CN116287471B - 鉴别番鸭细小病毒标准强毒p株和疫苗弱毒p1株的arms-pcr检测引物组及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种鉴别番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株的ARMS‑PCR检测的引物组，所述引物组的序列如SEQ ID NO:1‑SEQ ID NO:6所示，本发明建立的相应ARMS‑PCR检测方法可以特异鉴别番鸭细小病毒标准强毒P株及其疫苗弱毒P1株，而与番鸭的其他重要病原无交叉反应。本发明的引物特异性好，敏感性高，整个ARMS‑PCR过程可以在2h内完成，并且通过番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株VP1基因第942、第1150位核苷酸点突变进行SNP分型检测，仅需一次PCR扩增和一次琼脂糖电泳即可达到明确番鸭群番鸭细小病毒弱毒疫苗的预防免疫以及强毒感染的进程。

Description

鉴别番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株的ARMS-PCR 检测引物组及试剂盒
技术领域
本发明属于检测技术领域，具体涉及一种鉴别番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株的ARMS-PCR检测的引物组及试剂盒。
背景技术
水禽细小病毒是雏鹅和小鸭的高度传染性致死病原体。在水禽产业密集的国家，临床感染可能导致重大经济损失。根据基因组遗传变异、抗原交叉中和试验结果和宿主范围等特征，水禽细小病毒可分为鹅细小病毒(goose parvovirus，GPV)群和番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus，MDPV)群。GPV感染可以在幼鹅和番鸭中暴发德兹西氏病(Derzsy's disease)，迄今为止，MDPV感染引起的雏番鸭“三周病”(3-wk disease)的临床症状仅见于番鸭。
MDPV归类于细小病毒科(Parvoviridae)细小病毒亚科(Subfamilyparvovirinae)依赖病毒属(Dependovirus)雁形目依赖细小病毒1(Anseriformdependoparvovirus 1)，是一种无囊膜的二十面体病毒，基因组包含长度约5100个核苷酸的线性单链DNA基因组的单个拷贝，在5′和3′端都有相同的反向末端重复序列(ITR)。ITR可以折叠成回文发夹结构，末端解析位点(TRS)、Rep蛋白结合位点(RBS)和转录因子结合位点，它们参与病毒复制、包装和转录。MDPV基因组中都有两个主要的开放阅读框架(ORF)，左侧ORF编码非结构蛋白(NS)，参与病毒复制和调节功能；右侧ORF编码三个亚基套式共羧基端衣壳蛋白(VP1、VP2和VP3)，在病毒嗜性、宿主范围和致病性方面起着重要作用。
MDPV的基因组具有很高的遗传稳定性，MDPV疫苗毒P1株是由标准强毒P株经过非免疫番鸭胚蛋与番鸭成纤维细胞交替传代等生物技术实验方法诱变培育而成，但与标准强毒核苷酸序列差异仅有0.1％。随着兽医临床上MDPV活疫苗的广泛应用，单纯对MDPV检测已不能满足实际生产的需要，须建立一种快速区分强毒株和弱毒疫苗株的检测技术，以便临床上有针对性地采取相应的防制措施。
目前MDPV检测方法有很多，包括病毒分离培养、动物接种试验、血清学诊断方法和实时荧光定量PCR等。其中病毒分离和动物试验不同程度的存在诊断周期长、操作繁琐、检出率低等不足；常规的血清学试验又很难鉴别MDPV强毒感染和弱毒疫苗接种，而实时荧光定量PCR方法对实验仪器的要求很高，并不适合临床检测。目前临床检测MDPV的方法主要是致敏乳胶凝集与荧光定量PCR，但是都不能区分出野毒株和疫苗株。随着MDPV弱毒疫苗的广泛使用，单纯对MDPV检测已不能满足实际生产的需要，必须建立一种快速区分MDPV标准强毒P株与弱毒疫苗P1株的检测技术，以便临床上有针对性地采取相应的防制措施。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸变异引起的基因组DNA序列多态性。目前，SNP基因分型的方法主要包括高通量基因测序方法、限制性酶切片段长度多态性(PCR-RFLP)、单链构象多态性(PCR-SSCP)、等位基因特异性寡聚核苷酸杂交(ASO)以及等位基因特异性PCR(Allele-Specific PCR，AS-PCR)。AS-PCR又称为扩增阻滞突变系统PCR(Amplification Refractory Mutation SystemPCR，ARMS-PCR)。PCR-RFLP由于部分SNP没有合适的限制性内切酶，其应用具有很大的局限性。PCR-SSCP与ASO技术在测定点突变时，不能有效排除假阳性，测定特异性必须由DNA测序来证实。基于大型仪器的高通量筛选检测方法，如变性高效液相色谱(denaturing highperformance liquid chromatography，DHPLC)、高分辩率熔解曲线分析(high resolutionmelt，HRM)和基因芯片等技术，检测效率高，但对标本目的基因纯度要求较高易引起假阴性和假阳性。相比之下，利用ARMS-PCR技术对SNP进行分型，能够利用单个PCR反应体系同时检测两个等位基因，不需要限制性核酸内切酶，具有快速、价廉的优点，并可以区分等位基因是否存在突变。
ARMS-PCR基于引物3'末端碱基与模板结合的严谨性而发展起来的一种技术，已用于鉴定单核苷酸多态性(SNP)。该方法利用了Taq DNA聚合酶相对无法扩展在其3’端错配的引物及其缺乏3′至5′外切酶活性的固有倾向，因此扩展显著减少。在四引物ARMS-PCR分析中，外侧引物是非等位基因特异性的，用于扩增包含SNP的区域。对于内侧引物，引物3′端的最后一个核苷酸被设计为与目标核苷酸互补。有意引入了内侧引物3′端最接近SNP位点三个碱基内的额外错配。这种额外的错配破坏了引物与其相应非靶模板之间的碱基配对，通过消除假阳性结果显著提高了测定的特异性。该方法简单、稳健、可靠，不需要DNA纯化。该方法可以在不到2小时的时间内，在PCR反应中区分杂MDPV标准强毒P株和弱毒疫苗毒P1株。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，根据番鸭细小病毒标准强毒P株和弱毒疫苗P1株的结构蛋白VP1基因核苷酸序列特征，结合扩增阻滞突变系统3’端错配原则，设计一对番鸭细小病毒特异性通用引物做为外侧引物以及适合双向等位基因特异性PCR扩增的4条内侧引物，应用ARMS-PCR方法对番鸭细小病毒标准强毒P株和弱毒疫苗P1株的核酸DNA进行检测，判断所扩增番鸭细小病毒强弱毒株目的条带的大小，准确区分番鸭细小病毒标准强毒P株和弱毒疫苗P1株，具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点，在MDPV感染早期检测和快速诊断中具有重要意义。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一种鉴别番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株的ARMS-PCR检测的引物组，所述引物组包括一对番鸭细小病毒特异性通用外侧引物以及分别针对番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株VP1基因第942、第1150位核苷酸SNP位点的4条内侧鉴别引物；
所述一对番鸭细小病毒特异性通用外侧引物的序列如下：
外侧上游引物VPFO：5’-AAACCCAGACTCAAATACCCAATA-3’(SEQ ID NO:1)；
外侧下游引物VPRO：5’-TGAGCCGGTATACTGGAATCCTG-3’(SEQ ID NO:2)。
所述番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株VP1基因第942、第1150位核苷酸SNP位点的4条内侧鉴别引物的序列如下：
第942位核苷酸内侧上游引物P1-942FI：5’-AGCACTCAAATTCAAGATATTCAATATG-3’(SEQ ID NO:3)，
第942位核苷酸内侧下游引物P-942RI：5’-CTTGCGTCGTGACTTCTTTAACTGGT-3’(SEQID NO:4)，
第1150位核苷酸内侧上游引物P1-1150FI：5’-AATGCACACCAACCAGAGTGGAGATG-3’(SEQ ID NO:5)，
第1150位核苷酸内侧下游引物P-1150RI：5’-AAGGCACTTCTGTCATTGAACCT-3’(SEQID NO:6)，
根据GenBank中番鸭细小病毒标准强毒株和疫苗弱毒株VP1结构蛋白基因序列比较分析结果，同时结合3’端错配原则，得到能够进行ARMS-PCR特异性扩增的4条内侧鉴别引物的位点：在VP1蛋白第314与384位氨基酸上，MDPV标准强毒P株分别为缬氨酸(V)、精氨酸(R)，而MDPV疫苗弱毒P1株分别为甲硫氨酸(M)、甘氨酸(G)，即MDPV标准强毒P株致弱为疫苗弱毒MDPV-P1株后，VP1基因第942、第1150位核苷酸碱基均由A突变为G。因此，MDPV标准强毒P株与MDPV疫苗弱毒P1株ARMS-PCR的4条内侧鉴别引物分别为上述的P1-942FI(SEQ ID NO:3)、P-942RI(SEQ ID NO:4)、P1-1150FI(SEQ ID NO:5)、P-1150RI(SEQ ID NO:6)，其中引物序列中斜体字母为错配碱基。
本发明还提供以上所述的引物组在制备鉴别番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株ARMS-PCR试剂盒中的应用。
本发明提供一种鉴别番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株的ARMS-PCR试剂盒，所述试剂盒包括以上所述的引物组。
所述的ARMS-PCR试剂盒，其ARMS-PCR反应体系为25μL，包括如下组分：
TaKaRa Taq HS Perfect Mix(2×)12.5μL，浓度均为20μmol/L的引物VPFO、VPRO各2μL，浓度均为20μmol/L的引物P1-942FI、P-942RI、P1-1150FI、P-1150RI各1μL，MDPV-PDNA模板(即MDPV标准强毒P株DNA模板)与MDPV-P 1DNA模板(即MDPV疫苗弱毒P1株DNA模板)各1μL或待测样品的核酸模板2μL，补充DNase/RNase-free ddH2O至终体积25μL；
ARMS-PCR反应扩增条件为94℃5min；94℃20s、53℃30s、72℃30s，共33个循环，72℃延伸5min。
本发明还提供第二组鉴别番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株的ARMS-PCR检测的引物组，所述引物组包括一对番鸭细小病毒特异性通用外侧引物以及针对番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株VP1基因第942位核苷酸SNP位点的2条内侧鉴别引物；
所述番鸭细小病毒特异性通用外侧引物的序列如下：
外侧上游引物VPFO：5’-AAACCCAGACTCAAATACCCAATA-3’(SEQ ID NO:1)；
外侧下游引物VPRO：5’-TGAGCCGGTATACTGGAATCCTG-3’(SEQ ID NO:2)；
所述番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株VP1基因第942位核苷酸SNP位点的2条内侧鉴别引物的序列如下：
第942位核苷酸内侧上游引物P1-942FI：5’-AGCACTCAAATTCAAGATATTCAATATG-3’(SEQ ID NO:3)，
第942位核苷酸内侧下游引物P-942RI：5’-CTTGCGTCGTGACTTCTTTAACTGGT-3’(SEQID NO:4)；
第二组引物组在制备鉴别番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株ARMS-PCR试剂盒中的应用；
第二种鉴别番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株的ARMS-PCR试剂盒，包括所述的第二组引物组。
本发明还提供第三组鉴别番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株的ARMS-PCR检测的引物组，所述引物组包括一对番鸭细小病毒特异性通用外侧引物以及针对番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株VP1基因第1150位核苷酸SNP位点的2条内侧鉴别引物；
所述番鸭细小病毒特异性通用外侧引物的序列如下：
外侧上游引物VPFO：5’-AAACCCAGACTCAAATACCCAATA-3’(SEQ ID NO:1)；
外侧下游引物VPRO：5’-TGAGCCGGTATACTGGAATCCTG-3’(SEQ ID NO:2)。
所述番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株VP1基因第1150位核苷酸SNP位点的2条内侧鉴别引物的序列如下：
第1150位核苷酸内侧上游引物P1-1150FI：5’-AATGCACACCAACCAGAGTGGAGATG-3’(SEQ ID NO:5)，
第1150位核苷酸内侧下游引物P-1150RI：5’-AAGGCACTTCTGTCATTGAACCT-3’(SEQID NO:6)。
第三组引物组在制备鉴别番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株ARMS-PCR试剂盒中的应用。
第三种鉴别番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株的ARMS-PCR试剂盒，所述试剂盒包括所述的第三组引物组。
其中，四引物P1-942FI/VPRO、VPFO/P-942RI扩增MDPV标准强毒P株，预期目的片段大小为816bp与188bp；四引物P1-942FI/VPRO、VPFO/P-942RI扩增MDPV疫苗弱毒P1株，预期目的片段大小为816bp与681bp。
四引物P1-1150FI/VPRO、VPFO/P-1150RI扩增MDPV标准强毒P株，预期目的片段大小为816bp与393bp；所述的四引物P1-1150FI/VPRO、VPFO/P-1150RI扩增MDPV疫苗弱毒P1株，预期目的片段大小为816bp与471bp。
所述引物P1-942FI/VPRO、VPFO/P-942RI、P1-1150FI/VPRO、VPFO/P-1150RI扩增MDPV标准强毒P株，预期目的片段大小为816bp、393bp、188bp；所述引物P1-942FI/VPRO、VPFO/P-942RI、P1-1150FI/VPRO、VPFO/P-1150RI扩增MDPV疫苗弱毒P1株，预期目的片段大小为816bp、681bp、471bp。
较之现有技术而言，本发明的优点在于：本发明基于MDPV标准强毒P株与MDPV弱毒疫苗P1株VP1基因序列上的SNP位点第942、第1150位核苷酸碱基均由A突变为G的突变情况，成功设计并提供了用于鉴别MDPV标准强毒P株与MDPV弱毒疫苗P1株的ARMS-PCR引物组，采用3’端错配原则对MDPV标准强毒P株与MDPV弱毒疫苗P1株进行鉴别，具有特异性强的优点。本发明所设计的引物序列在MDPV感染早期检测和快速诊断中具有重要意义。本发明建立的相应ARMS-PCR检测方法可以特异鉴别番鸭细小病毒标准强毒P株及其疫苗弱毒P1株，而与番鸭的其他重要病原无交叉反应。本发明的引物特异性好，敏感性高，整个ARMS-PCR过程可以在2h内完成，并且通过番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株VP1基因第942、第1150位核苷酸点突变进行SNP分型检测，仅需一次PCR扩增和一次琼脂糖电泳即可达到明确番鸭群番鸭细小病毒弱毒疫苗的预防免疫以及强毒感染的进程。
附图说明
图1是MDPV标准强毒P株与MDPV疫苗弱毒P1株通用外侧引物特异性检测结果图，其中M：DNA分子质量标准；泳道1：MDPV标准强毒P株；泳道2：MDPV疫苗弱毒P1株；泳道3：鹅细小病毒(GPV)；泳道4：鸭坦布苏病毒(DTMUV)；泳道5：鸭副黏病毒(DPMV)；泳道6：番鸭呼肠孤病毒(MDRV)；泳道7：新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)；泳道8：鸭瘟病毒(DPV)；泳道9：DNase/RNase-free ddH2O对照；泳道10：空白对照。
图2是MDPV标准强毒P株与MDPV疫苗弱毒P1株VP1基因第942位碱基突变ARMS-PCR鉴别引物应用结果图，其中M：DNA分子质量标准；泳道1：MDPV标准强毒P株；泳道2：MDPV疫苗弱毒P1株；泳道3：DNase/RNase-free ddH2O对照；泳道4：空白对照。
图3是MDPV标准强毒P株与MDPV疫苗弱毒P1株VP1基因第1150位碱基突变ARMS-PCR鉴别引物应用结果图，其中M：DNA分子质量标准；泳道1：MDPV标准强毒P株；泳道2：MDPV疫苗弱毒P1株；泳道3：DNase/RNase-free ddH2O对照；泳道4：空白对照。
图4是MDPV标准强毒P株与MDPV疫苗弱毒P1株VP1基因第942位、1150位碱基突变ARMS-PCR鉴别引物应用结果图，其中M：DNA分子质量标准；泳道1：MDPV标准强毒P株；泳道2：MDPV疫苗弱毒P1株；泳道3：DNase/RNase-free ddH2O对照；泳道4：空白对照。
图5是MDPV标准强毒P株与MDPV疫苗弱毒P1株VP1基因第942位碱基突变ARMS-PCR鉴别引物的临床样品检测结果图，其中M：DNA分子质量标准；泳道1-9：人工感染MDPV强毒P株雏番鸭肝脏组织匀浆样品；泳道10：MDPV标准强毒P株；泳道11-19：人工免疫MDPV弱毒疫苗P1株健康雏番鸭肝脏组织匀浆样品；泳道20：MDPV疫苗弱毒P1株；泳道21：DNase/RNase-free ddH2O对照；泳道22：空白对照。
图6是MDPV标准强毒P株与MDPV疫苗弱毒P1株VP1基因第942位、第1150位碱基突变ARMS-PCR鉴别引物的临床样品检测结果图，其中M：DNA分子质量标准；泳道1-9：人工感染MDPV强毒P株雏番鸭肝脏组织匀浆样品；泳道10：MDPV标准强毒P株；泳道11-19：人工免疫MDPV弱毒疫苗P1株健康雏番鸭肝脏组织匀浆样品；泳道20：MDPV疫苗弱毒P1株；泳道21：DNase/RNase-free ddH2O对照；泳道22：空白对照。
图7是MDPV标准强毒P株与MDPV疫苗弱毒P1株VP1基因第1150位碱基突变ARMS-PCR鉴别引物的临床样品检测结果图，其中M：DNA分子质量标准；泳道1-9：人工感染MDPV强毒P株雏番鸭肝脏组织匀浆样品；泳道10：MDPV标准强毒P株；泳道11-19：人工免疫MDPV弱毒疫苗P1株健康雏番鸭肝脏组织匀浆样品；泳道20：MDPV疫苗弱毒P1株；泳道21：DNase/RNase-free ddH2O对照；泳道22：空白对照。
具体实施方式
一种鉴别番鸭细小病毒标准强毒P株与弱毒疫苗P1株的ARMS-PCR的引物组包括：
一对番鸭细小病毒特异性通用外侧引物，所述引物序列如下：
上游外侧引物VPFO：5’-AAACCCAGACTCAAATACCCAATA-3’，下游外侧引物VPRO：5’-TGAGCCGGTATACTGGAATCCTG-3’；
分别针对番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株VP1基因第942、第1150位核苷酸SNP位点的4条内侧鉴别引物，4条内侧鉴别引物序列如下：第942位核苷酸内侧上游引物P1-942FI：5’-AGCACTCAAATTCAAGATATTCAATATG-3’
第942位核苷酸内侧下游引物P-942RI：5’-CTTGCGTCGTGACTTCTTTAACTGGT-3’
第1150位核苷酸内侧上游引物P1-1150FI：5’-AATGCACACCAACCAGAGTGGAGATG-3’
第1150位核苷酸内侧下游引物P-1150RI：5’-AAGGCACTTCTGTCATTGAACCT-3’。
根据番鸭细小病毒强毒株和弱毒株VP1结构蛋白基因序列比较分析结果，同时结合3’端错配原则，得到能够设计双向等位基因特异性PCR扩增的4条内侧鉴别引物的位点：在VP1蛋白第314与384位氨基酸上，MDPV标准强毒P株分别为缬氨酸(V)、精氨酸(R)，而MDPV疫苗弱毒P1株分别为甲硫氨酸(M)、甘氨酸(G)，即MDPV强毒P株致弱为MDPV-P1株后，VP1基因第942、第1150个核苷酸碱基均由A突变为G。因此，设计的MDPV标准强毒P株与MDPV疫苗弱毒P1株ARMS-PCR的4条内侧鉴别引物如上所示，其中，所述引物序列中斜体字母为错配碱基。
第二组鉴别番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株的ARMS-PCR检测的引物组，所述引物组包括一对番鸭细小病毒特异性通用外侧引物以及针对番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株VP1基因第942位核苷酸SNP位点的2条内侧鉴别引物；
所述番鸭细小病毒特异性通用外侧引物的序列如下：
外侧上游引物VPFO：5’-AAACCCAGACTCAAATACCCAATA-3’；
外侧下游引物VPRO：5’-TGAGCCGGTATACTGGAATCCTG-3’；
所述番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株VP1基因第942位核苷酸SNP位点的2条内侧鉴别引物的序列如下：
第942位核苷酸内侧上游引物P1-942FI：5’-AGCACTCAAATTCAAGATATTCAATATG-3’，
第942位核苷酸内侧下游引物P-942RI：5’-CTTGCGTCGTGACTTCTTTAACTGGT-3’；
第三组鉴别番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株的ARMS-PCR检测的引物组，所述引物组包括一对番鸭细小病毒特异性通用外侧引物以及针对番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株VP1基因第1150位核苷酸SNP位点的2条内侧鉴别引物；
所述番鸭细小病毒特异性通用外侧引物的序列如下：
外侧上游引物VPFO：5’-AAACCCAGACTCAAATACCCAATA-3’；
外侧下游引物VPRO：5’-TGAGCCGGTATACTGGAATCCTG-3’。
所述番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株VP1基因第1150位核苷酸SNP位点的2条内侧鉴别引物的序列如下：
第1150位核苷酸内侧上游引物P1-1150FI：5’-AATGCACACCAACCAGAGTGGAGATG-3’，
第1150位核苷酸内侧下游引物P-1150RI：5’-AAGGCACTTCTGTCATTGAACCT-3’。
检测MDPV标准强毒P株与MDPV疫苗弱毒P1株VP1基因点突变的ARMS-PCR的引物组以及强弱毒株预测扩增结果，所述引物序列以及MDPV标准强毒P株与MDPV疫苗弱毒P1株预测扩增结果见表1：
表1扩增引物信息表(单位：bp)
下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：
各实施例用病原MDPV标准强毒P株、MDPV疫苗弱毒P1株、鹅细小病毒(GPV)，鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭副黏病毒(DPMV)，番鸭呼肠孤病毒(MDRV)，新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)，鸭瘟病毒(DPV)均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定和保存。
实施例1：
MDPV标准强毒P株与MDPV疫苗弱毒P1株通用外侧引物特异性应用情况：
以常规方法提取MDPV标准强毒P株与MDPV疫苗弱毒P1株基因组DNA，分别作为模板。用所设计的MDPV标准强毒P株与MDPV疫苗弱毒P1株通用外侧引物VPFO、VPRO进行PCR扩增。
按照TaKaRa Taq HS Perfect Mix扩增试剂盒推荐的25μL，包括TaKaRa Taq HSPerfect Mix(2×)12.5μL，浓度均为20μmol/L的引物VPFO、VPRO各1μL，MDPV DNA模板1μL，补充DNase/RNase-free ddH2O至终体积25μL。
PCR最佳反应条件为：94℃5min；94℃20s、53℃30s、72℃30s，共33个循环，72℃延伸5min。
同时采用建立的PCR方法分别对鹅细小病毒(GPV)，鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭副黏病毒(DPMV)，番鸭呼肠孤病毒(MDRV)，新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)，鸭瘟病毒(DPV)基因组核酸进行扩增，设DNase/RNase-free ddH2O与空白对照，验证MDPV标准强毒P株与MDPV疫苗弱毒P1株通用外侧引物VPFO、VPRO的特异性。反应结束后，取3μL扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察、拍照。PCR结果判断：仅MDPV标准强毒P株、MDPV疫苗弱毒P1株分别出现阳性特异性816bp扩增条带，而鹅细小病毒(GPV)，鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭副黏病毒(DPMV)，番鸭呼肠孤病毒(MDRV)，新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)，鸭瘟病毒(DPV)、DNase/RNase-free ddH2O与空白对照中未检测到特异性扩增条带，试验结果见图1。
实施例2：
MDPV标准强毒P株与MDPV疫苗弱毒P1株VP1基因第942位碱基突变ARMS-PCR鉴别引物应用情况：
以常规方法分别提取MDPV标准强毒P株、MDPV疫苗弱毒P1株基因组DNA。
ARMS-PCR反应体系为25μL，包括TaKaRa Taq HS Perfect Mix(2×)12.5μL，浓度均为20μmol/L的引物P1-942FI、VPRO、VPFO、P-942RI各1μL，MDPV-P DNA模板1μL，MDPV-P1DNA模板1μL，补充DNase/RNase-free ddH2O至终体积25μL。
ARMS-PCR反应扩增条件为94℃5min；94℃20s、53℃30s、72℃30s，共33个循环，72℃延伸5min。
同时设DNase/RNase-free ddH2O与空白对照，验证建立ARMS-PCR方法的特异性。反应结束后，取3μL扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察、拍照。PCR结果判断：同时产生816bp与188bp特异性条带为MDPV标准强毒P株；同时产生816bp与681bp特异性条带为MDPV疫苗弱毒P1株。DNase/RNase-free ddH2O与空白对照中未检测到特异性扩增条带，试验结果见图2。
实施例3：
MDPV标准强毒P株与MDPV疫苗弱毒P1株VP1基因第1150位碱基突变ARMS-PCR鉴别引物应用情况：
以常规方法分别提取MDPV标准强毒P株与MDPV疫苗弱毒P1株基因组DNA。
ARMS-PCR反应体系为25μL，包括TaKaRa Taq HS Perfect Mix(2×)12.5μL，浓度均为20μmol/L的引物P1-1150FI、VPRO、VPFO、P-1150RI各1μL，MDPV-P DNA模板1μL，MDPV-P1DNA模板1μL，补充DNase/RNase-free ddH2O至终体积25μL。
ARMS-PCR反应扩增条件为94℃5min；94℃20s、53℃30s、72℃30s，共33个循环，72℃延伸5min。
同时设DNase/RNase-free ddH2O与空白对照，验证建立ARMS-PCR方法的特异性。PCR反应结束后，取3μL扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察、拍照。PCR结果判断：同时产生816bp与393bp特异性条带为MDPV标准强毒P株；同时产生816bp与471bp特异性条带为MDPV疫苗弱毒P1株。DNase/RNase-free ddH2O与空白对照中未检测到特异性扩增条带，试验结果见图3。
实施例4：
MDPV标准强毒P株与MDPV疫苗弱毒P1株VP1基因第942位、第1150位碱基突变ARMS-PCR鉴别引物应用情况：
以常规方法分别提取MDPV标准强毒P株与MDPV疫苗弱毒P1株基因组DNA。
ARMS-PCR反应体系为25μL，包括TaKaRa Taq HS Perfect Mix(2×)12.5μL，浓度均为20μmol/L的引物VPFO、VPRO各2μL，浓度均为20μmol/L的引物P1-942FI、P-942RI、P1-1150FI、P-1150RI各1μL，MDPV-P DNA模板1μL，MDPV-P 1DNA模板1μL，补充DNase/RNase-free ddH2O至终体积25μL。
ARMS-PCR反应扩增条件为94℃5min；94℃20s、53℃30s、72℃30s，共33个循环，72℃延伸5min。同时设DNase/RNase-free ddH2O与空白对照，验证建立ARMS-PCR方法的特异性。PCR反应结束后，取3μL扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察、拍照。PCR结果判断：同时产生816bp、393bp、188bp特异性条带为MDPV标准强毒P株；同时产生816bp、681bp、471bp特异性条带为MDPV疫苗弱毒P1株。DNase/RNase-free ddH2O与空白对照中未检测到特异性扩增条带，试验结果见图4。
实施例5：
临床应用：
取人工感染MDPV强毒P株雏番鸭、人工免疫MDPV弱毒疫苗P1株健康雏番鸭肝脏组织匀浆样品各9份，同时设MDPV强毒P株、MDPV弱毒疫苗P1株阳性对照以及非免疫雏番鸭肝脏组织匀浆阴性样品对照，按常规方法提取总DNA，分别参考实施例2、实施例3、实施例4的ARMS-PCR反应体系以及反应条件建立ARMS-PCR检测方法进行ARMS-PCR扩增。PCR反应结束后，取3μL扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察、拍照。
ARMS-PCR检测结果表明：
利用实施例2、实施例3、实施例4中对应的MDPV标准强毒P株与MDPV疫苗弱毒P1株ARMS-PCR鉴别引物组建立的ARMS-PCR检测方法均能实现良好的检测鉴别效果(如图5、图6、图7所示)。
相对于使用实施例2与实施例4中MDPV标准强毒P株与MDPV疫苗弱毒P1株ARMS-PCR鉴别引物组建立的ARMS-PCR检测方法(试验结果见图5、图6)而言，使用实施例3中以VP1基因第1150位碱基上A(MDPV强毒P株)→G(MDPV疫苗弱毒P1株)导致第384位氨基酸上R(MDPV强毒P株)→G(MDPV疫苗弱毒P1株)差异位点设计的ARMS-PCR鉴别引物扩增效果最好，特异性条带最清晰明亮，MDPV-P强毒株感染雏番鸭病料中产生816bp和393bp的特异条带；MDPV-P1弱毒疫苗株免疫健康雏番鸭的组织样品中产生816bp和471bp特异性条带；非免疫阴性对照雏番鸭组织样品均未产生特异性鉴别条带，试验结果见图7。随机选取检测为MDPV标准强毒P株阳性1个样品、MDPV弱毒疫苗毒P1株阳性1个样品816bp特异性扩增产物进行克隆测序，结果符合预期。且MDPV-P强毒株阳性样品VP1基因第942、第1150个核苷酸碱基均为A，MDPV-P1弱毒疫苗株阳性样品VP1基因第942、第1150个核苷酸碱基为G，均符合ARMS-PCR扩增引物设计时的MDPV标准强毒P株与MDPV弱毒疫苗毒P1株目的基因序列特征。
虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (6)

1.一种鉴别番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株的ARMS-PCR检测的引物组，其特征在于：所述引物组包括一对番鸭细小病毒特异性通用外侧引物以及分别针对番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株VP1基因第942、第1150位核苷酸SNP位点的4条内侧鉴别引物；
所述番鸭细小病毒特异性通用外侧引物的序列如下：
外侧上游引物VPFO：5’- AAACCCAGACTCAAATACCCAATA -3’；
外侧下游引物VPRO：5’- TGAGCCGGTATACTGGAATCCTG-3’；
所述番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株VP1基因第942、第1150位核苷酸SNP位点的4条内侧鉴别引物的序列如下：
第942位核苷酸内侧上游引物P1-942FI：5’- AGCACTCAAATTCAAGATATTCAATATG -3’，
第942位核苷酸内侧下游引物P-942RI：5’- CTTGCGTCGTGACTTCTTTAACTGGT -3’，
第1150位核苷酸内侧上游引物P1-1150FI：5’- AATGCACACCAACCAGAGTGGAGATG -3’，
第1150位核苷酸内侧下游引物P-1150RI：5’- AAGGCACTTCTGTCATTGAACCT -3’。
2.如权利要求1所述的引物组在制备鉴别番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株ARMS-PCR试剂盒中的应用。
3.一种鉴别番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株的ARMS-PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组。
4.根据权利要求3所述的ARMS-PCR试剂盒，其特征在于：其 ARMS-PCR 反应体系为25 μL，包括如下组分：
TaKaRa Taq HS Perfect Mix 2× 12.5 mL，浓度均为20 mmol/L的引物VPFO、VPRO各2mL，浓度均为20 mmol/L的引物P1-942FI、P-942RI、P1-1150FI、P-1150RI各1 mL，MDPV-PDNA模板与MDPV-P 1 DNA模板各1 mL或待测样品的核酸模板2mL，补充无酶无菌水至终体积25 μL；
ARMS-PCR反应扩增条件为94 ℃ 5 min；94 ℃ 20 s、53 ℃ 30 s、72 ℃30 s，共33个循环；72 ℃延伸5 min。
5.一种鉴别番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株的ARMS-PCR检测的引物组在制备鉴别番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株ARMS-PCR试剂盒中的应用，其特征在于：所述引物组包括一对番鸭细小病毒特异性通用外侧引物以及针对番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株VP1基因第942位核苷酸SNP位点的2条内侧鉴别引物；
所述番鸭细小病毒特异性通用外侧引物的序列如下：
外侧上游引物VPFO：5’- AAACCCAGACTCAAATACCCAATA -3’；
外侧下游引物VPRO：5’- TGAGCCGGTATACTGGAATCCTG-3’；
所述番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株VP1基因第942位核苷酸SNP位点的2条内侧鉴别引物的序列如下：
第942位核苷酸内侧上游引物P1-942FI：5’- AGCACTCAAATTCAAGATATTCAATATG -3’，
第942位核苷酸内侧下游引物P-942RI：5’- CTTGCGTCGTGACTTCTTTAACTGGT -3’。
6.一种鉴别番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株的ARMS-PCR检测的引物组在制备鉴别番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株ARMS-PCR试剂盒中的应用，其特征在于：所述引物组包括一对番鸭细小病毒特异性通用外侧引物以及针对番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株VP1基因第1150位核苷酸SNP位点的2条内侧鉴别引物；
所述番鸭细小病毒特异性通用外侧引物的序列如下：
外侧上游引物VPFO：5’- AAACCCAGACTCAAATACCCAATA -3’；
外侧下游引物VPRO：5’- TGAGCCGGTATACTGGAATCCTG-3’；
所述番鸭细小病毒标准强毒P株和疫苗弱毒P1株VP1基因第1150位核苷酸SNP位点的2条内侧鉴别引物的序列如下：
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