CN104513828A - 冠心病相关基因即cyp17a1基因及其体外检测的试剂、制剂或试剂盒、应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程中冠心病相关基因相关技术领域，涉及一种冠心病相关基因即CYP17A1基因及其体外检测的试剂、制剂或试剂盒、应用，该基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO: 1所示的序列。本发明对冠心病相关基因及其体外检测的试剂、制剂或试剂盒和应用做了详细介绍，该体外检测冠心病相关基因的试剂盒除了可以用于体外检测冠心病相关基因的多态性外，还可以用于检测、预防、诊断或治疗冠心病，从而降低冠心病的发生率，对预防和治疗冠心病具有重大的意义。 <b/>

Description

冠心病相关基因即CYP17A1基因及其体外检测的试剂、制剂或试剂盒、应用

技术领域

本发明属于生物工程中冠心病相关基因相关技术领域，涉及一种冠心病相关基因即CYP17A1基因及其体外检测的试剂、制剂或试剂盒、应用。

背景技术

流行病学与临床研究表明，冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary artery disease)是发达国家和大多数发展中国家成年人发病和死亡的主要原因。许多发展中国家(包括中国)，随着人均寿命的延长、物质条件的富裕和生活方式的西方化，冠心病患病率和死亡率呈逐年增高的趋势已引起全球性关注。预计到本世纪20年代冠心病可能成为全球排名第一名的疾病。虽然近年来冠心病的诊断和治疗有了很大发展，冠心病2级预防药物和介入治疗等大大改善了冠心病患者的预后，但其病因学与发病机制的研究仍然进展缓慢。自上世纪60年代Frmainghma的研究结果公布以来，人们对冠心病的认识也有了很大的提高，已经认识到冠心病不只是一种单因素疾病，而是由多种内源性及外源性因素共同决定的复杂性疾病，除了传统的危险因素，如高血压，糖尿病，吸烟，代谢综合征等环境因素外，遗传因素在冠心病发生发展过程中的作用也得到了更进一步的认识及得到了一定程度的重视，在冠心病发生发展中遗传因素约占40%至60%。

冠心病的患病率及病死率与性别明显相关，男性明显高于女性，因此，性别和性激素与冠心病的关系深受人们的关注。新的研究证实，睾酮(testosterone，T)与冠心病多种危险因素密切相关，如血脂代谢紊乱、高血压、胰岛素抵抗与糖尿病、凝血纤溶系统等。但睾酮影响冠心病的发生、发展的机制目前尚未完全阐明。近年来研究发现，睾酮具有抗动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)的作用，生理剂量的睾酮可以抑制AS的反应，而睾酮水平低下则是AS及冠心病的高危险因子，Webb等对睾酮水平低下的老年男性补充少剂量睾酮制剂后可增加血管内皮功能，舒张冠状动脉，缓解老年男性心绞痛症状，改善心肌缺血。Morris等也研究发现经冠状动脉造影证实为冠心病患者较对照组睾酮水平明显降低。

大量研究证实血管内皮功能紊乱是冠心病发生发展的关键机制，生理量睾酮可直接作用血管内皮细胞促进一氧化氮释放，改善内皮功能，而低睾酮水平可降低血管内皮功能而促进冠心病的发生。脂质代谢紊乱也是冠心病的主要发病机制之一，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、总胆固醇(TC)升高是AS和冠心病发生的主要危险因子，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)则与AS和冠心病的发病呈负相关，研究表明睾酮水平与高密度脂蛋白胆固醇呈显著正相关，与总胆固醇、三酰甘油(TG)、极低密度脂蛋白(VLDL)均呈显著负相关，Malkin等也证实低水平睾酮引起血脂紊乱，而补充睾酮可以纠正血脂紊乱。胰岛素抵抗和糖尿病是冠心病重要的独立危险因素，游离睾酮水平降低与糖尿病有一定的关系，Selvin等研究证实2型糖尿病发病与低游离或低生物活性的睾酮水平密切相关。凝血与纤溶障碍是冠心病发生的重要机制，生理水平的睾酮可改善血管内皮细胞的功能，促进内皮细胞组织因子通道抑制剂及组织纤维蛋白溶酶原激活剂的表达，抑制纤溶酶原激活物抑制剂的分泌，睾酮水平低下时增加凝血因子VIII相关蛋白，致血管内皮功能异常及血管炎性反应，可促进血小板黏附于受损血管壁，增加冠心病的发生率。

雌激素是一种主要参与女性生殖的激素，但是在其他许多的生理和病理过程中都起着十分重要的作用，如调解血管收缩、血管内皮修复和脂质代谢，参与葡萄糖代谢和胰岛素血管通路等，这些都会直接或间接地影响到心血管系统的功能。目前认为雌激素通过这些不同的途径对心血管系统起着保护作用，雌激素缺乏可能对心血管系统产生不利的影响。综上，性激素及其比例关系在心血管疾病尤其是冠心病的发病中有着十分重要的作用。

 CYP17A1基因位于10q24.3，有8个外显子及7个内含子，主要在肾上腺及性腺表达。CYP17A1基因编码P450c17蛋白，该酶属于细胞色素P450超家族酶之一，催化许多反应，包括药物代谢及胆固醇、类固醇和其他脂类的合成，它含有17α-羟化酶和17,20-碳链裂解酶两种酶活性，是肾上腺及性腺类固醇激素(包括性激素)合成的关键酶之一。CYP17A1基因的多态性可导致17α-羟化酶和/或17,20-碳链裂解酶的缺乏，影响性激素的前体物质脱氢表睾酮和雄烯二酮的合成，从而引起一系列影响冠心病发生发展的病理生理变化。

 CYP17A1基因是近期在一项有关冠心病的全基因组关联研究（GWAS）中发现的新基因,认为遗传多态性与冠心病之间存在关联。近年来对于CYP17A1基因多态性及编码蛋白质在心血管系统发生发展过程中的作用逐渐引起了人们关注。

发明内容

本发明提供了一种冠心病相关基因即CYP17A1基因及其体外检测的试剂、制剂或试剂盒、应用，能够检测，预防，诊断或治疗冠心病。

本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种冠心病相关基因即CYP17A1基因，该基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO: 1所示的序列。

本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种体外检测根据权利要求1所述的冠心病相关基因的试剂，该试剂用于检测CYP17A1基因rs4919687位点的多态性，该试剂包括如下引物:

上游引物：5'CCACTCTTGCCCTTACAC 3'

下游引物：5'GCAGTCCTCAGCCTCTAC 3'

下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进：

上述试剂可为用于聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合的试剂或用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂。

本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的：一种有体外检测冠心病相关基因的试剂的制剂或试剂盒，该试剂盒包含PCR扩增酶及相应缓冲液。

本发明的技术方案之四是通过以下措施来实现的：一种体外检测冠心病相关基因的试剂在制备用于体外检测冠心病相关基因的制剂或试剂盒中的应用。

下面是对上述发明技术方案之四的进一步优化或/和改进：

上述试剂盒中可包含PCR扩增酶及相应缓冲液。

本发明对冠心病相关基因及其体外检测的试剂、制剂或试剂盒和应用做了详细介绍，该体外检测冠心病相关基因的试剂盒除了可以用于体外检测冠心病相关基因的多态性外，还可以用于检测、预防、诊断或治疗冠心病，从而降低冠心病的发生率，对预防和治疗冠心病具有重大的意义。

附图说明

图1为本发明的rs4919687多态性位点的酶切图谱。其中如泳道1,2,3,5,6和7显示待测个体rs4919687位点的基因型为G/G纯合子；泳道4显示待测个体的rs4919687位点为A/G杂合子；泳道8显示待测个体的rs4919687位点为A/A纯合子。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明，实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。除非特别说明，本发明中的%均为质量百分数；除非特别说明，制备过程在常温、常压状态下进行；除非特别说明，本发明中采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备；除非特别说明，本发明中采用的试验条件为本技术领域常规试验条件；除非特别说明，本发明中所用试剂均为市购；除非特别说明，本发明中的水为去离子水；除非特别说明，本发明中的溶液均为溶剂为水的水溶液，例如，若未做特别说明，盐酸溶液为盐酸水溶液。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件进行：如Sambrook等人所著的《分子克隆：实验手册》(New fork: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1，一种冠心病相关基因即CYP17A1基因，该基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO: 1所示的序列。含有CYP17A1的基因的待测样品可以从来自试验者的细胞获得，如来自血液、尿、唾液、胃液、头发、活组织检查和尸体解剖材料的细胞，优选来自血液。

实施例2，一种体外检测冠心病相关基因的试剂，该试剂用于检测CTP17A1基因rs4919687位点的多态性，该试剂包括如下引物:

上游引物：5'CCACTCTTGCCCTTACAC 3'

下游引物：5'GCAGTCCTCAGCCTCTAC 3'

所谓“基因多态性”指的是在人群中，各个体基因的核苷酸序列存在的差异。本领域普通技术人员已知，本发明所述的多态性位点为单核苷酸多态性（SNP）位点，即基因组序列中单核苷酸发生改变；核苷酸酸序列的差异可以体现在DNA水平上或者RNA水平上，所以，本发明的冠心病相关基因可以体现在DNA水平，RNA水平上，优选DNA水平，更优选基因组DNA。

目前关于复杂性状疾病的研究有两种策略，连锁分析的方法和病例-对照研究。由于冠心病是一种多因素疾病，是由遗传和环境因素共同作用的结果，因而采用连锁分析较为困难。从遗传的角度分析，冠心病/心肌梗死属于复杂遗传性状疾病。对该疾病的发生起作用的因素中，除环境因素外，起作用的基因总数估计多达上百条，各个基因之间又存在着相互作用，基因又和环境之间存在相互作用。冠心病/心肌梗死的发生具有一定的家族聚集性，但更多的是一些散发病例。所以本发明采用病例对照研究。所述病例对照研究就是在采用随机挑选的两组人群中(病例和对照)比较某等位基因的频率。

本发明在新疆维吾尔族人群中通过统计分析(189例冠心病患者和180例对照)，经过大量的实验，最后以确凿的证据证明了具有本发明的rs4919687多态性位点的CYP17A1基因为冠心病相关基因，A等位基因的携带者患冠心病的危险性较G等位基因携带者增加了2.3倍

实施例3，作为上述实施例的优选，该试剂为用于聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合的试剂或用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂。试剂盒中检测rs4919687位点的试剂根据检测方法的不同而不同，例如，采用聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合方法来检测rs4919687多态性位点时，试剂盒中可以含有限制性内切酶和相应的酶切图谱，例如kpnI限制性内切酶和相应的酶切图谱。

实施例4，一种有体外检测冠心病相关基因的试剂的制剂或试剂盒，其特征在于该试剂盒包含PCR扩增酶及相应缓冲液。本发明检测rs4919687位点多态性的冠心病相关基因的试剂盒可以用于体外检测冠心病相关基因的多态性；rs4919687位点突变的冠心病相关基因的试剂盒可以用于检测、预防、诊断或治疗冠心病；体外检测冠心病相关基因的方法可以用于检测、预防、诊断或治疗冠心病。

实施例5，一种体外检测冠心病相关基因的试剂在制备用于体外检测冠心病相关基因的制剂或试剂盒中的应用。本发明检测rs4919687位点多态性的冠心病相关基因的试剂盒可以用于体外检测冠心病相关基因的多态性；rs4919687位点突变的冠心病相关基因的试剂盒可以用于检测、预防、诊断或治疗冠心病；体外检测冠心病相关基因的方法可以用于检测、预防、诊断或治疗冠心病。

实施例6，与上述实施例的不同之处在于，试剂盒还包含PCR扩增酶及相应缓冲液。

实施例7，研究对象的选取

冠心病组（CAD组）189例，选自2006年1月～2011年7月在新疆医科大学第一附属医院心脏中心住院患者，符合世界卫生组织(WHO)关于缺血性心脏病的命名和诊断标准。对照组180例，选择2006年至2011年新疆地区人群慢性病调查中无任何心脏疾病者。两组均为维吾尔族人群，年龄和性别构成比均匹配，具有均衡性。

纳入标准：CAD组：按照我院经皮冠状动脉造影证实至少有一支冠状动脉血管狭窄≥50%且无其他方面的心脏病疾患。对照组：选择2006年至2011年新疆地区人群慢性病调查中无任何心脏疾病者. 两组在纳入研究前签署知情同意书。

剔除标准：CAD组: 临床资料不全者及同时合并以下疾病之一者予以剔除。（如：主动脉夹层、风湿性心脏病、先天性心脏病者、多脏器功能衰竭以及具有精神障碍不能配合者）。对照组：1、2006年至2010年新疆地区人群慢性病调查中证实患有任何心脏疾病者2、有心血管病家族史者3、吸毒者4、精神障碍者，予以剔除。

实施例8，采用PCR-RFLP方法检测本发明的冠心病相关基因rs4919687位点的多态性

方法：PCR反应体系(50 μl)：基因组模板DNA 50ng(来自血液标本，按照常规方法将白细胞内的DNA用苯酚-氛仿法或者用盐析法提取出来即可)、2*powder Taq PCR master mix 25ul, 21ul of去离子水，上，下引物各1ul,在96孔PCR自动循环仪上进行PCR反应，PCR循环参数：96℃预变性5分钟；经94℃ 30秒，61.0℃30秒，72℃1分钟；循环35周后于72℃延伸10分钟。引物如下:

上游引物：5'CCACTCTTGCCCTTACAC 3'

下游引物：5'GCAGTCCTCAGCCTCTAC 3'

扩增产物长度为369碱基，选用KpnI限制性内切酶(立陶宛MBI公司)进行酶切。酶切条件参见生产厂家的操作手册。然后在3%的琼脂糖胶上电泳后用紫外透射仪观察长度。

结果：如图1所示，当369碱基长的PCR产物切割后产生了310和59碱基两种长度的片段时，说明rs4919687位点的等位基因为G，当只有369一种片段时说明rs4919687位点的等位基因为A，当有369、310和59三种片段时说明待测个体rs919687位点的基因型为A/G杂合子，由于待测样品为来自待测个体的DNA，且100以下的碱基片段在琼脂糖胶上显示不清，所以基因型为G/G的纯合子或A/G的杂合子个体经酶切后产生的59片段显示不清，如泳道1,2,3,5,6和7所示，显示只有310片段时，则该待测个体rs4919687位点的基因型为G/G纯合子，携带G等位基因；如泳道4显示，显示有369和310两种片段时，则该待测个体的rs4919687位点为A/G杂合子，携带A,G等位基因；如泳道8所示，显示只有369一种片段时，待测个体的rs4919687位点为A/A纯合子，携带A等位基因。

实施例9，多态位点与冠心病的关联研究

为进一步从遗传的角度探讨CYP17A1基因和冠心病发病之间的关系，并为国内外已有的同类研究提供遗传流行病学的证据，运用PCR-RFLP的国际通行的基因分型方法，在收集到的189例冠心病患者和相应的180例对照中，体外检测来自待测个体的样品中rs4919687位点的多态性，从而分析rs4919687位点在冠心病患者和正常对照人群的分布差异。

首先运用Hardy-Weinberg平衡检验。Hardy-Weinberg平衡是一种群体遗传学的概念：主要是指一民族生活在某一地区、能相互随机杂交的一群人体，这个群体所具有的全部遗传信息称为该群体的基因库，它直接反映本地区，本民族的遗传特征。这些遗传信息的表达形式基因频率和基因型频率，在没有突变、迁移和遗传漂变的条件下，群体中基因频率和基因型频率遵守保持不变即为Hardy-Weinberg平衡。这样既有遗传多态性，又具备遗传的稳定性。

对基因分型结果分析发现，基因分型结果符合Hardy-Weinberg平衡，因此可以排除实验误差，该基因分型结果比较可靠,分析结果见表2。

结论：单因素分析发现，多态位点rs4919687的三种基因型个体在病例组和对照组中的分布有明显差异(P<0.05)，A/G显隐性遗传模式进一步分析发现，A等位基因的携带者相对G等位基因的携带者在病例组和对照组中有显著差别(P<0.05)，其中A等位基因的携带者患冠心病的危险性是G等位基因的携带者患冠心病的危险性的2.3倍。

结论：单因素分析发现，多态位点rs4919687的三种基因型个体在病例组和对照组中的分布有明显差异(P<0.05)，A/G显隐性遗传模式进一步分析发现，A等位基因及AA基因型的分布在冠心病组里明显高于对照组（等位基因A的分布：病例组为0.405，对照组为0.222；AA基因型的分布频率：冠心病组为19.0，对照组为5.6），并且具有统计学意义（P值均小于0.001）。以上研究结果表明，携带A等位基因者患冠心病的风险性高于携带等位基因G者。

干扰病例-对照研究最严重的因素包括人群在遗传基础上的混杂、病例入选时因为标准不严格产生的疾病混杂等，在排除了以上几个混杂因素的基础上，发明人挑选了189个研究样本和相应的对照，为了进一步分析rs4919687位点对冠心病危险度的贡献，在调整了年龄、性别、高血压、糖尿病，吸烟、甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白，低密度脂蛋白等冠心病其它危险因素的影响后，进行多变量logistic回归模型分析。logistic回归模型分析是统计学上的一种普通的分析方法，它主要用于二分变量的分析，可以用来调整对整个分析造成混杂的因素。结果见表3。

结果：如表3所示，多变量logistics回归模型分析表明，调整了年龄、性别、高血压、糖尿病、吸烟、甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白，低密度脂蛋白等冠心病其它危险因素的影响后发现rs4919687位点仍然保持为冠心病的危险因素[AA基因型与GG基因型相比，患冠心病的风险性明显增加，OR值=2.339,95%CI为（1.453至3.767）],并且具有统计学意义(P＜0.001)。

结论：说明多态位点rs4919687突变的CYP17A1基因为冠心病相关基因，携带A等位基因个体患冠心病的危险性比携带G等位基因的个体患冠心病的危险性显著升高，因此rs4919687位点突变的冠心病相关基因的试剂盒在临床上可以用于检测，预防，诊断或治疗冠心病。

实施例10，体外检测冠心病相关基因即CYP17A1基因的试剂盒

一种体外检测冠心病相关基因的试剂盒，该试剂盒包含:

1）扩增rs4919687位点的引物：

上游引物：5'CCACTCTTGCCCTTACAC 3'

下游引物：5'GCAGTCCTCAGCCTCTAC 3'

2）PCR扩增酶及相应缓冲液。

 3）Kpn I 限制性内切酶和相应的酶切图谱。

 序列表：

Application Project

<120> Title :冠心病相关基因即CYP17A1基因及其体外检测的试剂、制剂或试剂盒、应用

<212> Type : DNA

<211> Length : 8,206

      SequenceName :冠心病相关基因即多态性位点rs4919687突变的CYP17A1基因

<213> OrganismName : CYP17A1

<400> PreSequenceString :

 CCACTCTTGC CCTTACACCT CTGGTCCCTG CTTTCCTTCC TGGAGGAGAA

GGCACGTACC TGGCATGCTG ACTCCCATGT GGGCACAGCC CCACTGCACT

CCACCATGAC TGCAAGGACT TGGTAGGACA GACCCTAAGG CCTCCTACTC

CCAATTCCTT CAGAAATACA GTAGATCAAG GAGAAAGAAA GAACCCTTAA

TTAGAATGCA GCAGCATTGG GGTTCTTTTC GCTGACAGGG TGCCCTCTGG

GCTTCTTTTT GCTCATCAGT TTCTGACCAC AGGAAGGCAA CTCTGGATGG

GATAAACTCT CTAAACTATG CCTGTCCAGA GGGTAGGGAG CAGGTGAGCT

TGTAGAGGCT GAGGACTGC

Claims (6)

1.一种冠心病相关基因即CYP17A1基因，其特征在于该基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO: 1所示的序列。

2.一种体外检测根据权利要求1所述的冠心病相关基因的试剂，其特征在于该试剂用于检测CYP17A1基因rs4919687位点的多态性，该试剂包括如下引物:

上游引物：5'CCACTCTTGCCCTTACAC 3'

下游引物：5'GCAGTCCTCAGCCTCTAC 3'。

3.根据权利要求2所述的体外检测冠心病相关基因的试剂，其特征在于该试剂为用于聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合的试剂或用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂。

4.一种有根据权利要求2或3所述的体外检测冠心病相关基因的试剂的制剂或试剂盒，其特征在于该试剂盒包含PCR扩增酶及相应缓冲液。

5.一种根据权利要求2或3所述的体外检测冠心病相关基因的试剂在制备用于体外检测冠状动脉粥样硬化性心脏病相关基因的制剂或试剂盒中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于试剂盒中包含PCR扩增酶及相应缓冲液。