CN107130056B

CN107130056B - 一种作为分子标记的与猪胴体性状相关的14-3-3ζ基因片段的克隆与应用

Info

Publication number: CN107130056B
Application number: CN201710575709.8A
Authority: CN
Inventors: 徐永杰; 张朋朋; 徐海霞; 李�瑞; 张凯丽; 王素莹; 吴伟
Original assignee: Xinyang Normal University
Current assignee: Xinyang Normal University
Priority date: 2017-07-14
Filing date: 2017-07-14
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2037-07-14
Also published as: CN107130056A

Abstract

本发明属于动物分子标记制备技术领域，具体涉及一种作为分子标记的与猪胴体性状相关的14‑3‑3ζ基因片段的克隆与应用。14‑3‑3ζ基因片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示，其长度为2050bp，在第938bp处为T938C的碱基突变，导致BstxIPCR‑RFLP多态性。本发明还公开了检测碱基突变的引物对以及14‑3‑3ζ基因片段的克隆方法及应用，为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。

Description

一种作为分子标记的与猪胴体性状相关的14-3-3ζ基因片段的克隆与应用

技术领域

本发明属于动物分子标记制备技术领域，具体涉及一种作为分子标记的与猪胴体性状相关的14-3-3ζ基因片段的克隆与应用。

背景技术

猪肉是肉类消费的重要组成部分，是人类获得蛋白质营养物质的主要途径之一，在国人饮食结构中占据绝对的比重。长期以来，以提高生长速度、减少饲料消耗、增加瘦肉率为主要目标传统猪育种方法取得了显著成绩。但在猪的瘦肉率和生长速度大幅度提高的同时，传统的育种手段也遭遇到发展的瓶颈，已经很难像过去那样大幅度地提高猪的生产水平了。而猪生产水平的提高实际上降低了猪的体质和适应性，并影响到猪的肌肉品质。随着我国社会经济的发展，人民生活水平与消费水平的提高，人们在膳食结构与饮食观念也发生了变化，对猪肉品质的要求也越来越高。这一系列的矛盾和问题，迫切需要用新的手段和对策解决如何培育出安全环保优质新品种猪的问题。

快速发展的遗传学和分子生物学技术为突破传统育种的瓶颈提供强有力的补充，将猪育种工作推向新的分子育种阶段。目前，标记辅助选择(MAS)、重要数量性状的基因组区域定位、候选基因法和全基因组关联分析等研究已经成功地应用到国内外的猪育种实践当中，取得了巨大的经济效益和社会效益。已有多个位于功能基因内部的与生产性状紧密连锁的分子标记被发现。例如，与生长性状显著相关的MC4R、IGF-1、GRF，与产仔数和排卵率显著相关的候选基因ESR、FSH、PRLR、RBP4，与胴体性状显著相关的MSTN、HSL，与肉质性状显著相关的PRKAG3、Hal、OB、RYR1、H-FABP，与抗病能力显著相关的FUT1、SLA、NRAMP、大肠杆菌k88受体基因，以及与被毛颜色显著相关的KIT、MC1R。这些基因标记信息与传统的表型信息一起，通过标记辅助选择的方法，被积极的应用在生猪的商业生产中，给生猪产品的提高与促进带来了很大的帮助。

14-3-3蛋白又称酪氨酸3-加单氧酶/色氨酸5-加单氧酶激活蛋白(tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein)，是一个高度保守的、在真核生物中广泛表达的、具有复杂功能的调节性蛋白家族，主要通过与Ser/Thr磷酸化蛋白绑定结合发挥作用，参与许多重要的细胞生理过程，如信号转导、酶和细胞因子活性调节、细胞骨架动力学调节、细胞周期调控、细胞增生、分化和凋亡调节等。哺乳动物14-3-3蛋白至少存在7个由不同基因编码的高度保守的亚型，分别为β、γ、ε、ε、σ、ζ和τ，而β和σ分别是b和x的磷酸化形式，各亚型都有特殊的功能。通常14-3-3蛋白主要以同源或异源二聚体存在，14-3-3蛋白的N-末端约26-个氨基酸残基组成的结构域可能在14-3-3蛋白的二聚化中发挥了重要作用。

14-3-3ζ是14-3-3蛋白家族的重要一员，在肌形成及骨骼肌的生长发育中也起着非常重要的作用。MEF2(myocyte enhancer factor-2)是肌肉中一个重要的转录因子，其介导的多个信号通路在肌肉发育过程中起着关键的调节作用，它主要通过激活肌肉中一些特异表达的基因来发挥功能，但其活性又受到II型HDACs(histone deacetylases)和MITR(MEF2-interacting transcription repressor)的调控，HDACs和MITR能够在细胞核中与MEF2结合从而抑制MEF2的活性，而14-3-3ζ蛋白在细胞核中能够结合II型HDACs和MITR，使HDACs和MITR与MEF2解离而游离出细胞核，从而间接地激活MEF2。

鉴于14-3-3ζ基因对动物骨骼肌发育的调控作用，我们认为它很可能在猪的肌肉沉积过程中起到重要作用，进而影响猪的重要经济性状－胴体性状。但目前国内外对猪14-3-3ζ基因的cDNA全长克隆、基因组结构分析以及多态性研究还是空白。

发明内容

本发明的目的在于克隆一种作为分子标记的与猪胴体性状相关的14-3-3ζ基因片段，寻找突变位点，并建立相应的检测方法，分析其对猪胴体性状的关系，为猪的分子标记辅助选择提供一种新的分子标记。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种作为分子标记的与猪胴体性状相关的14-3-3ζ基因片段，所述14-3-3ζ基因片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示。

进一步地，所述序列表SEQ ID NO:3的长度为2050bp，在序列表SEQ ID NO:3第938bp处为T938C的碱基突变，导致BstxI PCR-RFLP多态性。

本发明设计了一对用于检测上述T938C碱基突变的引物对(该引物也是克隆本发明猪14-3-3ζ基因片段核苷酸序列的引物对)，其DNA序列如下所示：

正向引物：5'TGCCTGATAATTGGTAT 3'；

反向引物：5'TTAGCGTGCTGTCTTTGT 3'。

本发明提供了一种作为分子标记的与猪胴体性状相关的14-3-3ζ基因片段的克隆方法，包括以下步骤：

步骤1：用人14-3-3ζ基因cDNA为探针，作同源序列筛选，获得同源性90％以上的表达序列标签；然后拼接猪EST-重叠群，根据EST-重叠群序列设计基因特异性外侧引物GSP-5、

GSP-3和CDS区引物CDS-F、CDS-R，其DNA序列如下所示：

GSP-5：5’AGACGACCCTCCAAGATGACCTACGG 3’，

GSP-3：5’TGTCTGATGATGCCCTGCTTCCTTTGC 3’，

CDS-F：5’CCCAGAGACTGCTGAACCC 3’，

CDS-R：5’GTGGGACAGCATGGATGACA 3’；

以成年梅山猪肌肉组织中提取总RNA为模板，进行扩增、产物纯化和克隆测序，通过序列拼接获得如序列表SEQ ID NO:1所示的猪14-3-3ζ基因片段的cDNA序列；

步骤2：在步骤1的cDNA序列的第5至第7个内含子上设计引物，其DNA序列如下所示：

I5F：5’TGCCTGATAATTGGTAT 3’，

I7R：5’TTAGCGTGCTGTCTTTGT 3’；

以大白猪和梅山猪基因组DNA作为模版，进行扩增和克隆测序，获得如序列表SEQID NO:3所述的猪14-3-3ζ基因片段的核苷酸序列，其中第938bp处为T938C的碱基突变。

本发明还提供了一种作为分子标记的与猪胴体性状相关的14-3-3ζ基因片段在猪胴体性状分子标记辅助选择中的应用。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明发现了一个与猪胴体性状相关的猪14-3-3ζ基因片段，为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。

附图说明

图1为本发明的技术流程图。

图2为本发明中用于BstxI PCR-RFLP分型所用的猪14-3-3ζ基因片段的DNA序列片段，下划线为引物。

图3为本发明克隆的猪14-3-3ζ基因片段第6外显子的Bstx1 PCR-RFLP的两种基因型电泳结果，其中M泳道为DNA分子量标准(DL2000)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限定本发明的保护范围。若为特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例一猪14-3-3ζ基因片段的核苷酸序列克隆

1.1猪14-3-3ζ基因片段的cDNA克隆

1.1.1引物设计

利用报道的人14-3-3ζ基因的mRNA序列(GenBank收录号：NM_003406)为信息探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank猪EST数据库中做同源序列筛选，获得一系列同源性为90％以上的ESTs(片段长度大于100bp)，利用DNAStar软件中的SeqMan程序构建猪14-3-3ζ基因EST-重叠群，据此分别设计基因特异性外侧引物GSP-5、GSP-3和CDS区引物CDS-F、CDS-R，引物序列如表1所示。

表1用于扩增14-3-3ζ基因片段cDNA序列和CDS区的引物

1.1.2 RACE和CDS扩增

参照TriZoL试剂盒(日本TaRaKa公司产品)说明书步骤，利用该试剂盒从成年梅山猪肌肉组织中提取总RNA；利用经DEPC处理的超纯水溶解总RNA，利用Dnase I酶(美国Promega公司产品)于37℃处理30分钟、并经等体积的酚-仿抽提进行RNA的纯化；通过

640核酸-蛋白质浓度测定仪(美国Beckman公司产品)测定RNA的浓度，用1.5％的甲醛凝胶电泳检测其完整性。

利用RACE试剂盒(美国CLONTECH公司产品)首先进行cDNA第一链的合成，cDNA第一链合成之后首先以此产物为扩增模版，利用基因特异性外侧引物(GSP-5和GSP-3，其DNA序列如表1所示)及上述RACE试剂盒中的通用引物进行PCR扩增，扩增体系按照该试剂盒说明书配置；扩增条件为：95℃5min；34x(94℃，30s，70℃，30s，72℃，1min)；72℃，5min；15℃，2min。

利用PrimeScript TR Master Mix试剂盒(日本TaRaKa公司产品)合成普通cDNA第一链，再以cDNA模板利用CDS区引物CDS-F、CDS-R进行PCR反应扩增猪14-3-3ζ基因片段的CDS区，扩增条件为：95℃5min；35x(94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min)；72℃，5min；15℃，2min。

1.1.3PCR产物纯化、克隆与测序

按照PCR产物纯化试剂盒(日本TaRaKa公司产品)说明书操作要求进行PCR产物的纯化，将纯化PCR产物与pGEM-T载体(美国Promega公司产品)连接，连接反应总体积是5μl(包括2.5μl 2×buffer，0.5μl的pGEM-T载体，0.5μl的纯化PCR产物，0.5μl TaRaKa公司的T4 DNA连接酶)，最后加入1μl灭菌水置16℃水浴过夜；无菌状态下取100～120μl感受态细胞于1.5ml离心管中，将5μl的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s，其间不要摇动Ependorf管，取出后冰浴3～4min，加入400μl无抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养45min。取100μl涂布于已提前4h涂布了IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal的琼脂平板上，37℃平放1h后倒置培养；用牙签挑取单克隆置于1.5ml离心管中，37℃培养6～8小时，取1μl菌液作为PCR扩增的模版，利用通用引物进行PCR扩增，有阳性扩增产物者即为阳性克隆子；阳性菌液送由南京金斯瑞生物技术有限公司完成测序。

1.1.4猪14-3-3ζ基因片段的cDNA克隆结果

对于猪14-3-3ζ基因片段的RACE扩增和CDS区扩增均获得了特异的扩增产物。经测序验证发现，GSP-5和GSP-3和CDS区产物实际大小分别为692bp、612bp和874bp，通过Seqman拼接测序序列并去掉外源的通用引物获得猪14-3-3ζ基因片段的cDNA序列如序列表SEQ IDNO:1所示，cDNA序列全长为1975bp，包含460bp的5’UTR，738bp的CDS和777bp的3’UTR。通过ORF预测发现猪14-3-3ζ基因编码245个氨基酸，如序列表SEQ ID NO:2所示。

1.2猪14-3-3ζ基因片段的核苷酸序列克隆与SNP扫描

1.2.1引物设计

利用获得的猪14-3-3ζ基因片段cDNA序列比对人14-3-3ζ基因的基因组DNA，初步推测猪14-3-3ζ基因片段的结构，在第5至第7个内含子上设计引物，引物序列如表2所示。

表2用于克隆猪14-3-3ζ基因片段核苷酸序列的引物

1.2.2PCR扩增及SNP扫描

利用TaRaKa公司的rTaq DNA聚合酶进行PCR扩增，反应体系为20μl，包括如下组分：1×PCR buffer，75μM的dNTP，0.3μM引物，0.9～1.5mM的Mg²⁺，1U Taq DNA聚合酶，50ng猪基因组DNA。PCR反应程序为标准PCR扩增程序，退火温度如表2所示，延伸时间为90s。PCR扩增产物用TaRaKa公司的纯化试剂盒回收后，直接送交南京金斯瑞生物技术有限公司完成测序。

在上述DNA克隆过程中，对于每一段序列的PCR扩增，同时利用外来品种大白猪和中国地方品种梅山猪基因组DNA作为模版，即在扩增过程中，对于每一对引物，分别扩增6个大白猪DNA和6个梅山猪DNA，将大白猪与梅山猪DNA来源的PCR扩增产物分别回收，送南京金斯瑞生物技术有限公司完成测序；利用DNAStar软件的Seqman程序进行拼接和序列比对，搜寻其中的SNP位点。

1.2.3猪14-3-3ζ基因片段核苷酸序列的克隆与SNP扫描结果将一对分别位于内含子5和内含子7的引物扩增获得猪14-3-3ζ基因片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示，经测序验证其长度为2050bp，覆盖了猪14-3-3ζ基因片段第6和第7外显子的全部序列，通过比较分析，发现了位于938bp处(第6外显子77bp处)的一个T938C碱基突变。

实施例二猪14-3-3ζ基因片段T938C BstxI PCR-RFLP基因型与猪胴体性状的关联分析

2.1 BstxI PCR-RFLP检测方法的建立

2.1.1引物设计

检测上述T938C碱基突变的引物对与克隆猪14-3-3ζ基因片段核苷酸序列的引物序列一样，如表2所示。

2.1.2 PCR扩增条件

PCR反应总体积20μl，其中包含约50ng猪基因组DNA，含1×PCR Buffer，1.5mM Mg² ⁺，150μM dNTP Mix，0.3μM每条引物，1单位Taq DNA聚合酶。PCR扩增程序是：94℃5min，35x(94℃30s，58℃30s，72℃25s)，72℃延伸5min。PCR反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

2.2.3 BstxI PCR-RFLP基因型

PCR产物酶切反应体积是10μl，其中10×Bstx1Buffer 1μl，PCR产物3～5μl，限制性内切酶Bstx1为3U，用灭菌水补充至10μl，将样品混匀后离心，65℃水浴4小时，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，用凝胶成像系统拍照，记录基因型。

PCR扩增产物大小为628bp，序列如图2所示。分析发现该片段包含的T938C可以引起Bstx1限制性内切酶识别位点(’5CCANNNNN/NTGG3’)的丢失与保留，即当该位点为C等位基因时，可以被Bstx1所酶切，而当该位点为T等位基因时，不能被Bstx1酶所切开。因此，TT纯合型(CTANNNNN/NTGG)个体不被酶切，TC杂合型产生的大小为628bp、399bp和229bp的三个片段，CC纯合型(CCANNNNN/NTGG)个体酶切产生片段大小分别为399bp和229bp(没有发现该基因型)。因此，通过PCR扩增首先获得628bp的产物，经过酶切可以区分两种不同的基因型个体，部分电泳检测结果如图3所示。

实施例三作为分子标记的猪14-3-3ζ基因片段在不同猪群中的多态性分布在3个外来品种(大白猪、长白猪和杜洛克)和3个中国地方猪种(梅山猪、通城猪和清平猪)猪群中检测猪14-3-3ζ基因第5外显子C938T同义突变，检测结果如表3所示。在所检测的几个猪群中，长白猪和杜洛克两国外猪种中全为T等位基因，在大白猪及梅山猪、通城猪和清平猪中T等位基因占优势有少量C等位基因，但在6个群体中均未发现CC纯合基因型。

表3不同猪群中14-3-3ζ基因第五外显子T938C位点多态性分布

实施例四作为分子标记的猪14-3-3ζ基因片段在猪胴体性状标记辅助选择中的应用为了确定猪14-3-3ζ基因多态性与猪表型差异是否相关，选择华中农业大学农业部猪遗传育种重点实验室组建的302头大白猪×梅山猪F₂代资源群体为试验材料，采用实施例二所建立的Bstx1PCR-RFLP检测方法进行多态性检测，并分析猪14-3-3ζ基因第5外显子T938C位点不同基因型与猪生产性状的相关关系。采用SAS统计软件(SAS Institute Inc,Version 8.0)GLM程序进行单标记方差分析，同时采用REG程序计算基因加性效应和显性效应，并进行显著性检验，所采用模型为：

Y_ijkl＝μ+G_i+F_j+S_k+Y_l+b_ijklX_ijkl+e_ijkl

其中Y_ij为性状表型值，μ为平均值，G_i为基因型效应(包括基因加性效应和显性效应；加性效应用1，0和-1分别代表II、ID和DD基因型，显性效应用1，-1和1分别代表II、ID和DD基因型)；S_k、Y_l、F_j为固定效应，分别为性别、年度、家系效应，b_ijkl为屠宰体重或屠宰日龄的回归系数，胴体性状以屠宰体重为协变量，肉质性状以屠宰日龄为协变量，生长不考虑协变量；e_ijkl为残差效应。

在所检测的290头大白猪×梅山猪F₂代个体中，TT基因型有205个，TC基因型有85个，无CC型。不同基因型与生产性状间的统计分析结果总结于表4。

表4猪14-3-3ζ基因多态性与胴体性状的关联分析

从表4发现，猪14-3-3ζ基因不同基因型在皮率、瘦肉率、肥瘦肉比例和眼肌面积上显著差异(P<0.05)，其他胴体性状上不存在显著性的相关性。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理及工艺条件所做的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 信阳师范学院

<120> 一种作为分子标记的与猪胴体性状相关的14-3-3ζ基因片段的克隆与应用

<130> 2017

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1975

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<220>

<221> 5'UTR

<222> (1)..(460)

<220>

<221> CDS

<222> (461)..(1198)

<220>

<221> 3'UTR

<222> (1199)..(1975)

<400> 1

ggtcccggat gttgctgaac cggagcccct tctagaggga gtaactggcg caggcgcagc 60

agggccgcac gaaaacccaa ggcgcactcg ggacaagagt aaagaagttg gaaacctagc 120

agcctggggg gaagtgctgg agcggagagg acgcgcgctc ctcagctcgc cctctggcgc 180

gggcgggcag gtcgcgcgcg ctggggagcg gcggttgctc cgggccccca gagctgtggg 240

caccaatcaa cggttgccat agcagcgttt gacgtcatcg tgcgtgtggt gcccctgctg 300

ccggggctgg tgattggagg aaaccccgtg tctgcggagc ggctgtagcc tgtgagcagc 360

gagatctagg gacagagtct cagcctcgcc gctgccgccc agagactgct gaaccccggt 420

ccgtccgccg ccacccactc cggacacaga acatccagtc atg gat aaa aat gag 475

Met Asp Lys Asn Glu

1 5

ctg gtg cag aag gcc aaa ctg gcc gag cag gct gag cga tat gat gac 523

Leu Val Gln Lys Ala Lys Leu Ala Glu Gln Ala Glu Arg Tyr Asp Asp

10 15 20

atg gca gcc tgt atg aag tct gta act gag caa gga gct gaa tta tcc 571

Met Ala Ala Cys Met Lys Ser Val Thr Glu Gln Gly Ala Glu Leu Ser

25 30 35

aat gag gag agg aat ctt ctc tca gtt gct tat aaa aat gtt gta gga 619

Asn Glu Glu Arg Asn Leu Leu Ser Val Ala Tyr Lys Asn Val Val Gly

40 45 50

gcc cgt agg tca tct tgg agg gtc gtc tca agt att gag caa aag acg 667

Ala Arg Arg Ser Ser Trp Arg Val Val Ser Ser Ile Glu Gln Lys Thr

55 60 65

gaa ggt gct gag aaa aaa cag cag atg gct cga gaa tac cga gag aaa 715

Glu Gly Ala Glu Lys Lys Gln Gln Met Ala Arg Glu Tyr Arg Glu Lys

70 75 80 85

att gag acc gag cta aga gat atc tgc aat gat gta ctg tct ctt ttg 763

Ile Glu Thr Glu Leu Arg Asp Ile Cys Asn Asp Val Leu Ser Leu Leu

90 95 100

gaa aag ttc ttg atc ccc aat gct tca caa gca gag agc aaa gtc ttc 811

Glu Lys Phe Leu Ile Pro Asn Ala Ser Gln Ala Glu Ser Lys Val Phe

105 110 115

tat ttg aaa atg aaa gga gac tac tac cgt tac ttg gct gag gtt gct 859

Tyr Leu Lys Met Lys Gly Asp Tyr Tyr Arg Tyr Leu Ala Glu Val Ala

120 125 130

gct ggt gat gat aag aag ggg att gtg gat cag tca cag caa gca tac 907

Ala Gly Asp Asp Lys Lys Gly Ile Val Asp Gln Ser Gln Gln Ala Tyr

135 140 145

cag gaa gct ttt gaa atc agc aaa aag gaa atg caa cca aca cat cct 955

Gln Glu Ala Phe Glu Ile Ser Lys Lys Glu Met Gln Pro Thr His Pro

150 155 160 165

atc aga ttg ggt ctg gcc ctt aac ttc tct gtg ttc tat tat gag att 1003

Ile Arg Leu Gly Leu Ala Leu Asn Phe Ser Val Phe Tyr Tyr Glu Ile

170 175 180

ctg aac tcc cca gag aaa gcc tgc tct ctt gca aag aca gca ttt gat 1051

Leu Asn Ser Pro Glu Lys Ala Cys Ser Leu Ala Lys Thr Ala Phe Asp

185 190 195

gaa gcc att gct gaa ctt gat aca tta agt gaa gag tca tac aaa gac 1099

Glu Ala Ile Ala Glu Leu Asp Thr Leu Ser Glu Glu Ser Tyr Lys Asp

200 205 210

agc acg cta ata atg caa tta ctg aga gac aac ttg aca ttg tgg aca 1147

Ser Thr Leu Ile Met Gln Leu Leu Arg Asp Asn Leu Thr Leu Trp Thr

215 220 225

tcg gat acc caa gga gat gaa gct gaa gca gga gaa gga ggg gaa aat 1195

Ser Asp Thr Gln Gly Asp Glu Ala Glu Ala Gly Glu Gly Gly Glu Asn

230 235 240 245

taa ccggccttcc aacttttgtc tgcctcattc taaaatttac acagtagacc 1248

atttgtcatc catgctgtcc cacaaatagt tttttgttta cgatttatga caggtgcaca 1308

ggattacccc tcttcagcct tctgtcttgt caccaaccat ttctacttgg tggccatgta 1368

cttgggggaa aggccgcatg atctttctgg ctccactcag tgtctgatga tgccctgctt 1428

cctttgcttg catcccacaa actatttccc tcatcctctt cactgcagca aatctctcct 1488

tagttgatga gattgtgttt atctccctgt aaaccctgcc taccctgaat ggtctgtcat 1548

tgtctttgcc tttaaaatct tcctcttcct ttctttaaat aatgatgggg ctaagttata 1608

cccaaagctc accctgcaga ccatttcctc agtaccttgc agaaatcacc aaacaaaaaa 1668

taccatttta aaagaggtgt attttttttt tcttttagaa tgtaagctcc tcaagagcag 1728

ggacaatgtt ttctgtatgt tctattgtgc ctagtacact gtaaatgctc aataaatact 1788

gatgatggga ggcagtgagt cttgatgata agggtgagaa actgaaatcc caaatatggt 1848

tttgttgctt gttttattat gacctcagtt taaattggga aataacagcc ctttgggaca 1908

gttgtcccaa atattacatt caaataaaag tgcaatagaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1968

aaaaagt 1975

<210> 2

<211> 245

<212> PRT

<213> Sus scrofa

<400> 2

Met Asp Lys Asn Glu Leu Val Gln Lys Ala Lys Leu Ala Glu Gln Ala

1 5 10 15

Glu Arg Tyr Asp Asp Met Ala Ala Cys Met Lys Ser Val Thr Glu Gln

20 25 30

Gly Ala Glu Leu Ser Asn Glu Glu Arg Asn Leu Leu Ser Val Ala Tyr

35 40 45

Lys Asn Val Val Gly Ala Arg Arg Ser Ser Trp Arg Val Val Ser Ser

50 55 60

Ile Glu Gln Lys Thr Glu Gly Ala Glu Lys Lys Gln Gln Met Ala Arg

65 70 75 80

Glu Tyr Arg Glu Lys Ile Glu Thr Glu Leu Arg Asp Ile Cys Asn Asp

85 90 95

Val Leu Ser Leu Leu Glu Lys Phe Leu Ile Pro Asn Ala Ser Gln Ala

100 105 110

Glu Ser Lys Val Phe Tyr Leu Lys Met Lys Gly Asp Tyr Tyr Arg Tyr

115 120 125

Leu Ala Glu Val Ala Ala Gly Asp Asp Lys Lys Gly Ile Val Asp Gln

130 135 140

Ser Gln Gln Ala Tyr Gln Glu Ala Phe Glu Ile Ser Lys Lys Glu Met

145 150 155 160

Gln Pro Thr His Pro Ile Arg Leu Gly Leu Ala Leu Asn Phe Ser Val

165 170 175

Phe Tyr Tyr Glu Ile Leu Asn Ser Pro Glu Lys Ala Cys Ser Leu Ala

180 185 190

Lys Thr Ala Phe Asp Glu Ala Ile Ala Glu Leu Asp Thr Leu Ser Glu

195 200 205

Glu Ser Tyr Lys Asp Ser Thr Leu Ile Met Gln Leu Leu Arg Asp Asn

210 215 220

Leu Thr Leu Trp Thr Ser Asp Thr Gln Gly Asp Glu Ala Glu Ala Gly

225 230 235 240

Glu Gly Gly Glu Asn

245

<210> 3

<211> 2050

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<220>

<221> mutation

<222> (938)..(938)

<400> 3

tgtagccacc agcctatgcc agagccacag caacgcagga tccgagccgc gtctgtgacc 60

tacaccacag ctcacggcaa ggcctgattg ttaacccact gaggaagggc aggcatcgaa 120

cccccaacct catgggttcc tagttggatt cgttaaccac tgcgccacga cgggaactcc 180

ccgactttta aattatactc aagagttccc gtcatggctc agtggttaac aaacccaact 240

agtatccatg agagggcagg ttcaatccct ggccttgctc aactagtatc cttgcccaac 300

tagtatccat gagagggcag gttcaatccc tggccttgct cagttgggtt taggatccgg 360

agttgctgcg actgtggtat aggccagcag ctaaggctct gatttgaccc ctagcctggg 420

aacctccata tgcctccggt gtggccctaa aaaaagagga cccccccccc aaaaaatata 480

ctcagattct caactgcatg tggagagtct aaactgcctt gttcaagggt caactgtgta 540

tttactgcct gataattggt attgtaaaat gtatgctcac tgacaagcca attttatgta 600

taggaatgtt tcctcacaat tttaagaagc agtagttaca gtgtaactgt agggcagcac 660

aaactaatta ttaaagataa tactgagata attacagaga tgttgcccta acgttggtca 720

ttggctagtg cgtattccag gagaagctta tttttttaaa tttatttcaa aatttatcat 780

tggacagtaa aggtttagtt tgaggagtga aggtgcagtg caaactttta tcgatatgtt 840

ttggtgtgtt ttatcatcca gggattgtgg atcagtcaca gcaagcatac caggaagctt 900

ttgaaatcag caaaaaggaa atgcaaccaa cacatcctat cagattgggt ctggccctta 960

acttctctgt gttctattat gagattctga actccccaga gaaagcctgc tctcttgcaa 1020

agacagtatg tattttttac atgttacatg gaaattcagt aatcactagt atttgagcac 1080

tgaaatgtat tttattttaa tcataggcat ttgatgaagc cattgctgaa cttgatacat 1140

taagtgaaga gtcatacaaa gacagcacgc taataatgca attactgaga gacaacttga 1200

cagtaagtac ataacagtat cattaatggt tgatgtagtt gaagagatta caggcaaatc 1260

tgttttactg cacttcacag atgctgtaat ttttacaaat tgaaggtgtg tggcaaacct 1320

gcgttgagca agtctatggg tgccattttc tcaaaagcat ttgttcactt cttgtctctg 1380

taattttttt tggtaattta tcaataaagt tacttaataa agtatgtacc ttgttttttt 1440

taagacaagt gtaagatcta cctgttgtta aaactgttaa aactgtgaag aaaaccacct 1500

tacagaaacc agtattagac tgaggactaa aaatgtgcct tttcattaat tatataccca 1560

ttgttaaaat tttgggtttt gtttgtttgt ttgtttgttt tgtttttctc attttagggc 1620

tgcagccacg gcatgtgaaa gttcctgggc taggggttga attggagctg ctgctgtggg 1680

cctacaccac agccacagca actcgggata caagctgaat tggagctgta tctgtgacct 1740

acaccacagc ttgcttgcag caacactgga tacttaaccc actgagggaa gccaagactc 1800

gaacctgtgt cccagggaca ctgtgttgga ttcttaaccc actgaaccac aatgggaact 1860

cccaaaattt tgtttttaaa ataatttttt aattcaagat tttgaacttt caatcacata 1920

gttcatttta tttttcattt caatatattg attctgtttt ttccatgtag tcacaggaga 1980

gtttagcttt taagtgtcaa gtatctgccc tgtgctgggt aaagagctag gaacgattat 2040

agtctagtgc 2050

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(26)

<400> 4

agacgaccct ccaagatgac ctacgg 26

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(27)

<400> 5

tgtctgatga tgccctgctt cctttgc 27

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(19)

<400> 6

cccagagact gctgaaccc 19

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(20)

<400> 7

gtgggacagc atggatgaca 20

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<220>

<221> protein_bind

<222> (1)..(17)

<400> 8

tgcctgataa ttggtat 17

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(18)

<400> 9

ttagcgtgct gtctttgt 18

Claims

1.14-3-3ζ基因片段在猪胴体性状分子标记辅助选择中的应用，其特征在于，所述14- 3-3ζ基因片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示，所述猪胴体性状为皮率、瘦肉率、肥瘦肉比例和眼肌面积。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述序列表SEQ ID NO:3的长度为2050bp，在序列表SEQ ID NO:3第938bp处为T938C的碱基突变，导致BstxIPCR-RFLP多态性。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，检测所述碱基突变的引物对的DNA序列如下所示：

正向引物：5' TGCCTGATAATTGGTAT 3'；

反向引物：5' TTAGCGTGCTGTCTTTGT 3'。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述14-3-3ζ基因片段的克隆方法包括以下步骤：

步骤1：用人14-3-3ζ基因cDNA为探针，作同源序列筛选，获得同源性90%以上的表达序列标签；然后拼接猪EST-重叠群，根据EST-重叠群序列设计基因特异性外侧引物GSP-5、GSP-3和CDS区引物CDS-F、CDS-R，其DNA序列如下所示：

GSP-5：5’ AGACGACCCTCCAAGATGACCTACGG 3’，

GSP-3：5’ TGTCTGATGATGCCCTGCTTCCTTTGC 3’，

CDS-F：5’ CCCAGAGACTGCTGAACCC 3’，

CDS-R：5’ GTGGGACAGCATGGATGACA 3’；

以成年梅山猪肌肉组织中提取总RNA为模板，进行扩增、产物纯化和克隆测序，通过序列拼接获得如序列表SEQ ID NO:1所述的猪14-3-3ζ基因片段的cDNA序列；

步骤2：利用步骤1获得的猪14-3-3ζ基因片段cDNA序列比对人14-3-3ζ基因的基因组DNA，初步推测猪14-3-3ζ基因片段的结构，在第5至第7个内含子上设计引物，其DNA序列如下所示：

I5F：5’ TGCCTGATAATTGGTAT 3’，

I7R：5’ TTAGCGTGCTGTCTTTGT 3’；

以大白猪和梅山猪基因组DNA作为模版，进行扩增和克隆测序，获得如序列表SEQ IDNO:3所示的猪14-3-3ζ基因片段的核苷酸序列，其中第938bp处为T938C的碱基突变。