CN103215258B

CN103215258B - 两个增加猪肋骨数的主效标记及其在猪育种中的应用

Info

Publication number: CN103215258B
Application number: CN201210509536.7A
Authority: CN
Inventors: 黄路生; 任军; 幸宇云; 张志燕; 艾华水
Original assignee: Jiangxi Agricultural University
Current assignee: Jiangxi Agricultural University
Priority date: 2012-12-04
Filing date: 2012-12-04
Publication date: 2014-11-12
Anticipated expiration: 2032-12-04
Also published as: CN103215258A

Abstract

本发明公开了两个位于猪7号染色体上的增加猪肋骨数的主效标记及其在种猪遗传改良中的应用。本发明采用实时定量TaqManPCR技术和PCR扩增后直接电泳的技术分别对g.103457401A>C和g.103458678_103458679ins291主效突变位点进行基因型判定，利用标记辅助选择（MAS）选择有利基因型对个体留种，可以提高商业猪种和中国地方猪种每个个体平均约1根的肋骨数量，从而增加猪的体长暨产肉量。

Description

两个增加猪肋骨数的主效标记及其在猪育种中的应用

技术领域

本发明涉及动物遗传育种领域，尤其是涉及两个增加猪肋骨数的主效标记及其在种猪遗传改良中的应用。

背景技术

猪属于脊椎动物，猪的脊椎分为颈椎、胸椎、腰椎、荐椎和尾椎，猪的颈椎、荐椎和尾椎数相对固定，而胸椎和腰椎数存在差异，胸椎又俗称肋骨。猪肋骨数是重要的经济性状，且其遗传力高达0.6以上。肋骨数与猪的胴体长显著相关，随着肋骨数的增加，猪的胴体长也在相应的增长，每增加一根肋骨数可使体长增加80 mm左右，猪的产肉量也因此得到了相应的增加。

申请人前期利用构建的大规模白色杜洛克猪×二花脸猪F₂资源群体，测定了1029头F₂屠宰个体的脊椎数表型，通过全基因组扫描检测到了7号染色体上影响猪肋骨数的主效基因位点(QTL)，初步定位的区间大小为900 kb。

鉴于以上背景情况，申请人通过白色杜洛克猪×二花脸猪F₂资源群体、二花脸猪×通城猪F₂资源群体和苏太猪群体的全基因组关联（GWAS）分析和后裔同源相同（IBD）分析，将QTL区间缩小到100 kb。对该区域开展重测序、多态位点的搜寻、鉴别及其与猪肋骨数相关性的研究，以期建立高效准确的基因育种技术开展猪肋骨数的选育工作。

发明内容

本发明的第一个目的是提供两个增加猪肋骨数的主效标记，即：序列表SEQ ID NO:1所示的位于猪7号染色体上的基因变异序列，序列标注位置为2401的A2401-C2401的核苷酸突变；序列表SEQ ID NO:1中序列标注位置为3678和3679之间的一个291个核苷酸的插入突变。通过现代分子生物学技术检测这两个主效标记，判定携带增加肋骨数有利等位基因的个体。

本发明的第二个目的是增加猪肋骨数的主效标记在种猪遗传改良中的应用，即利用所鉴别的主效标记信息开展种猪选育,选择导致猪肋骨数更多的基因型个体留种，以提高种猪的肋骨数、胴体长和产肉量。

本发明的第一个目的是这样实现的：

1、实验动物和表型测定

本发明所使用的猪群体共有4个：白色杜洛克猪×二花脸猪F₂资源群体、二花脸猪×通城猪F₂资源群体、苏太猪（50%杜洛克猪和50%太湖猪血缘）群体和三元杂（杜洛克猪×长白猪×大白猪）群体。

白色杜洛克猪×二花脸猪F₂资源群体以2头白色杜洛克公猪和17头二花脸母猪为祖代繁殖F₁代，选9头F₁公猪与59头F₁母猪分6批次互交产生1912头F₂个体，其中918头F₂个体在240±3日龄屠宰以记录肋骨数表型数据。

二花脸猪×通城猪F₂资源群体以1头二花脸公猪和1头通城母猪交配得到2头F₁公猪和7头F₁母猪，F₁后代互交后产生61头F₂个体，所有F₂个体在60日龄屠宰以记录肋骨数表型数据。

苏太猪是一个中国培育品种，它是由中国太湖猪和西方杜洛克猪种通过超过18个世代的培育而获得的猪种（各含50%太湖猪和50%杜洛克猪的血缘）；本发明中，4头苏太公猪与55头苏太母猪交配获得461头后代，其中的435头在240±3日龄屠宰以记录肋骨数表型数据。此外，1403头195±3日龄的三元杂商品猪的样本和肋骨数表型数据分9个批次从位于南昌蒋巷的江西国鸿有限公司屠宰场获得。

、猪全基因组60K SNP判型

从上述4个实验群体中的每个个体采集一小块耳样、用标准苯酚-氯仿法提取全基因组DNA，经Nanodrop-100分光光度计检测质量后统一将浓度稀释至50 ng/μl，送北京怡美通德有限公司在Illumina Beadstration平台上根据公司标准流程进行猪全基因组60K SNP芯片(Illumina, 美国)基因型判定。利用R语言GenABEL包中checkmarker对所有样本60K芯片扫描分型数据进行质量控制，对于SNP检出率低于95%、家系孟德尔错误率高于0.1、最小等位基因频率小于0.1和哈代-温伯格平衡显著性水平高于10^-6的个体信息将被剔除。

、全基因组关联（GWAS）分析

为了消除群体层化效应，本发明采用线性混合模型单点回归分析并结合R程序中的GenABEL软件包进行GWAS 分析。对于meta-analysis（整合分析），每个位点在3个群体中的χ²值整合在一起计算新的χ²值。基因组水平的显著区域采用保守的Bonferrini校正方法确定，即基因组显著水平阈值为0.05。GWAS分析结果如图1所示，从图1中可知，3个不同群体GWAS及meta-analysis的分析结果均将影响猪肋骨数的位点定位在7号染色体上。通过LOD（似然函数比值的对数）值下降2的方法，根据3个实验群体共享的置信区间，将GWAS定位的影响肋骨数的主效位点确定在7号染色体上一个947 kb的范围内，该区域对应于国际猪基因组参考序列（10.2版本）7号染色体的103.37 Mb至104.31Mb的区间。

、后裔同源（IBD）定位分析

采用标记辅助分离分析方法判定白色杜洛克猪×二花脸猪F₂资源群体、二花脸猪×通城猪F₂资源群体、苏太猪的F₀和F₁公猪QTL基因型。每头具有后裔表型测定猪只的QTL基因型由Z值决定，Z值为似然率比值L_H1/L_H0的Log值，H₀假定双等位基因QTL基因型为纯合子QQ或qq，H₁为杂合子Qq。当Z<-2时，QTL基因型为QQ或qq；当Z>2时，QTL基因型为Qq；当-2<Z<2时，QTL基因型不能确定。通过simwalk2程序构建成功推导出QTL基因型个体的单倍型，并通过搜寻Q染色体共享的单倍型以缩小QTL区域。为将IBD区域缩小到尽可能小的区间内，本发明中首先使用60K高密度SNP芯片扫描数据进行IBD分析，具体结果见图2A。从该图可知，IBD区间被确定在SNP INRA0027623和ASGA0035500之间。为了将IBD区间进一步缩小，在SNP INRA0027623和ASGA0035500之间的猪基因组序列通过Ensembl网站（http://asia.ensembl.org/index.html）下载后，每隔约20000 bp用公用的Primer 3.0或Primer 5.0软件设计一对引物（共12对引物，见表1）对35个已知QTL基因型的个体进行PCR扩增。25 μL的聚合酶链式反应（PCR）反应体系中，包括40 ng猪基因组DNA，1.0 mM MgCl₂，0.2 mM dNTP，正反向引物各10 pmol，2.5单位DNA聚合酶（Taq酶）及1×PCR buffer（缓冲液）(上海博采公司)。PCR采用Touchdown程序，扩增条件为：95℃ 5 min；94℃ 30 s，68℃（每个循环降0.5℃）30 s，72℃ 45 s，26个循环；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，14个循环；最后在72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物采用QIAquick DNA纯化试剂盒(QIAGEN，Hilden，德国)纯化后委托上海生工生物工程有限公司直接测序，测序结果利用公用的DNAStar的SeqMan软件进行分析。对新获得的SNP信息再次进行IBD分析，Q染色体共享的区域如图2B所示，从图2B中可知，QTL区间被准确定位于一个100 kb（位于SNP 103451019 T>G和SNP 103552163 G>A之间）的区间内。

、目的IBD（100 kb）区间的重测序

通过Ensembl网站（http://asia.ensembl.org/index.html）下载SNP 103451019 T>G和SNP 103552163 G>A之间约100 kb的猪基因组序列，用Primer3.0在线软件（http://frodo.wi.mit.edu/）设计引物（见表2）对白色杜洛克猪×二花脸猪F2资源群体、苏太猪和二花脸猪×通城猪F2资源群体中已知QTL基因型的35个个体进行重测序。50 μL的聚合酶链式反应（PCR）反应体系中，包括100 ng猪基因组DNA，2.5 mM MgCl₂，0.4 mM dNTP，正反向引物各20 pmol，2.5单位DNA聚合酶（La Taq酶）及1×La PCR buffer（缓冲液）(Takara公司)。PCR扩增条件为：94℃ 2 min；98℃ 10 s，68℃ 8 min，30个循环；最后在72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物采用QIAquick DNA纯化试剂盒(QIAGEN，Hilden，德国)纯化后委托上海生工生物工程有限公司直接测序，测序结果利用公用的DNAStar的SeqMan软件进行分析。

、多态位点基因型与QTL基因型的一致性分析

将重测序得到的35个个体的多态位点基因型与QTL基因型相比较，通过QTL基因型与多态位点基因型的不一致性排除其为主效突变位点的可能性。35个个体在约100 kb区间共搜寻到187个多态位点，通过多态位点基因型与QTL基因型的不一致性共排除了183个多态位点，最后剩余4个多态位点其基因型与QTL基因型完全相符（见表3）。这4个多态位点为g.103446231 G>A、 g.103451235 C>T、g.103457401 A>C和g.103458678_103458679 ins291，其分别为位于Ensembl网站（http://asia.ensembl.org/index.html）国际猪基因组参考序列（10.2版本）7号染色体上的第103446231、103451235、103457401核苷酸的SNP（单核苷酸多态位点）和位于第103458678和103458679核苷酸之间的一个片段大小为291 bp的插入(ins)/缺失(deletion)突变。

、4个候选主效突变位点的保守性分析

本发明对4个可能的主效突变位点g.103446231 G>A、g.103451235 C>T、g.103457401 A>C和g.103458678_103458679 ins291进行保守性分析。根据已有报道，肋骨（胸椎）数量仅在哺乳动物的猪和羊中存在变异，因此若上述某个突变位点在猪、羊之外的哺乳动物中存在变异，即可被排除为因果突变。本发明比较了上述4个候选主效突变位点在猪、牛、犬、马、人和鼠中的序列保守性，结果见图3。从该图可得知，g.103446231 G>A和g.103451235 C>T两个突变位点在牛、犬、马、人和鼠中存在变异，因此排除这两个位点为候选因果突变。

、候选因果突变与肋骨数表型的关联性分析

本发明针对剩余的2个主效突变位点g.103457401 A>C和g.103458678_103458679 ins291与猪肋骨数表型进行关联性分析。g.103457401 A>C主效突变位点对应于Ensembl网站公布的国际猪基因组参考序列（10.2版本）7号染色体上第103457401个核苷酸位点，即下列SEQ ID NO:1序列的第2401个核苷酸；g.103458678_103458679 ins291主效突变位点对应于Ensembl网站公布的国际猪基因组参考序列（10.2版本）7号染色体上第103458678和103458679核苷酸，即下列SEQ ID NO:1序列第3678和3679个核苷酸之间的一个插入(ins)/缺失(deletion)突变。

SEQ ID NO:1为Ensembl网站公布的国际猪基因组参考序列（10.2版本）7号染色体上第103455001核苷酸至第103459980核苷酸之间的序列。

TTCCTGAACC AAAATGTACA AGCAGTTTGA ATCATATACA GTGGTCCAGT GGTCCCCTCT 60

CACCCGTGGC TCCCCCACCC CCTTTCCAGA CCTCTGGCGG ATGCCTGAAA CCACAGTTAA 120

TACCAAATCC TATGTGTAGA CACCGTTTTC CCCTATAGAC AGCATGGAGA GGCTGAATGG 180

AGGGAGGATT CCTTTACTTC CCAGCTGGGA CAACAGAGCA GGGCGAGAGA GCTCATTGTG 240

CTACGGGAAG AGTGCACAGT TTAAAAGTCA TGAGGGTTCA TTTCTGGGAT TTGTCATTTA 300

ATGTCTCCCC ACTGCAGATG ACTTCAGGGA ACGGAAAACA AAGAAAGCCA CACTGCAGAT 360

ATGGAGGGTC TACTGTATTA TTATTTAGAT ATCATCTATG TACATAATCC ATATTATGTA 420

CATACATAGT AGTCAAAAGT AGTTTAAAAA GTTTAACATA GAATAAAAAT ATGCACAGAG 480

AGACGAGACA CAAATACACA CGGGCAAATG CACAGAAAAA GATGAAACTG CACAGAAAAA 540

AGAACTAGGC AGATACACAG AGTGAGGAGA ACGTGTGAGG GACTGAAAGG GAGGACGTGC 600

TGAATTTGCT CTATTTTTTA CTCTGTACCG TTCGTTTGAG TCTTTTGTAA GGACAAGGCT 660

TAATTTGTGT TAAGTCTTAG AAAAGAAACT AGATTAGAAA GAAATGTACC AAGATATTCA 720

CAATAGCTGT CTCTAGATAA TGAGATTAGA GGTAATTTTT CCTTCCTATT ACTTTAAAAA 780

TCCTCCCAAT TAGTCTTCAT TTTCCCAATT AGTAGATAAA TAAGACTCTT ACTTTGATAA 840

TGGAAGCACC AACAAACCAT TTTTATCACT ATAGTTTCTT TGTAAAAAAC ATACTTTTAA 900

AGATTCTATG AGCCTTCTAA AGAACTTTAA ATTATCATCA TTGCCTTTTT AAACTGATAG 960

CAAGACTCCT TATAAAATGT CAAAAACAGA GACATGGAAA GACGTATCTC ATAATTTCAT 1020

CTCCTTCTGC AAAATCACAA TTCTTTGAAA CTTTAAAAAT TCTGCATTTC TATTAAGAAC 1080

TTTAAAATAA TTTCAGATTC ACTGGAGAAG CTGAGAATGG GAATATACTT GCTTTGGGCC 1140

AAGCAGAATC CTAAATGCTT TACATTTATC ATATTGAATC TACCCAACGA CTCTCCAGGG 1200

GAAAGAACTC TCTGGGGTCG GTGTTATGCC CCAGGAAGCA CTAAAGCAGG GCTCTGAGGT 1260

TTAAACAAGG TGCCTAAGGC CATACTCTCT CAGGGCAGGG TTGGCATTCA AATCCAAGTC 1320

CAGGAGGAAA GCCCAAGCCA GTGCCTCCCA CAGCTGCCAT TGAGGTGGGT GGGGCTGGTG 1380

TGACTTGGAT GCAGGACCAG GATTTGAGTT CACTTCTGGT GGCCCCCGAT CCAGGTCCCT 1440

GAGAATGCGT GTTTGAGAAA GGATTTTGAC TTCGGTGATG AGTGTAGGTT CATGACTGGT 1500

GGAGGAGGAA ACGATAATGC TAGAGCTGGG GCATAACCGA CCTTGTGGTG AGGGGTGGAG 1560

GTTTCCGTGG TAGCTGTGGG TAGGCGCTGA AGGGGAAAGG GGGGTCGAAC TGAAGCCCAG 1620

GAGGGCTGCC AGCTCCAGCA CTCCAAAGGG TTAAGGCCGG GCAGGAAAGC CTATGGGGAT 1680

GGGGTAGAGG GTGGGGGGTG GGGGGAGCTA CCACCAAAGG CTGCGCCATC TAGCAGCCCT 1740

CACCTCCCCC ACCAGCAGGG ACTGGACGGG CGGAGGGGAC TAGTTCCTCA GGGGATTATC 1800

TGAGGCCTCT GGGCTGAGGT GAGCTCCGGG GAGGGTCGGA AGCCCCAGGT GCCACGCGCC 1860

CCCACCTTCC TGTGGGGCTC AGAAAACTAG GTGACCTGGG ATAGGCGCCC TGACCCCTGA 1920

CAAAAGCATC TTTGTCCCAG GCACACTTTG GGAGTGAGGG GTGTTGAGCC CAAGCCTGGG 1980

GGATGCTCAG ACAAAGGTGG GGATGGAAGC CTTTCAGGAA GGGAATGGGA CCAGCACCTA 2040

GGCGGGGGCA GGGAGTTCTC CAGCCTCCCC ATCTCGCAGG GCCTGGGGTG GGGGAGCGGT 2100

CTCAGGAAGA GATGCATCCC TGGGGCTCAG AGAGCCCATC ACCCAGGCCA GTTTCCCCAG 2160

CTCAGCTTCG CTCTTTCCCC CTCCCCCCCT TAGCCTGGCT TCAGACTCTC TTTCCTCAGG 2220

TTCTTTCTAT CTAAACCTTC TCCTCCCCTC CCCTCCCCCC AAACTCTTTG GAAATCTTTC 2280

AACTTTCTTT CAAGTTTTCC TGGGCAGCTC GGGAATCTGA GCTAGGTCAG GGCGCTTTCA 2340

CACCCCCAGC TGGGTAGAGT GGACGAGACA ATAGCTGCTA TCACTTTACC ATTGGAAGTG 2400

ACCCCCGAAT TTGCACTTCT TTCATCTCGG GACTGCAGCA CTTGAGGGTG GGCGATTTCC 2460

TGGGGGGAGT GGCTTAAGCC GCTTCTCCAC CGACCAGTTG GCTGTAGACG GTCCATGCTC 2520

AATGGTCCAC CACAGATATG AAACCACTTC TGGAGTGAGA GTGGCGCTCA GTTGCTGCCC 2580

ACAGGGTGAC TTAAATGTCC CAAGCTGGAA GGTGGAGAGA GACGTGGACG CCCCCTGGGC 2640

TCTGGGCCAC CCTCGAGGTC AGTAAACTAG GAAGTTGGCT CAAAATTAGG AAGGGTGGGT 2700

GCCTCATGCA GTTTGGGGGC CCCAGGGGAG TGAGGGCGTG GACTTGGGAC ACTAAAGGGC 2760

CCAAGGGTCA AGGAGTGACC CAAACGATGC TGTGTGTGTG TGTGCGTGCG TGTGAGGGGA 2820

GGGGAGGCAT TGTTACAAGT TCTCTCTCCC CACCCCCACC TCCAGCCCCT TCCCCACCCC 2880

CACCCGCCGG CCTATCTCCC CTCCCCACCC TACACAATGG TCTGGCCTCA GCCCCTCCCC 2940

AGACTCCCAG TGCTTTCCGA TTTGGGTCCC TTGTCTCAGA TGCCCCCAGG CAGCCAGCTC 3000

TCTCCCCACC GGCCCGGGCC TCCTTGCAGC TCCCGCCGCT TCCCCTCGTG GGCTGCACTG 3060

GCATTCTCCT TCCCTTCCAG ACATGTGGTC CACTAGAGCT ACTGAACTTG GGAACTCCCA 3120

GGTGTGACTG ACTTGGCGGC CTCAGACCTA CCCTGGTGCC CCCAGGTGTT CCGTTGCCCT 3180

TGGTGCTGGA AGGTTCCTTC CCAGCCAAGG GACTCGGCAG ACACCAGGCA GGCCTTATGG 3240

CCGCCCATGC CCTCTGCGGC CTCCTGGCCT CTGGGGAAGA AGCCAAGATG GCTGGTGCTC 3300

CCTCAAGCCA GGGGCTCAGG CTGGGCAGCT GGGCCAGCGT GCCTGGGGGA CTGGAGGGCA 3360

GGCCAGAGAA GCATGGAGCC AGGCTGGGTG AGAGGCCAAC CCATCTACCA CAGTCTTAGC 3420

CAGTCTTCCT GAGGGCTGAG GCCTGTGTAG CCTCCCTCGT GCTTGTAGAG CCTGGCTGGC 3480

TATGGACACT GCAGGGCCTG CTTTATGAGG ACTGGTGAGA GGAGGGGCAG ATGAGGAGAA 3540

TGCGGGATCC TTGGTGAGCT CGAATACAGA GCCAGGATGA GGCTGGCAGG GAAGGTGTTT 3600

GTTATAGTCT TATCAGTGTT GTGTCAGCAG ATCTCAATTT TTTCCCTTGC CGTGCCCAGA 3660

GCCTTGGCTC ATCCCTTTTA AAATGCAAGG GACAGAGGCC AGTCCTGGGC TCCAAGACAC 3720

TATCTGCTTG AAGTAAGAAG ACTCCAGGAG GAGGAAGGTG GGTCTTGGTG AAGGTGGGGC 3780

TTTGAAAAGT CTGCAGAATT GCCTGTGTGC ATTCATTCAC CCCTTGGTTC CAGGGCCCTT 3840

CGGTGCCAAG ATGCTGGCTG GATGCTTTCT GGAGGTCCCG TTTCCTCCCT TCCAACCTCA 3900

AGCCAGGGGA GCCTGTGTAA TCTGGGGGGC CTTGCCTCCT TGGTTTCATG CCTTTTCACT 3960

TCCCTTCCAA TAACTGTGGG GCCAGGGGAG GCCAGCTGGG CAAAGCCCCC ATTTGAGCTC 4020

TGACGTTCTG CCCCTTATTC CATGAGTGCA CCTGGTAAGC GCCGGCTCTG CCTTGCCTTG 4080

CGTTTCCAGG GAGCCATCAC GGAAAAGACT GTTGCACCTG AACCCCATCA ACCAGTTGTC 4140

TACTTAAGTA TGATTAGCTG CCCCAGGCGG CCTCTGGCCC CAGACTCTGC TTGTCCAGAC 4200

CCACCTGAGT TGACCTGAGG TGCCGAGCCT CTCCACGGAG CTACTTTTTC TCAGCAAGCT 4260

TTTGAGGAAA AAAAGAAGTA GGGTATTACC TACTCGGAAC TTCTCTTACC TCCTGGGGGA 4320

AGAGAGGGTG GAGGGGGCTG GGCCTGGCCG GGAAGGGTAG GTAGGGTGGG ACAGGGGAGG 4380

GGAAGGGAGG TGGGTCTTGC CTGGGCAGAA GAGTGGTGGG TGTATCTGGA TACTGCAGAG 4440

TGTAATCAGG CAAGTCACCT TTAATCGAGG TTTCTGGACC TCGATTTCCT TAACTGTAAA 4500

ATGGCCAGGT TTGTCTCAAA GCCCCAAGAA TCCATGTGTT TCTGCATCCT ATGGATGATG 4560

AGAGTTTGGG GCCCTGTATC TCCCTGGATG GTGGAATTAC AAGGGTTAGG AGGGAAGCTC 4620

TGGAGTTGAT TGCTGTTTTT GTAGCTTTAG GAGCTGTTCG GTCTTGGGAA TGTTATTGAA 4680

TTTAACCCCC AAGCCTCTGA TTTCTCAAGG GTAAACCGGG AGTAGCCATC CTAGTGGCGG 4740

TGCAGGTGTG ATGGGTTGTG GTTCACGTGG AGGGAAAGTC AGAACCACAT ATAAATAAAT 4800

AAGGTTACCT CTGAAAGGCG TGAAATCCAA ATGCTCAGTG TAAAGCCCAC AGAAACTTGT 4860

CATCACTCAA AGGAACATCA TGCTCTGTTC ACAGAGTGGA AGGGCAGGAA GAATCACCCA 4920

CACAATGTAA TTGTCCCCTT TTATTTTTTT GAGATTTGGT TGAATTACCT AAGTTAAATG 4980

采用实时定量TaqMan PCR技术检测g.103457401 A>C主效突变位点。利用Primer Express 3.0软件设计一对特异性引物及探针，上下游引物序列分别为：5’-GGG TAG AGT GGA CGA GAC AAT AGC-3’和5’-CCG AGA TGA AAG AAG TGC AAA TT-3’；探针序列为CAT TGG AAG TGC CC（5’端用FAM标记、3’端用MGB标记）和TAC CAT TGG AAG TGA CC（5’端用VIC标记、3’端以MGB标记）。10 μl反应体系中含有30-50 ng基因组DNA、上下游引物各2 pmol，两条探针各1 pmol，轻微混匀后于7900HT FAST定量PCR仪上进行基因分型判定。PCR扩增循环为：50℃ 2 min；95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环。基因型判型方法如图4A所示，箭头1所示为AA基因型个体；箭头2所示为AC基因型个体；箭头3所示为CC基因型个体。

采用PCR扩增后直接电泳的方法检测g.103458678_103458679 ins291主效突变位点的基因型。上下游扩增引物分别为5’- AGG GGC AGA TGA GGA GAA TG-3’和5’- CCA AGG GGT GAA TGA ATG -3’。 25 μL的聚合酶链式反应（PCR）反应体系中，包括40 ng猪基因组DNA，1.0 mM MgCl₂，0.2 mM dNTP，正反向引物各10 pmol，2.5单位DNA聚合酶（Taq酶）及1×PCR buffer（缓冲液）(上海博采公司)。PCR扩增条件为：95℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；最后在72 ℃延伸10 min。PCR产物经1.5℅琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭(EB)染色后，于凝胶成像系统中观测电泳条带。具体判型方法见图4B。ins/ins个体只有一条596 bp的条带，del/del个体只有一条305 bp的条带，ins/del个体分别有一条596 bp和305 bp的条带。

对g.103457401 A>C位点和g.103458678_103458679 ins291两个主效突变位点在已知脊椎数表型数据的1003头白色杜洛克猪×二花脸猪F₂资源群体和44头二花脸猪×通城猪F₂资源群体个体中进行检测，结果发现这两个位点在遗传上处于完全连锁不平衡。应用GenABEL软件对基因型和表型数据的关联性进行分析，结果见表4。从表中可知，该两个位点与猪肋骨数存在极显著相关性，g.103457401 A>C位点的CC基因型个体比AA基因型个体多约1根肋骨；同样，g.103458678_103458679 ins291的ins/ins个体比del/del个体也多约1根肋骨数。

本发明的第二个目的是这样实现的：利用本发明第一个目的所建立的两个主效标记的基因型检测技术，将增加猪肋骨数的两个主效标记应用于种猪遗传改良。在种猪核心群中选择g.103457401 A>C位点的CC基因型个体或g.103458678_103458679 ins291的ins/ins个体，淘汰这两个位点的AA基因型或del/del基因型个体，逐世代提高等位基因C或ins的频率，以此增加种群的肋骨数、进而达到增加体长和增加产肉量的目的。

本发明鉴别了两个增加猪肋骨数的主效标记：一个单核苷酸多态位点（SNP）和一个插入/缺失（ins/del）突变位点，通过现代分子生物学技术检测这两个位点中的任何一个，利用标记辅助选择（MAS）选择有利基因型个体留种，可以有效地提高种群的肋骨数、增加个体体长及产肉量。

附图说明

图1为7号染色体上影响猪肋骨数的GWAS定位结果的示意图，其中：A为白色杜洛克猪×二花脸猪F₂资源群体的GWAS定位结果，B为二花脸猪×通城猪F₂资源群体的GWAS定位结果，C为苏太猪的GWAS定位结果，D为3个群体整合分析的GWAS定位结果。猪的18条常染色体信息标识于X轴，6万个SNP与肋骨数相关性的-log10(P)值按SNP在基因组中的位置显示于Y轴

图2为7号染色体上增加猪肋骨数的Q染色体共享区域的示意图，其中：A为60K SNP芯片扫描数据的IBD分析结果，B为在A中所示的IBD区域内增加新的SNP标记扫描后的IBD分析结果。ID表示个体号；F₀和F₁表示个体的世代；A和B中ID为73的“1”“2”数字上面对应的是SNP信息。Q染色体的IBD区域用黑框标识。

图3为4个侯选主效位点g.103446231 G>A、g.103451235 C>T、g.103457401 A>C和g.103458678_103458679 ins291在哺乳动物中的保守性分析示意图，四个灰色竖框分别为四个侯选主效突变位点在6个物种中的序列情况；其中：Sus scrofa 为猪，Bos taurus为牛，Canis Lupus familiaris为狗，Equus caballus为马，Homo sapiens为人，Mus musculus为小鼠，wild为野生型，mutation为突变型；“·”表述与猪野生型序列相同，“-”表示空缺。

图4A为g.103457401 A>C和g.103458678_103458679 ins291位点的基因型判定图的第一张图，即：A为g.103457401 A>C位点的判型图，箭头1所示为AA基因型个体；箭头2所示为AC基因型个体；箭头3所示为CC基因型个体。

图4B为g.103457401 A>C和g.103458678_103458679 ins291位点的基因型判定图的第二张图，即：B为g.103458678_103458679 ins291位点的判型图，M为100 bp分子标记；泳道1、3、4为del/del基因型；2为ins/del基因型；5为ins/ins基因型。

具体实施方式

下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。

针对种猪核心群个体，利用上述的实时定量TaqMan PCR检测和PCR扩增后直接电泳的方法鉴别猪7号染色体上两个影响肋骨数的主效突变位点基因型，选择有利的基因型对个体留种，群体继代选育后增加种群的肋骨数和体长，以此增加产肉量。

实施例：

利用中国培育猪种—苏太猪群体及西方三元杂交商品猪—杜洛克猪×（大白猪×长白猪）商品猪为实验动物。461头苏太猪个体饲养到240日龄屠宰、杜洛克猪×（大白猪×长白猪）商品猪在江西国鸿公司屠宰场定点屠宰，分别记录每个个体的肋骨数。采用上述实时定量TaqMan PCR检测和PCR扩增后直接电泳的方法对这435头苏太猪和1403头杜洛克猪×（大白猪×长白猪）三元杂商品猪个体开展g.103457401 A>C和g.103458678_103458679 ins291 两个主效标记位点的基因型判定。然后利用Gen ABEL软件进行基因型对表型的影响效应，结果如表4所示。从该表中可知，g.103457401 A>C位点的CC基因型个体比AA基因型个体平均多1.17根（苏太猪）和0.92根肋骨（西方三元杂交商品猪），同样，g.103458678_103458679 ins291的ins/ins个体比del/del个体也平均多1.17根（苏太猪）和0.92根肋骨（西方三元杂交商品猪）（见表4）。由此可知，在商业种猪和中国猪种核心群中，继代选育g.103457401 A>C位点的CC个体或g.103458678_103458679 ins291的ins/ins个体，均可以逐步提高猪群的肋骨数，达到增加猪的体长及产肉量的目的。

SEQ ID NO 1

<110> Jiangxi Agricultural University

<120> Two molecular markers with major effects on swine rib number and their utilization in the improvement of breeding pigs

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 4980

<212> DNA

<213> Jiangxi Agricultural University

<220>

<400> 1