CN106947824A - 阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征易感基因adipoq的变异位点及其检测方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学和医学领域，本发明公开了一个阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征易感基因ADIPOQ的变异位点及其检测方法和该变异位点在阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征易感性检测方面的用途，此外还公开了一种通过检测该变异位点基因型来预测阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征患病风险的方法，包括抽提样品的基因组DNA、特异性扩增、检测、变异位点基因型分析等步骤，当所述位点发生基因型变异时阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征的患病风险增加。本发明还公开了一种检测阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征易感性的试剂盒。

Description

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征易感基因ADIPOQ的变异位 点及其检测方法和用途

技术领域

本发明涉及分子生物学和医学领域，尤其涉及一个阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征易感基因ADIPOQ基因的变异位点，本发明还涉及该变异位点的检测方法及检测试剂盒。

背景技术

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(obstructive sleep apnea-hypopneasyndrome，OSAHS)是睡眠期间周期性上呼吸道阻塞致呼吸暂停和低通气，引起反复的低氧血症。目前认识到OSAHS是一种全身性疾病。2008年美国心脏协会(AHA)/美国心脏病学学院基金会(ACCF)发表科学声明指出，OSAHS是高血压、冠心病、心力衰竭、心律失常、卒中等心脑血管病新认识到的、可干预的独立危险因素，OSAHS已成为重大公共卫生问题。2015ESC室性心律失常管理和心脏性猝死预防指南指出：睡眠呼吸暂停综合征减少血氧饱和度是心脏病猝死的危险因素。最新的《睡眠白皮书》显示我国20.4％的成人患有OSAHS。

在美国未经控制的中-重度OSAHS每年会增加个人健康消费2700-3000美元，同时，美国中-重度OSAHS每年总经济成本达650-1650亿美元以上。虽然目前我国尚缺乏OSAHS对健康消费影响的研究，但2005-2015年心血管疾病、卒中和糖尿病给中国造成约5500亿美元的经济损失，而OSAHS作为心血管疾病的独立危险因素，在健康消费中也应占有重要地位。

OSAHS是多病因引起的综合征，其中遗传因素在其发病过程中占有重要地位，睡眠呼吸暂停指数的变化大约40％归因于遗传。由于环境因素是可以人为控制和改变的，而OSAHS遗传学因素却是固定不变的。对可变因素的控制，如对OSAHS危险因素的预防，可以在一定程度上延缓和预防OSAHS的发病，但是对固定不变的遗传因素的认识不足却严重影响着对OSAHS的预测、诊断和治疗。因此，对OSAHS进行充分的遗传学研究显得尤为必要。

早在1978年，Rostand等提出OSAHS是常染色体显性遗传病；1993年，Duglas等对20个非肥胖的睡眠呼吸暂停患者的一级亲属做了前瞻性研究，研究发现，其亲属在睡眠中呼吸紊乱的频率增加；2003年，Palmer等对66个确诊OSAHS的白种人进行全基因扫描，发现与AHI相关的基因位于染色体1q、2q、12q、19q，而与BMI相关的基因位于染色体2q、7q、19q；随着二代测序的发展，越来越多的易感基因被发现。

最新的一项包括12558名参与者的GWAS研究发现：5个基因(GPR83、ATP2B4、ARRB1、INSIG2和PLCB1)与OSAHS的发生相关，其中两个新的位点rs11691765、rs35424364与OSAHS显著相关。但该研究是针对拉丁美洲国家开展的，鉴于OSAHS相关基因分布有明显的种族差异，对亚洲人群而言借鉴意义不大。

脂联素(ADIPOQ)基因已被证实为一种OSAHS的易感基因。人类ADIPOQ基因全长17kb，位于染色体3q27，包括分子量从18-4277bp的3个外显子和大小为0.8bp和12bp的2个内含子。该基因包含公认的启动子元件，但没有典型的TATA(胸腺嘧啶核苷-腺嘌呤核苷-胸腺嘧啶核苷-腺嘌呤核苷)盒，第3个外显子含有一段长的包括3个Alu的重复序列，这种外显子-内含子的结构与编码瘦素(leptin)的肥胖基因非常相似，并且该基因仅在白色脂肪组中表达，其转录产物脂联素是脂肪组织基因表达最丰富的蛋白质产物之一，其血浆浓度为5-30μg/ml，约占总血浆蛋白的0.01％。

ADIPOQ基因编码脂联蛋白的C1Q和胶原结构域(adiponectin，C1Q and collagendomain containing)——一种在结构上与胶原X和VIII以及补体C1q类似的蛋白质。脂联素作为特异的脂肪细胞因子，也与肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病和心血管疾病密切相关。这些疾病患者很多脂肪细胞因子的血浆浓度明显上升，但血浆脂联素水平却显著下降。此外，脂联素与体重、脂肪分布、空腹胰岛素浓度、葡萄糖耐量试验呈负相关，与胰岛素敏感性呈正相关，因此脂联素可以作为这些疾病的诊断指标。脂联素可能通过其受体结合激活p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)，活化过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)后发挥改善胰岛素抵抗、降血糖、抗炎等生物学作用；还可通过与脂联蛋白受体1(AdipoR1)结合，活化AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)进而发挥生物学作用。

研究证实：ADIPOQ基因的突变或异常表达等都会引起胰岛素抵抗相关的代谢综合征。其在OSAHS患者中主要表现为表达水平下降，可能的原因是其表达调控出现了异常，但是目前对OSAHS患者ADIPOQ基因变异及转录调控方面的研究仍较少。尤其是针对中国人群的ADIPOQ基因变异位点相关研究非常缺乏，鉴于不同人种间相同基因中发生单一核苷酸变异的位点往往具有一定差异，因此，很有必要对中国人群的ADIPOQ基因变异位点进行深入研究，力争寻找到相关位点并建立相应的检测方法，并推广应用于国人阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征易感人群的筛查、预防和早期诊断和治疗。

发明内容

本发明公开了一个针对中国人群的阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征易感基因ADIPOQ的变异位点，所述位点位于ADIPOQ基因3’端非编码区中Chromosome 3-NC_000003.11区域186575720-186575721位点处，所述位点的位置在SEQ ID NO:1所示的序列中。

ADIPOQ基因详细序列可参见登录号：NG_021140.1。

ADIPOQ基因3’端非编码区186575720-186575721位点的核苷酸序列可参见网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。

本发明人对ADIPOQ基因的3’端非编码区域进行了测序。

本发明旨在提供一种检测上述阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征易感基因ADIPOQ变异位点的方法。

本发明还提供了一种通过对OSAHS易感基因的检测来预测阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征发病风险的方法，即检测ADIPOQ基因3’端非编码区186575720-186575721位点处的基因型是否发生变异。该基因3’端非编码区186575720-186575721位点处发生CT缺失变异的基因型个体其阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征的发病风险远高于普通人群。

上述方法的具体步骤包括：(a)利用DNA纯化试剂盒抽提样品的基因组DNA，扩增获得ADIPOQ基因3’端非编码区；(b)通过特异性引物扩增获得该基因包含3’端非编码区186575720-186575721位点的区域，所述特异性引物序列如SEQ ID NO:2-3所示，扩增产物序列如SEQ ID NO:4所示；(c)检测步骤；(d)产物中基因变异位点3’端非编码区186575720-186575721位点的基因型分析。

上述方法中涉及的抽提基因组DNA、测序、扩增等技术均可采用本领域的常规操作方法。

本发明还涉及了ADIPOQ基因3’端非编码区186575720-186575721位点基因变异检测在预测阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征试剂盒和阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征诊断及治疗药物中的应用。

本发明提供了一种检测阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征易感基因变异位点的试剂盒，其中包含扩增ADIPOQ基因3’端非编码区186575720-186575721位点区域的特异性引物。在本发明的一个实施例中，扩增ADIPOQ基因3’端非编码区186575720-186575721位点区域的特异性引物序列如SEQ ID NO:2-3所示。

本发明通过深入研究，首次证明了ADIPOQ基因变异位点3’端非编码区186575720-186575721位点(位于ADIPOQ基因3’端非编码区中Chromosome 3-NC_000003.11区域的186575720-186575721位点的CT缺失变异)与OSAHS的发生密切相关，并且发现了该变异位点新的预测功能：ADIPOQ基因3’端非编码区186575720-186575721位点基因型的改变将导致OSAHS的发病风险升高。其中关联研究结果显示，该基因3’端非编码区186575720-186575721位点的CT缺失变异在病例组和对照组中的分布存在显著性差异(p<0.05)，即在OSAHS患者中该基因型主要变现为CT缺失变异，而在正常对照组中该基因型无缺失变异，该位点变异通过改变转录因子的结合位点发挥生理作用。

本发明提供了一种对个体的OSAHS易感性进行判断的方法，包括以下步骤：检测受试个体的ADIPOQ基因3’端非编码区186575720-186575721位点的基因型，根据该基因型变异与否判断该个体患OSAHS的风险是否高于普通人群。

本发明提供了一种检测样品是否存在ADIPOQ基因单核苷酸多态性的方法，包括以下步骤：(a)用ADIPOQ基因3’端非编码区特异性引物扩增样品的基因组DNA，得到扩增产物；(b)检测扩增产物中186575720-186575721位点区域的基因型。

上述ADIPOQ基因3’端非编码区186575720-186575721位点的基因型可用本领域常规技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交法等检测突变。

综上所述，本发明发现并公开了一个与中国人群阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征易感性相关的ADIPOQ基因新的变异位点，并提供了一种检测阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征易感基因ADIPOQ基因3’端非编码区186575720-186575721位点变异的方法，包括检测该位点的基因型。此外，本发明还公开了ADIPOQ基因3’端非编码区186575720-186575721位点基因变异检测在预测阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征试剂盒和阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征诊断及治疗药物中的用途，并提供了相应的检测试剂盒，该试剂盒中包含扩增ADIPOQ基因3’端非编码区186575720-186575721位点区域的特异性引物。本发明在一定程度上补充了国人阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征易感基因信息的缺乏，有利于阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征的早期筛查和诊断。同时，本发明变异位点基因型检测方法及试剂盒操作简便、快速高效、成本低廉、易于推广，从而为阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征患病风险的预测提供了简捷的新途径，有助于OSAHS及相关心脑血管疾病的预防和治疗。

附图说明

图1是利用本发明引物通过PCR扩增后所得产物测序结果截图。显示了ADIPOQ基因3’端非编码区186575720-186575721位点的一种变异基因型的测序结果。其中A图为正常对照组正向测序图，B图为重度阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征患者组正向测序图。从图中可以看出，正常对照组的CT碱基在重度OSAHS组中出现碱基缺失变异。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.Sambrook等著，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照实验器材制造厂商所建议的条件。

实施例1 阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征相关基因筛查

研究对象：严格按照重度阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征的入组和排除标准入选病例和对照组各100例；收集相应的临床资料信息(基本信息，生化指标，病史)及静脉血4ml；DTA抗凝管收取，暂时4℃保存。分离白细胞：将盛有血液的抗凝管放入离心管中，3000r/min离心10min，可见血液分为三层：下层为红细胞，中间层为白细胞，上层为血浆，分离外周血白细胞，1.5mlEP管中存放，然后置于-80℃保存。

一、提取外周血DNA、测定浓度和纯度

使用QIAamp DNA Mini Kit(购自Qiagen,Hilden,Germany)，提取外周血基因组DNA。

实验试剂：

无水乙醇(分析纯) 西陇化工股份有限公司

QIAamp DNA Mini Kit Qiagen,Hilden,Germany

实验仪器：

提取方法：

取全血200μl，按照QIAamp DNA Mini Kit基因组抽提试剂盒说明书，提取基因组DNA，实验步骤如下：

1、用移液枪吸20μl蛋白酶放在1.5ml EP管中，加入200μl血样；

2、加入200μl Buffer AL至样品，震荡15s；

3、56℃金属浴加热10min；

4、加入200μl乙醇(96-100％)，震荡混匀15s；

5、混合物加入吸附柱管中，8000rpm离心1min，把柱子放到新管子中，弃滤液；

6、加入500μl Buffer AW1于吸附柱中，8000rpm离心1min，把柱子放到新管子中，弃滤液；

7、加入500μl Buffer AW2，8000rpm离心1min，把柱子放到新管子中，弃滤液；

8、在离心管中加入500μl无水乙醇，8000rpm离心1min，弃滤液；

9、12000rpm空转3min；

10、把吸附柱放在干净的离心管中，开盖室温静置5min，加入50μl Buffer AE，扣盖室温中静置5min，12000rpm离心1min。

DNA浓度及纯度测定：

按照Nanodrop2000仪器使用说明书检测基因组DNA浓度及纯度。

实验步骤如下：

1、打开测定软件；

2、加1.5μl蒸馏水至测量孔，放下检测臂，然后抬起来用滤纸将测量孔和检测臂的水擦干；

3、用移液枪取1.5μl Buffer AE至测量孔，放下检测臂，点击Blank做空白对照；

4、抬起检测臂，用滤纸将测量孔和检测臂的水擦干，吸取1.5μl样本至测量孔，放下检测臂，点击Measure测量，记录OD260、OD280值。DNA样本的浓度(μg/ml)＝OD260*50；纯度值OD260/OD280＞2.0，表明有RNA污染；纯度值OD260/OD280＜1.6，表明有蛋白质、有机溶剂等污染。

二、运用sanger测序法对ADIPOQ基因上的变异位点186575720-186575721进行检测

主要试剂和仪器：

实验步骤如下：

1、运用PCR扩增含目的位点的基因片段

引物序列：

正向引物：5’－AAAATAACATACGCACTCAACTTCC－3’；

反向引物：5’－AGAGGTAGCAGTGAGCCAAGAT－3’。

2、PCR反应体系

3、PCR反应条件如下：

95℃10min预变性；

95℃30s变性—60℃30s退火—72℃30s延伸，共35个循环；

72℃10min延伸；4℃保存。

4、琼脂糖凝胶电泳

取琼脂糖1.8g，倒入三角烧杯，加入1X TBE缓冲液，定容至60ml，微波炉加热溶解；2min后取出烧杯，加入EB溶液2μl，混匀，倒入固定有塑料齿梳的凝胶槽；30min后取出梳子和隔板，将成型的胶放入水平电泳槽中；吸取5μl酶切产物至薄膜手套表面，加入1μl 6X上样缓冲液，移液枪吹打混匀，将上述混合物加入到凝胶点样孔中，最后加入5μl DL500作为Marker。打开开关，设置电压120V，电泳30min后，将凝胶置入凝胶成像仪。

5、运用E.Z.N.A.Gel Extraction Kit试剂盒从琼脂糖凝胶中回收目标DNA片段实验步骤如下：

1)切取目标片段的凝胶，称重，加入等倍量Binding Buffer(如凝胶0.2g，则体积为0.2ml)，于65℃温浴10min，使凝胶完全融化；

2)转移上述混合液至HiBind DNA柱子上，10000rpm离心1min，弃去滤液；

3)加入Binding Buffer 300μl，10000rpm离心1min，弃去滤液；

4)加入SPW Washbuffer 700μl，10000rpm离心1min，弃去滤液；

5)重复步骤4)一次；

6)13000rpm离心2min甩干残留的液体；

7)加入50μl灭菌水在柱膜上洗脱DNA，室温放置5min，10000rpm离心1min，收集滤液即为目标DNA片段。

然后以回收的目标DNA片段为模板，建立测序PCR反应，反应体系如下：

测序PCR反应条件如下：

96℃10min预变性；

96℃10s变性—50℃5s退火—60℃4min延伸，共25个循环；

60℃7min延伸；4℃保存。

对PCR产物进行上机前纯化，步骤如下：

1)EP管中加入2μl 125m MEDTA，2μl 3M NaAc和50μl无水乙醇，混匀，室温放置15min，3000rpm离心30min，倒置EP管，甩去上清液；

2)加入70μl 70％乙醇，3000rpm离心30min，倒置EP管，甩去上清液；

3)重复步骤2)一次；

4)室温挥发掉乙醇，加入10μl HiDi溶解DNA，95℃变性4min，迅速置冰上冷却4min后，转移至96孔板中；

5)在3130基因分析仪中进行毛细电泳分析(结果如附图1所示)。

三、统计结果分析：计算基因位点的突变率，进行关联分析。结果显示ADIPOQ基因3’端非编码区186575720-186575721位点的CT缺失变异在病例组和对照组中的分布存在显著性差异(p<0.05)，即在OSAHS患者中该基因型主要表现为CT缺失变异，而在正常对照组中该基因型无缺失变异。

在本发明中提及的所有文献都在本申请中引用做参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。

SEQUENCE LISTING

<110> 首都医科大学附属北京安贞医院，北京市心肺血管疾病研究所

<120> 阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征易感基因ADIPOQ的变异位点及其检测方法

和用途

<130> 2017

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1000

<212> DNA

<213> 人体

<400> 1

agctggaaaa ttcctattga ttttctctaa aatttcaaca agtagctaaa gtctggctat 60

gctcacagtc tcacatctgg ttggggtggg ctccttacag aacacgcttt cacagttacc 120

ctaaactctc tggggcaggg ttattccttt gtggaaccag aggcacagag agagtcaact 180

gaggccaaaa gaggcctgag agaaactgag gtcaagattt caggattaat ggtcctgtga 240

tgctttgaag tacaattgtg gatttgtcca attctcttta gttctgtcag cttttgcttc 300

atatatttta gcgctctatt attagatata tacatgttta gtattatgtc ttattggtgc 360

atttactctc ttatcattat gtaatgtcct tctttatctg tgataatttt ctgtgttctg 420

aagtctactt tgtctaaaaa taacatacgc actcaacttc cttttctttc ttccttcctt 480

tctttcttcc ttcctttctt tctctctctc tctttccttc cttccttcct ccttttcttt 540

ctctctctct ctctctctct ttttttgaca gactctcgtt ctgtggccct ggctggagtt 600

cagtggtgtg atcttggctc actgctacct ctaccatgag caattctcct gcctcagcct 660

cccaagtagc tggaactaca ggctcatgcc actgcgccca gctaattttt gtatttttcg 720

tagagacggg gtttcaccac attcgtcagg ttggtttcaa actcctgact ttgtgatcca 780

cccgcctcgg cctcccaaag tgctgggatt acaggcatga gccatcacac ctggtcaact 840

ttcttttgat tagtgttttt gtggtatatc tttttccatc atgttacttt aaatatatct 900

atattattgt atttaaaatg tgtttcttac agactgcatg tagttgggta taatttttat 960

ccagtctaaa aatatctgtc ttttaattgg tgtttagaca 1000

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaaataacat acgcactcaa cttcc 25

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agaggtagca gtgagccaag at 22

<210> 4

<211> 174

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aggggtcatt gtcttctttc tttcttcctt cctttctttc tctctctctc tttttctctc 60

tctctctcct cttttttttt ctctctctct ctctctcttt ttttgagaca cactctctct 120

gtgggcctgg ggggggattt caggggtgag ctcgtgtctc tgtgacatct ctaa 174

Claims (9)

1.一个阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征易感基因ADIPOQ的变异位点，其特征在于：所述变异位点位于ADIPOQ基因3’端非编码区中Chromosome 3-NC_000003.11区域的186575720-186575721位点处，所述186575720-186575721位点的位置在SEQ ID NO:1所示的序列中。

2.如权利要求1所述的ADIPOQ的变异位点在制备阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征易感性检测试剂中的用途。

3.如权利要求1所述的ADIPOQ的变异位点在制备阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征诊断或治疗药物中的用途。

4.一种通过检测权利要求1所述的ADIPOQ的变异位点来预测阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征患病风险的方法，包括以下步骤：(a)利用DNA纯化试剂盒抽提样品的基因组DNA，扩增获得ADIPOQ基因3’端非编码区；(b)通过特异性引物扩增获得该基因包含3’端非编码区186575720-186575721位点的区域，扩增产物序列如SEQ ID NO:4所示；(c)检测步骤；(d)产物中3’端非编码区186575720-186575721位点的基因型分析，发生CT缺失变异的基因型个体其阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征的患病风险增加。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述特异性引物序列如SEQ ID NO:2-3所示。

6.如权利要求4所述的方法，其中所述的检测步骤采用以下检测方法：Southern印迹法、DNA序列分析、PCR或原位杂交法。

7.一种检测阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征易感性的试剂盒，其中包含扩增ADIPOQ基因3’端非编码区186575720-186575721位点区域的特异性引物。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其中所述特异性引物序列如SEQ ID NO:2-3所示。

9.如权利要求7或8所述的试剂盒，通过所述特异性引物扩增获得ADIPOQ基因包含3’端非编码区186575720-186575721位点的区域，并对该位点进行检测和基因型分析，所述位点发生CT缺失变异时阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征的患病风险增加。