一种CYP3A4基因SNP检测特异性引物、液相芯片及方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域,涉及医学和生物技术,具体的是涉及CYP3A4基因SNP检测特异性引物、液相芯片及方法。
背景技术
细胞色素P450(cytochrome P450,cytochrome CYPs,简称P450)是一类以血红素为辅基的B族细胞色素超家族蛋白酶,存在于细胞内质网膜上。P450酶系是最重要的一组代谢酶,参与的代谢包括致癌物质和临床治疗药物等。在CYP450超家族中,CYP1A2,CYP2A6,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6和CYP3A4与目前市场上95%以上药物代谢及药物间相互作用有关。
CYP3A同工酶参与了烟草致癌物和类固醇代谢,包括CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7和CYP3A43,在人类肺部组织的表达和活性的转录水平存在显著的个体间差异。其中,CYP3A4被认为是肝脏和小肠中含量最丰富的CYP,现已发现CYP3A4参与了大约38个类别共150多种药物的代谢。研究证明CYP3A4的酶活性与肝癌、前列腺癌、白血病等的发生密切相关。此外,该酶还参与了部分前致癌物质的活化,与之相关的药物相互作用亦十分多见。
目前已报道的CYP3A4等位基因型超过40种,其中CYP3A4*1B是较早发现的突变基因型,研究证明CYP3A4*1B等位基因存在与启动子活性的提高和晚期前列腺癌直接相关。CYP3A4*1B等位基因携带者患上非小细胞肺癌风险显著提高,其中,女性携带者患上肺癌的风险更高。吸烟剂量大的CYP3A4*1B等位基因携带男性比吸烟剂量小的*1A/*1A携带者患上肺癌的几率更高。CYP3A4*2的分布频率较低,国内暂未发现,有研究证明该突变基因型会导致人体对硝苯地平的药物清除能力下降;CYP3A4*4、CYP3A4*5和CYP3A4*6是在对中国人群的研究中首先发现的,均会导致酶活性的下降;有研究发现CYP3A4*17和CYP3A4*18会影响睾酮的药效,其中CYP3A4*18在中国人群的分布频率达10%;CYP3A4*19在亚洲的分布频率为2%,主要出现在印度和巴基斯坦一带,CYP3A4*3在中国人中分布频率为1.5%。
CYP3A4基因的多态性是造成个体对药物治疗效果差异的主要原因之一,因此专家建议在药物使用前对靶标进行检测,使临床医生了解遗传信息,从而有针对性地使用药物和剂量,有效减少毒副作用和提高药效。
目前国内外检测CYP3A4基因多态性的方法有少量报道,主要建立在传统固相芯片和PCR的基础上,固相芯片价格昂贵,而且敏感度不高,检测结果的可重复性差。而其它以PCR为基础的SNPs检测技术,如直接测序法,半定量PCR技术,PCR-单链构象多态性分析(SSCP)检测等,存在灵敏度低,样品易污染、假阳性率高的缺点。普通PCR方法和荧光定量PCR由于检测通量的局限性不能满足临床的需要,而聚合酶链式反应-限制性片段长度多态(PCR-RFLP)分析技术和基于TaqMan技术的等位基因差异分析法一次只能进行一种突变的检测,耗时费力。
基于芯片的原理,美国Luminex公司开发出了以微球为载体的悬浮液相芯片技术。该项技术利用聚苯乙烯微球作为反应的载体,以荧光检测仪作为检测平台,对核酸和蛋白质等生物大分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造过程中,掺入不同比例的红光及红外光染色剂,从而形成多至100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的蛋白质或核酸分子作为探针分子,报告分子以生物素标记,并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测,其中红色激光检测微球表面红色分类荧光的强度,并根据微球中不同色彩而编号分类,从而确定反应的类型;绿色激光检测样本中荧光标记物的荧光强度,再通过机器与计算机自动统计分析激光所检测到微球种类、数量,从而判定待测样本多种目标测试物各自的浓度。因此,液相芯片技术既满足了高通量检测的要求,同时具备了快速准确,灵敏度高,特异性好,结果重复性好等优点。我们采用xTAG液相芯片技术可以同时检测多种SNPs,实现高通量快速简便化操作,大大提高了检测效率,在同类检测技术中处于领先地位。
发明内容
本发明的目的之一是提供CYP3A4基因SNP检测液相芯片。该液相芯片可用于检测CYP3A4基因十种常见基因型CYP3A4*1B、CYP3A4*2、CYP3A4*3、CYP3A4*4、CYP3A4*5、CYP3A4*6、CYP3A4*15、CYP3A4*17、CYP3A4*18、和/或CYP3A4*19的野生型和突变型。
一种CYP3A4基因SNP检测液相芯片,包括有:
(1)针对每种型别的SNP位点分别设计的野生型和突变型ASPE引物对,每种ASPE引物对由5’端的tag序列和3’端的针对目的基因SNP位点的特异性引物序列组成,所述特异性引物序列分别选自:SEQ ID NO.21及SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25及SEQID NO.26、SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29及SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31及SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33及SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35及SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37及SEQ ID NO.38、和SEQ ID NO.39及SEQ ID NO.40中的一对或多对;所述tag序列选自SEQ IDNO.1~SEQ ID NO.20中的序列;
(2)分别包被有特异的anti-tag序列的微球,所述anti-tag序列能相应地与(1)中所选tag序列互补配对,所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.41~SEQ ID NO.60中的序列;
(3)用于扩增具有CYP3A4*1B、CYP3A4*2、CYP3A4*3、CYP3A4*4、CYP3A4*5、CYP3A4*6、CYP3A4*15、CYP3A4*17、CYP3A4*18和CYP3A4*19中一个或多个SNP位点的CYP3A4基因目标序列的引物。
优选地,用于扩增的引物包括:针对CYP3A4*1B SNP位点的SEQ ID NO.61和SEQ IDNO.62;针对CYP3A4*4SNP位点的SEQ ID NO.63和SEQ ID NO.64;针对CYP3A4*15SNP位点的SEQ ID NO.65和SEQ ID NO.66;针对CYP3A4*2、CYP3A4*5和CYP3A4*17SNP位点的SEQID NO.67和SEQ ID NO.68;针对CYP3A4*6SNP位点的SEQ ID NO.69和SEQ ID NO.70;针对CYP3A4*18SNP位点的SEQ IDNO.71和SEQ IDNO.72;和针对CYP3A4*3和CYP3A4*19SNP位点的SEQ ID NO.73和SEQ ID NO.74中的一对或一对以上。
优选地,所述野生型及突变型ASPE引物对选自:针对CYP3A4*1B SNP位点的由SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.21组成的序列及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.22组成的序列、针对CYP3A4*2SNP位点的由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.23组成的序列及由SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.24组成的序列、针对CYP3A4*3SNP位点的由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.25组成的序列及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.26组成的序列、针对CYP3A4*4SNP位点的由SEQ ID NO.7和SEQID NO.27组成的序列及由SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.28组成的序列、针对CYP3A4*5SNP位点的由SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.29组成的序列及由SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.30组成的序列、针对CYP3A4*6SNP位点的由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.31组成的序列及由SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.32组成的序列、针对CYP3A4*15SNP位点的由SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.33组成的序列及由SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.34组成的序列、针对CYP3A4*17SNP位点的由SEQ IDNO.15和SEQ ID NO.35组成的序列及由SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.36组成的序列、针对CYP3A4*18SNP位点的由SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.37组成的序列及由SEQ ID NO.18和SEQID NO.38组成的序列、和针对CYP3A4*19SNP位点的由SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.39组成的序列及由SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.40组成的序列中的一对或多对。
本发明的另一目的是提供CYP3A4基因SNP检测的特异性引物序列,该引物序列特异性强,能准确区分各种基因型,并且多位点同步检测不存在交叉反应率。
用于CYP3A4基因SNP检测的特异性引物,包括有:针对CYP3A4*1B SNP位点的野生型和突变型的SEQ ID NO.21及SEQ ID NO.22;针对CYP3A4*2SNP位点的S野生型和突变型的EQ IDNO.23及SEQ ID NO.24;针对CYP3A4*3SNP位点的野生型和突变型的SEQ ID NO.25及SEQ IDNO.26;针对CYP3A4*4SNP位点的野生型和突变型的SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28;针对CYP3A4*5SNP位点的野生型和突变型的SEQ ID NO.29及SEQ ID NO.30;针对CYP3A4*6SNP位点的野生型和突变型的SEQ ID NO.31及SEQ ID NO.32;针对CYP3A4*15SNP位点的野生型和突变型的SEQ ID NO.33及SEQ ID NO.34;针对CYP3A4*17SNP位点的野生型和突变型的SEQ ID NO.35及SEQ ID NO.36;针对CYP3A4*18SNP位点的野生型和突变型的SEQ ID NO.37及SEQ ID NO.38;和/或针对CYP3A4*19SNP位点的野生型和突变型的SEQ ID NO.39及SEQ IDNO.40。
本发明的另一目的是提供使用上述液相芯片对CYP3A4基因SNP进行检测的方法。
一种使用上述液相芯片对CYP3A4基因SNP检测的方法,主要包括以下步骤:
(一)PCR扩增待测样品DNA;
(二)PCR反应产物用ExoSAP-IT试剂盒进行酶切处理;
(三)用所述ASPE引物进行引物延伸反应,在反应过程中掺入生物素标记的dCTP,从而使反应后的产物带上多个的生物素标记;
(四)将对应ASPE引物的包被有特异的anti-tag序列的微球与上述延伸反应后的产物进行杂交反应;
(五)杂交反应后的产物与链霉亲和素-藻红蛋白进行反应;
(六)通过荧光检测仪检测。
本发明的主要优点在于:
1.本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100%。所制备的CYP3A4基因SNP检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比,并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应。tag标签序列、anti-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合,能够避免交叉反应,实现多个SNP位点的并行检测。
2.本发明设计的ASPE型特异性引物具有非常好的特异性,能准确区分各种型别的基因型。
3.本发明的检测方法步骤简单,可通过一步多重PCR即可完成七个具有SNP位点的目标序列的扩增,避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素,因而可大大提高检测准确率,体现了精确的同时定性、定量分析特征。
4.本发明所提供的检测方法所需要的时间远远低于常用的测序技术,特别符合临床需要。
5.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高,检测结果的可重复性差的缺陷,同时对现有的液相芯片技术进行改进,使得所制备微球能适用于不同的检测项目,具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高,从而使得检测的灵敏度进一步得到提高,信噪比增强,检测结果更加准确可靠。
具体实施方式
实施例1 CYP3A4基因SNP检测液相芯片,主要包括有:
一、ASPE引物
针对CYP3A4的十种常见SNP位点,分别设计特异性的引物序列。其中CYP3A4*1B为A392G突变,发生在5’UTR;CYP3A4*2为T664C突变,发生在外显子7;CYP3A4*3为T1334C突变,发生在外显子12;CYP3A4*4为A352G突变,发生在外显子5;CYP3A4*5为C653G突变,发生在外显子7;CYP3A4*6为831insA,发生在外显子9;CYP3A4*15为G485A突变,发生在外显子6,CYP3A4*17为T566C突变,发生在外显子7;CYP3A4*18为T878C突变,发生在外显子10;CYP3A4*19为C1399T突变,发生在外显子12。ASPE引物由“Tag+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示:
表1 ASPE引物序列(Tag+特异性引物序列)
每条ASPE引物包括两个部分,5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列,3’端为突变型或野生型特异性引物序列(如上述表1所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/LTris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
二、anti-tag序列包被的微球
根据所设计的ASPE引物序列,选择tag序列,最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE引物序列可能形成的二级结构,选择的二十种微球编号与微球上相应的anti-tag序列如表2所示:
表2 微球编号与微球上相应的anti-tag序列
选择的20种微球购自美国Luminex公司,将anti-tag序列包被与微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5-10个T的间隔臂序,即在每个anti-tag序列前加上一段5-10个T的间隔臂序列,anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌ddH2O配成100nmol/ml的贮存液。所述间隔臂为用于将anti-tag与微球表面间隔开来或是将anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在anti-tag序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列,可减少空间位阻,提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT,即poly(dT),寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n≥3),如(CH2)12、(CH2)18等。另外,如果存在poly(dA)干扰,还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-10个T,微球包被的过程如下:
分别取5×106个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul 0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5),加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide)(购自Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液,恒温孵育30分钟,再加入2.5ul的EDC工作液,再恒温孵育30分钟。反应结束后,用0.02%的Tween-20洗涤一次,再用0.1%的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/L Tris(pH8.0),1mmol/L EDTA中,2-8℃避光保存。
三、扩增出具有SNP位点的目标序列的引物
目标检测的十种常见的CYP3A4SNP位点发生在不同的外显子上,其中,A392G发生在5’UTR,A352G发生在外显子5,831insA发生在外显子9,G485A发生在外显子6,T878C发生在外显子10,CYP3A4*2、CYP3A4*5和CYP3A4*17均发生在外显子7,设计一对引物扩增出含有3个突变位点的目标序列;CYP3A4*3和CYP3A4*19均位于外显子12,设计一对引物扩增出含有2个突变位点的目标序列。利用Primer5.0设计七对引物(见表3),分别扩增出七条具有SNP位点的目标序列。
表3 扩增出具有SNP位点的目标序列的引物
所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/LTris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
实施例2:运用CYP3A4基因SNP检测液相芯片对临床样本的检测
所述各种溶液的配方如下:
50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml):
试剂 |
来源 |
终浓度 |
每250ml的用量 |
MES(2[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) |
Sigma M-2933 |
0.05M |
2.44g |
5M NaOH |
Fisher SS256-500 |
--- |
5滴 |
2×Tm杂交缓冲液
试剂 |
来源 |
终浓度 |
每250ml的用量 |
1MTris-HCl,pH8.0 |
SigmaT3038 |
0.2M |
50ml |
试剂 |
来源 |
终浓度 |
每250ml的用量 |
5MNaCl |
Sigma S5150 |
0.4M |
20ml |
Triton X-100 |
Sigma T8787 |
0.16% |
0.4ml |
过滤后贮存于4℃。
ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。
生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
一、样本的DNA提取:
参照AxyPrep全血基因组小量提取试剂盒说明,得到待检测的DNA。
二、待测样品的PCR扩增
利用Primer5.0设计七对引物,多重PCR一步扩增出CYP3A4的5’UTR、外显子5、外显子6、外显子7、外显子9、外显子10和外显子12共七条具有SNP位点的目标序列,产物大小分别为758bp、594bp、460bp、539bp、401bp、437bp、553bp。引物序列(SEQ NO.61-74)见上述表3所示。
首先配制多重PCR引物工作液:分别各取SEQ NO.61-74的引物贮存液100ul于1.5ml微量离心管中,混合均匀即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下:
10×缓冲液(含Mg2+) 5ul
dNTP(各2.5mmol/L) 4ul
Taq酶(5U/ul) 0.5ul
多重PCR引物工作液(各7.1pmol/mL) 14ul
模板DNA(10ng/ul) 1ul
ddH2O 25.5ul
共 50ul
PCR扩增程序为:95℃3min;94℃20s,56℃30s,72℃30s,30个循环;72℃10min;4℃保存备用。
三、PCR产物的酶切处理
参照ExoSAP-IT试剂盒说明,详细步骤如下:
1.取7.5ul PCR反应后的产物,加入3ul ExoSAP-IT酶;
2.37℃孵育15min。80℃孵育15min,使多余的酶灭活。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。
四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)
利用上述设计的位点特异性引物进行引物延伸反应,在反应过程中掺入生物素标记的dCTP,从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。
首先配制混合的ASPE引物工作液:分别各取A392G-w,A392G-m,T664C-w,T664C-m,T1334C-w,T1334C-m,A352G-w,A352G-m,C653G-w,C653G-m,831insA-w,831insA-m,G485A-w,G485A-m,T566C-w,T566C-m,T878C-w,T878C-m,C1399T-w,C1399T-m相应的ASPE引物贮存液10ul于1.5ml微量离心管中,混合均匀即为ASPE混合引物工作液。ASPE反应的体系如下:
10×缓冲液 2ul
MgCl2(50mmol/L) 0.5ul
Biotin-dCTP(400umol/L) 0.25ul
dATP、dGTP、dTTP混合液(各100umol/L) 1ul
Tsp酶(5U/ul) 0.25ul
混合的ASPE引物工作液(各500nmol/L) 1ul
酶切处理的PCR扩增产物 5ul
ddH2O 10ul
共 20ul
PCR程序为:96℃2min;94℃30s,58℃1min,72℃2min,30个循环;4℃保存备用。
五、杂交反应
1.根据设计的ASPE引物,选择相应的最优的二十种微球(微球浓度均为2.5×105个/ml)。每种微球分别带有不同颜色编码,同时每种微球表面分别连接有一段24bp的特异性的寡核苷酸序列(anti-tag),这些anti-tag序列能分别与对应的ASPE引物5’端的tag序列特异结合;
2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中;
3.微球于≥10000g离心1-2min;
4.弃去上清,微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中,涡旋混匀;
5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中,对照孔加25ul的ddH2O;
6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中,用ddH2O补足至50ul;
7.用锡箔纸包住96孔板以避光,95℃60s,37℃15min孵育杂交;
8.杂交后的微球于≥3000g离心2-5min;
9.去上清,将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中;
10.微球于≥3000g离心2-5min;
11将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中,加入15ul浓度为10ug/ml的链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE);
12.37℃孵育15min,于Luminex仪器上检测。
六、结果检测与数据分析
反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。以聚苯乙烯微球作为反应的载体,以荧光检测仪作为检测平台,对核酸分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造过程中,掺入不同比例的红光及红外光染色剂,从而形成多至100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的核酸分子作为探针分子,报告分子以生物素标记,并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测,检测结果如表4~表7所示。
对荧光值(MFI)和数据处理有以下要求:
1.每个位点需至少有一个等位基因MFI大于300而且大于10×PCR阴性对照MFI;
2.NET MFI=样品MFI-PCR阴性对照MFI(NET MFI小于0的以0表示);
3.满足以上两个条件的数据,按下列公式计算突变比值:
突变比值=突变型NETMFI÷(突变型NETMFI+野生型NETMFI)
4.根据经验对每个检测位点的突变比值确定阈值(cut-off值),以划分野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子。
使用本方法检测大量样本的CYP3A4基因多态性,实验数据符合上述要求,因此可计算得它们的突变比值。阈值(cut-off值)的设置如下:突变比值范围在0%-20%视为野生型纯合子;30%-70%视为杂合子;80%-100%视为变异型纯合子。以测序法检测与液相芯片结果作对照,计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的TPMT基因型检测结果与测序结果吻合率达到100%。可见本发明所提供的TPMT基因SNP检测液相芯片能够准确地检测出CYP3A4基因的SNP类型,且结果稳定可靠。
表4 样本检测结果(MFI)
表5 样本检测结果(MFI)
表6 样本检测结果(MFI)
表7 样本CYP3A4基因多态性分析结果
实施例3 不同的ASPE引物的液相芯片对CYP3A4基因SNP检测基因突变的检测
一、液相芯片制备的设计(Tag序列及Anti-Tag序列的选择)
以CYP3A4基因CYP3A4*1B(A392G)位点突变的检测液相芯片为例,针对A392G的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列,而ASPE引物5’端的Tag序列则选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.20中的6条,相应的,包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选择SEQ ID NO.41-SEQ ID NO.60。具体设计如下表(表8)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表8 液相芯片制备的设计
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片,按实施例2所述检测过程和方法对血清样品21-40进行检测,检测结果如下:
表9 样本检测结果(MFI)与基因多态性分析
以上是针对本发明的可行实施例的具体说明,但该实施例并非用以限制本发明的专利范围,凡未脱离本发明的等效实施或变更,均应包含于本发明的专利范围中。
序列表
<110>广州益善生物技术有限公司
<120>一种CYP3A4基因SNP检测特异性引物、液相芯片及方法
<160>74
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
ctttaatcct ttatcacttt atca 24
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
aatcaatctt cattcaaatc atca 24
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ataccaataa tccaattcat atca 24
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<213>人工序列
<400>12
cttttcatca ataatcttac cttt 24
<210>13
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
aatcttacta caaatccttt cttt 24
<210>14
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
tcatttactc aacaattaca aatc 24
<210>15
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
tcaattacct tttcaataca atac 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
tcaatcaatt acttactcaa atac 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
cttttcaatt acttcaaatc ttca 24
<210>18
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
taacattaca actatactat ctac 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
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aatctacaaa tccaataatc tcat 24
<210>20
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
tcattcatat acataccaat tcat 24
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<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
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gccatagaga caagggcaa 19
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<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>22
gccatagaga caagggcag 19
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
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ttttggatcc attctttctc t 21
<210>24
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>24
ttttggatcc attctttctc c 21
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<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
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ccagaaactg cattggcat 19
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<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
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ccagaaactg cattggcac 19
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<212>DNA
<213>人工序列
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gggatttatg aaaagtgcca 20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>28
gggatttatg aaaagtgccg 20
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
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taagatttga ttttttggat cc 22
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>30
taagatttga ttttttggat cg 22
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<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>31
ccttcagctg atgattgac 19
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<213>人工序列
<400>32
ccttcagctg atgattgaa 19
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<212>DNA
<213>人工序列
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ggtgagaaat ctgaggcg 18
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>34
ggtgagaaat ctgaggca 18
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>35
gtgatcacta gcacatcatt 20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>36
gtgatcacta gcacatcatc 20
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<212>DNA
<213>人工序列
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tttcagctct gtccgatct 19
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>38
tttcagctct gtccgatcc 19
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<212>DNA
<213>人工序列
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tcagaacttc tccttcaaac 20
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<212>DNA
<213>人工序列
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tcagaacttc tccttcaaat 20
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<212>DNA
<213>人工序列
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tgataaagtg ataaaggatt aaag 24
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>42
tgatgatttg aatgaagatt gatt 24
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>43
gtattgtatt gaaaaggtaa ttga 24
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>44
gtatttgagt aagtaattga ttga 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>45
aaagaaagat tgttgagatt atga 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>46
aaagttgaga tttgaatgat tgaa 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>47
tgatatgaat tggattattg gtat 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>48
gattaaagtt gattgaaaag tgaa 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>49
gtaatgataa agatgatgat attg 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>50
gtagattagt ttgaagtgaa taat 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>51
atgagattat tggatttgta gatt 24
<210>52
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>52
atgaattggt atgtatatga atga 24
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>53
atgaattgaa agtgattgaa aaag 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>54
gattgtattg aagtattgta aaag 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>55
aaagtgatgt atatgagtaa attg 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>56
aaaggtaaga ttattgatga aaag 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>57
aaagaaagga tttgtagtaa gatt 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>58
gatttgtaattgttgagtaa atga 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>59
tgaagatttg aagtaattga aaag 24
<210>60
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>60
gtagatagta tagttgtaat gtta 24
<210>61
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>61
tccaccagcc tttctagttg 20
<210>62
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>62
ctgagtcttc ctttcagctc t 21
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>63
tagcataggg cccatcacc 19
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>64
aaccccatgg ctgcgctt 18
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>65
tcacttactg ctccatgctg 20
<210>66
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>66
ccctaaagga tatatttagt cttct 25
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<212>DNA
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gtgatagaag gtgatctagt aga 23
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tgattagtgg ttgcatatga tg 22
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agggagatca aggaccacg 19
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tccacagacc gcagactga 19
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<211>19
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gaaaccaccc ccagtgtac 19
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aacgtggaac cagattcag c 20
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cttctccaag ttctggttgg 20