi+SEXj+COMBINATIONk+εijk,
其中,yiik是性状观察值,μ为总体均数,GENOTYPEi为基因型效应,SEXj为性别效应,COMBINATIONk为组合的效应,εiik为随机误差,假定服从N(0,σ2)分布。
本发明的效果是:
1.猪CMYA1基因的克隆结果:以成年“长白猪”(一种来源于欧洲血缘的猪种)的肌肉组织提取总RNA反转录合成的cDNA为模板,分别用表1所列的引物进行PCR扩增,扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示均为特异的PCR产物。将PCR产物回收纯化后克隆测序,并用GeneTool1.0软件中的ASSEMBLY程序进行拼接,得到一条长度为6310bp的cDNA整合序列(见SEQ ID NO:1所述)。将这段cDNA序列在GenBank中进行同源性检索,检索结果该序列与人CMYA1基因cDNA(GenBank收录号:NM_194293)的同源性达81%,序列分析表明该cDNA序列具有5421bp(nt 159-5579)的开放阅读框,编码一个由1806个氨基酸组成的蛋白质。
2.猪CMYA1基因的定位结果:用CMYA1的MF和MR引物在IMpRH分型结果是00000100000010010000 0000001000 0000000010 0000000000 000100101? 0000010000 0000100?000000000010 0100000010 1000001000 01010000(其中0和1分别表述扩增结果为阴性和阳性,?表示不确定)。将以上的检测结果提交网站(
http://www.toulouse.inra.fr/lgc/lgc.html/),统计分析结果,CMYA1基因与猪13号染色体上的微卫星S0288紧密连锁,LOD值为11.59,RH图距是0.27 Ray。
3.PCR-RFLP诊断方法建立:用CMYA1 S1F和S1R引物扩增猪基因组DNA得到291bp特异扩增片段,该片段位于第二外显子内(如图2)。测序的结果发现在该291bp片段中存在一个HaeIII酶切位点(GG↓CC),其中第212bp处为多态性切点,位于外显子2中,再分别对该位点两个纯合子的测序结果显述,当第212bp位置是A212时,则该HaeIII酶切位点不存在,HaeIII酶切后检测结果只有1个片段,长度是291bp(定为等位基因A);但存在A212→G212的替换时,其结果导致第212bp处一个HaeIH酶切位点的产生,得到2个片段,长度分别为212bp和79bp(定为等位基因G),三种基因型AA,AG,GG如图3所述。
用CMYA1 S2F和S2R引物扩增猪基因组DNA得到989bp特异扩增片段,该片段位于第二外显子内(如图2)。测序的结果发现在该989bp片段中存在一个NcoI酶切位点(C↓CATGG),其中第499bp处为多态性切点,位于外显子2中,再分别对该位点两个纯合子的测序结果显述,当第499bp位置是A499时,则该NcoI酶切位点不存在,NcoI酶切后检测结果只有1个片段,长度是989bp(定为等位基因A);但存在A499→G499的替换时,其结果导致第499bp处一个NcoI酶切位点的产生,得到2个片段,长度分别为499bp和490bp(定为等位基因G),三种基因型AA,AG,GG如图4所述。
用CMYA1 S3F和S3R引物扩增猪基因组DNA得到246bp特异扩增片段,该片段位于第二外显子内(如图2)。测序的结果发现在该246bp片段中存在一个RsaI酶切位点(GT↓AC),其中第132bp处为多态性切点,位于外显子2中,再分别对该位点两个纯合子的测序结果显述,当第132bp位置是A132时,则该RsaI酶切位点不存在,RsaI酶切后检测结果只有1个片段,长度是246bp(定为等位基因A);但存在A132→C132的替换时,其结果导致第132bp处一个RsaI酶切位点的产生,得到2个片段,长度分别为132bp和114bp(定为等位基因C,三种基因型AA,AC,CC如图5所述。
4.标记性状关联分析:对猪CMYA1基因第2外显子HaeIII-RFLP多态性位点与部分生产性状进行关联分析,所分析的性状是170日龄屠宰时的背膘厚。
基因型检测结果表明在204个个体中AA基因型,有66个,AG基因型有106个个体,GG基因型有32个个体。在与部分生产性状进行关联分析中,所分析的性状是170日龄屠宰时的屠宰率、胸腰椎背膘厚和三点平均背膘厚。基因型间性状的简单均数和标准差分析结果总结于表2。关联分析结果表明,AA与GG基因型猪,以及AG型与GG型猪的背膘厚呈显著差异,GG基因型猪的背表厚为:平均值2.9645±0.168(cm)最薄。
表2:不同CMYA1基因HaeIII-RFLP基因型与部分生产性状的关联分析
基因型 | 个体数目 | 三点平均背膘厚(cm) |
AAAGGG | 6610632 | 3.4155±0.117a3.4145±0.093a2.9645±0.168b |
AA-AGAA-GGAG-GG | P-value0.9960.0290.020 |
对猪CMYA1基因第2外显子RsaI-RFLP多态性位点与部分生产性状进行关联分析,所分析的性状是170日龄屠宰时的背膘厚。
基因型检测结果表明在199个个体中AA基因型,有28个,AC基因型有92个个体,CC基因型有79个个体。在与部分生产性状进行关联分析中,所分析的性状是170日龄屠宰时的屠宰率、胸腰椎背膘厚和三点平均背膘厚。基因型间性状的简单均数和标准差分析结果总结于表3。关联分析结果表明,AC与CC基因型猪的背膘厚呈显著差异。
表3:不同CMYA1基因RsaI-RFLP基因型与部分生产性状的关联分析
基因型 | 个体数目 | 三点平均背膘厚(cm) |
ACCC | 9279 | 3.4625±0.099a3.1565±0.107b |
AC-CC | P-value0.036 |
附图说明
序列表SEQ ID NO:1是本发明克隆的猪背膘厚CMYA1基因的cDNA和DNA序列;
图1:是本发明CMYA1基因制备的流程图;
图2:是本发明中猪CMYA1基因用于PCR-RFLP检测的部分DNA片段。所用的引物序列用下划线标注;
图3:是本发明中猪CMYA1基因第2外显子的HaeIII-RFLPs的三种基因型(AA AG GG)电泳结果。M:DNA分子量标准(100bp ladder);
图4:是本发明中猪CMYA1基因第2外显子的NcoI-RFLPs的三种基因型(AA AG GG)电泳结果。M:DNA分子量标准(100bp ladder);
图5:是本发明中猪CMYA1基因第2外显子的RsaI-RFLPs的三种基因型(AA AG GG)电泳结果。M:DNA分子量标准(100bp ladder)。
具体实施方式
实施例1:不同CMYA1基因第2外显子HaeIII-RFLP基因型与部分生产性状的关联分析
在一个通城猪群中对猪CMYA1基因第2外显子HaeIII-RFLP多态性位点与部分生产性状进行关联分析,在与部分生产性状进行关联分析中,所分析的性状是170日龄屠宰时的屠宰率、胸腰椎背膘厚和三点平均背膘厚。基因型间性状的简单均数和标准差分析结果总结于表4。关联分析结果表明,AA与GG基因型猪,以及AG型与GG型猪的背膘厚呈显著差异。
表4不同CMYA1基因HaeIII-RFLP基因型与部分生产性状的关联分析
基因型 | 个体数目 | 三点平均背膘厚(cm) |
AAAGGG | 6610632 | 3.4155±0.117a3.4145±0.093a2.9645±0.168b |
AA-AGAA-GGAG-GG | P-value0.9960.0290.020 |
实施例2:PCR-RFLP-HaeIII多态性在各猪品种中的分布情况
在9个猪品种中检测猪CMYA1基因PCR-RFLP-HaeIII多态性,检测结果如表5所述。表5的数据分析显示,在所检测的这几个猪品种中,杜洛克、通城和大花白猪中占优势的等位基因A的频率分别为0.8077、0.9286和0.93640,而大白、小梅山和二花脸中优势等位基因G的频率分别为0.7000、0.8750和0.7353,在长白猪中等位基因A和等位基因G的频率接近,分别为0.5714和0.4286。
表5几个猪品种中CMYA1基因HaeIII多态性的基因型和基因频率
品种 | 个体数 | 基因型 | 等位基因频率 | |||
大白长白杜洛克通城猪玉山黑猪清平猪 | 5726425732 | AA0116361810 | AG361063521 | GG200041 | A0.30000.57140.80770.92860.62280.6406 | G0.70000.42860.19230.07140.37720.3594 |
大花白猪二花脸 | 5533 | 480 | 713 | 020 | 0.93640.20 | 0.06360.80 |
对猪CMYA1基因HaeIII-RFLP多态性位点基因频率在不同品种中的分布差异进行检验,差异显著性结果见表6。根据表6的分析结果表明该位点基因频率在所检测的这八个猪品种中存在较大程度的差异。
表6猪CMYA1基因HaeIII-RFLP多态性位点在不同品种中分布的差异性检验结果
长白 | 杜洛克 | 通城猪 | 玉山黑猪 | 清平猪 | 大花白猪 | 二花脸 | |
大白长白杜洛克通城猪玉山黑猪清平猪大花自猪 | 3.77 | 13.944.93 | 25.96*16.555.21 | 6.741.697.4728.90* | 8.831.135.7223.100.61 | 32.50**19.967.050.0536.28**28.83* | 0.7511.5636.06**58.34**34.83**29.06*68.59** |
注:肩注*表述P<0.05;肩注**表述P<0.01。
实施例3:PCR-RFLP-NcoI多态性在各猪品种中的分布情况
在9个猪品种中检测猪CMYA1基因PCR-RFLP-NcoI多态性,检测结果如表7所述。表7的数据分析显述,在所检测的这几个猪品种中,杜洛克猪中占优势的等位基因A的频率为0.8846,而长白、通城、玉西黑、清平、大花白、小梅山和二花脸中优势等位基因G的频率分别为0.7143、0.9643、0.7700、0.7222、0.8415、1.0000和1.0000,在大白猪中等位基因A和等位基因G的频率接近,分别为0.5833和0.4167,
表7几个猪品种中CMYA1基因NcoI多态性的基因型和基因频率
品种 | 个体数 | 基因型 | 等位基因频率 | |||
大白长白杜洛克通城猪玉山黑猪清平猪大花白猪小梅山二花脸 | 6726425027411722 | GG131393114281722 | AG344315111300 | AA2021042000 | G0.41670.71430.11540.96430.77000.72220.841511 | A0.58330.28570.88460.03570.23000.27780.158500 |
表8猪CMYA1基因NcoI-RFLP多态性位点在不同品种中分布的差异性检验结果
长白 | 杜洛克 | 通城猪 | 玉山黑猪 | 清平猪 | 大花白猪 | 小梅山 | 二花脸 | |
大白长白杜洛克通城猪玉山黑猪清平猪大花白猪小梅山 | 3.08 | 5.4816.55 | 25.3712.2556.61** | 5.802.29542.74**12.31 | 4.160.9530.22*15.850.92 | 16.441.69550.05**8.053.444.13 | 18.1011.6639.05**1.289.0211.626.95 | 22.3214.5844.15**1.6511.3614.428.790 |
注:肩注*表述P<0.05;肩注**表述P<0.01。
实施例4:不同CMYA1基因第2外显子RsaI-RFLP基因型与部分生产性状的关联分析
对猪CMYA1基因第2外显子RsaI-RFLP多态性位点与部分生产性状进行关联分析,所分析的性状是170日龄屠宰时的背膘厚。
基因型检测结果表明在199个个体中AA基因型,有28个,AC基因型有92个个体,CC基因型有79个个体。在与部分生产性状进行关联分析中,所分析的性状是170日龄屠宰时的屠宰率、胸腰椎背膘厚和三点平均背膘厚。基因型间性状的简单均数和标准差分析结果总结于表9。关联分析结果表明,AC与CC基因型猪的背膘厚呈显著差异。
表9:不同CMYA1基因RsaI-RFLP基因型与部分生产性状的关联分析
基因型 | 个体数目 | 三点平均背膘厚(cm) |
AC | 92 | 3.4625±0.099a |
CC | 79 | 3.1565±0.107b |
AC-CC | P-value0.036 |
实施例5:PCR-RFLP-RsaI多态性在各猪品种中的分布情况
在6个猪品种中检测猪CMYA1基因PCR-RFLP-RsaI多态性,检测结果如表10所述。表10的数据分析显示,在所检测的这6个猪品种中,杜洛克猪中占优势的等位基因C的频率为0.7703,大花白猪中占优势的等位基因A的频率为0.6250,而大白、通城、清平和二花脸中等位基因A和等位基因C的频率接近。
表10几个猪品种中CMYA1基因RsaI多态性的基因型和基因频率
品种 | 个体数 | 基因型 | 等位基因频率 | |||
AA | AC | CC | A | C |
大白杜洛克通城猪清平猪大花白猪二花脸 | 203735394035 | 5117162 | 121532311832 | 3212161 | 0.55000.22970.48570.57690.62500.5143 | 0.45000.77030.51430.42310.37500.4857 |
对猪CMYA1基因RsaI-RFLP多态性位点基因频率在不同品种中的分布差异进行检验,差异显著性结果见表11。根据表11的分析结果表明该位点基因频率在所检测的这6个猪品种中,杜洛克猪和其它猪之间存在较大程度的差异。
表11猪CMYA1基因RsaI-RFLP多态性位点在不同品种中分布的差异性检验结果
杜洛克 | 通城猪 | 清平猪 | 大花白猪 | 二花脸 | |
大白杜洛克通城猪清平猪大花白猪 | 12.55 | 8.5021.81* | 4.0328.21**4.65 | 1.46421.76*18.91*10.53 | 7.87624.63**0.672.5818.13 |
注:肩注*表述P<0.05;肩注**表述P<0.01。
序列表
<110>华中农业大学
<120>一种猪背膘厚基因CMYA1的克隆及其应用
<130>
<141>2005-11-28
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>6310
<212>DNA
<213>猪(sus scrofa)
<220>
<221>gene
<222>(1)..(6310)
<223>
<220>
<221>polyA_signal
<222>(6280)..(6310)
<223>
<220>
<221>mutation
<222>(3448)..(3448)
<223>
<220>
<221>mutation
<222>(1552)..(1552)
<223>
<220>
<221>mutation
<222>(1909)..(1909)
<223>
<220>
<221>3’UTR
<222>(5580)..(6310)
<223>
<220>
<221>5’UTR
<222>(1)..(158)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(159)..(5579)
<223>
<400>1
gcggggacag agacccagag cctgggcagc gagaaggcac ctggccgagc cagcagagca 60
caaccagccc caaacaacaa caagaggaac cacagaccct taggccacac ctgccgcaga 120
ccccacgccc ccatcagcca aacaggaccc tcagaagg atg gct gac acc cag acg 176
Met Ala Asp Thr Gln Thr
1 5
cag gtg gcc cca aaa cca acc atc cca gtg gca act gca gag gac ctg 224
Gln Val Ala Pro Lys Pro Thr Ile Pro Val Ala Thr Ala Glu Asp Leu
10 15 20
ccc ttc cct ccc cca cct gcc cct gag gat ctg ccg ctg cca cca ccc 272
Pro Phe Pro Pro Pro Pro Ala Pro Glu Asp Leu Pro Leu Pro Pro Pro
25 30 35
aag gag tcc ttc tcc aag ttc cac cag cag cga caa gcc agt gag ctc 320
Lys Glu Ser Phe Ser Lys Phe His Gln Gln Arg Gln Ala Ser Glu Leu
40 45 50
cgc cgc ctc tac aag cac att cac ccc gag ctc cgc aag aat ctg gct 368
Arg Arg Leu Tyr Lys His Ile His Pro Glu Leu Arg Lys Asn Leu Ala
55 60 65 70
gag gcc gtg gct gaa gac ctg gct gag gtc ctg ggt tcc gag gag ccc 416
Glu Ala Val Ala Glu Asp Leu Ala Glu Val Leu Gly Ser Glu Glu Pro
75 80 85
acc gaa ggt gat gtc cag tgc atg cgc tgg atc ttt gag aac tgg cgg 464
Thr Glu Gly Asp Val Gln Cys Met Arg Trp Ile Phe Glu Asn Trp Arg
90 95 100
ctg gat gcc att ggg gac cat gac agg cca cct gcc aag gag ccg gtg 512
Leu Asp Ala Ile Gly Asp His Asp Arg Pro Pro Ala Lys Glu Pro Val
105 110 115
cct ggt ggc aac gtt cag gcc acc tcc cga aaa ttt gaa gaa gga tcc 560
Pro Gly Gly Asn Val Gln Ala Thr Ser Arg Lys Phe Glu Glu Gly Ser
120 125 130
ttt gcc aac agc ata gac cag gag cca gct aga cct cag cca tcc cga 608
Phe Ala Asn Ser Ile Asp Gln Glu Pro Ala Arg Pro Gln Pro Ser Arg
135 140 145 150
ggg gat gtc cgt gca gcc cgc tgg ctg ttt gag aca aag ccg ctg gat 656
Gly Asp Val Arg Ala Ala Arg Trp Leu Phe Glu Thr Lys Pro Leu Asp
155 160 165
gag ctg aca ggc cag acg gag gca ccg gag gct cca gtg aag gag cct 704
Glu Leu Thr Gly Gln Thr Glu Ala Pro Glu Ala Pro Val Lys Glu Pro
170 175 180
gaa gcc agt ggc gat gtc cag ggt act agg atg ctc ttt gag aca cgg 752
Glu Ala Ser Gly Asp Val Gln Gly Thr Arg Met Leu Phe Glu Thr Arg
185 190 195
cca ctg gac cgc cta ggc tct cgt ccc tcc atc cag gaa cag agc ccc 800
Pro Leu Asp Arg Leu Gly Ser Arg Pro Ser Ile Gln Glu Gln Ser Pro
200 205 210
ttg gag cta cgc tca gag atc cag gag ctg aag ggt gat gtg aag aag 848
Leu Glu Leu Arg Ser Glu Ile Gln Glu Leu Lys Gly Asp Val Lys Lys
215 220 225 230
acg gtg aag ctg ttc caa aca gag cca ctg tgt gcc atc cag gac gca 896
Thr Val Lys Leu Phe Gln Thr Glu Pro Leu Cys Ala Ile Gln Asp Ala
235 240 245
gag ggc gcc atc cat gag gtc aag gcc gcc tgc cgg gag gag atc cag 944
Glu Gly Ala Ile His Glu Val Lys Ala Ala Cys Arg Glu Glu Ile Gln
250 255 260
agc aat gca gtg agg act gcc cgt tgg ctc ttc gag acc caa cct ctg 992
Ser Asn Ala Val Arg Thr Ala Arg Trp Leu Phe Glu Thr Gln Pro Leu
265 270 275
gac gcc atc aac cgg gac ccc agc cag gtg cgg gtg att cgg ggg atc 1040
Asp Ala Ile Asn Arg Asp Pro Ser Gln Val Arg Val Ile Arg Gly Ile
280 285 290
tcc ctg gag gag gca gcc cgg cct gat gtt agc gca act cgc tgg atc 1088
Ser Leu Glu Glu Ala Ala Arg Pro Asp Val Ser Ala Thr Arg Trp Ile
295 300 305 310
ttt gag aca cag ccc ctg gat gcc atc cgg gag atc ttg gtg gac gag 1136
Phe Glu Thr Gln Pro Leu Asp Ala Ile Arg Glu Ile Leu Val Asp Glu
315 320 325
aag gac ttc cag cca tcc cca gat ctt atc cct cct ggc cca gat gtt 1184
Lys Asp Phe Gln Pro Ser Pro Asp Leu Ile Pro Pro Gly Pro Asp Val
330 335 340
cag cag cag cgg cac ctg ttt gag acc cga cca cta gac act ctc aag 1232
Gln Gln Gln Arg His Leu Phe Glu Thr Arg Pro Leu Asp Thr Leu Lys
345 350 355
ggg gaa gag gag gct gaa gca gag gtc cca ccc aaa gag gaa gtg gtc 1280
Gly Glu Glu Glu Ala Glu Ala Glu Val Pro Pro Lys Glu Glu Val Val
360 365 370
cct ggt gat gtc cgc tcc acc ctg tgg cta ttt gag aca aag ccc ctg 1328
Pro Gly Asp Val Arg Ser Thr Leu Trp Leu Phe Glu Thr Lys Pro Leu
375 380 385 390
gac aca cct aga gac aag gtc caa gtg ggc cac ctg cag cga gtg ggt 1376
Asp Thr Pro Arg Asp Lys Val Gln Val Gly His Leu Gln Arg Val Gly
395 400 405
ccc cag gag agt aag ggg ttc aca cgt gag cat cta tcc agc gat ggc 1424
Pro Gln Glu Ser Lys Gly Phe Thr Arg Glu His Leu Ser Ser Asp Gly
410 415 420
tcc tca gcg ctg tcc ctc tct cag tgt gcg ccc cag ggg gat gtg gtg 1472
Ser Ser Ala Leu Ser Leu Ser Gln Cys Ala Pro Gln Gly Asp Val Val
425 430 435
aag ggg gat gta aag acc ttc aag aat ctt ttc gag acc ctt ccc ctg 1520
Lys Gly Asp Val Lys Thr Phe Lys Asn Leu Phe Glu Thr Leu Pro Leu
440 445 450
gat agc atc ggg cag ggt gaa gct ttg gcc cgt ggg aat gta agc aga 1568
Asp Ser Ile Gly Gln Gly Glu Ala Leu Ala Arg Gly Asn Val Ser Arg
455 460 465 470
gca gaa gga act gat tct gct gag cag tcc caa gac ata ggg tcc cca 1616
Ala Glu Gly Thr Asp Ser Ala Glu Gln Ser Gln Asp Ile Gly Ser Pro
475 480 485
gtg tac gcc ctg cag gat ggc aaa ggc cac ctt cat gcc ctg aca tcc 1664
Val Tyr Ala Leu Gln Asp Gly Lys Gly His Leu His Ala Leu Thr Ser
490 495 500
gtc agc aga gag cag gtc gtg gga ggt gat gtg cag ggc tac agg tgg 1712
Val Ser Arg Glu Gln Val Val Gly Gly Asp Val Gln Gly Tyr Arg Trp
505 510 515
atg ttt gag aca cag ccc cta gac caa cta ggt cga aac ccc agt acc 1760
Met Phe Glu Thr Gln Pro Leu Asp Gln Leu Gly Arg Asn Pro Ser Thr
520 525 530
gtc gac gtg gtg cgg ggc atc acc cgg gag gaa gtg gtg gct gga gat 1808
Val Asp Val Val Arg Gly Ile Thr Arg Glu Glu Val Val Ala Gly Asp
535 540 545 550
gtg ggc act gcc cgg tgg ctc ttt gag act cag ccc ctg gag gta atc 1856
Val Gly Thr Ala Arg Trp Leu Phe Glu Thr Gln Pro Leu Glu Val Ile
555 560 565
cac caa cgg gag cag cag gaa cga cag gaa gag gaa gga atg cct ccg 1904
His Gln Arg Glu Gln Gln Glu Arg Gln Glu Glu Glu Gly Met Pro Pro
570 575 580
gga gac cct cag cct gag gca ccc ctc aag ggt gat gtg cag acc atc 1952
Gly Asp Pro Gln Pro Glu Ala Pro Leu Lys Gly Asp Val Gln Thr Ile
585 590 595
cgc tgg ttg ttc gag acg tgc cca atg agt gag ttg gcc gag aag cag 2000
Arg Trp Leu Phe Glu Thr Cys Pro Met Ser Glu Leu Ala Glu Lys Gln
600 605 610
ggg tca gag gtc aca gat ccc aca act aag gac aag gca cgg tcc tgc 2048
Gly Ser Glu Val Thr Asp Pro Thr Thr Lys Asp Lys Ala Arg Ser Cys
615 620 625 630
acc tgg atg ttc atg tcc caa ccc cca gcc agg cca gaa gtt tcc cag 2096
Thr Trp Met Phe Met Ser Gln Pro Pro Ala Arg Pro Glu Val Ser Gln
635 640 645
gag cag cac ctt cag gtt agc cag gtc cag gct ggg gaa aga cag aca 2144
Glu Gln His Leu Gln Val Ser Gln Val Gln Ala Gly Glu Arg Gln Thr
650 655 660
gac aga cac gtc ttc gag acc gag cct ctg cag ggc tca ggc cgt ccc 2192
Asp Arg His Val Phe Glu Thr Glu Pro Leu Gln Gly Ser Gly Arg Pro
665 670 675
agt gga aga ggg ctg ata cga tac tgc agc aga gtg gac atc cct tca 2240
Ser Gly Arg Gly Leu Ile Arg Tyr Cys Ser Arg Val Asp Ile Pro Ser
680 685 690
ggg cag gtg tct cgc cag aag gag gtt ttc cag gcc ctg gag gca ggc 2288
Gly Gln Val Ser Arg Gln Lys Glu Val Phe Gln Ala Leu Glu Ala Gly
695 700 705 710
aag aag gaa gac cag gag tcc agg gtc atc cct gag ccc att cca gtg 2336
Lys Lys Glu Asp Gln Glu Ser Arg Val Ile Pro Glu Pro Ile Pro Val
715 720 725
ggc tct gtg cac aag ttc acc tgg ctc ttt gag aac tgc ccc atg ggc 2384
Gly Ser Val His Lys Phe Thr Trp Leu Phe Glu Asn Cys Pro Met Gly
730 735 740
tcc ctg gca gct gag agt atc caa ggg ggt aac ttc caa gag gag caa 2432
Ser Leu Ala Ala Glu Ser Ile Gln Gly Gly Asn Phe Gln Glu Glu Gln
745 750 755
cct gtg ggc tcc tcg gcc gac aga gtt cta gag aga cag gag act gca 2480
Pro Val Gly Ser Ser Ala Asp Arg Val Leu Glu Arg Gln Glu Thr Ala
760 765 770
gcc gag ggg acc ctg cgg act ctg cat gcc aca cct ggc atc ctg cac 2528
Ala Glu Gly Thr Leu Arg Thr Leu His Ala Thr Pro Gly Ile Leu His
775 780 785 790
cat gga ggc atc ctc atg gaa gcc cga ggg cca ggg gag ctc tgc ctg 2576
His Gly Gly Ile Leu Met Glu Ala Arg Gly Pro Gly Glu Leu Cys Leu
795 800 805
acc aag tac gtg ctc cca ggc ccg ggg cag ggc agt ccc cag gtt cgg 2624
Thr Lys Tyr Val Leu Pro Gly Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gln Val Arg
810 815 820
aag gag gag ctg gtg ttt ggc gag ctt ccc agg atc att cgc caa gtg 2672
Lys Glu Glu Leu Val Phe Gly Glu Leu Pro Arg Ile Ile Arg Gln Val
825 830 835
ctg cgc cgg cca gac ata gac cag cag ggg ctg ctg gtg cag gag gac 2720
Leu Arg Arg Pro Asp Ile Asp Gln Gln Gly Leu Leu Val Gln Glu Asp
840 845 850
cca atg ggc cag ctt caa ctc aag ccg ctg aaa ctg cca gca cca ggc 2768
Pro Met Gly Gln Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Leu Pro Ala Pro Gly
855 860 865 870
agc aat ggg aac ctt gaa gac atg gac cct gag ttc cag cag ttg ctg 2816
Ser Asn Gly Asn Leu Glu Asp Met Asp Pro Glu Phe Gln Gln Leu Leu
875 880 885
gct tgt ggc ctt ggg acc tcg gtg gcg agg act ggg cta gtg atg caa 2864
Ala Cys Gly Leu Gly Thr Ser Val Ala Arg Thr Gly Leu Val Met Gln
890 895 900
gag aca gag cag ggc ctg gtg gca ctg act gcc tac tct ctg cag ccc 2912
Glu Thr Glu Gln Gly Leu Val Ala Leu Thr Ala Tyr Ser Leu Gln Pro
905 910 915
cgg cta acc agc agg gcc ccg gag agg agc agt gtg cag ctg ctg gcc 2960
Arg Leu Thr Ser Arg Ala Pro Glu Arg Ser Ser Val Gln Leu Leu Ala
920 925 930
agc tgc ata gac aaa gga gac ctg agc agc ctg cat agc ctg cgg tgg 3008
Ser Cys Ile Asp Lys Gly Asp Leu Ser Ser Leu His Ser Leu Arg Trp
935 940 945 950
gag ccc cca gct gac tca agt cca gag cca gtc agt gaa ggg gcc cag 3056
Glu Pro Pro Ala Asp Ser Ser Pro Glu Pro Val Ser Glu Gly Ala Gln
955 960 965
agg ctg ccc ccg aca gag agc atc atc cat gtc ccc cca ctg gac ccc 3104
Arg Leu Pro Pro Thr Glu Ser Ile Ile His Val Pro Pro Leu Asp Pro
970 975 980
ggc atg agg atg gag aat ctg agg aga ccg gga gcc acc ccc tgc ccc 3152
Gly Met Arg Met Glu Asn Leu Arg Arg Pro Gly Ala Thr Pro Cys Pro
985 990 995
cca cag gcc acg gga aag gca gtc cct ctg gct ggg gca gaa aag 3197
Pro Gln Ala Thr Gly Lys Ala Val Pro Leu Ala Gly Ala Glu Lys
1000 1005 1010
cag gaa agc agg tac acg gga cag aaa ggg atg gca gct ttg gga 3242
Gln Glu Ser Arg Tyr Thr Gly Gln Lys Gly Met Ala Ala Leu Gly
1015 1020 1025
aag tca gaa gga gcc acc act gtg ccc cca ggg gct ggg gcc tca 3287
Lys Ser Glu Gly Ala Thr Thr Val Pro Pro Gly Ala Gly Ala Ser
1030 1035 1040
gac ctc cag gct gct atg cag agt ctg cgg aca gca aca gcc gaa 3332
Asp Leu Gln Ala Ala Met Gln Ser Leu Arg Thr Ala Thr Ala Glu
1045 1050 1055
gcc cag agc ctg cac cag caa gtt ctg agc aag cac aag cag ggc 3377
Ala Gln Ser Leu His Gln Gln Val Leu Ser Lys His Lys Gln Gly
1060 1065 1070
cct gcc cct gga gtt gcc tct aca ccc act cag aat ggt ctt cag 3422
Pro Ala Pro Gly Val Ala Ser Thr Pro Thr Gln Asn Gly Leu Gln
1075 1080 1085
caa gcc act ggg act gcc cag agt aac acc aag ctt atg gcg gga 3467
Gln Ala Thr Gly Thr Ala Gln Ser Asn Thr Lys Leu Met Ala Gly
1090 1095 1100
ggt gac ccc agg atc cca gca gcc cct gga aag gtc agt ggg gaa 3512
Gly Asp Pro Arg Ile Pro Ala Ala Pro Gly Lys Val Ser Gly Glu
1105 1110 1115
cag aaa gca cta cct gga gag ctg cct ggg ggg tgg gtg act att 3557
Gln Lys Ala Leu Pro Gly Glu Leu Pro Gly Gly Trp Val Thr Ile
1120 1125 1130
cag gat ggc atc tac act gct cac cct gtg agg acc ttt gac cca 3602
Gln Asp Gly Ile Tyr Thr Ala His Pro Val Arg Thr Phe Asp Pro
1135 1140 1145
cct ggg ggt gtc cgg cct tct gag aga gga ccc ctg cca agg ggc 3647
Pro Gly Gly Val Arg Pro Ser Glu Arg Gly Pro Leu Pro Arg Gly
1150 1155 1160
agg gag act gcc ccc aca tcc cag cct ccc agc cca ttc ttg gaa 3692
Arg Glu Thr Ala Pro Thr Ser Gln Pro Pro Ser Pro Phe Leu Glu
1165 1170 1175
ggc cca gtt cag agt ctc agg cct gag caa gag gag cct ggg ggc 3737
Gly Pro Val Gln Ser Leu Arg Pro Glu Gln Glu Glu Pro Gly Gly
1180 1185 1190
tac aca cag aag gcc tgg gag cct cca gag aag gtg atg gca gaa 3782
Tyr Thr Gln Lys Ala Trp Glu Pro Pro Glu Lys Val Met Ala Glu
1195 1200 1205
cat ggc cca ggg ggc ctc cga gct cca gag acc acc ctg aag gct 3827
His Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ala Pro Glu Thr Thr Leu Lys Ala
1210 1215 1220
gcc cct tta gcc cac cac aca ctg gcc tct ggg cct ggg gct gca 3872
Ala Pro Leu Ala His His Thr Leu Ala Ser Gly Pro Gly Ala Ala
1225 1230 1235
gat gcc agc ctg cac tcc cat aat gcc tct gtt cct cct cct cct 3917
Asp Ala Ser Leu His Ser His Asn Ala Ser Val Pro Pro Pro Pro
1240 1245 1250
ctt ctc cca gct gct gtg acg aga cct gac ttt cca gcc cga gct 3962
Leu Leu Pro Ala Ala Val Thr Arg Pro Asp Phe Pro Ala Arg Ala
1255 1260 1265
ggc cat gat gag gac tcc agc cag cag gcc tcc aag ccc cca cag 4007
Gly His Asp Glu Asp Ser Ser Gln Gln Ala Ser Lys Pro Pro Gln
1270 1275 1280
gac ccc ctt ctc tac tcc cac agc agc cct gct ggc cag aga agc 4052
Asp Pro Leu Leu Tyr Ser His Ser Ser Pro Ala Gly Gln Arg Ser
1285 1290 1295
cct ggg gag tca cag gca aag acc ctg aaa ctg gag ccc act aca 4097
Pro Gly Glu Ser Gln Ala Lys Thr Leu Lys Leu Glu Pro Thr Thr
1300 1305 1310
tgc cca agg aag aag ccc cag ctg ccc ccc aaa cct gca cac cta 4142
Cys Pro Arg Lys Lys Pro Gln Leu Pro Pro Lys Pro Ala His Leu
1315 1320 1325
agc cag atc cct ctt cct cac tgg ctg ccc aag ccc tta gcc ccg 4187
Ser Gln Ile Pro Leu Pro His Trp Leu Pro Lys Pro Leu Ala Pro
1330 1335 1340
tct ccc agc acc tct aag gag gag ggg caa gga aaa tgc aaa caa 4232
Ser Pro Ser Thr Ser Lys Glu Glu Gly Gln Gly Lys Cys Lys Gln
1345 1350 1355
ggt gag act ggt aca gct gac cat gat acc cag cca gcc aag gcc 4277
Gly Glu Thr Gly Thr Ala Asp His Asp Thr Gln Pro Ala Lys Ala
1360 1365 1370
ccc acc act gca ggc cag ggc tgc ata cct ctg gct aga tgc ccc 4322
Pro Thr Thr Ala Gly Gln Gly Cys Ile Pro Leu Ala Arg Cys Pro
1375 1380 1385
act gga cag agc cca ccc agc ccc cca tat ggc ccc agc acc aca 4367
Thr Gly Gln Ser Pro Pro Ser Pro Pro Tyr Gly Pro Ser Thr Thr
1390 1395 1400
gcc ttc aag ccc acc aag agc caa gct atg agc agc aac aac cag 4412
Ala Phe Lys Pro Thr Lys Ser Gln Ala Met Ser Ser Asn Asn Gln
1405 1410 1415
agc cct gag tcc ccc aag ctt tca gct ccc gga agt gac ccc acc 4457
Ser Pro Glu Ser Pro Lys Leu Ser Ala Pro Gly Ser Asp Pro Thr
1420 1425 1430
tca ctg cag caa ggc ctc agc tcc cca gga gag aag tac atg gat 4502
Ser Leu Gln Gln Gly Leu Ser Ser Pro Gly Glu Lys Tyr Met Asp
1435 1440 1445
ggc tcc cag caa gca gcc cct aga agt cct gag atc ctg cag gaa 4547
Gly Ser Gln Gln Ala Ala Pro Arg Ser Pro Glu Ile Leu Gln Glu
1450 1455 1460
agc cag caa gag ctc cag ggc ctc ctg agt caa gtg caa gcc ctg 4592
Ser Gln Gln Glu Leu Gln Gly Leu Leu Ser Gln Val Gln Ala Leu
1465 1470 1475
gag aag gag gcc aaa agc act gtg gat gtg cgg gcg ctt cgg aga 4637
Glu Lys Glu Ala Lys Ser Thr Val Asp Val Arg Ala Leu Arg Arg
1480 1485 1490
ctc ttt gag gct gtg ccc cag ctg aga ggg gcc cct cca gct ccc 4682
Leu Phe Glu Ala Val Pro Gln Leu Arg Gly Ala Pro Pro Ala Pro
1495 1500 1505
gct gcc ctc cac aag ccc gag gcc tct gtg gag cag gcc ttt ggg 4727
Ala Ala Leu His Lys Pro Glu Ala Ser Val Glu Gln Ala Phe Gly
1510 1515 1520
gaa ttg acg agg gtc agc acg gag gtg gcc ctg ctg aag gaa cag 4772
Glu Leu Thr Arg Val Ser Thr Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln
1525 1530 1535
acc ctg gcc agg ttg ctg gac att gag aag gcc gtg cac aag gcc 4817
Thr Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Glu Lys Ala Val His Lys Ala
1540 1545 1550
ctc agc tcc atg tct agc ctc cag cct ggg act aac acc agg ggc 4862
Leu Ser Ser Met Ser Ser Leu Gln Pro Gly Thr Asn Thr Arg Gly
1555 1560 1565
cat ccc cag gga ccc cca aag gac cat agt acc cac aag gtc aat 4907
His Pro Gln Gly Pro Pro Lys Asp His Ser Thr His Lys Val Asn
1570 1575 1580
gtc tca gac agc agt aga gct agg ccc aac tgc cca agc cag gag 4952
Val Ser Asp Ser Ser Arg Ala Arg Pro Asn Cys Pro Ser Gln Glu
1585 1590 1595
gtc ggg ggt cca act gaa gtt cgg agc caa acc gat ggt aca tgc 4997
Val Gly Gly Pro Thr Glu Val Arg Ser Gln Thr Asp Gly Thr Cys
1600 1605 1610
cct act gag atc tgg agt caa gcc aag gtc aga agt ccc act gag 5042
Pro Thr Glu Ile Trp Ser Gln Ala Lys Val Arg Ser Pro Thr Glu
1615 1620 1625
gca aga agt caa gca tcc ctg ccc acc tct acc acc agg agg ctg 5087
Ala Arg Ser Gln Ala Ser Leu Pro Thr Ser Thr Thr Arg Arg Leu
1630 1635 1640
gac aca ttg aga gaa gat tgg ggc ctc cct cga gta tta cct ccc 5132
Asp Thr Leu Arg Glu Asp Trp Gly Leu Pro Arg Val Leu Pro Pro
1645 1650 1655
agc aga cat tca ccc tcc tcc cca acc ttc atc tct atc gag tca 5177
Ser Arg His Ser Pro Ser Ser Pro Thr Phe Ile Ser Ile Glu Ser
1660 1665 1670
gcc aca agg aaa ctt cca gag gct ccc aga cct cag ggc agc cct 5222
Ala Thr Arg Lys Leu Pro Glu Ala Pro Arg Pro Gln Gly Ser Pro
1675 1680 1685
gat gtc tca gtg aaa agc aca cac ctc agc cag gat gtg ggc caa 5267
Asp Val Ser Val Lys Ser Thr His Leu Ser Gln Asp Val Gly Gln
1690 1695 1700
gct cag ctc cac cag aaa gat gtc cag gac aag gcc agg aag agg 5312
Ala Gln Leu His Gln Lys Asp Val Gln Asp Lys Ala Arg Lys Arg
1705 1710 1715
gag gcc acc gag tgc tct gga cag ccc cag cct gct cct gcc tca 5357
Glu Ala Thr Glu Cys Ser Gly Gln Pro Gln Pro Ala Pro Ala Ser
1720 1725 1730
gcc agc ccc ctg ccc act ggg cgg cag aag agc att ctg gag ctg 5402
Ala Ser Pro Leu Pro Thr Gly Arg Gln Lys Ser Ile Leu Glu Leu
1735 1740 1745
cag act ggc cca ggt ggc tcc cag tgc tac aga gcc aca aga act 5447
Gln Thr Gly Pro Gly Gly Ser Gln Cys Tyr Arg Ala Thr Arg Thr
1750 1755 1760
gtg aat gag cag cat gag agg gtg aac cag tgt ggg aac aca gca 5492
Val Asn Glu Gln His Glu Arg Val Asn Gln Cys Gly Asn Thr Ala
1765 1770 1775
ctc aca ttc ccc acc atg gtc acg gag ccc aca gag cta acc aag 5537
Leu Thr Phe Pro Thr Met Val Thr Glu Pro Thr Glu Leu Thr Lys
1780 1785 1790
gtg ccc aga ccc cca cct cgg tgc tcc aca cct ccc cct tga 5579
Val Pro Arg Pro Pro Pro Arg Cys Ser Thr Pro Pro Pro
1795 1800 1805
tgaggcagtt cctgcgcagc ccagccgagc tcagcggggg cctggcagaa gcagggatgg 5639
cgcctatgcc cttcagccac ttecagccag cagctcagtg agcccctaaa cctcccacca 5699
ccacctccca cccatcccct gggctccgga cagaggtggg tgcctacctt ttgcacacgt 5759
gaggaaagga ccaagaagaa aaggcatctg ctgagattgt gggcagtttc tttttcatcg 5819
gttccgtcca tcatctgcat tcttgcaaaa gagggaaaag aaaactgcaa agatgctccc 5879
tgagttgccc aagcacagga acaggacggg ggcttatggc taccagtgga ggctatgata 5939
tgtacagaca ggcgtgccaa caccagtgag tctgcaagcc actacgggag acagtccttg 5999
agtcaccctc cactttcagc ctttttttct tttactatga gtcttctcct ccttaattcc 6059
tggagagaag aaggacagct ggacaaggga ttggtctctg tttcacattg atcctagggc 6119
cccttcatca ccatcttcac tgctccaaag ctcacacaga aaaggctggc aatcagcaat 6179
gtccctagaa cccaaagctt ccctccaccc ccactacccc tcactctgcc cctcaaaagg 6239
gaaggacacg gtctgaataa acccaagttt tattccctca taaaaaaaaa aaaaaaaaaa 6299
aaaaaaaaaaa 6310
<210>2
<211>1806
<212>PRT
<213>猪(sus scrofa)
<400>2
Met Ala Asp Thr Gln Thr Gln Val Ala Pro Lys Pro Thr Ile Pro Val
1 5 10 15
Ala Thr Ala Glu Asp Leu Pro Phe Pro Pro Pro Pro Ala Pro Glu Asp
20 25 30
Leu Pro Leu Pro Pro Pro Lys Glu Ser Phe Ser Lys Phe His Gln Gln
35 40 45
Arg Gln Ala Ser Glu Leu Arg Arg Leu Tyr Lys His Ile His Pro Glu
50 55 60
Leu Arg Lys Asn Leu Ala Glu Ala Val Ala Glu Asp Leu Ala Glu Val
65 70 75 80
Leu Gly Ser Glu Glu Pro Thr Glu Gly Asp Val Gln Cys Met Arg Trp
85 90 95
Ile Phe Glu Asn Trp Arg Leu Asp Ala Ile Gly Asp His Asp Arg Pro
100 105 110
Pro Ala Lys Glu Pro Val Pro Gly Gly Asn Val Gln Ala Thr Ser Arg
115 120 125
Lys Phe Glu Glu Gly Ser Phe Ala Asn Ser Ile Asp Gln Glu Pro Ala
130 135 140
Arg Pro Gln Pro Ser Arg Gly Asp Val Arg Ala Ala Arg Trp Leu Phe
145 150 155 160
Glu Thr Lys Pro Leu Asp Glu Leu Thr Gly Gln Thr Glu Ala Pro Glu
165 170 175
Ala Pro Val Lys Glu Pro Glu Ala Ser Gly Asp Val Gln Gly Thr Arg
180 185 190
Met Leu Phe Glu Thr Arg Pro Leu Asp Arg Leu Gly Ser Arg Pro Ser
195 200 205
Ile Gln Glu Gln Ser Pro Leu Glu Leu Arg Ser Glu Ile Gln Glu Leu
210 215 220
Lys Gly Asp Val Lys Lys Thr Val Lys Leu Phe Gln Thr Glu Pro Leu
225 230 235 240
Cys Ala Ile Gln Asp Ala Glu Gly Ala Ile His Glu Val Lys Ala Ala
245 250 255
Cys Arg Glu Glu Ile Gln Ser Asn Ala Val Arg Thr Ala Arg Trp Leu
260 265 270
Phe Glu Thr Gln Pro Leu Asp Ala Ile Asn Arg Asp Pro Ser Gln Val
275 280 285
Arg Val Ile Arg Gly Ile Ser Leu Glu Glu Ala Ala Arg Pro Asp Val
290 295 300
Ser Ala Thr Arg Trp Ile Phe Glu Thr Gln Pro Leu Asp Ala Ile Arg
305 310 315 320
Glu Ile Leu Val Asp Glu Lys Asp Phe Gln Pro Ser Pro Asp Leu Ile
325 330 335
Pro Pro Gly Pro Asp Val Gln Gln Gln Arg His Leu Phe Glu Thr Arg
340 345 350
Pro Leu Asp Thr Leu Lys Gly Glu Glu Glu Ala Glu Ala Glu Val Pro
355 360 365
Pro Lys Glu Glu Val Val Pro Gly Asp Val Arg Ser Thr Leu Trp Leu
370 375 380
Phe Glu Thr Lys Pro Leu Asp Thr Pro Arg Asp Lys Val Gln Val Gly
385 390 395 400
His Leu Gln Arg Val Gly Pro Gln Glu Ser Lys Gly Phe Thr Arg Glu
405 410 415
His Leu Ser Ser Asp Gly Ser Ser Ala Leu Ser Leu Ser Gln Cys Ala
420 425 430
Pro Gln Gly Asp Val Val Lys Gly Asp Val Lys Thr Phe Lys Asn Leu
435 440 445
Phe Glu Thr Leu Pro Leu Asp Ser Ile Gly Gln Gly Glu Ala Leu Ala
450 455 460
Arg Gly Asn Val Ser Arg Ala Glu Gly Thr Asp Ser Ala Glu Gln Ser
465 470 475 480
Gln Asp Ile Gly Ser Pro Val Tyr Ala Leu Gln Asp Gly Lys Gly His
485 490 495
Leu His Ala Leu Thr Ser Val Ser Arg Glu Gln Val Val Gly Gly Asp
500 505 510
Val Gln Gly Tyr Arg Trp Met Phe Glu Thr Gln Pro Leu Asp Gln Leu
515 520 525
Gly Arg Asn Pro Ser Thr Val Asp Val Val Arg Gly Ile Thr Arg Glu
530 535 540
Glu Val Val Ala Gly Asp Val Gly Thr Ala Arg Trp Leu Phe Glu Thr
545 550 555 560
Gln Pro Leu Glu Val Ile His Gln Arg Glu Gln Gln Glu Arg Gln Glu
565 570 575
Glu Glu Gly Met Pro Pro Gly Asp Pro Gln Pro Glu Ala Pro Leu Lys
580 585 590
Gly Asp Val Gln Thr Ile Arg Trp Leu Phe Glu Thr Cys Pro Met Ser
595 600 605
Glu Leu Ala Glu Lys Gln Gly Ser Glu Val Thr Asp Pro Thr Thr Lys
610 615 620
Asp Lys Ala Arg Ser Cys Thr Trp Met Phe Met Ser Gln Pro Pro Ala
625 630 635 640
Arg Pro Glu Val Ser Gln Glu Gln His Leu Gln Val Ser Gln Val Gln
645 650 655
Ala Gly Glu Arg Gln Thr Asp Arg His Val Phe Glu Thr Glu Pro Leu
660 665 670
Gln Gly Ser Gly Arg Pro Ser Gly Arg Gly Leu Ile Arg Tyr Cys Ser
675 680 685
Arg Val Asp Ile Pro Ser Gly Gln Val Ser Arg Gln Lys Glu Val Phe
690 695 700
Gln Ala Leu Glu Ala Gly Lys Lys Glu Asp Gln Glu Ser Arg Val Ile
705 710 715 720
Pro Glu Pro Ile Pro Val Gly Ser Val His Lys Phe Thr Trp Leu Phe
725 730 735
Glu Asn Cys Pro Met Gly Ser Leu Ala Ala Glu Ser Ile Gln Gly Gly
740 745 750
Asn Phe Gln Glu Glu Gln Pro Val Gly Ser Ser Ala Asp Arg Val Leu
755 760 765
Glu Arg Gln Glu Thr Ala Ala Glu Gly Thr Leu Arg Thr Leu His Ala
770 775 780
Thr Pro Gly Ile Leu His His Gly Gly Ile Leu Met Glu Ala Arg Gly
785 790 795 800
Pro Gly Glu Leu Cys Leu Thr Lys Tyr Val Leu Pro Gly Pro Gly Gln
805 810 815
Gly Ser Pro Gln Val Arg Lys Glu Glu Leu Val Phe Gly Glu Leu Pro
820 825 830
Arg Ile Ile Arg Gln Val Leu Arg Arg Pro Asp Ile Asp Gln Gln Gly
835 840 845
Leu Leu Val Gln Glu Asp Pro Met Gly Gln Leu Gln Leu Lys Pro Leu
850 855 860
Lys Leu Pro Ala Pro Gly Ser Asn Gly Asn Leu Glu Asp Met Asp Pro
865 870 875 880
Glu Phe Gln Gln Leu Leu Ala Cys Gly Leu Gly Thr Ser Val Ala Arg
885 890 895
Thr Gly Leu Val Met Gln Glu Thr Glu Gln Gly Leu Val Ala Leu Thr
900 905 910
Ala Tyr Ser Leu Gln Pro Arg Leu Thr Ser Arg Ala Pro Glu Arg Ser
915 920 925
Ser Val Gln Leu Leu Ala Ser Cys Ile Asp Lys Gly Asp Leu Ser Ser
930 935 940
Leu His Ser Leu Arg Trp Glu Pro Pro Ala Asp Ser Ser Pro Glu Pro
945 950 955 960
Val Ser Glu Gly Ala Gln Arg Leu Pro Pro Thr Glu Ser Ile Ile His
965 970 975
Val Pro Pro Leu Asp Pro Gly Met Arg Met Glu Asn Leu Arg Arg Pro
980 985 990
Gly Ala Thr Pro Cys Pro Pro Gln Ala Thr Gly Lys Ala Val Pro Leu
995 1000 1005
Ala Gly Ala Glu Lys Gln Glu Ser Arg Tyr Thr Gly Gln Lys Gly
1010 1015 1020
Met Ala Ala Leu Gly Lys Ser Glu Gly Ala Thr Thr Val Pro Pro
1025 1030 1035
Gly Ala Gly Ala Ser Asp Leu Gln Ala Ala Met Gln Ser Leu Arg
1040 1045 1050
Thr Ala Thr Ala Glu Ala Gln Ser Leu His Gln Gln Val Leu Ser
1055 1060 1065
Lys His Lys Gln Gly Pro Ala Pro Gly Val Ala Ser Thr Pro Thr
1070 1075 1080
Gln Asn Gly Leu Gln Gln Ala Thr Gly Thr Ala Gln Ser Asn Thr
1085 1090 1095
Lys Leu Met Ala Gly Gly Asp Pro Arg Ile Pro Ala Ala Pro Gly
1100 1105 1110
Lys Val Ser Gly Glu Gln Lys Ala Leu Pro Gly Glu Leu Pro Gly
1115 1120 1125
Gly Trp Val Thr Ile Gln Asp Gly Ile Tyr Thr Ala His Pro Val
1130 1135 1140
Arg Thr Phe Asp Pro Pro Gly Gly Val Arg Pro Ser Glu Arg Gly
1145 1150 1155
Pro Leu Pro Arg Gly Arg Glu Thr Ala Pro Thr Ser Gln Pro Pro
1160 1165 1170
Ser Pro Phe Leu Glu Gly Pro Val Gln Ser Leu Arg Pro Glu Gln
1175 1180 1185
Glu Glu Pro Gly Gly Tyr Thr Gln Lys Ala Trp Glu Pro Pro Glu
1190 1195 1200
Lys Val Met Ala Glu His Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ala Pro Glu
1205 1210 1215
Thr Thr Leu Lys Ala Ala Pro Leu Ala His His Thr Leu Ala Ser
1220 1225 1230
Gly Pro Gly Ala Ala Asp Ala Ser Leu His Ser His Asn Ala Ser
1235 1240 1245
Val Pro Pro Pro Pro Leu Leu Pro Ala Ala Val Thr Arg Pro Asp
1250 1255 1260
Phe Pro Ala Arg Ala Gly His Asp Glu Asp Ser Ser Gln Gln Ala
1265 1270 1275
Ser Lys Pro Pro Gln Asp Pro Leu Leu Tyr Ser His Ser Ser Pro
1280 1285 1290
Ala Gly Gln Arg Ser Pro Gly Glu Ser Gln Ala Lys Thr Leu Lys
1295 1300 1305
Leu Glu Pro Thr Thr Cys Pro Arg Lys Lys Pro Gln Leu Pro Pro
1310 1315 1320
Lys Pro Ala His Leu Ser Gln Ile Pro Leu Pro His Trp Leu Pro
1325 1330 1335
Lys Pro Leu Ala Pro Ser Pro Ser Thr Ser Lys Glu Glu Gly Gln
1340 1345 1350
Gly Lys Cys Lys Gln Gly Glu Thr Gly Thr Ala Asp His Asp Thr
1355 1360 1365
Gln Pro Ala Lys Ala Pro Thr Thr Ala Gly Gln Gly Cys Ile Pro
1370 1375 1380
Leu Ala Arg Cys Pro Thr Gly Gln Ser Pro Pro Ser Pro Pro Tyr
1385 1390 1395
Gly Pro Ser Thr Thr Ala Phe Lys Pro Thr Lys Ser Gln Ala Met
1400 1405 1410
Ser Ser Asn Asn Gln Ser Pro Glu Ser Pro Lys Leu Ser Ala Pro
1415 1420 1425
Gly Ser Asp Pro Thr Ser Leu Gln Gln Gly Leu Ser Ser Pro Gly
1430 1435 1440
Glu Lys Tyr Met Asp Gly Ser Gln Gln Ala Ala Pro Arg Ser Pro
1445 1450 1455
Glu Ile Leu Gln Glu Ser Gln Gln Glu Leu Gln Gly Leu Leu Ser
1460 1465 1470
Gln Val Gln Ala Leu Glu Lys Glu Ala Lys Ser Thr Val Asp Val
1475 1480 1485
Arg Ala Leu Arg Arg Leu Phe Glu Ala Val Pro Gln Leu Arg Gly
1490 1495 1500
Ala Pro Pro Ala Pro Ala Ala Leu His Lys Pro Glu Ala Ser Val
1505 1510 1515
Glu Gln Ala Phe Gly Glu Leu Thr Arg Val Ser Thr Glu Val Ala
1520 1525 1530
Leu Leu Lys Glu Gln Thr Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Glu Lys
1535 1540 1545
Ala Val His Lys Ala Leu Ser Ser Met Ser Ser Leu Gln Pro Gly
1550 1555 1560
Thr Asn Thr Arg Gly His Pro Gln Gly Pro Pro Lys Asp His Ser
1565 1570 1575
Thr His Lys Val Asn Val Ser Asp Ser Ser Arg Ala Arg Pro Asn
1580 1585 1590
Cys Pro Ser Gln Glu Val Gly Gly Pro Thr Glu Val Arg Ser Gln
1595 1600 1605
Thr Asp Gly Thr Cys Pro Thr Glu Ile Trp Ser Gln Ala Lys Val
1610 1615 1620
Arg Ser Pro Thr Glu Ala Arg Ser Gln Ala Ser Leu Pro Thr Ser
1625 1630 1635
Thr Thr Arg Arg Leu Asp Thr Leu Arg Glu Asp Trp Gly Leu Pro
1640 1645 1650
Arg Val Leu Pro Pro Ser Arg His Ser Pro Ser Ser Pro Thr Phe
1655 1660 1665
Ile Ser Ile Glu Ser Ala Thr Arg Lys Leu Pro Glu Ala Pro Arg
1670 1675 1680
Pro Gln Gly Ser Pro Asp Val Ser Val Lys Ser Thr His Leu Ser
1685 1690 1695
Gln Asp Val Gly Gln Ala Gln Leu His Gln Lys Asp Val Gln Asp
1700 1705 1710
Lys Ala Arg Lys Arg Glu Ala Thr Glu Cys Ser Gly Gln Pro Gln
1715 1720 1725
Pro Ala Pro Ala Ser Ala Ser Pro Leu Pro Thr Gly Arg Gln Lys
1730 1735 1740
Ser Ile Leu Glu Leu Gln Thr Gly Pro Gly Gly Ser Gln Cys Tyr
1745 1750 1755
Arg Ala Thr Arg Thr Val Asn Glu Gln His Glu Arg Val Asn Gln
1760 1765 1770
Cys Gly Asn Thr Ala Leu Thr Phe Pro Thr Met Val Thr Glu Pro
1775 1780 1785
Thr Glu Leu Thr Lys Val Pro Arg Pro Pro Pro Arg Cys Ser Thr
1790 1795 1800
Pro Pro Pro
1805
Claims (8)
1、一种猪背膘厚基因CMYA1,它的cDNA序列如序列表SEQ ID NO:1所述。
2、根据权利要求1所述的基因,它的DNA序列如序列表SEQ ID NO:1所述。
3、根据权利要求1所述的cDNA序列,其特征在于:所获得的CMYA1基因序列长度为6310bp,序列中包含5421bp的开放阅读框,158bp的5’非翻译区和731bp的3’非翻译区。
4、根据权利要求1所述的cDNA序列,其特征在于:所获得的CMYA1基因cDNA序列中有1个如序列表SEQ ID NO:1所述的A1552-G1552的碱基替换,该替换引起氨基酸由组氨酸变成精氨酸。
5、根据权利要求1所述的cDNA序列,其特征在于:所获得的CMYA1基因cDNA序列中有1个如序列表SEQ ID NO:1所述的A1909-G1909的碱基替换,该替换引起氨基酸由天门冬氨酸变成甘氨酸。
6、根据权利要求1所述的cDNA序列,其特征在于:所获得的CMYA1基因cDNA序列中有1个如序列表SEQ ID NO:1所述的A3448-C3448的碱基替换,该替换引起氨基酸由苏氨酸变成天门冬氨酸。
7、制备如权利要求1或2所述的DNA序列的方法,按照以下步骤:
1)用人CMYA1基因cDNA为信息探针,作同源序列筛选,获得同源性80%以上的表达序列标签(EST);然后拼接猪EST-重叠群,设计引物扩增中间未知片段,纯化克隆测序;设计5’和3’RACE引物;提取猪肌肉组织总RNA并做cDNA第一链反转录;RACE的PCR扩增和RACE产物的纯化克隆和测序;通过序列分析获得如序列表SEQ ID NO:1所述的cDNA序列;
2)从猪血液基因组中提取DNA,以猪CMYA1基因cDNA序列为模扳设计引物,进行PCR扩增,PCR产物纯化和克隆测序,获得如序列表SEQ ID NO:1所述的DNA序列。
8、应用PCR-RFLP方法检测猪CMYA1基因第1552位、1909位、3448位的碱基替换。
Priority Applications (1)
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