CN110343774A - 一种鉴别贵州地方猪种与大白猪的klf8基因中sv103分子标记及其检测技术 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴别香猪和大白猪的结构变异SV103，其特征在于：SV103位于猪参考基因组Sscrofa 11.1的chrx：48720306‑48720408，SV103缺失基因定为D，正常不缺失的基因定为I。应用本发明所述的检测技术，检测样品的SV103基因型，发现香猪存在两种基因型，则为DD型和II型。而大白猪无纯合缺失型(DD)和杂合缺失型(DI)，只存II型。因此可应用结构变异SV103作为分子标记区分大白猪和中国地方猪品种香猪。

Description

一种鉴别贵州地方猪种与大白猪的KLF8基因中SV103分子标 记及其检测技术

技术领域

本发明涉及动物分子生物学检测领域，具体来说，涉及一种区分香猪和大白猪品种的分子标记和检测技术。

背景技术

香猪是我国特有的小型猪种，早在20世纪70年代末被发现于贵州省都柳江与广西接壤区域的山区，主产区位于贵州省从江县宰便、加鸠两地。从江香猪是我国贵州省从江县特殊的生态环境下，经自然选择和人工选育形成的微型优良的猪种。中国的地方猪种与外国猪种相比，具有生长速度缓慢、出栏率低、屠宰率低和瘦肉率低等特点，因而不能适应养猪业的产业化发展要求，无法满足市场的需求，从而限制了中国猪种的发展。但是随着人们生活水平的提高，部分消费者对猪肉的品质有了更高的要求。“快大型”的外三元不能满足追求高品质肉质消费者的需求，这给我国许多地方猪种带来危机。利用我国地方猪种肉质好的特性通过与外来猪种杂交生产，而导致消费者无法正确的判断是否为高肉质或者纯种猪种，并且还有可能导致纯种的地方猪种走向稀有。

伴随着基因组学和功能基因学的快速发展，分子标记及其检测技术已经发展到了第三代，主要以单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)、表达序列标签(Expressed sequence Tag， EST)、结构变异(structure variation，SV)为主。结构变异SV通常是指获得与缺失变异(PAVs，presence/absence variants)和拷贝数变异(CNVs，copynumber variants)，包括大尺度序列的缺失(deletion)、插入(insertion)、复制(duplications)、倒置(inversion)和易位(translocation)等(Xi R,2010)。在基因组中结构变异的数目远远小于序列多态，一般SNP的数量在百万数量级，而结构变异的数量为十万数量级，二者相差十倍，但结构变异所占的长度总和、影响的基因组序列变化的却远远大于SNP(Conrad, D.F.,2010)，因而，结构变异对基因组和动物性状的影响的权重可能更大。

我们前期应用二代测序技术，测定6头香猪的全基因组序列，与测定的黔北黑猪重测序结果，以及NCBI数据库下载的大白猪重测序数据，共3个猪品种的重测序数据之间进行比较分析，进行全基因组SVs 检测，从中发现了结构变异SV103。基因的表达对细胞正常生长和发育具有重要的调控作用，KLF8基因主要参与基因表达调控、RNA生物合成过程调控和生物合成等过程。KLF8基因编码Sp/KLF家族的一种转录因子，该家族的成员含有C端DNA结合域和三个Kruppel样锌指结构。KLF8基因编码的蛋白质被认为在调节上皮至间充质转变过程中起重要作用，KLF8蛋白能干扰上皮间质转化(epithelial–mesenchymaltransition，EMT)相关蛋白E-cadherin、N-cadherin的表达，阻断 EMT过程，抑制鼻咽癌(CNE1-LMP1)细胞的侵袭性转移(胡文兵，2016)。 KLF8基因可能在癌症的发生、诊断和治疗中起关键作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：一种鉴别贵州地方猪种与大白猪的结构变异KLF8基因中SV103分子标记及其检测技术。

本发明的技术方案是：一种鉴别贵州地方猪种和大白猪的结构变异SV103，位于猪参考基因组Sscrofa11.1的chrx：46186712- 46187032位置，结构变异SV103的三种基因型分别命名为DD、DI和 II型，其中II为插入型基因型、DD为纯合缺失的基因型、DI为杂合缺失的基因型。

用于检测与香猪品种相关的SV320标记的引物对，所述引物对为：正向引物SV103F：CCAATCACCCATGAGAATAATGAC，反向引物 SV103R：CAGCAGTATACAGGTTAAGAGTGCCA。扩增片段的碱基序列分别为SEQ ID No.1，SEQ ID No.2和SEQ ID No.3。

本发明还提供所述结构变异KLF8基因中SV103在不同猪品种群体中的检测方法。

所述检测方法包括以下步骤：

(1)提取香猪的基因组DNA；

(2)以上述香猪基因组DNA为模板，利用所述引物SV103F和SV103R，进行PCR扩增，检测猪基因组SV103的基因型；

(3)根据上述检测结果，如果目的片断全部为纯合型，即纯合确实和纯合正常型，则待测猪为贵州地方猪种；如果此片断只存在纯合正常型，则待测个体为大白猪。

步骤(2)中进行PCR扩增的体系为20μL：2×Taq PCR Master Mix 10μL，10μmol/L上游引物F 0.4μL，10μmol/L下游引物F 0.4μL，ddH₂O 8.2μL，10ng/μL基因组DNA 1μL；进行PCR反应采用的条件： 1)预变性：95.0℃5min；2)扩增反应：变性：95.0℃30sec，退火： 58℃30sec，延伸：72.0℃45sec，35个循环；72.0℃10min，4℃保存。

本发明进一步提供所述结构变异在鉴别贵州猪种和大白猪的检测技术。

所述的应用包括以下步骤：

(1)采用普通PCR技术检测该结构变异在不同猪品种群体中的分布情况；

(2)计算各猪品种中3种基因型在群体中的频率(即纯合缺失型DD、杂合型DI、插入型II样品数分别占总实验样品数的百分比)和等位基因的频率，分析该结构变异在香猪与大白猪品种之间的差异大小。

(3)根据结构变异SV103是否为缺失基因型辅助鉴别大白猪和香猪品种。

在本发明的实施例中，以结构变异SV103位点(chrx： 48720306-48720408)为候选位点，通过PCR技术检测该位点在群体中的结构变异分布情况；本发明检测了结构变异SV103在3个猪品种群体中的分布情况，2个地方猪品种群体的SV103发生缺失(D基因) 的频率明显高于大白猪，且大白猪的D基因频率为0％，结构变异 SV103可作为鉴别地方猪品种的分子标记，为地方猪品种的鉴别和辅助选育提供技术支持。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供的香猪结构变异不受香猪的年龄、性别和饲养环境条件等因素的限制。

(2)本发明建立的检测香猪结构变异SV103的方法准确可靠，操作简便。

(3)本发明所提的结构变异SV103的检测技术，可为鉴别香猪与大白猪的分子标记辅助选育技术奠定理论和技术基础。

附图说明

图1为本发明实施例1中琼脂糖凝胶电泳检测SV103基因型结果，M：DL2000 DNAMarker；1：DD型；2：DI型；3：II型；

图2为本发明实施例2中3个猪品种SV103的等位基因频率。

具体实施方式

以下实例对本发明做进一步的解释，但不限定本发明的范围，若无特别指明，实施例中所用的技术方法和条件均为本领域技术人员所熟知的技术方法和常规实验条件，或按照相关试剂厂商说明书建议的方法和条件。

实施例1为本发明的检测方法，步骤如下：

1、基因组DNA提取

本发明采用购自天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，用于从血液或组织中提取基因组DNA，具体方法如下：

(1)实验样本预处理

a.血液样品

取300μL新鲜或-80℃保存的血液加到1.5mL的无菌EP管中，不足 300μL用GA缓冲液补足体积。

b.组织样品

取出-80℃冰箱中保存的组织样品，剪取50mg，彻底剪碎，转移到无菌的1.5mL EP管中，加入200μL的GA缓冲液，充分悬浮组织颗粒。向离心管中加入4μL RNaseA(100mg/mL)溶液，用漩涡振荡器充分振荡15sec，便于酶与溶液充分混匀，为去除样品中RNA污染，将样品放置在室温下静置5min，将离心管进行瞬时离心。

(2)向离心管中加入20μL Proteinase K，充分震荡混匀。

a.血液样品基因组提取时，直接进行步骤4。

b.耳组织样品基因组提取时，56℃水浴使样品中组织碎块彻底溶解，瞬时离心。

(3)再次向离心管中加入200μL GB缓冲液,漩涡振荡器充分混匀，将EP管置于70℃水浴锅中，恒温水浴10min，直至EP管中溶液变清亮，瞬时离心。

(4)再次向EP管中加入200μL无水乙醇，颠倒使溶液混匀，此时EP 管中可能会出现白色絮状沉淀，将EP管进行短暂离心。

(5)将上述步骤获得的溶液和絮状沉淀全部转移到吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rmp离心1min，倒掉废液。将吸附柱CB3 重新放回收集管中。

(6)向吸附柱CB3中加入500μL事先加入无水乙醇的缓冲液GD，静置2min，12000rmp离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3重新放回收集管中。

(7)向吸附柱CB3中加入600μL加入无水乙醇的漂洗液PW，静置2 min，12000rmp离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3重新放回收集管中。

(8)重复操作步骤(8)一次。

(9)将上一步获得的吸附柱CB3和收集管，12000rmp离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3盖子打开，置于干净的白纸上室温放置数分钟，去除吸附材料中残留的漂洗液，以免影响后续实验。

(10)将彻底晾干的吸附柱CB3转入一个1.5mL无菌EP管中，向吸附膜中央悬空滴加200μL的洗脱缓冲液TE，室温静置3min,12000 rmp离心2min，基因组DNA于1.5mL离心管中。

可将离心收集的溶液再次加入到吸附柱CB3中，12000rpm离心2min，重新收集DNA溶液，以提高基因组DNA的得率。获得基因组DNA可直接用于下一步实验或置于-20℃保存。

2.目标序列及参考序列的扩增

根据NCBI数据库登录的该区域的序列设计引物，所述引物对为：正向引物SV103F：GAGTGTATGTCTTTCGTCTCTTTGATTA，反向引物 SV103R:CAGAGAATAAGAATAGGATGCCCA。目的片段分别为489bp和387bp。以20μL计：步骤(2)中进行PCR扩增的体系为20μL：2×Taq PCRMaster Mix 10μL，10μmol/L上游引物F 0.4μL，10μmol/L下游引物F 0.4μL，ddH₂O 8.2μL，10ng/μL基因组DNA 1μL；进行PCR 反应采用的条件：1)预变性：95.0℃5min；2)扩增反应：变性： 95.0℃30sec，退火：58℃30sec，延伸：72.0℃45sec，35个循环； 72.0℃10min，4℃保存。

本试剂盒所包含的引物符合PCR扩增要求，扩增效果稳定、特异性强，PCR扩增结果可准确反应基因组中目标序列的结构变异情况。

3.琼脂糖凝胶电泳检测

电泳检测选用0.7％的琼脂糖凝胶。点样时，用微量加样器将PCR 产物5μL，加入点样孔中，同时加入D2000 DNA Marker 0.3μL对参照，设置电压为120V，时间为30min。电泳完成后，在凝胶成像系统中观察结果，并做好图像的保存。

每个基因组，以引物F1、R1组合进行PCR检测。若扩增出单条带且大小为387bp，将基因型定义为DD型；若扩增两条带，一条带大小为489bp而另一条带为387bp，则基因型定义为DI型；若扩增出单条带而且大小为489bp，将基因型定义为II型(图1)。

4.Sanger测序

为了获得精确的SV103的断点信息，我们通过Sanger测序技术对扩增片段进行序列测定，将序列信息与猪参考基因组序列(ref. Sscrofa11.1)进行同源比对分析，确定SV103区域的精确断点位置和基因组定位。

实施例2分子标记SV103的应用按照实施例1的方法，以猪基因组区域结构变异位点(chrx： 48720306-48720408)为候选位点，利用PCR技术检测该结构变异的基因型在3个猪品种群体中的分布情况，142头香猪耳组织采自贵州省从江县香猪养殖场和清镇市香猪养殖基地，35头大白猪血样和34 头黔北黑猪血样。以SV103候选区域，应用本发明建立检测技术分析群体中的结构变异SV103的分布频率，结果显示香猪群体中存在 SV103变异。

表1三个猪品种KLF8-I6-sv103位点基因分型

应用本发明建立的检测技术可检测待测个体基因组中结构变异 SV103的基因型，不受香猪的年龄、性别、营养和环境等因素的限制，且操作简便，结果准确。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域的技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

SEQ ID No.1：

<110> 贵州大学

<120> 一种鉴别贵州地方猪种与大白猪的结构变异KLF8基因中SV103分子标记及其检测技术

<210> 1

<211> 489 bp

<212> DNA

<213>香猪SV103区段正常

<400> 1

GAGTGTATGTCTTTCGTCTCTTTGATTAAGTTTATTCCTAGTTATTTTATTCTTTTTCAT 60

GTGATTATAAAATGGTATGATTTCCTTAACTTATATTTCTGCCCATTCTTTATTAGTGTG 120

TACAAAATCTACACTTTTATATATGTTAATCTTATATTCTGTAACTTTACTGAAATCATT 180

TATCAGTTCTAATAGTTTTTTGGTGGAGACTTCAGGGATATATATATATATATCTATATA 240

TATCTATATCTATATATATATATCTATATATATATCTATATATATATCTATATATATATA 300

TCTATATATATAGATATATATAGATATATATATATCATGTCATTTGCAAATAGTGCCAGT 360

TTTACTTCTTCCCTTCTAATTTGGATGCCTTTTACTTCTTTTTTTTTCTTGTTTAACTAC 420

TATAACAAAAATTTCCAATACTTTGTTGAATAAAAATGGCAATAGTGGGCATCCTATTCT 480

TATTCTCTG

SEQ ID No.2：

<210> 2

<211> 387

<212> DNA

<213>香猪SV103区段缺失

<400> 2

GAGTGTATGTCTTTCGTCTCTTTGATTAAGTTTATTCCTAGTTATTTTATTCTTTTTCAT 60

GTGATTATAAAATGGTATGATTTCCTTAACTTATATTTCTGCCCATTCTTTATTAGTGTG 120

TACAAAATCTACACTTTTATATATGTTAATCTTATATTCTGTAACTTTACTGAAATCATT 180

TATCAGTTCTAATAGTTTTTTGGTGGAGACTTCAGGGATAATATATATATATCATGTCAT 240

TTGCAAATAGTGCCAGTTTTACTTCTTCCCTTCTAATTTGGATGCCTTTTACTTCTTTTT 300

TTTTCTTGTTTAACTACTATAACAAAAATTTCCAATACTTTGTTGAATAAAAATGGCAAT 360

AGTGGGCATCCTATTCTTATTCTCTG

SEQ ID No.3：

<210> 3

<211>103

<212> DNA

<213>香猪SV103缺失片段的核苷酸序列

<400> 3

TATATATATATATCTATATATATCTATATCTATATATATATATCTATATATATATCTATA 60

TATATATCTATATATATATATCTATATATATAGATATATATAG

Claims (5)

1.一种鉴别贵州地方猪种与大白猪的结构变异KLF8基因中SV103分子标记，其特征在于：所述的SV103分子标记是指猪基因组中Sscrofa11.1的候选区域chrx：48720306-48720408，该区域缺失结构变异103bp片段，或不缺失。

2.根据权利要求1所述的一种鉴别贵州地方猪种与大白猪的结构变异KLF8基因中SV103分子标记，其特征在于：所述的SV103分子标记的引物对为正向引物SV103F：GAGTGTATGTCTTTCGTCTCTTTGATTA，反向引物SV103R：CAGAGAATAAGAATAGGATGCCCA。

3.如权利要求1或2所述的SV103分子标记的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)提取待测样品的基因组DNA；(2)以基因组DNA为模板，利用引物R和F，进行PCR扩增；(3)0.7％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，凝胶成像系统记录条带并判断基因型。

4.根据权利要求3所述的SV103分子标记的检测方法，其特征在于：步骤(2)中进行PCR扩增的体系为20μL：2×Taq PCR Master Mix 10μL，10μmol/L上游引物F 0.4μL，10μmol/L下游引物F 0.4μL，ddH₂O 8.2μL，10ng/μL基因组DNA 1μL；进行PCR反应采用的条件：1)预变性：95.0℃5min；2)扩增反应：变性：95.0℃30sec，退火：58℃30sec，延伸：72.0℃45sec，35个循环；72.0℃10min，4℃保存。

5.如权利要求1或2所述的一种鉴别贵州地方猪种与大白猪的结构变异KLF8基因中SV103分子标记的应用方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)采用普通PCR技术检测该结构变异在不同猪品种群体中的分布情况；

(2)计算各猪品种中3种基因型在群体中的频率和等位基因的频率，分析该结构变异在香猪与大白猪品种之间的差异大小，

(3)根据结构变异SV103是否为缺失基因型辅助区分大白猪和香猪品种。