CN102533954A - 一种cyp17a1基因多态性检测特异性引物和液相芯片 - Google Patents
一种cyp17a1基因多态性检测特异性引物和液相芯片 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种CYP17A1基因多态性检测特异性引物和液相芯片,所述液相芯片主要包括有:由5’端的tag序列和3’端针对基因突变的特异性引物组成的ASPE引物,所述特异性引物分别为:针对A221G位点的SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8、针对C193T的SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10、和/或针对T81C的SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12;有anti-tag序列包被的的微球;扩增引物。本发明所提供的CYP17A1基因多态性检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100%。所制备的液相芯片具有非常好的信号-噪声比,tag标签序列、anti-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合,能够避免交叉反应,实现多个多态性位点的并行检测。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域,涉及医学和生物技术,具体的是涉及一种CYP17A1基因多态性检测特异性引物和液相芯片。
背景技术
细胞色素氧化酶P450(CYP450)是一类参与内源性和外源性化合物代谢的酶,主要存在于生物体的内质网内,CYP450是催化药物代谢和胆固醇、类固醇、其它脂类合成等众多反应的单氧酶,CYP450酶有许多种同工酶,其中,细胞色素CYP17酶在肾上腺和性腺类固醇激素的合成过程中起到重要的作用,它主要发挥两种酶的功能,即17α-羟化酶和17,20-裂解酶,17α-羟化酶(17α-hydroxylase)又称17,20碳链裂解酶,催化孕烯醇酮和孕酮转变为17α羟孕烯醇酮和17α羟孕(17αP),17,20-裂解酶使17,20位碳链裂解,形成雌激素的前体,即去氢表雄(DHEA)和雄烯二酮。研究证实在人类存在CYP17A1基因编码这两种同工酶。
CYP17A1基因位于10q24,共有8个外显子及7个内含子1。基因突变导致17α-羟化酶/17,20-裂解酶缺陷症A221G。
本发明目标检测的CYP17A1基因突变位点,如表所示:
序号 | CYP17A1位点突变的内容 | 简写 |
1 | SEQ ID NO 25的第221位核苷酸,发生A→G突变 | A221G |
2 | SEQ ID NO 26的第193位核苷酸,发生C→T突变 | C193T |
3 | SEQ ID NO 27的第81位核苷酸,发生T→C突变 | T81C |
目前检测CYP17A1的产品一般是基于PCR技术的RT-PCR、荧光定量PCR、传统的固相芯片技术、直接测序、PCR-RFLP等,该技术存在灵敏度低,样品易污染、假阳性率高的缺点,同时由于检测通量的局限性,不能满足实际应用的需要。
发明内容
本发明的目的之一是提供CYP17A1基因多态性检测液相芯片。该液相芯片可用于检测CYP17A1基因三种常见基因型A221G、C193T和T81C的野生型和突变型。
实现上述目的的技术方案如下:
一种CYP17A1基因多态性检测液相芯片,主要包括有:
(A).针对每种突变分别设计的野生型和突变型的ASPE引物:每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变的特异性引物组成,所述野生型和突变型的特异性引物分别为:针对A221G位点的SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8、针对C193T的SEQ ID NO.9及SEQ IDNO.10、和/或针对T81C的SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12;所述tag序列选自SEQ ID NO.1-6;
(B).有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列;所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.13~SEQ ID NO.18中的序列,且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对;
(C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
优选地,所述扩增引物为:针对A221G位点的SEQ ID NO.19及SEQ ID NO.20、针对C193T的SEQ ID NO.21及SEQ ID NO.22、针对T81C的SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24。
优选地,所示ASPE引物为:针对A221G位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.7组成的序列及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.8组成的序列、针对C193T的由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.9组成的序列及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.10组成的序列、和/或针对T81C的由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.11组成的序列及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.12组成的序列。
本发明还提供了一种CYP17A1基因多态性检测的特异性引物。
具体技术方案如下:
一种CYP17A1基因多态性检测的特异性引物,包括有:针对A221G位点的SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8、针对C193T的SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10、和/或针对T81C的SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12。
本发明的主要优点在于:
1.本发明所提供的CYP17A1基因多态性检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100%,检测所需要的时间远远低于常用的测序技术,特别符合实际应用需要。由于在非常大量的特异性引物中,经过大量试验,反应验证,得到最优组合的液相芯片系统,所制备的CYP17A1基因多态性检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比,并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应,tag标签序列、anti-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合,能够避免交叉反应,实现多个多态性位点的并行检测。
2.本发明设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的突变位点,准确区分各种型别的基因型;在同一个反应体系中,不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应,检测特异性好,交叉反应率低于3%;除了能够单独检测CYP17A1基因单个突变位点情况,也能够同时并行检测CYP17A1基因多个突变位点的多态性情况,检测效果一致。
3.本发明的检测方法步骤简单,三种多态性检测可通过一步多重PCR即可完成三个含有SNP位点的目标序列的扩增,避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素,因而可大大提高检测准确率,体现了精确的同时定性、定量分析特征。
4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高,检测结果的可重复性差的缺陷,同时对现有的液相芯片技术进行改进,使得所制备微球能适用于不同的检测项目,具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高,从而使得检测的灵敏度进一步得到提高,信噪比增强,检测结果更加准确可靠。
具体实施方式
实施例1CYP17A1基因多态性检测液相芯片,主要包括有:
一、ASPE引物
针对CYP17A1基因的三种常见基因型A221G、C193T和T81C的野生型和突变型,分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“Tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示:
表1CYP17A1基因的ASPE引物序列(Tag序列+特异性引物序列)
每条ASPE引物包括两个部分,5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列,3’端为突变型或野生型特异的引物片段(如上述表1所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
二、anti-tag序列包被的微球
根据所设计的ASPE特异性引物片段,选择tag序列,最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物片段可能形成的二级结构,选择的6种微球编号与微球上相应的anti-tag序列如表2所示:
表2微球编号与微球上相应的anti-tag序列
选择的6种微球购自美国Luminex公司,将anti-tag序列包被与微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5-10个T的间隔臂序列,即在每个anti-tag序列前加上一段5-10个T的间隔臂序列,anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌ddH2O配成100nmol/ml的贮存液。所述间隔臂为用于将anti-tag与微球表面间隔开来或是将anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在anti-tag序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列,可减少空间位阻,提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT,即poly(dT),寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n≥3),如(CH2)12、(CH2)18等。另外,如果存在poly(dA)干扰,还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-10个T,微球包被的过程如下:
分别取5×106个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul 0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5),加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl-N-ethylcarbodiimide)(购自Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液,恒温孵育30分钟,再加入2.5ul的EDC工作液,再恒温孵育30分钟。反应结束后,用0.02%的Tween-20洗涤一次,再用0.1%的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/LTris(pH8.0)],1mmol/LEDTA中,2-8℃避光保存。
三、扩增出含有突变位点的目标序列的引物
针对CYP17A1基因的三种常见基因型A221G、C193T和T81C的野生型和突变型,设计扩增引物对(见表3),分别扩增出两条含有多态性位点的目标序列。
表3扩增出具有SNP位点的目标序列的引物
所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/LTris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
实施例2运用CYP17A1基因检测液相芯片对样本的检测
所述各种溶液的配方如下:
50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml):
2×Tm杂交缓冲液
试剂 | 来源 | 终浓度 | 每250ml的用量 |
1MTris-HCl,pH8.0 | SigmaT3038 | 0.2M | 50ml |
5MNaCl | Sigma S5150 | 0.4M | 20ml |
Triton X-100 | Sigma T8787 | 0.16% | 0.4ml |
过滤后贮存于4℃。
ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。
生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
一、样本的DNA提取:
参照《分子克隆》关于DNA提取的相关方法,得到待检测的DNA。
二、待测样品的PCR扩增
设计三对引物,多重PCR一步扩增出分别含有CYP17A1基因的三种常见基因型A221G、C193T和T81C共三条的目标序列,产物大小分别为322bp、358bp和440bp,引物序列
(SEQ IDNO.19-24)见上述表3所示。
首先配制多重PCR引物工作液:分别各取SEQ ID NO.19-24的引物贮存液100ul于1.5ml微量离心管中,混合均匀即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下:
2×缓冲液(含Mg2+) 25ul
dNTP(各2.5mmol/L) 4ul
Taq酶(5U/ul) 0.2ul
多重PCR引物工作液(各8.3pmol/mL) 6ul
模板DNA(10ng/ul) 2ul
ddH2O 12.8ul
共 50ul
PCR扩增程序为:95℃3min;94℃30s,56℃30s,72℃40s,30个循环;72℃10min;4℃保存备用。
三、PCR产物的酶切处理
1.取7.5ul PCR反应后的产物,加入1ul 10×SAP缓冲液、1ul SAP酶和0.5ul Exo-I酶;2.37℃孵育15min,80℃孵育15min,灭活多余的酶。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。
四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)
利用上述设计的ASPE引物进行引物延伸反应,在反应过程中掺入生物素标记的dCTP,从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。
首先配制混合的ASPE引物工作液:分别取待检测基因相应的野生型和突变型ASPE引物贮存液10ul于1.5ml微量离心管中,加入10mmol/L Tris Buffer补至200ul,混合均匀即为ASPE混合引物工作液。ASPE反应的体系如下:
10×缓冲液 2ul
MgCl2(50mmol/L) 0.5ul
Biotin-dCTP(400umol/L) 0.25ul
dATP、dGTP、dTTP混合液(各100umol/L) 1ul
Tsp酶(5U/ul) 0.25ul
混合的ASPE引物工作液(各500nmol/L) 1ul
酶切处理的PCR扩增产物 5ul
ddH2O 10ul
共 20ul
反应程序为:96℃2min;94℃30s,54℃1min,72℃2min,30个循环;4℃保存备用。
五、杂交反应
1.根据设计的ASPE引物,每组选择相应的6种微球(微球浓度均为2.5×105个/ml);
2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中;
3.微球于≥10000g离心1-2min;
4.弃去上清,微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中,涡旋混匀;
5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中,对照孔加25ul的ddH2O;
6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中,用ddH2O补足至50ul;
7.用锡箔纸包住96孔板以避光,95℃60s,37℃15min孵育杂交;
8.杂交后的微球于≥3000g离心2-5min;
9.去上清,将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中;
10.微球于≥3000g离心2-5min;
11.将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中,加入15ul浓度为10ug/ml的链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE);
12.37℃孵育15min,于Luminex仪器上检测。
六、结果检测与数据分析
反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。检测结果如表4、表5和表6所示。
对荧光值(MFI)和数据处理有以下要求:
1.每个位点需至少有一个等位基因MFI大于300而且大于10×PCR阴性对照MFI;
2.NET MFI=样品MFI-PCR阴性对照MFI(NET MFI小于0的以0表示);
3.满足以上两个条件的数据,按下列公式计算突变比值:
突变比值=突变型NET MFI÷(突变型NET MFI+野生型NET MFI)
4.根据经验对每个检测位点的突变比值确定阈值(cut-off值),以划分野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子。
使用本方法检测20份样本的CYP17A1基因多态性位点,实验数据符合上述要求,因此可计算得它们的突变比值。阈值(cut-off值)的设置如下:突变比值范围在0%-20%视为野生型纯合子;30%-70%视为杂合子;80%-100%视为变异型纯合子。以测序法检测与液相芯片结果作对照,计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的CYP17A1基因型检测结果与测序结果吻合率达到100%。可见本发明所提供的CYP17A1基因多态性检测液相芯片能够准确地检测出CYP17A1的基因类型,且结果稳定可靠。
表4样本检测结果(MFI)
表5样本CYP17A1基因突变比值(%)
表6样本CYP17A1基因突变类型分析结果
样本号 | 液相芯片检测结果 | 测序结果 |
1 | 野生型 | 野生型 |
2 | 野生型 | 野生型 |
3 | 野生型 | 野生型 |
4 | 野生型 | 野生型 |
5 | 野生型 | 野生型 |
6 | 221GG | 102CC |
7 | 野生型 | 野生型 |
8 | 193TT | 193TT |
9 | 野生型 | 野生型 |
10 | 81CC | 81CC |
11 | 野生型 | 野生型 |
12 | 野生型 | 野生型 |
13 | 野生型 | 野生型 |
14 | 野生型 | 野生型 |
15 | 221AG | 102TC |
16 | 野生型 | 野生型 |
17 | 野生型 | 野生型 |
18 | 野生型 | 野生型 |
19 | 野生型 | 野生型 |
20 | 野生型 | 野生型 |
实施例3不同的ASPE引物的液相芯片对CYP17A1基因多态性的检测
一、液相芯片制备的设计(Tag序列及Anti-Tag序列的选择)
以CYP17A1基因的A221G位点突变检测液相芯片为例,分别针对A221G的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列,而ASPE引物5’端的Tag序列则选自SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.6,相应的,包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选自SEQID NO.13-SEQ ID NO.18。具体设计如下表(表7)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表7液相芯片制备的设计
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片,按实施例2所述检测过程和方法对样品21-40进行检测,
检测结果如下:
表8样本检测结果与基因多态性分析
其它针对不同的突变位点的液相芯片,ASPE引物运用不同的Tag序列,其结果依然稳定可靠,具体数据省略。而ASPE引物选用实施例1中tag序列与特异性引物序列搭配时,效果更佳(信噪比更好),参见本实施例试验组1。其它不同tag序列与特异性引物序列搭配,与实施例2和本实施例的结果相同,具体数据省略。
以上是针对本发明的可行实施例的具体说明,但该实施例并非用以限制本发明的专利范围,凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更,均应包含于本发明的专利范围中。
Claims (6)
1.一种CYP17A1基因多态性检测液相芯片,其特征是,主要包括有:
(A).针对每种突变分别设计的野生型和突变型的ASPE引物:每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变的特异性引物组成,所述野生型和突变型的特异性引物分别为:针对A221G位点的SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8、针对C193T的SEQ ID NO.9及SEQ IDNO.10、和/或针对T81C的SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12;所述tag序列选自SEQ ID NO.1-6;
(B).有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列;所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.13~SEQ ID NO.18中的序列,且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对;
(C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
2.根据权利要求1所述的CYP17A1基因多态性检测液相芯片,其特征是,所述扩增引物为:针对A221G位点的SEQ ID NO.19及SEQ ID NO.20、针对C193T的SEQ ID NO.21及SEQ IDNO.22、针对T81C的SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24。
3.根据权利要求1所述的CYP17A1基因多态性检测液相芯片,其特征是,所示ASPE引物为:针对A221G位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.7组成的序列及由SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.8组成的序列、针对C193T的由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.9组成的序列及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.10组成的序列、和/或针对T81C的由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.11组成的序列及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.12组成的序列。
4.根据权利要求1所述的CYP17A1基因多态性检测液相芯片,其特征是,主要包括以下:
(A).所述ASPE引物:针对A221G位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.7组成的序列及由SEQID NO.2和SEQ ID NO.8组成的序列、针对C193T的由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.9组成的序列及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.10组成的序列、和针对T81C的由SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.11组成的序列及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.12组成的序列;
(B).有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列;所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.13~SEQ ID NO.18中的序列,且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对;
(C).扩增引物:针对A221G位点的SEQ ID NO.19及SEQ ID NO.20、针对C193T的SEQ IDNO.21及SEQ ID NO.22、针对T81C的SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24。
5.根据权利要求1-4任一项所述的CYP17A1基因多态性检测液相芯片,其特征是,所述间隔臂为5-10个T。
6.一种CYP17A1基因多态性检测的特异性引物,其特征是,包括有:针对A221G位点的SEQID NO.7及SEQ ID NO.8、针对C193T的SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10、和/或针对T81C的SEQID NO.11及SEQ ID NO.12。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
CB02 | Change of applicant information |
Address after: Five 510663 Guangdong city of Guangzhou province Guangzhou Science City Moon Road No. 80, Guangzhou technology innovation base B, C Applicant after: Surexam Biological Technology Co., Ltd. Address before: Five 510663 Guangdong city of Guangzhou province Guangzhou Science City Moon Road No. 80, Guangzhou technology innovation base B, C Applicant before: Guangzhou Yishan Biotechnology Co., Ltd. |
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COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: GUANGZHOU YISHAN BIOTECHNOLOGY CO., LTD. TO: SUREXAM BIOTECHNOLOGY CO., LTD. |
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C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |