CN110343772A

CN110343772A - 一种鉴别香猪与大白猪的结构变异smc1a基因中sv320分子标记及其检测技术

Info

Publication number: CN110343772A
Application number: CN201910819953.3A
Authority: CN
Inventors: 冉雪琴; 王嘉福; 李升�; 李大鹏
Original assignee: Guizhou University
Current assignee: Guizhou University
Priority date: 2019-08-31
Filing date: 2019-08-31
Publication date: 2019-10-18

Abstract

本发明公开了一种鉴别香猪和大白猪的结构变异SV320，其特征在于：SV320位于猪参考基因组Sscrofa 11.1的chrx：46186712‑46187032，SV320缺失基因定为D，正常不缺失的基因定为I。应用本发明所述的检测技术，检测样品的SV320基因型，发现香猪只存在一种基因型，则为DD型，等为基因频率D为100％，对于大白猪无纯合缺失型(DD)，只存在DI和II型，以II型为主。因此可应用结构变异SV320作为分子标记区分大白猪和中国地方猪品种香猪。

Description

一种鉴别香猪与大白猪的结构变异SMC1A基因中SV320分子标记及其检测技术

技术领域

本发明涉及动物分子生物学检测领域，具体来说，涉及一种区分香猪和大白猪品种的分子标记和检测技术。

背景技术

香猪是我国特有的小型猪种，早在20世纪70年代末被发现于贵州省都柳江与广西接壤区域的山区，主产区位于贵州省从江县宰便、加鸠两地。香猪屠宰时，二月龄断奶的乳猪无乳腥气味；出栏肥猪宰杀开膛，腹腔无腥臭味，煮熟后猪肉肉香浓郁。1993年，从江香猪被农业部列为国家二级珍贵保护畜种；1995年，在北京召开的“百家中国特产之乡”大会上，贵州省从江县被命名为“中国香猪之乡”；2006年，从江香猪被列入农业部《国家级畜禽遗传资源保护名录》(申学林等，2007)。近年来，随着人们生活水平的提高，人们对肉类的消费理念也在发生转变，从肉类消费量的增长，转变成追求肉类的品质，相应地，现代生猪养殖行业从个体户养殖、转变成规模化养殖，目前正向特色、优质猪的养殖转变，因此养殖业对猪品种的关注度日渐提高，特别是具有优良肉质的地方猪种成为学术界关注的焦点。

伴随着基因组学和功能基因学的快速发展，分子标记及其检测技术已经发展到了第三代，主要以单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)、表达序列标签(Expressed sequence Tag，EST)、结构变异(structure variation，SV)为主。结构变异SV通常是指获得与缺失变异(PAVs，presence/absence variants)和拷贝数变异(CNVs，copynumber variants)，包括大尺度序列的缺失(deletion)、插入(insertion)、复制(duplications)、倒置(inversion)和易位(translocation)等(Xi R,2010)。在基因组中结构变异的数目远远小于序列多态，一般SNP的数量在百万数量级，而结构变异的数量为十万数量级，二者相差十倍，但结构变异所占的长度总和、影响的基因组序列变化的却远远大于SNP(Conrad,D.F.,2010)，因而，结构变异对基因组和动物性状的影响的权重可能更大。

我们前期应用二代测序技术，测定6头香猪的全基因组序列，与我们测定的黔北黑猪重测序结果，以及NCBI数据库下载的大白猪重测序数据，共3个猪品种的重测序数据之间进行比较分析，进行全基因组SVs检测，从中发现了结构变异SV320。基因的表达对细胞正常生长和发育具有重要的调控作用，如基因GCIP(Guanylyl cyclase inhibitory protein-like)对细胞周期蛋白cyclinD1的启动子具有抑制作用，从而抑制周期蛋白的转录活性、抑制癌细胞的发生(罗剑，2007)；染色体基因RPL10(Ribosomal protein L10)对细胞的增值和存活具有重要的调控作用，基因沉默导致精子发生异常。X染色体中锌指蛋白基因失活可能与卵巢早衰发生有关(吴星，2006)。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：一种鉴别香猪与大白猪的结构变异SMC1A基因中SV320分子标记及其检测技术。

本发明的技术方案是：一种鉴别香猪和大白猪的结构变异SV320，位于猪参考基因组Sscrofa11.1的chrx：46186712-46187032位置，结构变异SV320的三种基因型分别命名为DD、DI和II型，其中II为插入型基因型、DD为纯合缺失的基因型、DI为杂合缺失的基因型。

用于检测与香猪品种相关的SV320标记的引物对，所述引物对为：正向引物SV320F：CCAATCACCCATGAGAATAATGAC，反向引物SV320R：CAGCAGTATACAGGTTAAGAGTGCCA。扩增片段的碱基序列分别为SEQ ID No.1，SEQ ID No.2和SEQ ID No.3。

本发明还提供所述结构变异SV320在不同猪品种群体中的检测方法。

所述检测方法包括以下步骤：

(1)提取香猪的基因组DNA；

(2)以上述香猪基因组DNA为模板，利用所述引物SV320F和SV320R，进行PCR扩增，检测猪基因组SV320的基因型；

(3)根据上述检测结果，如果目的片断纯合缺失，则待测猪为香猪；如果此片断不纯合缺失，则待测个体为大白猪。

步骤(2)中进行PCR所用的扩增体系以20μL为例：

PCR反应条件为：

本发明进一步提供所述结构变异在鉴别香猪和大白猪的检测技术。

所述的应用包括以下步骤：

(1)采用普通PCR技术检测该结构变异在不同猪品种群体中的分布情况；

(2)计算各猪品种中3种基因型在群体中的频率(即纯合缺失型DD、杂合型DI、插入型II样品数分别占总实验样品数的百分比)和等位基因的频率，分析该结构变异在香猪与大白猪品种之间的差异大小。

(3)根据结构变异SV320是否为缺失基因型辅助鉴别大白猪和香猪品种。

在本发明的实施例中，以结构变异SV320位点(chrx：46186712-46187032)为候选位点，通过PCR技术检测该位点在群体中的结构变异分布情况；如果待测个体SV320区段全部缺失(DD)，则待测猪种为香猪，如果待测个体SV320区段(DD)基因型出现率为0％,则待测猪种为大白猪。该结构变异位点的检出，为鉴别香猪和大白猪提供理论基础。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供的香猪结构变异不受香猪的年龄、性别和饲养环境条件等因素的限制。

(2)本发明建立的检测香猪结构变异SV320的方法准确可靠，操作简便。

(3)本发明所提的结构变异SV320的检测技术，可为鉴别香猪与大白猪的分子标记辅助选育技术奠定理论和技术基础。

附图说明

图1为本发明实施例1中琼脂糖凝胶电泳检测SV320基因型结果，M：DL2000 DNAMarker；1：DD型；2：DI型；3：II型；

图2为本发明实施例2中3个猪品种SV320的等位基因频率。

具体实施方式

以下实例对本发明做进一步的解释，但不限定本发明的范围，若无特别指明，实施例中所用的技术方法和条件均为本领域技术人员所熟知的技术方法和常规实验条件，或按照相关试剂厂商说明书建议的方法和条件。

实施例1为本发明的检测方法，步骤如下：

1、基因组DNA提取

本发明采用购自天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，用于从血液或组织中提取基因组DNA，具体方法如下：

(1)实验样本预处理

a.血液样品

取300μL新鲜或-80℃保存的血液加到1.5mL的无菌EP管中，不足300μL用GA缓冲液补足体积。

b.组织样品

取出-80℃冰箱中保存的组织样品，剪取50mg，彻底剪碎，转移到无菌的1.5mL EP管中，加入200μL的GA缓冲液，充分悬浮组织颗粒。

向离心管中加入4μL RNaseA(100mg/mL)溶液，用漩涡振荡器充分振荡15sec，便于酶与溶液充分混匀，为去除样品中RNA污染，将样品放置在室温下静置5min，将离心管进行瞬时离心。

(2)向离心管中加入20μL ProteinaseK，充分震荡混匀。

a.血液样品基因组提取时，直接进行步骤4。

b.耳组织样品基因组提取时，56℃水浴使样品中组织碎块彻底溶解，瞬时离心。

(3)再次向离心管中加入200μL GB缓冲液,漩涡振荡器充分混匀，将EP管置于70℃水浴锅中，恒温水浴10min，直至EP管中溶液变清亮，瞬时离心。

(4)再次向EP管中加入200μL无水乙醇，颠倒使溶液混匀，此时EP管中可能会出现白色絮状沉淀，将EP管进行短暂离心。

(5)将上述步骤获得的溶液和絮状沉淀全部转移到吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rmp离心1min，倒掉废液。将吸附柱CB3重新放回收集管中。

(6)向吸附柱CB3中加入500μL事先加入无水乙醇的缓冲液GD，静置2min，12000rmp离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3重新放回收集管中。

(7)向吸附柱CB3中加入600μL加入无水乙醇的漂洗液PW，静置2min，12000rmp离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3重新放回收集管中。

(8)重复操作步骤(8)一次。

(9)将上一步获得的吸附柱CB3和收集管，12000rmp离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3盖子打开，置于干净的白纸上室温放置数分钟，去除吸附材料中残留的漂洗液，以免影响后续实验。

(10)将彻底晾干的吸附柱CB3转入一个1.5mL无菌EP管中，向吸附膜中央悬空滴加200μL的洗脱缓冲液TE，室温静置3min,12000rmp离心2min，基因组DNA于1.5mL离心管中。

可将离心收集的溶液再次加入到吸附柱CB3中，12000rpm离心2min，重新收集DNA溶液，以提高基因组DNA的得率。获得基因组DNA可直接用于下一步实验或置于-20℃保存。2.目标序列及参考序列的扩增

根据NCBI数据库登录的该区域的序列设计引物，所述引物对为：正向引物SV320F：CCAATCACCCATGAGAATAATGAC，反向引物SV320R:CAGCAGTATACAGGTTAAGAGTGCCA。目的片段分别为1062bp和742bp。以20μL计：

10×PCR Mix	10.00μL
		Up-primer(0.10μg/μL)	0.40μL
Down-primer(0.10μg/μL)	0.40μL
		gDNA	1.00μL
ddH<sub>2</sub>O	8.20μL
		Total Volume	20.00μL

PCR反应条件为：

本试剂盒所包含的引物符合PCR扩增要求，扩增效果稳定、特异性强，PCR扩增结果可准确反应基因组中目标序列的结构变异情况。

3.琼脂糖凝胶电泳检测

电泳检测选用1％的琼脂糖凝胶。点样时，用微量加样器将PCR产物5μL，加入点样孔中，同时加入D2000 DNA Marker 0.3μL对参照，设置电压为120V，时间为30min。电泳完成后，在凝胶成像系统中观察结果，并做好图像的保存。

每个基因组，以引物F1、R1组合进行PCR检测。若扩增出单条带且大小为742bp，将基因型定义为DD型；若扩增两条带，一条带大小为1062bp而另一条带为742bp，则基因型定义为DI型；若扩增出单条带而且大小为1062bp，将基因型定义为II型(图1)。

实施例2分子标记SV320的应用按照实施例1的方法，以猪基因组区域结构变异位点(chrx：46186712-46187032)为候选位点，利用PCR技术检测该结构变异的基因型在3个猪品种群体中的分布情况，184头香猪耳组织采自贵州省从江县香猪养殖场和清镇市香猪养殖基地，29头大白猪血样和14头黔北黑猪血样。以SV320候选区域，应用本发明建立检测技术分析群体中的结构变异SV320的分布频率，结果显示香猪群体中存在SV320变异。

表1猪群变异位点SMC1A-I15-sv320基因分型基因型频率和等位基因频率检测结果

应用本发明建立的检测技术可检测待测个体基因组中结构变异SV320的基因型，不受香猪的年龄、性别、营养和环境等因素的限制，且操作简便，结果准确。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域的技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

SEQ ID No.1：

<110> 贵州大学

<120> 一种鉴别香猪与大白猪的结构变异SMC1A基因中SV320分子标记及其检测技术

<210> 1

<211> 1062

<212> DNA

<213>香猪SV320区段正常

<400> 1

CCAATCACCCATGAGAATAATGACAATAATAAAAGCGAGTATCAGAGTTCCCACTGTGAC 60

GCAACGGGATTGGCAGCGTCTTGGGAGTGCTGGGACACAGGTTTGATCCCCCCCATCAGT 120

GGGTTAAGGATCTGGTGTTGCTGCAACTGTGGCTTAGGTCTCAACTATGACTCAGATTTG 180

TTCCCTGGCCTGCGAACTCCATATGCCTCGGGGCGGCAAAAAAAAAAAAAGTAAAATAAA 240

AGCTAGTATCTATTGCTCTTAGTAGATGCTAAGTATCATGCTGAGTACTTTATAAGGATT 300

AACCAACCCAACATCTGATCCATCCAACAAATCTGAGACAGGTATTGTTATCCCAATTGA 360

CACATAAGGAAACTGGGGCTTAGAGAGATCAAGTCACTGCTCAAGATGATAAACCATGGA 420

GCTGGGATTTTAACCCAGATAAACCACATTTAAAGTTGGCATTCTGGAGTTCCTGTTGTG 480

GCGCAGTGGTTAACGAATCCGACTAGGAACCATGAGGTTGCGGGTTCAATCCCTGGCCTT 540

GCTCAGTGGGTTAACGATCCGGCGTTGCCGTGAGCTGTGGTGTAGGTTGCAGACGCGGCT 600

CGGATCCCGCGTTGCTGTGGCTCTGGCGTAGGCCAGTGGCTACAGCTCCAATTCGACCCC 660

TAGCCTGGGAACCTCCATATGCCGCGGGAGCGGCCCAAGAAATAGCAACAACAACAACAA 720

CAAAGACAAAAAGACCAAAAAAAAAAAAAATAAAAATTAAAAAAAAAAAATAAAGTTGGC 780

ATTCTTAGGGAGTCCCCATCGTGGCTCAGCAGTAACGGATGCGACTAGTATCCATGAGGA 840

CACAGGTTTGATCCCTGGCCTCACTCAGTGGGTTAAGGGTCTGGCCTTGCCGTGAGCTGC 900

GGTGTAGGTCTCAGACTCGGCTTGGATCTGGCGTTGCTGTGCTGTGATGTAGGCCGGCAG 960

CTACACCTCCGATTTGACCCCTAGGCTGGGAACTTCCACACGCCTCAGGTGCGGCCTTAA 1020

AAACAAACAAAAAAGCTGGCACTCTTAACCTGTATACTGCTG

SEQ ID No.2：

<210> 2

<211> 742

<212> DNA

<213>香猪SV320区段缺失

<400> 2

CCAATCACCCATGAGAATAATGACAATAATAAAAGCGAGTATCAGAGTTCCCACTGTGAC 60

GCAACGGGATTGGCAGCGTCTTGGGAGTGCTGGGACACAGGTTTGATCCCCCCCATCAGT 120

GGGTTAAGGATCTGGTGTTGCTGCAACTGTGGCTTAGGTCTCAACTATGACTCAGATTTG 180

TTCCCTGGCCTGCGAACTCCATATGCCTCGGGGCGGCAAAAAAAAAAAAAGTAAAATAAA 240

AGCTAGTATCTATTGCTCTTAGTAGATGCTAAGTATCATGCTGAGTACTTTATAAGGATT 300

AACCAACCCAACATCTGATCCATCCAACAAATCTGAGACAGGTATTGTTATCCCAATTGA 360

CACATAAGGAAACTGGGGCTTAGAGAGATCAAGTCACTGCTCAAGATGATAAACCATGGA 420

GCTGGGATTTTAACCCAGATAAACCACATTAAAGTTGGCATTCTTAGGGAGTCCCCATCG 480

TGGCTCAGCAGTAACGGATGCGACTAGTATCCATGAGGACACAGGTTTGATCCCTGGCCT 540

CACTCAGTGGGTTAAGGGTCTGGCCTTGCCGTGAGCTGCGGTGTAGGTCTCAGACTCGGC 600

TTGGATCTGGCGTTGCTGTGCTGTGATGTAGGCCGGCAGCTACACCTCCGATTTGACCCC 660

TAGGCTGGGAACTTCCACACGCCTCAGGTGCGGCCTTAAAAACAAACAAAAAAGCTGGCA 720

CTCTTAACCTGTATACTGCTG

SEQ ID No.3：

<210> 3

<211>320

<212> DNA

<213>香猪SV320缺失片段的核苷酸序列

<400> 3

TTAAAGTTGGCATTCTGGAGTTCCTGTTGTGGCGCAGTGGTTAACGAATCCGACTAGGAA 60

CCATGAGGTTGCGGGTTCAATCCCTGGCCTTGCTCAGTGGGTTAACGATCCGGCGTTGCC 120

GTGAGCTGTGGTGTAGGTTGCAGACGCGGCTCGGATCCCGCGTTGCTGTGGCTCTGGCGT 180

AGGCCAGTGGCTACAGCTCCAATTCGACCCCTAGCCTGGGAACCTCCATATGCCGCGGGA 240

GCGGCCCAAGAAATAGCAACAACAACAACAACAAAGACAAAAAGACCAAAAAAAAAAAAA 300

ATAAAAATTAAAAAAAAAAAA

Claims

1.一种鉴别香猪与大白猪的结构变异SMC1A基因中SV320分子标记，其特征在于：SV320标记是指猪基因组中Sscrofa11.1的区域chrx：46186712-46187032，该区域缺失结构变异320bp片段，或不缺失。

2.根据权利要求1所述的一种鉴别香猪与大白猪的结构变异SMC1A基因中SV320分子标记，其特征在于：所述的SV320分子标记的引物对为正向引物SV320F：CCAATCACCCATGAGAATAATGAC，反向引物SV320R：CAGCAGTATACAGGTTAAGAGTGCCA。

3.如权利要求1或2所述的SV320分子标记的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)提取待测样品的基因组DNA；(2)以基因组DNA为模板，利用引物R和F，进行PCR扩增；(3)0.7％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，凝胶成像系统记录条带并判断基因型。

4.根据权利要求3所述的SV320分子标记的检测方法，其特征在于：步骤(2)中进行PCR所用的扩增体系，以20μL为例：

2×Taq PCR Master Mix 10.00μL F-primer(0.10μg/μL) 0.40μL R-primer(0.10μg/μL) 0.40μL gDNA 1.00μL ddH<sub>2</sub>O 8.20μL TotalVolume 20.00μL

；

PCR反应条件为：

5.如权利要求1或2所述的一种鉴别香猪与大白猪的结构变异SMC1A基因中SV320分子标记的应用方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)采用普通PCR技术检测该结构变异在不同猪品种群体中的分布情况；

(2)计算各猪品种中3种基因型在群体中的频率和等位基因的频率，分析该结构变异在香猪与大白猪品种之间的差异大小；

(3)根据结构变异SV320是否为缺失基因型辅助区分大白猪和香猪品种。