CN109234404A

CN109234404A - 一种鉴定绵羊产肉性状的方法及专用引物

Info

Publication number: CN109234404A
Application number: CN201811171227.7A
Authority: CN
Inventors: 胡圣伟; 倪伟; 张翔宇; 李村院; 李晓悦
Original assignee: Shihezi University
Current assignee: Shihezi University
Priority date: 2018-10-09
Filing date: 2018-10-09
Publication date: 2019-01-18
Anticipated expiration: 2038-10-09
Also published as: CN109234404B

Abstract

本发明公开了一种辅助鉴定绵羊产肉相关性状的方法及应用。本发明提供了一种辅助鉴定绵羊产肉相关性状的方法，具体步骤为：采用特定引物对对待测绵羊基因组DNA进行PCR扩增，利用DNA测序与不对称PCR‑SSCP技术进行DNA多态性检测及快速分型，检测PCR扩增所得产物的自5’末端起第209位核苷酸为A或G，确定待测绵羊的基因型为GG或AA，该SNP位点与绵羊产肉相关性状之间存在一定的相关性，GG基因型的绵羊的产肉性能高于AA基因型的绵羊的产肉性能。利用本发明可以对绵羊产肉进行早期筛选，有效增加养殖绵羊的产肉量，降低育种花费，提高养殖绵羊经济效益。本发明的方法操作简单，成本较低，准确度较高，将对绵羊的育种具有重要意义。

Description

一种鉴定绵羊产肉性状的方法及专用引物

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种辅助鉴定绵羊产肉相关性状的方法及应用。

背景技术

绵羊在农业生产和人们生活中都占有重要地位，是重要的家畜动物。多年来，我国绵羊和山羊数量,羊肉、羊皮、羊肠衣及山羊绒等生产量均居世界第1位。同时，国内羊肉价格始终高于猪肉、牛肉和鸡肉，而且一路攀升。随着人们生活水平的提高，餐桌上肉的种类也不断增多，人们已不简单地满足于猪肉等脂肪含量高、胆固醇含量高的肉类。绵羊肉的蛋白质和必需氨基酸含量高于猪肉、鸡肉和牛肉，脂肪含量低于猪肉，胆固醇含量低于所有肉类，是一种渐受青睐的健康肉类。我国对羊肉的大规模需求以及良好的价格形势使我国肉羊生产继续保持稳步增长的态势，总体来看，近年来我国肉羊养殖效益比较稳定，肉羊生产具备巨大的潜力。由于我国良种覆盖率低，导致羊肉的生产能力下降以至于每年仍需花费大量的外汇从国外进口羊肉。肉羊良种覆盖率约仅为55％,而国外养羊业发达国家多在75％以上。个体平均产肉量仅及世界平均水平的1/3,人均年消费羊肉量为1.2㎏,低于世界平均水平。肉羊养殖业在美国、澳大利亚和新西兰等国家发展很快，羊肉已经从数量型增长转向质量型增长，主要以生产瘦肉率高、脂肪含量少的优质羊肉，特别是羔羊肉为主。虽然我国是世界养羊大国，但是我国不是养羊强国，因此，我国羊肉的生产能力有待提高。

骨骼肌的生长发育是一个复杂且长期的生物学过程，同时也有多种基因进行调控。近年来，研究调控骨骼肌的基因已经成为分子生物学领域的一个热点，备受科学家的关注。通过大量的研究发现，在肌肉中富含相当数量一系列的miRNA，这些miRNA也被称作myomiRs(McCarthy JJ.The MyomiR network in skeletal muscle plasticity.2011,39(3):150-154.)。近几年有研究鉴定发现,miR-1,miR-133a,miR-133b,miR-206,miR-208,miR-208b,miR-486and miR-499都是myomiRs(McCarthy JJ et al.MicroRNA-1andmicroRNA-133a expression are decreased during skeletal musclehypertrophy.2007,102(1):306-313；Nielsen S et al.Muscle specific microRNAs areregulated by enduranceexercise in human skeletal muscle.2010,588(Pt 20):4029-4037.)。由此可见，miRNA在骨骼肌的发育过程中起到十分重要的调控作用。

miR-1是肌肉特异的一种miRNA，对于骨骼肌来说，miR-1通过HDAC4作为靶基因促进成肌细胞的发生(myogenesis)，对调控骨骼肌增殖与分化起了非常重要的作用。(ChenJF et al.The role of microRNA-1and microRNA-133in skeletal muscleproliferation and differentiation.2006,38(2):228-233.)科学家在对果蝇的研究中发现，miR-1是生存相关的重要基因，miR-1突变体的幼虫肌肉组织呈现萎缩状态，而且运动减少直至死亡(Ambros V et al.Heterochronic mutants of the nematodeCaenorhabditis eiegants，1984,226:409-416.)。

有鉴于此，研究绵羊骨骼肌生长发育的调控机制，更好的服务于优良产肉型绵羊品种的选育，从而提高肉羊的胴体重，提高我国肉羊生产的整体水平，具有十分重要的研究意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与绵羊产肉相关的SNP位点，并提供了一种利用该SNP位点用于鉴定或辅助鉴定待测绵羊的产肉相关性状的试剂，从而利用该SNP位点用于绵羊辅助育种。

本发明中SNP位点位于绵羊基因组4.0版本参考序列13号染色体上第53971777位核苷酸位点A>G突变(记为g.53971777A>G)。该位点的应用具体可为如下中的任一种：(1)绵羊基因组PCR扩增所得产物的自5’末端起第209位核苷酸的单核苷酸多态性在鉴定或辅助鉴定待测绵羊的产肉相关性状中的应用；(2)用于检测绵羊基因组PCR扩增所得产物的自5’末端起第209位核苷酸的单核苷酸多态性的物质在鉴定或辅助鉴定待测绵羊的产肉相关性状中的应用。

本发明所提供的用于鉴定待测绵羊的产肉相关性状的试剂，是用于检测绵羊基因组中13号染色体上第53971777位核苷酸位点(g.53971777A>G)的单核苷酸多态性的引物；该引物由序列表中序列1所示的单链DNA和序列表中序列2所示的单链DNA组成的特异引物对。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测绵羊的产肉相关性状的方法，具体可包括如下步骤：采用特定引物对对待测绵羊基因组DNA进行PCR扩增，通过DNA测序与不对称PCR-SSCP技术进行多态性检测及快速分型，检测PCR扩增所得产物的自5’末端起第209位核苷酸(即绵羊基因组4.0版本参考序列13号染色体上第53971777位核苷酸)为A还是G，确定待测绵羊的基因型为GG还是AA。根据所述待测绵羊的基因组按照如下确定待测的产肉相关性状：GG基因型的待测绵羊的产肉量高于AA基因型的待测绵羊；

进一步的，所述GG基因型为绵羊基因组中13号染色体上第53971777位核苷酸位点为G的纯合型；所述AA基因型为绵羊基因组中13号染色体上第53971777位核苷酸位点为A的纯合型；所述检测待测绵羊的基因组中13号染色体上第53971777位核苷酸为A还是G的方法具体可为测序分析。所述测序分析包括PCR扩增和对PCR扩增产物进行测序两个步骤；所述PCR扩增所用的引物对需满足以下条件：以待测绵羊的基因组DNA为模板进行PCR扩增所得扩增产物含有绵羊基因组中13号染色体上第53971777位核苷酸。当采用所述引物对进行PCR扩增时，根据待测绵羊的基因组DNA不同，扩增得到的DNA片段为序列表中序列3所示的DNA片段或序列表中序列4所示的DNA片段。

进一步的，所述引物或所述方法在绵羊育种中的应用也属于本发明的保护范围。

在本发明中，所述绵羊为萨福克绵羊和湖羊。

本发明提供的方法可对待选绵羊进行早期筛选，有效的缓解实际生产中的选优良种羊时间长的问题，降低育种费用，有效增加实际生产中的绵羊的产肉量，提高经济效益。本发明的检测方法操作简单，费用低，准确度高，在绵羊的育种方面具有很高的应用价值。

附图说明

图1为GG基因型个体(对应序列3)和AA基因型个体(对应序列4)绵羊miR-1前体基因g.53971777A>G多态性位点附近序列的测序结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细叙述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试剂、材料，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的萨福克羊属于国外引进肉羊品种，公众可从全国各地获得，该生物材料只为本发明的相关实验所用，不可作为其它用途。

下述实施例中的湖羊公众可从新疆昌吉州玛纳斯县新澳畜牧有限责任公司获得，也可从其他地方获得，该生物材料只为本发明的相关实验所用，不可作为其它用途。

实施例1SNP位点的确定

1.实验材料选取

采集湖羊的肌肉组织40份，39份萨福克羊(新疆昌吉州玛纳斯县新澳畜牧有限责任公司)的肌肉组织，并分别提取基因组DNA，将每份样品的DNA浓度均调为100ng/μL，共得到40份湖羊DNA样品，39份萨福克羊DNA样品，-80℃保存备用。

2、引物的设计与合成

由于绵羊miR-1基因的成熟序列还未公布，故从miRBase数据库(http://www.mirbase.org/)调取牛miR-1基因的成熟序列(MIMAT0009214，ID：bta-miR-1)，并与NCBI绵羊基因组数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行比对，并截取左右侧翼各200bp序列，设计一对引物(引物组合)，用来克隆绵羊miR-1前体基因，该引物组合的序列如下所示：

U(上游引物)：5’-ATGCCCGCTGGACTACCT-3’；

D(下游引物)：5’-GCAAAGTGACAGAACAATACCG-3’。

3、混合池样品的制备

分别选取以步骤1得到的萨福克绵羊和湖羊的基因组DNA样本各10个进行等体积混合，-20℃保存备用。

4、PCR扩增

分别以步骤3得到的绵羊基因组DNA混合池样本为模板，以U和D为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增体系：模板DNA100ng 1μL，2X Taq PCR MasterMix 10μL，上、下游引物各0.5μL(10pmol)，用ddH₂O补足体系至20μL。PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸50s，共30个循环；最后72℃延伸10min，用1％琼脂糖凝胶电泳检测。

5、PCR产物的纯化

在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管中，然后用PCR产物纯化试剂盒(TaKaRa，货号：9761，按该试剂盒的说明书操作)纯化PCR产物，所得纯化PCR产物与-20℃保存备用。

6、PCR产物的序列测定

序列测定由北京睿博兴科生物技术有限公司完成。测序结果表明，PCR产物序列只存在一个脱氧核糖核苷酸的差异(A/G)，此脱氧核糖核苷酸为PCR扩增所得的扩增产物的自5’末端起第209位核苷酸，即绵羊基因组4.0版本参考序列13号染色体上第5397177位，因此将该位点命名为g.53971777A>G。

实施案例2miR-1前体基因不对称PCR-SSCP检测方法的建立

1、PCR扩增

分别以步骤1得到的待测绵羊的基因组DNA为模板，以U和D为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增体系：100ng的基因组DNA1μL，2×Taq PCR MasterMix 10μL，正向引物0.5μL(浓度为10μmol/L)，反向引物0.5μL(浓度为10μmol/L)，加ddH2O至20μL。PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸50s，共30个循环；最后72℃延伸10min，用1％琼脂糖凝胶电泳检测。

2、不对称PCR扩增条件

采用二次PCR方法，即先用等浓度的引物进行第一次PCR扩增，扩增出目的片段的双链(dsDNA)，再以此PCR产物为模板，利用其中的一条引物与另一条引物添加的比例不同进行第二次PCR扩增，扩增出目的片段的单链(ssDNA)。第二次PCR扩增反应体系也为20μL，其中2×Taq PCR MasterMix 10μL，上下游引物(前引物的浓度与第一次PCR一样，与后引物浓度比例为100：1)各0.5μL，模板为第一次PCR扩增产物1μL，加ddH2O至20μL。PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸50s，共30个循环；最后72℃延伸10min。

3、扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

取4μL扩增的单链DNA，与3μL上样缓冲液混合，经10％非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE10％,Acr：Bis＝39：:1)电泳进行分型鉴定，电泳条件：4℃条件下300V电压预电泳，15min左右。然后120V过夜电泳12h左右终止电泳。凝胶经固定、银染、显色并拍照，然后根据不同的带型对各样品进行分型鉴定。结果表明，PCR扩增产物显示三种不同的带型。

4、测序及序列分析

挑选不同带型的PCR扩增产物，经回收纯化后进行测序，以确定突变位点及序列。测序结果表明，PCR产物序列只存在一个脱氧核糖核苷酸的差异(A/G)，均为序列3和序列4中自5’末端起第209位核苷酸，该处的碱基在序列3中为G，在序列4中为A，如图1中箭头所示，该位点为绵羊基因组4.0版本参考序列13号染色体上自5’末端第53971777个核苷酸位点，因此将该位点命名为g.53971777A>G。

将在绵羊基因组4.0版本参考序列13号染色体上自5’末端第53971777个核苷酸位点(即步骤1得到的PCR产物自5’末端起第209位核苷酸)为A的纯合个体的基因型命名为AA；将在绵羊基因组4.0版本参考序列13号染色体上自5’末端第53971777个核苷酸位点(即步骤1得到的PCR产物自5’末端起第209位核苷酸)为G的纯合个体的基因型命名为GG；将在绵羊基因组4.0版本参考序列13号染色体上自5’末端第53971777个核苷酸位点(即步骤1得到的PCR产物自5’末端起第209位核苷酸)为A和G的杂合个体的基因型命名为AG。

实施案例3绵羊miR-1前体基因g.53971777A>G多态性位点与绵羊的产肉相关性状的关联性分析

为确定g.53971777A>G多态性位点与绵羊产肉量是否相关，以40只萨福克绵羊和39只湖羊为实验材料，确定其基因型，并进行基因突变位点与产肉量的关联分析。采用SPSS13.0软件计算绵羊miR-1前体基因g.53971777A>G多态性位点在群体中的基因型及等位基因频率，并使用卡方检验分析各群体中基因型是否处于Hardy-Weinberg平衡。结果如表1所示。

miR-1基因该SNP位点基因频率与基因型频率在各绵羊品种中的分布及Hardy-Weinberg平衡

注：括号内为不同基因型或等位基因的个体数。

等位基因A与等位基因G在群体中的分布情况见表1，基因型检测结果表明，39只萨福克羊中，29只萨福克羊的基因型为GG基因型，1只萨福克羊为AG基因型，9只萨福克羊为AA基因型，GG基因型频率为0.74，AG基因型频率为0.03，AA基因型频率为0.23；40只湖羊中，17只湖羊的基因型为GG基因型，23只湖羊为AG基因型，没有检测到AA基因型，GG基因型频率为0.425，AG基因型频率为0.575，在湖羊群体中没有检测到AA基因型。本实验所用的萨福克羊是从国外引进的优良肉羊品种，G等位基因频率达到0.76％，是A等位基因频率的3.17倍。湖羊是我国地方品种，产肉性能方面不及萨福克羊，但是，由于湖羊群体可能受到杂交改良与选育的影响，因此在湖羊群体中野生纯合AA基因型未检测到，GG基因型向优势基因型进行过渡。由表1可以看出，在产肉性能高的绵羊群体中，GG基因型为优势基因型，G等位基因为优势等位基因。

综上所述，在实际的绵羊选育中，为获得产肉量更高的绵羊，最好选择GG基因型的绵羊进行选育。

<110> 石河子大学

<120> 一种鉴定绵羊产肉性状的方法及专用引物

<160> 4

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

atgcccgctggactacct 18

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

gcaaagtgacagaacaataccg 22

<210> 3

<211> 254

<212> DNA

<213> 绵羊（Ovis aries）

<220>

<223>

<400> 3

atgcccgctg gactacctgc ttgggaaaca tacttcttta tgtgcccata tggacctgct 60

aagctatgga atgtaaagaa gtatgtattt caggtcggga actctctcgc tggaggaagg 120

gggcagcgcg cccacggggc cgcccagggg acggacagac agacgggcgg ctgtggccgg 180

ccgggcctcc gtggcaggct gcctgggcgt cggtggccgg cctgtccccg gccggtattg 240

ttctgtcact ttgc 254

<210> 4

<211> 254

<212> DNA

<213> 绵羊（Ovis aries）

<220>

<223>

<400> 4

atgcccgctg gactacctgc ttgggaaaca tacttcttta tgtgcccata tggacctgct 60

aagctatgga atgtaaagaa gtatgtattt caggtcggga actctctcgc tggaggaagg 120

gggcagcgcg cccacggggc cgcccagggg acggacagac agacgggcgg ctgtggccgg 180

ccgggcctcc gtggcaggct gcctgggcat cggtggccgg cctgtccccg gccggtattg 240

ttctgtcact ttgc 254

Claims

1.一种鉴定绵羊产肉性状的方法，包括如下步骤：

a)采用特定引物对对待测绵羊基因组DNA进行PCR扩增，通过DNA测序与不对称PCR-SSCP技术进行多态性检测及快速分型，检测PCR扩增所得产物的自5’末端起第209位核苷酸即绵羊基因组4.0版本参考序列13号染色体上第53971777位核苷酸为A或G，确定待测绵羊的基因型为GG或AA；

b)根据所述待测绵羊的基因组按照如下确定待测的产肉相关性状：GG基因型的待测绵羊的产肉量高于AA基因型的待测绵羊；

所述GG基因型为绵羊基因组中13号染色体上第53971777位核苷酸位点为G的纯合型；

所述AA基因型为绵羊基因组中13号染色体上第53971777位核苷酸位点为A的纯合型。

2.根据权利要求1所述的鉴定绵羊产肉性状的方法，其特征在于：所述确定待测绵羊的基因组中13号染色体上第53971777位核苷酸位点为A还是G的方法为测序分析，所述测序分析包括PCR扩增和对PCR扩增产物进行测序两个步骤；所述PCR扩增所用的引物对需满足以下条件：以待测绵羊的基因组DNA为模板进行PCR扩增所得扩增产物含有绵羊基因组中13号染色体上第53971777位核苷酸。

3.根据权利要求1所述的鉴定绵羊产肉性状的方法，其特征在于：所述PCR扩增所用的引物对具体为由序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对，

序列1：5’-ATGCCCGCTGGACTACCT-3’

序列2：5’-GCAAAGTGACAGAACAATACCG-3’。

4.根据权利要求1所述的鉴定绵羊产肉性状的方法，其特征在于：所述待测绵羊为萨福克羊和湖羊。

5.权利要求1所述的鉴定绵羊产肉性状的方法在绵羊的育种中应用。

6.权利要求1所述的鉴定绵羊产肉性状的方法在选育具有高产肉性状的绵羊中的应用，包括如下步骤：检测待测绵羊的基因组中13号染色体上第53971777位核苷酸为A或G，若为G，则将待测绵羊的基因型记为GG；选取基因型为GG的待测绵羊进行育种。

7.一种用于鉴定绵羊产肉性状时扩增使用的引物，其特征在于：

U(上游引物)：5’-ATGCCCGCTGGACTACCT-3’；

D(下游引物)：5’-GCAAAGTGACAGAACAATACCG-3’。