CN107760792B - 山羊nod1基因的一个snp标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于山羊分子标记筛选与应用技术领域，具体涉及山羊NOD1基因的一个SNP分子标记及应用。所述的分子标记是从山羊NOD1基因外显子中克隆得到，本发明还包括山羊NOD1基因外显子序列突变位点的检测方法与应用。本发明通过制备筛选得到一种山羊感染性状(FEC)相关的SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，在序列表SEQ ID NO:1所示序列的第301bp处存在一个G/A碱基突变，该突变导致PCR‑FokI‑RFLP多态性。本发明还公开了该分子标记的筛选方法及其在山羊的感染性状(FEC)关联分析中的应用。

Description

山羊NOD1基因的一个SNP标记及应用

技术领域

本发明属于山羊遗传标记筛选和应用技术领域，具体涉及山羊NOD1基因的一个SNP标记及应用，所述的标记是从山羊NOD1基因外显子中克隆得到，本发明还包括山羊NOD1基因外显子序列突变位点的检测方法与应用。

背景技术

近年来,我国山羊业迅速发展，但是受品种、疾病和生态环境因素的影响，羊肉的产量和消费量一直较低，国家统计局发布的《中国统计年鉴2015》数据显示：截止2014年底我国羊存量总量达到3.03亿头，其中山羊存栏量为14465.92万头，占存栏总量的47.72％。随着我国城乡居民生活水平的不断提高、生活方式和饮食方式的不断转变，我国羊肉消费市场快速发展，羊肉消费需求稳步增加，羊肉已不仅仅是部分边疆牧区和民族地区居民的重要肉类食品，目前几乎已是全民消费，其在改善我国城乡居民膳食结构、提高国人身体素质、满足人们饮食消费需要等诸多方面己不可或缺，发挥着越来越重要的作用。但目前,中国人均占有羊肉不足2.5kg，山羊肉的人均占有量更是不足1kg。家畜疫病的发生始终是影响畜牧业生产的主要问题，寄生虫病是山羊中最常见的疾病，而捻转血矛线虫是牛羊最主要的的寄生虫病之一，山羊感染捻转血矛线虫后，感染后的山羊常表现为胃肠炎、腹泻、消瘦，严重的会引起大批山羊急性死亡，给养殖户造成严重的经济损失。一些预防性措施的应用在养羊业中发挥了重要作用，如改善卫生环境、提高管理水平、注射疫苗药物等，但随着全球对减少食用肉中药物残留的呼声越来越高，采用分子遗传学方法选育抗病品系，从本质上提高畜禽机体自身抗病能力的方法已成一个开拓山羊养殖业的重要的研究领域。

目前我国养羊业对疾病的控制主要采取改善环境、免疫接种和药物治疗等措施,但这并非对所有疾病都有效,而且以上措施很难从根本上控制和消灭疾病的发生和流行研究证实,家畜对许多感染性疾病的抗性是由遗传控制的,家畜品种本身的遗传性状决定了某些感染性疾病的发病率,即动物可能对一些传染性疾病存在完全或部分抗性。通过寻找抗病基因进行抗病育种,从根本上改变反当动物的遗传结构,也是控制和减少疾病发生的有效途径之一。抗病基因辅助育种属于间接选择育种，主要是对一些免疫指标以及与免疫指标相关的分子标记来进行选育。随着分子生物学及其技术的发展，分子标记辅助育种已成为研究的热点和趋势。应用分子技术阐明免疫应答的分子机理和遗传控制机制，结合免疫性状指标进行抗病育种，必将大大加快动物抗病育种的进程。

分子标记辅助选择(Molecular marker-assisted selection，MAS)是随着现代分子生物学技术的迅速发展而产生的新技术，利用与育种性状相关的各种标记代替以表型为基础的选择，从分子水平上分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择，进行分子育种。可克服直接选择的弊端，提高选择准确性和缩短世代间隔(吴常信2000)。进行分子育种，首先要寻找一些新型的分子标记，如单核苷酸多态性(Single nucleotidepolymorphism，SNP)，由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入、缺失等。目前利用MassARRAY分子量阵列技术(李汉东等，基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱在微生物基因组研究中的应用.济宁医学院学报.2011,63-67)可以准确、方便，快捷的检查到。

应用分子技术阐明免疫应答的分子机理和遗传控制机制，结合免疫性状指标进行抗病育种，必将大大加快动物抗病育种的进程。免疫应答主要分为先天性免疫和获得性免疫。与获得性免疫系统相比，先天免疫不需要基因重组，它的多样性依赖于若干先天免疫基因，它们的接合变异型编码在宿主基因组中。先天免疫可以对病原体作出快速应答，并起防御第一道防线的作用。先天免疫系统通过模式识别受体(Patten recagnition receptors，PRRs)来识别病原体，模式识别受体可以检测到保守的微生物成分——病原体相关分子模式(Pathogen associated moleculal patterns，PAMPs)。先天免疫系统由几种模式识别受体组成，包括Toll受体(Toll-like receptors，TLRs)，NOD样受体(NOD-like receptors，NLRs)和RIG-1样受体(RIG-1like receptors，RLRs)。近期的研究发现核苷酸结合寡聚化结构域NLRs可以在细胞内识别PAMPs。这一细胞溶质PRRs的发现说明一些回避胞外检测的细菌在宿主细胞溶质中可被另一条识别路线所识别(Kanneganti TD等，Intracellular NOD-like receptors in host defense and disease.Immunity,2007,27(4)：549-559.)，说明了这类基因与动物细胞的先天性免疫密切相关并且是联系先天性免疫和后天性免疫的桥梁(Medzhitov R等，Toll-like receptors and innate immunity.Nature ReviewsImmunology,2001,1(2):135-145.)。

NOD1(Nucleotide Binding and Oligomerization Domain)基因编码的蛋白是NLRs家族CARD亚家族中的成员，包含一个单一CARD结构域，也是哺乳动物NLR家族中最先发现的细胞内微生物传感器，可以识别、抵御微生物病原体，在动物和植物体内的先天免疫中起重要作用。许多活体内的研究已证明NOD1蛋白都能促进细胞内病原体肺炎衣原体从肺中的清除。含有NOD1蛋白的老鼠会延迟清除肺部细菌且iNOS的表达及NO的产生有缺陷，说明NOD1可识别C.pneumoniae。NOD1与宿主抵御多种病原菌联系在一起，肽聚糖的成分meso-DAP(NOD1激动剂)可以通过NOD1激活人体上皮细胞来分泌抗菌因子和细胞因子(Uehara A等，Various human epithelial cells express functional Toll-like receptors,NOD1and NOD2 to produce anti-microbial peptides,but notproinflammatorycytokines.Mol Immunol,2007,44(12)：3100-3111)。

目前在山羊研究中，关于NOD1基因家族在寄生虫感染上的调控作用的研究还没有出现，本发明从NCBI中得到山羊NOD1基因家族，并找到了一个与山羊抗寄生虫性状密切相关的突变位点,对其进行了关联分析的应用检测，为山羊的抗病育种提供了新的分子标记资源。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，获得山羊NOD1基因的一个SNP标记，通过PCR扩增NOD1基因部分DNA片段，寻找突变位点，筛选一种与山羊抗寄生虫感染性状(主要为山羊感染性状(FEC))相关的分子标记，利用该分子标记进行抗寄生虫感染性状(主要为山羊感染性状(FEC))的标记辅助选择关联分析中的应用。

申请人通过基因克隆方法，得到一种与山羊抗寄生虫感染性状相关的NOD1基因DNA片段(该基因片段就是本发明制备的与山羊抗寄生虫感染性状相关的分子标记)，其核苷酸序列如下所示：

上述序列中的301位中的R是G或A，该突变不会导致NOD1基因编码区(反向互补序列)的氨基酸突变(密码子为CTG(D)或CTA(D)是同义突变)。但是该G/A突变导致PCR-FokI-RFLP多态性。

申请人设计了扩增上述NOD1基因片段的引物对(该引物对也是扩增本发明的分子标记的引物对)，其DNA序列如下所示：

正向引物：5'GAAACAGGGCAGCAAAGAAGG 3'(即SEQ ID NO:2所对应的序列)；

反向引物：5'CTGGATCATCTTCCGGTGCTT 3'(即SEQ ID NO:3所对应的序列)。

实现本发明的具体制备方法是：

提取山羊的基因组DNA，根据http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/中公布的山羊NOD1基因序列信息，设计PCR扩增引物(其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2和3所示)，以山羊基因组DNA为模版，用PCR方法扩增山羊NOD1基因的DNA片段，PCR产物纯化克隆和测序，通过序列分析获得如序列表SEQ ID NO：1所示的序列。在该序列的第301位有一个等位基因的突变(G/A)，该突变导致PCR-FokI-RFLP多态性，进而对所获得的PCR产物分型，进行基因型与山羊感染性状之间的关联分析的应用，为山羊的分子标记辅助选择提供一个新的分子标记。

本发明筛选的一种与山羊抗寄生虫感染性状(主要为山羊感染性状(FEC))相关分子标记可应用于山羊标记辅助选择中。

本发明制备的引物对在可应用于山羊抗寄生虫感染性状(主要为山羊感染性状(FEC))相关分子标记的筛选中。

本发明的效果如下：

本发明发现了一个与山羊抗寄生虫感染性状相关的分子标记，为山羊的抗病育种提供了新的分子标记资源。

更详细的技术方案见《具体实施方式》。

附图说明

序列表SEQ ID NO:1：是本发明筛选的山羊NOD1基因的一个SNP标记的核苷酸序列(即NOD1基因的特异片段)，序列长度为601bp。其中：在该序列的301-301bp处存在一个G—A的等位基因突变位点。

序列表SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3是扩增SEQ ID NO:所示的特异片段所用的正向引物和反向引物的DNA序列，也是检测山羊G/A变异PCR-FokI-RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法的正向引物和反向引物序列。

图1：本发明中NOD1基因部分DNA序列测序分型结果

图2：是克隆的山羊抗寄生虫感染性状相关基因NOD1基因部分DNA序列示意图(该图与SEQ ID NO:1所示的序列并不完全对应，序列表SEQ ID NO:1中第301处的碱基已经是突变后的碱基)，其中第301处的突变位点是G301-A301(G/A替换)。

图3：是本发明的技术流程示意图。

图4：本发明中NOD1基因部分DNA序列扩增琼脂糖凝胶电泳结果。附图标记说明：泳道M为maker，S1-S3和P1-P3为样本编号。

具体实施方式

实施例1 山羊基因组DNA提取，引物设计和突变位点的PCR扩增和样本的基因分型测试

1、山羊基因组DNA提取(中国山羊和孟加拉山羊)

本发明所使用的山羊群体的DNA样品全部采用天根生化(北京)技术有限公司生产的基因组DNA试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit；按该试剂盒说明书进行操作)提取，具体步骤如下所示：

(1)将取自中国山羊和孟加拉山羊的耳样(组织)放入2ml的EP管中，用酒精棉擦拭干净的眼科手术剪剪成糊状后加入200μl缓冲液GA(该试剂盒自带)。

(2)再加入20μl蛋白酶K溶液(该试剂盒自带)，混匀后置于56℃水浴锅中消化过夜。

(3)加入200μl缓冲液GB(该试剂盒自带)，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

(4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

(5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

(6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(该试剂盒自带)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(7)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(该试剂盒自带)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(8)重复步骤(7)的操作。

(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

(10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温下放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

(11)对提取出的DNA的浓度及质量进行检测后置于－80℃下保存备用。

2、引物设计和突变位点的PCR扩增

本发明的突变位点位于山羊NOD1基因组的外显子上，根据NCBI提供的山羊NOD1(登录号ACCESSION:NC_030811.1)基因组DNA序列信息，设计正、反向引物，其中正向引物为5’-GAAACAGGGCAGCAAAGAAGG-3’(即是如序列表SEQ ID NO：1的第159-179位所示的序列)，反向引物为5’-CTGGATCATCTTCCGGTGCTT-3’(即如序列表SEQ ID NO：1的第542-562位所示的序列)，

采用常规PCR方法扩增山羊NOD1基因的DNA片段：

PCR扩增：反应总体积50μL：双蒸水20μL、Premix25μL、上述制备的正向引物1.5μL、上述制备的反向引物1.5μL、山羊DNA2μL。

PCR扩增程序：95℃预变性5min，95℃30s，57℃30s，72℃30S，35个循环、72℃再延伸5min，15℃2min停止反应，共10管。

在本实施例中，PCR扩增所得的产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示均为特异的PCR产物，片段全长为404bp，如图4所示。经检测扩增产物为合格后，对上述扩增的产物进行测序，送商业基因(北京天一辉远生物科技有限公司进行测序。

对测序结果进行序列分析获得如序列表SEQ ID NO：1所示的序列。结果发现在SEQID NO：1所示序列的301bp处有一个G/A的等位基因替换(突变)，该突变导致RFLP-FokI酶切的多态性。

3、样本的基因分型测试

突变位点查找：通过比对测序结果，表明在扩增的产物的序列的第301bp处存在G301-A301突变，该突变导致RFLP-FokI多态性。

基因分型：取山羊样本中未感染和感染严重的个体的DNA，用超纯水稀释至30ng/μL，送往商业基因公司(北京六合华大基因科技有限公司)以MassARRAY分子量阵列技术(李汉东等，基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱在微生物基因组研究中的应用,济宁医学院学报,2011,63-67)进行基因型分析。

通过扩增山羊基因组DNA得到了404bp扩增片段(见图1)，序列分析结果表明在301bp处存在G301-A301位的等位基因突变(碱基替换)，该突变导致RFLP-FokI多态性。该基因突变位点由两个等位基因控制，其中A基因是形成酶切位点的等位基因，G基因是没有形成酶切位点的等位基因。这两个等位基因可组成三种基因型，其中AA型为发生酶切的纯合型，GG型为未发生酶切的纯合型，GA为杂合型。

实施例2 NOD1基因各基因型频率和基因频率检测

利用MassARRAY分子量阵列技术(李汉东等，基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱在微生物基因组研究中的应用，济宁医学院学报，2011,63-67)检测了中国山羊和孟加拉山羊群体的基因型，山羊群体的基因型频率和基因频率见表1所述。

研究结果显示：NOD1基因各基因型在检测的山羊群体中均有分布，在497个山羊个体中GG基因型有74个，GA基因型有173个个体，AA基因型有250个个体。即：G等位基因频率为0.32，A等为基因频率为0.68；可见A等位基因占优势。

表1 本发明的PCR--RFLP--FokI多态性在中国本地山羊和孟加拉山羊中的分布

表1的说明：在本说明书中使用的中国本地山羊，中国山羊和孟加拉山羊与简称的“山羊”同义。

实施例3：山羊NOD1基因分子标记位点G301-A301与山羊抗寄生虫感染性状(FEC)的关联分析

基因型与抗寄生虫感染性状关联分析所用的中国、孟加拉山羊群体。从每头山羊上采血用来提取基因组DNA和检测血液指标，例如血红蛋白和红细胞比积，并且收集粪便用于捻转血矛线虫的粪便虫卵计数。

申请人通过广义线性模型(GLM)进行山羊群体基因型与粪卵计数性状(FEC)之间的关联研究，并使用R软件3.2.5包。其线性模型如下：

y＝μ+B+V+SNP+e

其中，y是观察FEC(粪卵计数)特征，μ是总体群体平均数，B和V是品种和地域的固定效应，总共10个SNP相关联，e是残差。

在通过关联分析发现的所有山羊群体中粪便蛋计数(FEC)的所有重要SNP基因型之间进行多元回归分析。

对山羊NOD1基因DNA片段301bp处多态性位点与抗寄生虫感染性状进行关联分析。发现其在全基因组水平上与中国本地山羊的疾病感染显著相关(见表2)。

表2 NOD1基因片段301G/A多态性与山羊寄生虫感染性状的关联分析检测

表2的说明：显着性水平***(p<0.001)

由表1和表2可知，中国山羊品种和孟加拉的BBW山羊群体均表现出对捻转血矛线虫易感，但孟加拉BBH山羊群体则显示出不敏感，关联分析检测其301位G/A处的SNP(与FEC性状显著相关(p<0.001)，并且GG-AA(p<0.01)基因型与GG-AG(p<0.01)基因型也显著关联(p<0.01)，其山羊GG基因型个体的更容易感染寄生虫，AA基因型的个体对寄生虫感染具有较强的抗性，不同基因型的山羊个体对寄生虫感染的抗性在全基因组水平是显著的(P<0.001)。因此，选择A等位基因对中国本地山羊抗寄生虫感染性状选择是有利的。

说明：本说明书中使用的中国本地山羊，中国山羊，孟加拉山羊与简称的“山羊”同义。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 山羊NOD1基因的一个SNP标记及应用

<141> 2017-11-30

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 601

<212> DNA

<213> 山羊(Capra hircus)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(601)

<220>

<221> mutation

<222> (301)..(301)

<400> 1

cttgaagggg tcttccccat gcaggccacg gccccccaga cactggacgg ggagaaaagg 60

aggaaaacag gtcgatgtgg ccacagcctc ctcgggagga gtccactcct ggaagaacct 120

gagcagctcc ctagtgccta ccttgtcgtc caccactaga aacagggcag caaagaaggc 180

ctggagggtt aggtggaaga actcatagga ctgctgttcc tctccgaggc ccagctccgg 240

cacggtccga aggaagccca gctgcaggtc cccctcccgc acctcggacg cctgcacctc 300

gtcctggttg aagacaaaga ggctcttctc catgcccctg tgagccaccc ggcccagcga 360

gcacagggtg tcccggccgg cgcggagggt ctccgtctgg ctccgagtgt tctgctgcac 420

caggctggtg ggctgcgtcc tgttcaggtg gacctcggtg accaacagga agatgtcagt 480

cagcgtcacc gtgagatcag ggagctgcgg ggagctctca aaggtgtcgt ggaagtgctg 540

gaagcaccgg aagatgatcc agcagaagag gggcaccgcg cacaggctgc agaggttggg 600

g 601

Claims (3)

1.克隆自山羊NOD1基因的一个SNP分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如下所示：

CTTGAAGGGGTCTTCCCCATGCAGGCCACGGCCCCCCAGACACTGGACGGGGAGAAAAGGAGGAAAACAGGTCGATGTGGCCACAGCCTCCTCGGGAGGAGTCCACTCCTGGAAGAACCTGAGCAGCTCCCTAGTGCCTACCTTGTCGTCCACCACTAGAAACAGGGCAGCAAAGAAGGCCTGGAGGGTTAGGTGGAAGAACTCATAGGACTGCTGTTCCTCTCCGAGGCCCAGCTCCGGCACGGTCCGAAGGAAGCCCAGCTGCAGGTCCCCCTCCCGCACCTCGGACGCCTGCACCTCRTCCTGGTTGAAGACAAAGAGGCTCTTCTCCATGCCCCTGTGAGCCACCCGGCCCAGCGAGCACAGGGTGTCCCGGCCGGCGCGGAGGGTCTCCGTCTGGCTCCGAGTGTTCTGCTGCACCAGGCTGGTGGGCTGCGTCCTGTTCAGGTGGACCTCGGTGACCAACAGGAAGATGTCAGTCAGCGTCACCGTGAGATCAGGGAGCTGCGGGGAGCTCTCAAAGGTGTCGTGGAAGTGCTGGAAGCACCGGAAGATGATCCAGCAGAAGAGGGGCACCGCGCACAGGCTGCAGAGGTTGGGG，

上述序列中的301位中的R是G或A，导致PCR-FokI-RFLP多态性 。

2.一种引物组合在非诊断目的的山羊感染性状标记辅助选择中的应用，所述山羊品种为中国山羊，所述引物组合的序列如下所示：

正向引物：GAAACAGGGCAGCAAAGAAGG，

反向引物：CTGGATCATCTTCCGGTGCTT 。

3.一种分子标记在非诊断目的的山羊感染性状标记辅助选择中的应用，所述山羊品种为中国山羊，所述分子标记的核苷酸序列如下所示：

CTTGAAGGGGTCTTCCCCATGCAGGCCACGGCCCCCCAGACACTGGACGGGGAGAAAAGGAGGAAAACAGGTCGATGTGGCCACAGCCTCCTCGGGAGGAGTCCACTCCTGGAAGAACCTGAGCAGCTCCCTAGTGCCTACCTTGTCGTCCACCACTAGAAACAGGGCAGCAAAGAAGGCCTGGAGGGTTAGGTGGAAGAACTCATAGGACTGCTGTTCCTCTCCGAGGCCCAGCTCCGGCACGGTCCGAAGGAAGCCCAGCTGCAGGTCCCCCTCCCGCACCTCGGACGCCTGCACCTCRTCCTGGTTGAAGACAAAGAGGCTCTTCTCCATGCCCCTGTGAGCCACCCGGCCCAGCGAGCACAGGGTGTCCCGGCCGGCGCGGAGGGTCTCCGTCTGGCTCCGAGTGTTCTGCTGCACCAGGCTGGTGGGCTGCGTCCTGTTCAGGTGGACCTCGGTGACCAACAGGAAGATGTCAGTCAGCGTCACCGTGAGATCAGGGAGCTGCGGGGAGCTCTCAAAGGTGTCGTGGAAGTGCTGGAAGCACCGGAAGATGATCCAGCAGAAGAGGGGCACCGCGCACAGGCTGCAGAGGTTGGGG，

上述序列中的301位中的R是G或A，导致PCR-FokI-RFLP多态性 。

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