CN109763173A - 一种血浆细胞外囊泡长链rna文库及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细胞外囊泡长链RNA文库及其构建方法,该构建方法包括如下步骤:血浆样品分离;血浆细胞外囊泡纯化;细胞外囊泡总RNA提取以及细胞外囊泡RNA测序文库构建和测序分析。本发明的一种血浆细胞外囊泡长链RNA文库的构建方法可从1ml血浆中稳定获得超过1万个RNA靶点,包括信使RNA、长链非编码RNA和环状RNA,可用于疾病的诊断,尤其是癌症病人的筛查和诊断。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体的说涉及一种血浆细胞外囊泡长链RNA 文库及其构建方法。
背景技术
细胞外囊泡是一种由各类细胞分泌的纳米级微囊泡。最初人们认为细胞外囊泡是细胞碎片,因而没有对其进行过多的研究和探索。但近几年有诸多研究表明细胞外囊泡是细胞间信号传递的重要介质,可作为疾病诊断与预后的一种新型生物标记物。细胞外囊泡能成为一种极有潜力的用于诊断或预后的生物标志物,其优势是:存在于较易获得的体液(特别是血液)中,选择性携带了亲代细胞的生物活性物质,具有与亲代细胞相似的生物学活性。细胞外囊泡含有大量的能反映细胞来源的各种生物分子,包括RNA、蛋白质、脂质和代谢物等。阐明细胞外囊泡的分子组成极为重要,这有助于探索细胞外囊泡在细胞通讯过程中发挥的重要作用,有助于挖掘细胞外囊泡作为生物标志物的潜力。但是,目前用于揭示细胞外囊泡内容物的方法还有待开发。
细胞外囊泡中含有大量不同类型的能稳定存在的RNA。关于细胞外囊泡微小RNAs(miRNAs)的研究已较多,能较好地描述其特性,但miRNA数量少,缺乏特异性,限制了其在生物标志物方面的广泛应用。随着研究的发展,越来越多的证据表明长链RNA也存在于细胞外囊泡中,包括信使RNA(mRNA)、环状RNA(circRNA)和长非编码RNA(lncRNA),可作为疾病诊断标志物,且能发挥一定的生物学作用,具有重要的临床意义。然而,目前尚没有有效的方法对血浆细胞外囊泡中的长链RNA进行高通量的检测和分析。
技术内容
本发明首先提供了一种细胞外囊泡长链RNA文库的构建方法,该方法包括如下步骤:
(1)样品分离
采用两步离心法从全血中分离血浆;
(2)细胞外囊泡纯化
使用膜亲和离心柱子快速分离血浆细胞外囊泡;
(3)细胞外囊泡总RNA提取
使用离心柱子提取细胞外囊泡中的总RNA;
(4)细胞外囊泡长链RNA文库的构建和测序分析
使用SMARTer技术,即Switching Mechanism At the end of RNA Temp 模板末端的转换机制技术制备得到RNA-seq文库;
其中步骤(2)中的膜亲和离心柱子为exoRNeasy血清/血浆试剂盒中的离心柱子;步骤(3)中的离心柱子为miRNeasy试剂盒中的RNeasy MinElute 旋转柱;步骤(4)中的SMARTer技术为SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico-Input Mammalian试剂盒。
本发明还提供了上述方法构建得到的细胞外囊泡长链RNA文库。
本发明还提供了上述细胞外囊泡长链RNA文库的应用,其可用于癌症的诊断。
其中所述的癌症是肝细胞癌。
具体的说,本发明的一种细胞外囊泡长链RNA文库的构建方法,具体包括如下步骤:
(1)血浆分离与存储
收集全血,低速离心,收集上层血浆;高速离心血浆,收集上清液。
(2)细胞外囊泡纯化
使用Qiagen公司的exoRNeasy血清/血浆试剂盒纯化血浆细胞外囊泡。具体地,加入等体积的XBP缓冲液到血浆中,将混合液加到exoRNeasy试剂盒中的离心柱上,500x g离心1分钟;加3.5ml XWP溶液,5000x g离心5 分钟,清洗旋转柱上的残余缓冲液;加700ulQIAzol裂解细胞外囊泡用于RNA 抽提。
(3)细胞外囊泡总RNA提取
使用Qiagen公司的miRNeasy(RNeasy MinElute旋转柱)试剂盒提取总 RNA,
具体提取步骤如下:
1.加700ul QIAzol(Qiagen公司)到离心柱膜上,室温下孵育2-3分钟,5000x g离心,收集裂解物并全部转移到管中,短暂旋转后在室温孵育5分钟。
2.往管中加入氯仿,并盖紧盖,大力晃动15秒,室温孵育2-3分钟;在 4℃下,12,000x g离心15分钟,将上层清夜转移到新管中;
3.加入2倍体积的无水乙醇,使充分混匀,转移到RNeasy MinElute柱内,盖上盖子,以≥8000x g(≥10,000rpm)室温离心15秒;
4.向RNeasy MinElute离心柱内加入RWT缓冲液,盖上盖,≥8000x g (≥10,000rpm)离心15秒,弃滤液;
5.吸取RPE缓冲液于RNeasy MinElute离心柱内,盖上盖,≥8000x g (≥10,000rpm)离心15秒,弃滤液;
6.吸取RPE缓冲液于RNeasy MinElute离心柱内,盖上盖,≥8000x g (≥10,000rpm)离心2分钟,弃滤液和收集管;
7.将RNeasy MinElute柱移入新的收集管中,打开离心柱的盖,最大转速离心5分钟,干燥膜,弃滤液和收集管;
8.将RNeasy MinElute柱移入新的1.5ml收集管中,在离心柱膜的中心直接加入14ul RNase-free水;盖上盖,立式放置离心柱1分钟,最大转速离心1分钟以洗脱RNA。
(4)RNA-seq文库制备
1.用DNase I(NEB公司)处理RNA 37℃,15分钟,然后用AHTS RNA Clean beads(南京诺唯赞公司)纯化RNA;
2.采用Clontech公司SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico-InputMammalian试剂盒进行文库制备,其中将RNA打断的条件改为85℃处理4分 30秒;第一轮PCR的循环数改为6次;第二轮PCR使用16次循环来扩增最终的RNA-seq文库;采用VAHTS DNAClean beads(南京诺唯赞公司)纯化最终的RNA-seq文库。
制备得到的RNA-seq文库进行测序:
测序文库委托苏州金唯智公司在Illumina高通量测序仪进行双端150bp 读长测序,获得测序原始数据后,首先需要对数据进行过滤、去接头序列及对低质量reads进行处理。采用Hisat2软件进行基因组比对,对已知信使RNA 和长链非RNA进行定量分析;未比对上的reads采用ACFS2软件分析环状RNA。
对同一个样本,采用该方法,两次重复之间的Pearson相关分析R=0.99。采用该方法,对126个正常人进行血浆细胞外囊泡长链RNA测序,每个样本可稳定获得超过1万多种长链RNA,包括信使RNA、长链非编码RNA和环状RNA (实施例1)。这些靶点可进行年龄与性别的筛选与鉴别(实施例2)。血浆细胞外囊泡长链RNA包含各种组织细胞特异性RNA,肝癌病人中的肝特异靶点显著高于正常人(实施例3)。
采用该方法,我们检测了不同癌症病人的血浆细胞外囊泡长链RNA,发现血浆外囊泡长链RNA可区分正常人和癌症病人(实施例4)。细胞外囊泡长链 RNA可用作HCC诊断标志物,且具有较高的敏感性和特异性。基于细胞外囊泡长链RNA创建的肝癌分类器的预测诊断能力超越了现有诊断方法(如:AFP);其可以诊断HCC早期患者或AFP-阴性的HCC患者;也可以区分HCC患者和肝炎、肝硬化、良性肿瘤患者(实施例5)。建立了健康个体和癌症患者的血浆细胞外囊泡长链RNA图谱,展现了细胞外囊泡长链RNA标志物在癌症诊断方面的作用。
与循环肿瘤DNA(ctDNA)测定方法不同,本方法不需要首先识别患者的体细胞突变。此外,定量PCR或靶向测序可以很容易地检测特定RNA标志物,表明该方法可被常规经济使用。血浆细胞外囊泡长链RNA来自不同的组织,含有许多组织特异性RNA利用细胞外囊泡长链RNA标记不仅可以提高癌症的诊断准确率,也可以提高其他疾病(如肝炎、肝硬化等)诊断率。
本发明的创新点所在:本发明的方法,重复性高,可从1ml血浆中稳定获得超过1万个RNA靶点,包括信使RNA、长链非编码RNA和环状RNA,这些靶点来源于不同组织细胞,可作为疾病诊断和预后的生物标志物。通过该方法检测血浆中的细胞外囊泡长链RNA表达谱,可区分正常个体和癌症患者,发现癌症诊断靶点。
附图说明
图1-6人类血浆细胞外囊泡长链RNA测序结果
其中,图1、囊泡分离后的扫描电子显微镜图像;图2、分离囊泡的尺寸大小分布图;图3、蛋白质免疫印迹法分析囊泡蛋白表达情况;图4、细胞外囊泡长链RNA测序的重复性;图5、各类注释基因(包括发现的circRNAs) 的匹配数目的比列分布;图6、箱线图展示每个细胞外囊泡长链RNA测序样本 (126个正常个体)的细胞外囊泡长链RNA数目;线表示细胞外囊泡长链RNA 数目的中位数和四分位数范围,点表示剩余的数据,图中数字为每一类长链RNA的中位数。
图7-8血浆细胞外囊泡中与性别和年龄相关的长链RNA
其中,2-A、Wilcoxon秩和检验分析在男性和女性血浆细胞外囊泡中的差异表达的长链RNAs,图中的‘Y’表示来自Y染色体的RNAs,‘XIST’表示XIST RNA;2-B、Spearman相关分析检出与年龄相关的长链RNAs,数字代表与年龄显著相关的RNA数目;
图9-11血浆细胞外囊泡长链RNA包括不同组织特异RNA,并可指示不同类型免疫细胞的组织来源和相对比例
其中,图9、正常个体(n=126)和肝癌患者(n=71)血浆细胞外囊泡中组织特异性RNA表达谱,右侧列出不同组织中特异表达的RNA总数;图10、运用CIBERSORT和白细胞基因标记矩阵(LM22)评估在正常个体和肝癌样本中不同免疫细胞的相对比例(37个正常样本,36个肝癌样本);图11、用Z- 检验和Wilcoxon检验比较正常个体和肝癌患者细胞外囊泡长链RNA评估的免疫细胞组分差异情况。
图12-15血浆细胞外囊泡长链RNAs可区分癌症患者和健康个体
其中,图12、正常人和多种肿瘤血浆差异表达的细胞外囊泡长链RNA的无监督聚类热图;图13、SVM分类器预测训练集(n=101)和检验集(n=68) 所得ROC曲线;随机分类器表明SVM模型诊断预测两个随机抽样集合的准确性;图14、SVM分类器预测训练集(顶图)和验证集(底图)的结果混淆矩阵;1000次随机抽样和训练SVM模型所得的诊断准确率;图15、不同类型肿瘤特异的细胞外囊泡长链RNA区分五类肿瘤的热图。
图16-21血浆细胞外囊泡长链RNA可作为肝癌诊断的生物标志物
其中,图16、用训练数据集和验证数据集评估标记物构建的肝癌分类器预测模型得到的ROC曲线;图17、采用肝癌分类器分别预测训练集(左边), 验证集(中间)和测试集(右边)的结果矩阵。其中,图18、用于构建肝癌分类器的8个细胞外囊泡长链RNA标志物在验证集中的表达热图;图19、用于构建肝癌分类器的8个细胞外囊泡长链RNA标志物在测试集中的表达热图;图20、肝癌分类器预测的ROC曲线和AFP表达水平预测的ROC曲线;图21、应用肝癌分类器预测不同癌症群体的准确性不同,对照组(94个正常个体, 19个肝炎和肝硬化患者,18个良性肝肿瘤患者),肝癌(71个),GC(胃癌, 9个),CRC(结肠直肠癌,12个),BRCA(乳腺癌,10个),KIRC(肾癌,15 个)。
具体实施方式
实施例1血浆细胞外囊泡长链RNA文库的制备
样本采集:
总样本集包括健康个体(n=126)、HCC患者(肝癌,n=104)、良性肝肿瘤 (n=24)、肝炎(n=11)、肝硬化(n=8)、GC(胃癌,n=9)、CRC(结直肠癌, n=12)、BRCA(乳腺癌,n=10)和KIRC(肾癌,n=15)。样本来源于复旦大学附属肿瘤医院,根据病理诊断结果明确疾病类型。
第一步:血浆分离与存储
1.用含EDTA的采血管收集5-10ml的全血,室温(15-25℃)存放,并于 2小时内对其进行如下处理:
2.在室温或4℃下,用摇摆桶式离心机转子以3000rpm的转速对采血管中的血浆样本离心10分钟。
3.将上层血浆(黄色)转移到新管中,需注意不能破坏中间的白膜层(包含白细胞和血小板)。正常情况下,10ml全血可获取4-5ml血浆。
4.在4℃下,13,000x g离心血浆样本10分钟,将上清液转移到新管中,注意不能破坏离心管外部/底部的沉淀物。
第二步:细胞外囊泡纯化
使用Qiagen公司的exoRNeasy血清/血浆试剂盒纯化血浆细胞外囊泡。
具体方法:加入等体积的XBP缓冲液(试剂盒自带)到血浆中,将混合液加到exoRNeasy试剂盒中的离心柱上,500x g离心1分钟;加3.5ml XWP 溶液(试剂盒自带),5000x g离心5分钟,清洗旋转柱上的残余缓冲液;加 700ul QIAzol裂解液(Qiagen公司)裂解细胞外囊泡用于RNA抽提。
1.加入等体积的XBP缓冲液到血浆中,立即轻轻倒置5次以充分混合。
2.将样品/XBP混合液加到exoRNeasy离心柱上,500x g离心1分钟,弃液体后将旋转柱置于相同的收集管中。
3.加3.5ml XWP,5000x g离心5分钟,清洗旋转柱上的残余缓冲液,把收集管连同其中的液体一同丢掉。
4.如果是用于RNA分离的话,按照后续的第三步用QIAzol裂解细胞外囊泡。如果是用于电镜和蛋白印迹分析,用400ul XE洗脱缓冲液(Qiagen公司) 洗脱细胞外囊泡,可通过超滤法浓缩洗脱体积。
对细胞外囊泡进行电镜检查:
用PBS稀释分离到的细胞外囊泡,然后超滤浓缩(Amicon Ultra-15tubes,Millipore公司),将再悬浮细胞外囊泡和4%多聚甲醛混合。取10uL再悬浮细胞外囊泡移送至铜网上3min,然后用滤纸从铜网边缘吸收液体,用1%醋酸双氧铀染色1min,置于白炽灯下干燥2min。将此铜网置于透射电子显微镜(JEM-1200EX,JEOL公司)下观察形态并拍照(图1)。
细胞外囊泡尺寸测量:
用NanoFCM流式细胞仪(厦门福流公司)分析细胞外囊泡的大小尺寸。先用蒸馏水将分离出来的细胞外囊泡稀释1~100倍,然后以纳米二氧化硅微珠Cocktail(S16M-Exo,厦门福流公司)的尺寸为基标准,构建一条关于颗粒尺寸和散射强度的刻度标准线,利用该标准线可以将每个囊泡的散射强度转换为相应的囊泡尺寸(图2)。
第三步:细胞外囊泡总RNA提取
使用Qiagen公司的miRNeasy(RNeasy MinElute旋转柱)试剂盒提取总 RNA,
具体提取步骤如下:
1.加700ul QIAzol(Qiagen公司)到离心柱膜上,室温下孵育2-3分钟, 5000x g离心,收集裂解物并全部转移到管中,短暂旋转后在室温孵育5分钟。
2.往管中加入氯仿,并盖紧盖,大力晃动15秒,室温孵育2-3分钟;在 4℃下,12,000x g离心15分钟,将上层清夜转移到新管中;
3.加入2倍体积的无水乙醇,使充分混匀,转移到RNeasy MinElute柱内,盖上盖子,以≥8000x g(≥10,000rpm)室温离心15秒;
4.向RNeasy MinElute离心柱内加入RWT缓冲液,盖上盖,≥8000x g (≥10,000rpm)离心15秒,弃滤液;
5.吸取RPE缓冲液于RNeasy MinElute离心柱内,盖上盖,≥8000x g (≥10,000rpm)离心15秒,弃滤液;
6.吸取RPE缓冲液于RNeasy MinElute离心柱内,盖上盖,≥8000x g (≥10,000rpm)离心2分钟,弃滤液和收集管;
7.将RNeasy MinElute柱移入新的收集管中,打开离心柱的盖,最大转速离心5分钟,干燥膜,弃滤液和收集管;
8.将RNeasy MinElute柱移入新的1.5ml收集管中,在离心柱膜的中心直接加入14ul RNase-free水;盖上盖,立式放置离心柱1分钟,最大转速离心1分钟以洗脱RNA。
第四步:RNA-seq文库制备
1.用DNase I(NEB公司)处理RNA 37℃,15分钟,然后用AHTS RNA Clean beads(南京诺唯赞公司)纯化RNA;
2.采用Clontech公司SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico-InputMammalian试剂盒进行文库制备,其中将RNA打断的条件改为85℃处理4分 30秒;第一轮PCR的循环数改为6次;第二轮PCR使用16次循环来扩增最终的RNA-seq文库;采用VAHTS DNAClean beads(南京诺唯赞公司)纯化最终的RNA-seq文库。
第五步:测序和数据分析
测序文库委托苏州金唯智公司在Illumina高通量测序仪进行双端150bp 读长测序,获得测序原始数据后,首先需要对数据进行过滤、去接头序列及对低质量AHTS RNAClean beads进行处理。采用Hisat2软件进行基因组比对,对已知信使RNA和长链非RNA进行定量分析;未比对上的AHTS RNA Clean beads采用ACFS2软件分析环状RNA。
电子显微成像和尺寸分布测量表明,分离囊泡是膜包裹的,直径约87nm (图1和图2)。蛋白质免疫印迹分析证明细胞外囊泡标志物CD63(一种跨膜蛋白)和TSG101(一种细胞质蛋白)富集存在于分离囊泡中,但是在外周血单核细胞(PBMC)中没有富集(图3)。另一方面,在细胞外囊泡中不会有富集的Grp 94和calnexin在PBMC中可观察到,在分离囊泡中未观察到(图3)。上述结果表明这些分离囊泡主要由细胞外囊泡组成。经细胞外囊泡长链RNA-seq后,每个样本平均产生33.8百万序列读数。两次重复之间的相关性说明细胞外囊泡长链RNA-seq具有高度可重复性(Pearson相关分析R=0.99,图4)蛋白编码RNA(mRNA)占总序列匹配数的76%,其他类型的RNA只占了一小部分:6%是circRNA,假基因和lncRNA分别有2%和1%(图5)。对于每个细胞外囊泡长链RNA测序样本,我们检测到约11971个蛋白编码mRNA,4919 个环状RNA,1031个长链非编码RNA和706个假基因(图6)。
实施例2血浆细胞外囊泡中与性别和年龄相关的长链RNA
本文研究的健康群体的年龄范围较广(27-70岁),男性样本和女性样本的数目比较对等,这使得我们能够探索在血浆细胞外囊泡中是否存在与性别和年龄相关的长链RNA。应用Wilcoxon秩和检验识别性别相关的细胞外囊泡长链RNAs。共鉴别出1293个有性别偏倚倾向的细胞外囊泡长链RNAs,其中有531个偏向女性,762个偏向男性(图7)。在这些具有性别特异性的RNAs 中,121个男性特异的RNAs来自Y染色体,女性特异的Xist RNA来自X染色体。
为了寻找血浆细胞外囊泡RNA随年龄而发生动态变化的靶点,我们应用 Spearman相关性分析发现了525个年龄相关的细胞外囊泡长链RNA (|Spearman’sρ|>0.5),包括209个正相关的RNA,316个负相关的RNA (图8)。
实施例3血浆细胞外囊泡长链RNA可反映其组织来源以及不同类型免疫细胞的相对比例
血浆细胞外囊泡来源于不同的组织,我们分析了是否可在血浆细胞外囊泡中检测到具有组织特异性的RNAs。我们运用GTEx提供的30个人类组织的基因表达谱,计算每个基因的组织特异性打分(Ti-score)。有1783个 Ti-score>4的基因被选定为组织特异基因,其中约33.1%(591)的基因在正常个体的细胞外囊泡长链RNA数据中有出现(图9)。在细胞外囊泡中那些富集存在的组织特异性标志物对应的组织有血浆、肝和大脑(图9)。我们进一步分析了在肝癌患者的细胞外囊泡中,组织特异性基因的出现情况。结果发现与正常个体相比,肝特异性基因在肝癌患者中是显著富集存在的。表明细胞外囊泡长链RNA可反映其组织来源。
基于CIBERSORT工具,我们也探究了正常个体和肝癌患者细胞外囊泡长链RNA数据中出现的不同类型免疫细胞。在约22种免疫细胞类型中,有16 种可以被评估,它们的比列差别很大(图10)。我们观察到与正常个体相比,肝癌患者中的中性粒细胞、静息NK细胞和M2巨噬细胞有明显富集,但是初始B细胞有减少(图11)。
实施例4血浆细胞外囊泡长链RNA用于区分癌症患者和正常个体
我们探讨了细胞外囊泡长链RNA是否能区分癌症患者和健康人群。与健康对照组相比,癌症组总共有581个上调的细胞外囊泡长链RNA,1110个下调的细胞外囊泡长链RNA(FDR<.05,fold change>2)。基于检测到的差异细胞外囊泡长链RNA进行非监督层次聚类,聚类结果大体上能将癌症患者和健康对照区分开(图12)。然后,采用支持向量机(SVM)算法基于10-倍交叉验证对癌症患者和健康个体进行分类。评估分类器预测训练集和独立检验集效果所得的AUC值分别为0.9988(95%CI=0.996~1)和0.9939(95%CI =0.982~1),可见图13。用Mann-Whitney U检验检测训练集(n=101)样本的差异性,得到分类器特异的细胞外囊泡长链RNA谱(n=78)。训练集的诊断性敏感性为96%,特异性为97%(图14)。该分类模型预测独立验证集(n=68) 的敏感性和特异性均为97%(图14)。为了评估该分类器识别所有样本的准确性,我们按3:2比例随机将所有数据分为训练组和验证组,随机1000次,最后得到的训练集准确率(97%±1.1%)和验证集准确率(97%±1.6%)及其相近。此外,基于组织特异性打分(Ti-score>2)确定了五种癌症中3052 个具有组织特异性的细胞外囊泡长链RNA,通过这些特异的细胞外囊泡长链 RNA可将五种癌症分离开(图15)。
实施例5血浆细胞外囊泡长链RNA可作为肝癌诊断的生物标志物
对肝癌群体和非肿瘤群体进行细胞外囊泡长链RNA测序,其中肝癌群体由104个肝癌患者组成,非肿瘤群体有144个样本,包括101个正常、24个良性肝肿瘤、11个肝炎和8个肝硬化样本。然后整合不同数据集以评估特定细胞外囊泡长链RNAs在肝癌诊断中的效果。训练集包含44个肝癌患者和78 个对照个体。
选出在肝癌患者中高表达的细胞外囊泡长链RNAs;再将这些细胞外囊泡长链RNA和肝癌组织上调的RNA进行取交集;最后只选择那些均高表达的细胞外囊泡长链RNA。此外,用随机森林算法和最小绝对值收敛和选择算法 (LASSO)分析这些被选择的细胞外囊泡长链RNA标志物(n=379),基于训练集构建模型进而达到压缩变量数目的目的。按照上述方式,最终得到8个相关的细胞外囊泡长链RNA标志物用以创建肝癌分类器。
然后,使用SVM算法结合这8个细胞外囊泡长链RNA标志物以确定肝癌诊断分类器的性能。肝癌分类器预测训练集的敏感性为84%,特异性为94%,预测验证集(53个对照个体和27个肝癌患者)的敏感性和特异性分别为89%和91%,以及独立预测集(39个对照样本和33个肝癌患者)的敏感性和特异性分别为85%和95%(图16和17),这个肝癌分类器可有效区分训练集(AUC= 0.9527),验证集(AUC=0.9825)和预测集(AUC=0.9627)中的肝癌患者和正常个体。
此外,这8个细胞外囊泡长链RNA标志物的热图也可以较高预测准确率识别出验证集(图18)和预测集(图19)中的肝癌患者。
甲胎蛋白(AFP)是肝癌风险评估和监测的传统生物标志物,但是其灵敏度低,不能识别所有可能发展为肝癌的患者。事实上,许多肝硬化患者发展为肝癌后,AFP表达水平不会升高。本实施例的肝癌群体中,28%患者(n=17) 的血清AFP含量正常(<10ng/mL)。基于训练集得到的肝癌分类模型用于预测所有样本,计算模型的预测概率,将其与用AFP水平诊断肝癌患者(n=60) 和对照组(n=17)的效率进行比较。肝癌分类器预测的敏感性和特异性均优于AFP(AUC 0.9461vs.0.8343,p-value=0.037,图20)。该肝癌分类器还可区分其它肝脏疾病(如肝炎、肝硬化或良性肿瘤)和其它癌症(图21)。
Claims (5)
1.一种细胞外囊泡长链RNA文库的构建方法,其特征在于该方法包括如下步骤:
(1)样品分离
采用两步离心法从全血中分离血浆;
(2)细胞外囊泡纯化
使用膜亲和离心柱子快速分离血浆细胞外囊泡;
(3)细胞外囊泡总RNA提取
使用离心柱子提取细胞外囊泡中的总RNA;
(4)细胞外囊泡长链RNA文库的构建和测序分析
使用SMARTer技术,模板末端的转换机制技术制备得到RNA-seq文库。
2.根据权利要求1所述的细胞外囊泡长链RNA文库的构建方法,其特征在于其中步骤(2)中的膜亲和离心柱子为exoRNeasy血清/血浆试剂盒中的离心柱子;步骤(3)中的离心柱子为miRNeasy试剂盒中的RNeasy MinElute旋转柱;步骤(4)中的SMARTer技术为SMARTerStranded Total RNA-Seq Kit Pico-Input Mammalian试剂盒。
3.权利要求1或2任一项所述方法构建得到的细胞外囊泡长链RNA文库。
4.权利要求3所述的细胞外囊泡长链RNA文库的应用,其可用于癌症的诊断。
5.权利要求4所述的应用,其特征在于其中所述的癌症是肝细胞癌。
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CN201910086801.7A Pending CN109763173A (zh) | 2019-01-29 | 2019-01-29 | 一种血浆细胞外囊泡长链rna文库及其构建方法 |
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-
2019
- 2019-01-29 CN CN201910086801.7A patent/CN109763173A/zh active Pending
Non-Patent Citations (5)
Title |
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