CN104372006A - 一种与猪肌肉pH值性状相关的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于猪的遗传标记制备技术领域，具体涉及一种猪肌肉pH值相关的分子标记制备及在标记辅助选择上的应用。所述的分子标记由GYS1基因启动子序列克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示。在序列表SEQIDNO：2所示序列的第267位碱基处有一个C267-T267的碱基突变，导致MvaIPCR-RFLP多态性。本发明还公开了获得上述分子标记的制备方法和多态性检测方法的应用，为开展高肌肉品质猪的标记辅助选择提供了新的遗传标记。

Description

一种与猪肌肉 pH 值性状相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于动物分子标记制备技术领域，具体涉及一种与猪肌肉pH值性状相关基因GYS1基因启动子片段的克隆，分子标记的制备及其在标记辅助选择上的应用。

背景技术

动物体内糖原的含量直接影响到肌肉的一些品质性状，比如屠宰后的肌肉PH值、系水力、肌肉嫩度等。骨骼肌的蛋白质的分解和糖原合成过程直接关系到肌肉的品质。因此，对骨骼肌糖原合成和分解代谢过程的研究，一直受到人们的关注。屠宰后肌肉最终的pH值是衡量猪肌肉品质的重要指标，肌肉的pH值过高则容易形成DFD肉，如果肌肉的pH值过低则容易形成PSE肉，这两种情况都对猪肉的品质造成了巨大的影响，并且对猪肉的深加工带来了较大影响。肌肉糖原含量过高导致最终的pH值过低，使蛋白质对水的结合能力降低，从而对猪肌肉的系水力、剪切力、肉色等肉质性状有影响。pH值只是我们通常测定的一个品质性状指标，其实影响肌肉pH值的主要因素是屠宰时肌肉的糖原含量。目前肌肉糖原含量和肌肉pH值相关性的研究较少，Immonen and Puolanne（2000）研究报道猪肉的最终pH值和糖原含量有较高的相关性。Henckel 等（2000）报道当肌肉内糖原含量较低时（小于53μmol/g）糖原含量和屠宰后最终pH值有较高的相关性，而当肌肉内糖原含量比较高的时侯，这种相关性则很低。

糖原合成酶（GS）是糖原合成过程的限速酶，关键调控位点，在动物的肌肉和肝脏的糖原的合成过程中起着重要的作用(Kaslow and Lesikar, 1984)。在哺乳动物中糖原合成酶存在两种亚型，一种是肌肉类型糖原合成酶（LGS），由GYS1基因编码，在组织中普遍表达(Browner et al., 1989)；另外一种肝脏类型糖原合成酶（MGS），由GYS2基因编码，在组织中肝脏特异表达(Kaslow et al., 1985; Bai et al., 1990)。肌肉类型糖原合成酶转基因小鼠研究表明，转基因小鼠的肌肉糖原含量有明显的提高(Manchester et al., 1996)。而敲除糖原合成酶基因后对小鼠的心肌和骨骼肌的糖原代谢有较大的影响，敲除小鼠比野生型的小鼠在葡萄糖的清除上效率更高，并且能够维持一个更高的血清胰岛素水平，这些结果表明糖原合成酶在控制组织的糖原代谢方面具有重要的作用。敲除糖原合成酶基因的小鼠具有更多比例的慢速氧化型肌纤维（І型），同时快速酵解型肌纤维（ІІa型）的比例下降(Pederson et al., 2005)。I型肌纤维肌浆中含有更多的线粒体和细胞色素，氧化酶活力高具有更高的储存甘油三酯的能力；II型肌纤维肌浆中线粒体和细胞色素含量少，氧化酶活力低、磷酸化酶和ATP酶活力高。

目前发现并已经鉴定的影响肌肉品质的候选基因也大多是通过影响猪肌肉的糖原代谢，从而影响肌肉品质。PRKAG3基因编码腺苷一磷酸激活蛋白激酶γ亚基。PRKAG3基因在骨骼肌的能量和糖原合成代谢方面其着重要的作用，发现R225Q突变与肌肉内糖原含量增加有相关(Milan et al., 2000)。RN-基因携带个体的背最长肌肉中糖原含量增加了70%，其最终的肌肉pH值比正常要低很多，并且猪肉色泽苍白和滴水损失增加。所以该不同的基因型也很可能通过调节糖原代谢和葡萄糖的转运过程来影响肌肉内的糖原含量，从而影响猪肌肉品质性状。左波等分离克隆猪糖原合成酶基因部分片段，并分析了在猪不同组织中的表达规律，发现在肌肉和心脏中表达量最高 (Zuo et al., 2005)。猪GYS1基因定位于猪六号染色体(Fontanesi et al., 2003)，在这一区域存在大量影响猪肌肉品质性状的QTL(de Koning et al., 1999; Clop et al., 2003)，所以糖原合成酶基因是影响猪肌肉品质性状的重要的候选基因。到目前为止仍没有见到研究猪GYS1基因启动子SNP多态性与猪肉质性状关系的研究的相关报道。所以申请人将猪GYS1基因作为影响猪肉质性状的重要侯选基因，发现GYS1基因启动子区域存在一个突变位点，并且与猪肌肉pH值这一重要肉质性状具有显著相关，可以进一步利用糖原合成酶基因开展优良肌肉品质猪分子标记辅助育种。

参考文献：

Bai, G., Zhang, Z.J., Werner, R., Nuttall, F.Q., Tan, A.W. and Lee, E.Y. The primary structure of rat liver glycogen synthase deduced by cDNA cloning. Absence of phosphorylation sites 1a and 1b. J Biol Chem 265 (1990), pp. 7843-8.

Browner, M.F., Nakano, K., Bang, A.G. and Fletterick, R.J. Human muscle glycogen synthase cDNA sequence: a negatively charged protein with an asymmetric charge distribution. Proc Natl Acad Sci U S A 86 (1989), pp. 1443-7.

Clop, A., Ovilo, C., Perez-Enciso, M., Cercos, A., Tomas, A., Fernandez, A., Coll, A., Folch, J.M., Barragan, C., Diaz, I., Oliver, M.A., Varona, L., Silio, L., Sanchez, A. and Noguera, J.L. Detection of QTL affecting fatty acid composition in the pig. Mamm Genome 14 (2003), pp. 650-6.

de Koning, D.J., Janss, L.L., Rattink, A.P., van Oers, P.A., de Vries, B.J., Groenen, M.A., van der Poel, J.J., de Groot, P.N., Brascamp, E.W. and van Arendonk, J.A. Detection of quantitative trait loci for backfat thickness and intramuscular fat content in pigs (Sus scrofa). Genetics 152 (1999), pp. 1679-90.

Henckel P, Karlsson A, Oksbjerg N, et al. Control of postmortem pH decrease in pig muscles:experimental design and testing of animal models. Meat Sci, 2000, 55: 131-138.

Immonen K, Puolanne E. Variation in residual glycogenglucose concentration at ultimate pH values below 5.75. Meat Sci, 2000, S5: 279-283.

Kaslow, H.R. and Lesikar, D.D. Isozymes of glycogen synthase. FEBS Lett 172 (1984), pp. 294-8.

Kaslow, H.R., Lesikar, D.D., Antwi, D. and Tan, A.W. L-type glycogen synthase. Tissue distribution and electrophoretic mobility. J Biol Chem 260 (1985), pp. 9953-6.

Manchester, J., Skurat, A.V., Roach, P., Hauschka, S.D. and Lawrence, J.C., Jr. Increased glycogen accumulation in transgenic mice overexpressing glycogen synthase in skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A 93 (1996), pp. 10707-11.

Milan, D., Jeon, J.T., Looft, C., Amarger, V., Robic, A., Thelander, M., Rogel-Gaillard, C., Paul, S., Iannuccelli, N., Rask, L., Ronne, H., Lundstrom, K., Reinsch, N., Gellin, J., Kalm, E., Roy, P.L., Chardon, P. and Andersson, L. A mutation in PRKAG3 associated with excess glycogen content in pig skeletal muscle. Science 288 (2000), pp. 1248-51.

Pederson, B.A., Schroeder, J.M., Parker, G.E., Smith, M.W., DePaoli-Roach, A.A. and Roach, P.J. Glucose metabolism in mice lacking muscle glycogen synthase. Diabetes 54 (2005), pp. 3466-3473.

Zuo, B., Xiong, Y.Z., Deng, C.Y., Su, Y.H., Wang, J., Lei, M.G., Li, F.E., Jiang, S.W. and Zheng, R. Polymorphism, linkage mapping and expression pattern of the porcine skeletal muscle glycogen synthase (GYS1) gene. Anim Genet 36 (2005), pp. 254-7.

发明内容

本发明的目的在于克隆与猪肌肉pH值性状相关的基因GYS1基因的启动子区域，寻找基因突变位点，并建立相应的多态性检测方法进行猪肌肉pH值性状关联分析，为猪的标记辅助选择提供一种有用的分子标记。

本发明通过以下技术实现：

一种作为分子标记应用的与猪肉质性状相关的GYS1基因启动子区域序列，全长为785bp，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述。依据获得的如序列表SEQ ID NO：1所述DNA序列设计引物，通过扩增和测序获得了GYS1基因启动子部分核苷酸序列，该序列长度为296bp，其中第267bp处有一个C267-T267的碱基突变，导致MvaІ-PCR-RFLP多态性。所述引物对为：Promoter-SNP-F：AGGCCTCTTTGCTAAGGCC；Promoter-SNP-R：CCCCGGGCCAGTGTCATT。

一种制备所述的与猪肉质性状相关的GYS1基因启动子序列的方法，按照以下步骤：

（1）以猪GYS1基因的cDNA为信息探针，在猪基因组数据库做同源序列筛选，获得一个包含猪GYS1基因的一个BAC克隆子，以BAC克隆子序列作模板设计引物，以中国地方猪品种梅山猪的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，PCR产物纯化和克隆测序，获得猪GYS1基因启动子序列，如序列表SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列。

（2）选择3头大白猪和3头梅山猪为试验材料，从血液中提取猪基因组DNA，设计引物，PCR扩增、PCR产物纯化、克隆测序，获得如序列表SEQ ID NO：2所述的猪GYS1基因启动子部分核苷酸序列。

在本发明的实施例中申请人已将制备的与猪肌肉pH值性状相关分子标记应用在猪分子标记辅助育种的关联分析中的应用。

本发明的效果是：发现了一个与猪肌肉pH值性状相关的分子标记，为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。

更详细的技术方案请参见《具体实施方式》中的实施例。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的猪肌肉pH值性状相关基因GYS1基因的启动子核苷酸序列。

序列表SEQID NO：2是本发明克隆的猪肌肉pH值性状相关基因GYS1基因的启动子区域部分核苷酸序列。

图1：是本发明中猪GYS1基因启动子序列的MvaІ-RFLP三种基因型电泳图谱。图中：M：DNA分子量标准（DL2000 ladder）。

图2：是本发明所扩增得到的猪GYS1基因启动子部分核苷酸序列，片段大小为296bp，图中下划线分别为正、反向引物序列。括号内所显示的是碱基突变。

具体实施方式

实施例1: （一）猪GYS1基因启动子区域DNA序列扩增

（1）引物设计：

用猪GYS1基因的cDNA （GenBank登录号：GQ845034）为信息探针，利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)的BLAST工具在Genomic Biology猪基因组数据库中做同源序列筛选。获得一个包含猪GYS1基因的一个BAC克隆子CH242-517N5（GenBank登录号：FP102974），以该BAC克隆子序列作模板设计引物，以中国地方猪品种梅山猪的基因组DNA为模板，获得猪GYS1基因启动子序列。用Primer Premier 5.0 软件设计1对引物扩增SEQ ID NO：1，所述的序列，它们的序列大小分别为785bp。

所述1对引物的DNA序列如下：

SNP-1F：5’- ATCCTAGCGGAAACGGAA-3’

SNP-1R：5’- ACAAAGTGCGGCTTAGAG-3’。

（2）PCR扩增反应

PCR反应体系为25 μl，其中模板为猪DNA为100ng，dNTPs浓度为10mmol/L，每条引物浓度为10mmol/L，2U的Taq DNA聚合酶，加去离子水至总体积25 μl。PCR反应程序：94℃预变性4min；然后94℃变性40s、59℃退火40s、72℃延伸50s，共35个循环；最后72℃延伸7min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。

（3）PCR产物的回收、纯化、克隆和测序

PCR产物经纯化（按照上海生工生物工程有限公司的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒说明书操作）。载体连接体系组成：10×buffer，1µL；pMD18-T Vector（50ng），1µL；回收的PCR扩增片段，8µL；总体积为10µL并混和均匀，于16℃连接4小时或者4℃过夜连接。将10µL的连接产物与100µL感受态细胞混匀，在冰上放置30min，然后于42℃的循环水浴中热击90s。迅速将管转移到冰浴中5min。加入400µL LB液体培养基，37℃复苏培养1h。4000r/min离心6分钟后弃部分上层液，取100µL转移到LB培养基平板上。待液体被吸收后，倒置平皿，于37℃培养12-16h。挑取单个菌落加入含有氨苄青霉素的LB培养基中培养6h以上，然后进行PCR扩增，电泳检测，挑取阳性克隆子。鉴定正确的菌液送北京奥科生物技术有限责任公司进行序列测定。

（二）PCR-RFLP诊断方法建立

（1）引物序列和PCR扩增条件

选择3头大白猪和3头梅山猪，通过实施例1获得的GYS1基因启动子序列为试验材料，设计了以下引物，引物序列如下：

Promoter-SNP-F：AGGCCTCTTTGCTAAGGCC；

Promoter-SNP-R：CCCCGGGCCAGTGTCATT。

用该引物分别在3头“大白猪”和3头“梅山猪”基因组DNA中进行PCR扩增。PCR反应体系为25μl，其中模板DNA为50ng，dNTPs浓度为10mmol/L，每条引物浓度为10mmol/ L，1U的Taq DNA聚合酶，加去离子水至总体积25μl。PCR反应程序：94℃预变性4min；然后94℃变性40s、61℃退火40s、72℃延伸25s，共35个循环；最后72℃延伸7min。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

（2）RFLP检测

PCR产物酶切反应体积是10μl ，其中PCR产物6μl，双蒸水2.7μl，1×buffer Tango 1μl，限制性内切酶MvaІ为0.3μl (10U/μl) ，将样品混匀后离心，37℃培养箱放置6h，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。

利用引物Promoter-SNP-F/Promoter-SNP-R对启动子区域1432(T/C)处建立了MvaІ-PCR-RFLP酶切分型方法，如图2所示，当该位点为C时，电泳时只有一条296bp电泳条带(C等位基因)，而当该位点为T时，是限制性内切酶MvaІ的切点，所以电泳时有266bp和30bp两条带（T等位基因）。

实施例 2 ：分子标记在不同猪群中的多态性分布

在三种地方品种（梅山猪48头、通城猪21头和清平猪22头）和三种外来品种（大白32头、长白35头和杜洛克28头）中进行两处变异的多态性分布检测，结果如表1所示，GYS1启动子区域MvaІ-RFLP多态性分布，在地方品种中T等位基因占主要地位，而在外来品种中C等位基因占主要地位，中外品种中也存在显著差异（表 1）。

表 1 不同猪品种中GYS1基因 MvaI 多态性的基因型和基因频率

实施例 3 ：分子标记在肉质性状中的应用

分析猪GYS1基因MvaI-PFLP不同基因型与猪肉质性状的关联分析和遗传效应估计。用于统计分析的群体包括2000和2003年两批大×梅F2代资源家系，所分析肉质性状主要包括肌内脂肪含量、系水力、失水率、屠宰后45分钟背最长肌PH值、股二头肌PH值、半膜肌pH值、背最长肌肉色值、股二头肌肉色值和大理石纹评分。申请人采用SAS统计软件（SAS Institute Inc, Version 8.0）glm程序进行单标记方差分析，并进行显著性检验，所采用模型为：

Yijkl=μ+Gi +Sk+Yl(+bijklXijkl)+eijkl

Yij为性状表型值，μ为平均值，Gi为基因型效应；Sk、Yl为固定效应，分别为性别、年度效应，bijkl为屠宰体重或屠宰日龄的回归系数，胴体性状以屠宰日龄为协变量；eijkl为残差效应。

表 2 猪 GYS1 基因 Mva І 酶切基因型与肉质性状的关联分析

基因型	No.	pHLD	pHBF	pHSC
					GYS1-MvaІ
CC	125	6.369a ± 0.016	6.421a ± 0.007	6.434a ± 0.007
					TC	144	6.359a ± 0.009	6.420a ± 0.007	6.437a ± 0.006
TT	48	6.329b ± 0.016	6.381b ± 0.012	6.399b ± 0.011
					p-Value		0.1085	0.0148*	0.0091**

相同字母在同一列表示不同基因型之间没有显著性差异，* P<0.05， ^** P<0.01。

基因型检测结果表明：对于MvaI多态位点，在所检测的317头大×梅F2代个体中，CC基因型有125个，TC基因型有144个，TT基因型有48个。在统计的肉质性状中MvaI位点与屠宰后45分钟股二头肌PH值(pHBF)和半膜肌PH值(pHSC)两个性状存在显著和极显著水平（表 2）。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川农业大学

<120> 一种与猪肌肉pH值性状相关的分子标记及其应用

<130> 2014

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 785

<212> DNA

<213> 猪（Sus scrofa）

<400> 1

atcctagcgg aaacggaaac gtgctaggaa cgaggcgttc tgacccctct agtctcccaa 60

gtcctccaag aaatctcggt ggttctttat aaatatgcaa acctctcctg gtggggcgcg 120

gcgtcacttt taaggccccg cctactcgct ggaagatgcg ttcccggagc ttcggggtcc 180

gttccccacg cctcctggct cctcctcctt ttacccaggc ctctttgcta aggcctattg 240

caaaattctt aacacttctt tggggaacca cacgtccccc acgcttcctt tcctccttag 300

ccaccgtctt ccctcccccg cccactttgg ggcttcaagc ttcgtattga cagagctgaa 360

gaccaatcag cggaagcagc ggtaaacccc gcccccccag ctcttcccgc cagccaagga 420

ggtggcgggg atgagcgaac cctacactgt ccaccaatga ggggactcca gagccccgcc 480

cctggacgct gaccaatgac actggcccgg gggcgggcac cgcctcctgg cagccgcaag 540

atttcactgc gggagccccc ctaggctcag tgacgctgcg gccgcctgca gcactggttc 600

tagcgcttcg ggcgggggtg cggtcgtgca ataggaagcc gagggcggtg caagcttcct 660

gtcgggcagc aactacctgg cccagcgccc tgcccagggc attcctcaga caaatcctgg 720

gcccccacct gcggctcccc ggagccctcc tctcgcgtcg gccatgcctc taagccgcac 780

tttgt 785

<210> 2

<211> 296

<212> DNA

<213> 猪（Sus scrofa）

<220>

<221> mutation

<222> (267)..(267)

<400> 2

aggcctcttt gctaaggcct attgcaaaat tcttaacact tctttgggga accacacgtc 60

ccccacgctt cctttcctcc ttagccaccg tcttccctcc cccgcccact ttggggcttc 120

aagcttcgta ttgacagagc tgaagaccaa tcagcggaag cagcggtaaa ccccgccccc 180

ccagctcttc ccgccagcca aggaggtggc ggggatgagc gaaccctaca ctgtccacca 240

atgaggggac tccagagccc cgcccctgga cgctgaccaa tgacactggc ccgggg 296

Claims (5)

1.一种作为分子标记应用的与猪肌肉pH值相关的GYS1基因启动子片段，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所述。

2. 根据权利要求1所述的基因片段，其特征在于：在序列表SEQ ID NO：2所述的第267bp处有一个C267-T267的碱基突变，导致MvaI-PCR-RFLP多态性。

3.检测权利要求1所述遗传标记的正、反向引物的DNA序列如下所示：

Promoter-SNP-F：AGGCCTCTTTGCTAAGGCC；

Promoter-SNP-R：CCCCGGGCCAGTGTCATT。

4.制备如权利要求1或2所述的基因片段的方法，按照以下步骤：

（1）以猪GYS1基因的cDNA为信息探针，在猪基因组数据库做同源序列筛选，获得一个包含猪GYS1基因的一个BAC克隆子，以BAC克隆子序列作模板设计引物，以中国地方猪品种梅山猪的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，PCR产物纯化和克隆测序，获得猪GYS1基因启动子序列；

（2）提取猪基因组DNA，以SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列为模板设计引物，PCR扩增、PCR产物纯化和测序，获得猪GYS1基因启动子部分核苷酸序列，获得如序列表SEQ ID NO：2所述的核苷酸序列。

5.权利要求2所述的遗传标记在猪背最长肌肉PH值、股二头肌肉PH值、半膜肌肉pH值性状关联分析中的应用。