CN116171332A - 用于认知疾病的生物标志物 - Google Patents

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Abstract

分析微RNA(miRNA)标志物，以确定或预测个体的认知障碍阶段和阿尔茨海默病的可能性。

Description

用于认知疾病的生物标志物
发明领域
本发明涉及可用于确定或预测个体的认知障碍(cognitive impairment)阶段和阿尔茨海默病的可能性的微RNA(miRNA)标志物(signature)。该信息可与预防的和积极的疗法配对，以防止或延缓认知能力的下降。
发明背景
阿尔茨海默病(AD)的早期检测对于有效治疗策略的开发和提供至关重要。虽然在有AD病史的家族血统中鉴定已知的突变是可行的，但没有这样的常规测试可用于检测该病的散发性形式。ApoEε4基因型是一个长期确立的晚发AD的风险因素，但它本身并不能强烈预测AD的进展，也没有其他单一突变显示出更强的预测价值。相反地，虽然量化脑脊液和脑中β淀粉样蛋白(Aβ)的水平，这是AD的诊断特征之一，以及皮质结构中的解剖学变化是可能的，但如果不重复使用正电子发射断层扫描(PET)、磁共振成像(MRI)扫描或腰椎穿刺，则不可能测量这些早期变化。这些都是昂贵的和/或侵入性的操作，只有高度专业化的中心才有，目前并不适用于人群筛查。
关注的焦点集中在AD的血液源性生物标志物(biomarker)，但目前还没有这种生物标志物可以用来预测疾病的发生。事实上，尽管淀粉样变性(amyloidosis)和认知能力下降之间有很强的关联性，但对于它们在血浆中的水平是否与疾病有很好的相关性仍有很多争议。尽管有新技术的发展，但直接测量Aβ和磷酸化-tau在技术上有很大的挑战性。这可能是由于Aβ的高度聚集特性、血液中的低水平、以及缺乏关于Ap如何从脑中输出的知识。此外，有证据表明血液中的Aβ水平随着AD的进展而下降。
最近，越来越多的证据表明，微RNA(miRNA)在AD中失调，且血液源性miRNA可能是该疾病的良好候选生物标志物，所述微RNA(miRNA)是一类非编码RNA，通过在转录后水平调节基因表达而发挥作用。有趣的是，虽然可以在脑脊液中检测到miRNA，但miRNA穿过血脑屏障，并通过与蛋白质复合体结合和封存入膜结合的囊泡(如外泌体)中而免于降解。
事实上，最近的证据表明，外泌体可能参与了神经退行性疾病的传播，且外泌体来源的miRNA可以转导接受细胞。因此，miRNA的循环水平不仅可以准确反映神经元的功能和功能障碍，而且可能代表治疗痴呆症的新的治疗靶标。
报道的构成假定的AD相关组的miRNA种类几乎没有一致性。除了研究队列中的异质性，血液收集、加工和储存的分析前差异，血液成分的差异以及用于评估生物标志物水平的分析和统计平台都是寻找AD基于血液的生物标志物的关键限制因素。
因此，鉴定强大的、易于监测的生物标志物作为准确的初期AD指标，并了解这些标志物在疾病的整个过程中如何变化是至关重要的。本发明的目的是在一定程度上满足这一需求；和/或至少为公众提供一个有用的选择。
本发明的其他目的可从以下描述中明显看出，这些描述仅以举例方式给出。
在本说明书中对文件、行为、材料、装置、物品或类似物的任何讨论，仅仅是为了给本发明提供一个上下文。它不应被视为承认任何或所有这些事项构成现有技术基础的一部分，或不应被视为承认因为它在优先权日期之前就存在而为与本发明有关的领域中的普遍公知的常识。
发明概述
本发明提供了检测升高的认知障碍生物标志物组(biomarker panel)的方法，包括：a)检测人的体液样本中表1(并参考图1)所列的任一miRNA生物标志物水平的任何组合；和b)当所述miRNA生物标志物中至少一种的水平相对于健康对照水平上调或下调时，检测所述升高的认知障碍生物标志物组。在一些实施方案中，所述miRNA生物标志物包括miR-29c-3p、miR-335-5p、miR-142-3p、miR-324-5p、miR-195-5p、miR-148a-3p、miR-27a-3p、miR-27b-3p、miR-122-5p、miR-193b-3p、miR-342-3p和miR-885-5p。在一些实施方案中，所述miRNA生物标志物进一步包括miR-143-3p、miR-320a-3p、miR-365-3p、miR-532-5p和miR-132-3p。
在一些实施方案中，步骤a)包括检测体液中表1所列的任一miRNA生物标志物水平的任何组合。在一些实施方案中，所述miRNA生物标志物包括miR-29c，miR-335-5p、miR-142-3p、miR-324-5p、miR-195-5p、miR-148-3p、miR-27a-3p、miR-27b-3p、miR-122-5p、miR-193b-3p、miR-342-3p和miR-885-5p。
在一些实施方案中，怀疑所述人有认知障碍或阿尔茨海默病，例如，通过认知测试确定。在一些实施方案中，体液样品是血浆。在一些实施方案中，体液选自血清、白血球或全血。
在一些实施方案中，检测miRNA生物标志物的水平包括通过基于扩增的方法进行检测。在一些实施方案中，检测miRNA生物标志物的水平包括通过基于阵列的方法进行检测。
在一些实施方案中，当miR-29c-3p、miR-335-5p或miR-142-3p中的任何一个被上调，或当miR-122-5p、miR-342-3p、miR-885-5p被下调时，诊断该人为可能在脑中具有高β淀粉样蛋白负载、淀粉样蛋白阳性(Aβ+)。在一些实施方案中，该方法进一步包括检测miRNA生物标志物miR-27b-3p、miR-143-3p、miR-320a-3p、miR-532,5p、miR-193-3p、miR-324-5p、miR-365-3p、miR-148-3p、miR-27a-3p或miR-132-3p的水平。在一些实施方案中，β淀粉样蛋白负载与miR-27a-3p、miR-27b-3p和miR-324-5p的表达水平相关联。
在一些实施方案中，当miR-195-5p、miR-148-3p、miR-324-5p中的任何一个被上调或miR-142-3p被下调时，将所述人诊断为患有轻度认知障碍(MCI)。在一些实施方案中，该方法进一步包括检测miRNA生物标志物miR-885-5p、miR-483-5p、miR-199a-3p、miR-365-3p、miR-132-3p、miR-27a-3p、miR-27b-3p、miR-143-3p、miR-335-5p或let-7e-5p的水平。
在一些实施方案中，当miR-122-5p、miR-193b-3p或miR-885-5p中的任何一个被上调或miR-27a-3p、miR-27b-3p或miR-324-5p中的任何一个被下调时，将所述人诊断为患有阿尔茨海默病。在一些实施方案中，该方法进一步包括检测miRNA生物标志物miR-486-3p、miR-486-5p、miR-378-3p、miR-365-3p、miR-132-3p、miR-195-5p、miR-335-5p、miR-30c-5p、miR-340-5p或miR-142-3p的水平。
在一些实施方案中，该方法进一步包括当检测到升高的认知障碍生物标志物组时，对所述人给予PET或MRI扫描或认知治疗。在一些实施方案中，当检测到升高的认知障碍生物标志物组时，还对所述人进行药物治疗。
在一些实施方案中，该方法进一步包括通过腰部穿刺从该人获得脑脊液(脊髓穿刺(spinal tap)样本)，并当检测到认知障碍生物标志物组时检测样本中β淀粉样蛋白或tau/p-tau的水平。在一些实施方案中，该方法包括从该人获得血清、白细胞或全血，并当检测到认知障碍生物标志物组时检测样本中的β淀粉样蛋白或tau/p-tau水平。在一些实施方案中，该方法进一步包括检测体液或组织样本中ApoE-ε4基因型的存在。
在一些实施方案中，该方法进一步包括当检测到认知障碍生物标志物组时，检测取自人的样本中的β淀粉样蛋白或tau/p-tau的水平。
本发明还提供了测量人升高的认知障碍生物标志物组的方法，包括：a)从该人获得体液样本；b)确定该生物样本中生物标志物组的测量值，所述生物标志物选自表1中所列的miRNA生物标志物的任意组合，其中该测量包括测量该组中每个生物标志物的水平。在一些实施方案中，该组包含miR-29c-3p、miR-335-5p、miR-142-3p、miR-324-5p、miR-195-5p、miR-148-3p、miR-27a-3p、miR-27b-3p、miR-122-5p、miR-193b-3p、miR-342-3p和miR-885-5p。在一些实施方案中，所述miRNA生物标志物进一步包括miR-143-3p、miR-320-3p、miR-365-3p、miR-532-5p和miR-132-3p。
在一些实施方案中，怀疑所述人有认知障碍或阿尔茨海默氏病。在一些实施方案中，体液样本是血浆。在一些实施方案中，体液选自血清、白血球或全血。
在一些实施方案中，所述确定包括通过基于扩增的方法进行测量。在一些实施方案中，所述确定包括通过基于阵列的方法进行测量。
在一些实施方案中，当miR-29c-3p、miR-335-5p或miR-142-3p中的任何一个相对于健康对照被上调，或miR-122-5p、miR-342-3p、miR-885-5p相对于健康对照被下调时，将所述人诊断为可能具有脑中高β淀粉样蛋白负载、淀粉样蛋白阳性(Aβ+)。在一些实施方案中，该方法进一步包括检测miRNA生物标志物miR-27b-3p、miR-143-3p、miR-320a-3p、miR-532,5p、miR-193-3p、miR-324-5p、miR-365-3p、miR-148-3p、miR-27a-3p或miR-132-3p的水平。在一些实施方案中，β淀粉样蛋白负载与miR-27a-3p、miR-27b-3p和miR-324-5p的表达水平相关。
在一些实施方案中，当miR-195-5p、miR-148-3p、miR-324-5p中的任何一个相对于健康对照组被上调或miR-142-3p相对于健康对照组被下调时，将所述人诊断为患有轻度认知障碍(MCI)。在一些实施方案中，该方法进一步包括检测miRNA生物标志物miR-885-5p、miR-483-5p、miR-132-3p、miR-199a-3p、miR-365-3p、miR-132-3p、miR-27a-3p、miR-27b-3p、miR-143-3p、miR-335-5p或let-7e-5p的水平。
在一些实施方案中，当miR-122-5p、miR-193b-3p或miR-885-5p中的任何一个相对于健康对照被上调或miR-27a-3p、miR-27b-3p或miR-324-5p中的任何一个相对于健康对照被下调时，将所述人诊断为患有阿尔茨海默病。在一些实施方案中，该方法进一步包括检测miRNA生物标志物miR-486-3p、miR-486-5p、miR-378-3p、miR-365-3p、miR-132-3p、miR-195-5p、miR-335-5p、miR-30c-5p、miR-340-5p或miR-142-3p的水平。
在一些实施方案中，该方法进一步包括当检测到升高的认知障碍生物标志物组时，对所述人给予PET或MRI扫描或认知治疗。在一些实施方案中，当检测到升高的认知障碍生物标志物组时，还对所述人进行药物治疗。
在一些实施方案中，该方法进一步包括当检测到升高的认知障碍生物标志物组时，从所述人获得脊髓穿刺样本，和检测样本中的淀粉样蛋白或tau的水平。在一些实施方案中，该方法进一步包括检测体液样本中ApoE-ε4基因型的存在。
本发明还提供了确定认知障碍的进展的方法，包括
a)在第一时间从人获得第一体液样本；
b)在第一时间之后的第二时间从该人获得第二体液样本；
c)检测该第一体液样本中miRNA生物标志物miR-29c-3p、miR-335-5p、miR-142-3p、miR-324-5p、miR-195-5p、miR-148-3p、miR-27a-3p、miR-27b-3p、miR-122-5p、miR-193b-3p、miR-342-3p和miR-885-5p的水平；
d)检测该第二体液样本中miRNA生物标志物miR-29c-3p、miR-335-5p、miR-142-3p、miR-324-5p、miR-195-5p、miR-148-3p、miR-27a-3p、miR-27b-3p、miR-122-5p、miR-193b-3p、miR-342-3p和miR-885-5p的水平；
e)比较在该第一时间获取的miRNA生物标志物的水平，从而确定认知障碍的进展。
在一个实施方案中，当miR-29c-3p和miR-335-5p改变时，诊断该人为脑中可能有高β淀粉样蛋白负载。
在一个实施方案中，当miR-142-3p、miR-324-5p、miR-195、miR-148a-3p改变时，诊断该人为患有轻度认知障碍(MCI)。
在一个实施方案中，当miR-27a-3p、miR-27b-3p、miR-122-5p、miR-193b-3p、miR-324-5p改变时，诊断该人为患有阿尔茨海默病。
本发明还提供了用于检测认知障碍生物标志物组的试剂盒。在一些实施方案中，该试剂盒包含a)与miRNA生物标志物miR-29c-3p、miR-335-5p、miR-142-3p、miR-324-5p、miR-195-5p、miR-148-3p、miR-27a-3p、miR-27b-3p、miR-122-5p、miR-193b-3p、miR-342-3p和miR-885-5p中的各种miRNA生物标志物特异性杂交的寡核苷酸；和b)特异性检测miRNA生物标志物miR-29c-3p、miR-335-5p、miR-142-3p、miR-324-5p、miR-195-5p、miR-148-3p、miR-27a-3p、miR-27b-3p、miR-122-5p、miR-193b-3p、miR-342-3p和miR-885-5p中的各种miRNA生物标志物的标记的探针。在一些实施方案中，该试剂盒进一步包含与miR-143-3p、miR-320-3p、miR-365-3p、miR-532-5p和miR-132-3p特异性杂交的寡核苷酸；和特异性检测miR-143-3p、miR-320-3p、miR-365-3p、miR-532-5p和miR-132-3p的标记的探针。在一些实施方案中，所述寡核苷酸或探针被连接到阵列上。
在一些实施方案中，所述试剂盒包括分开的反应混合物或分开的阵列，用于检测MCI和AD的认知障碍生物标志物。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包括用于检测或测量当前所述的认知障碍生物标志物水平的试剂，例如，缓冲剂、聚合酶等。
在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包括用于检测ApoE-ε4等位基因的存在或β淀粉样蛋白或tau/p-tau水平的试剂。
本发明还提供了确定人脑中可能具有高β淀粉样蛋白负载、淀粉样蛋白阳性(Aβ+)的可能性的方法，包括检测来自该人的体液样本中表1中所列的任何miRNA生物标志物的水平的任何组合(例如，miR-29c-3p、miR-335-5p、miR-142-3p、miR-324-5p、miR-195-5p、miR-148-3p、miR-27a-3p、miR-27b-3p、miR-122-5p、miR-1 93b-3p、miR-342-3p和miR-885-5p)，和当miR-29c-3p、miR-335-5p、miR-142-3p中的任何一个相对于健康对照水平上调或当miR-122-5p、miR-342-3p和miR-885-5p相对于健康对照水平下调时，确定该人可能脑中具有高β淀粉样蛋白负载、淀粉样蛋白阳性(Aβ+)。
本发明还提供了确定人患有轻度认知障碍(MCI)的可能性的方法，包括检测来自该人的体液样本中表1中所列的任何miRNA生物标志物的水平的任何组合(例如，miR-29c-3p、miR-335-5p、miR-142-3p、miR-324-5p、miR-195-5p、miR-148-3p、miR-27a-3p、miR-27b-3p、miR-122-5p、miR-193b-3p和miR-885-5p)，和当miR-195-5p、miR-148-3p、miR-324-5p中的任何一个相对于健康对照水平上调或当miR-142-3p相对于健康对照水平下调时，确定该人可能患有MCI。
本发明还提供了确定人患有阿尔茨海默病(AD)的可能性的方法，包括检测来自该人的体液样本中表1中所列的任何miRNA生物标志物的水平的任何组合(例如，miR-29c-3p、miR-335-5p、miR-142-3p、miR-324-5p、miR-195-5p、miR-148-3p、miR-27a-3p、miR-27b-3p、miR-122-5p、miR-193b-3p和miR-885-5p)，和当miR-122-5p、miR-193b-3p或miR-885-5p中的任何一个相对于健康对照水平上调或当miR-27a-3p、miR-27b-3p或miR-324-5p中的任何一个相对于健康对照水平下调时，确定该人可能患有AD。
Figure BDA0004113632930000071
表1：差异表达的miRNA。基于相对于HC(健康对照)的倍数变化，使用经验贝叶斯调节的t检验(p＜0.05)确定每个队列中显著地差异表达的miRNA。粗体字是在特定队列中统计学显著的miRNA表达；p＜0.05。Aβ+，认知正常时的淀粉样蛋白阳性；MCI，轻度认知障碍；AD，阿尔茨海默病。括号内为每个队列中的参与者数量。
在一些实施方案中，体液是血浆。在一些实施方案中，进一步包括检测体液样品中ApoE-ε4基因型的存在。
本发明也可以说广泛地包括在本申请说明书中提到或指出的部分、元素和特征，单独或组合地包括两个或多个所述部分、元素或特征的任何或所有组合，并且如果文中提到的具体整数在本发明所涉及的技术中具有已知的等价物，这类已知的等价物也视为并入本文，如同单独列出一样。
提及的文中公开的数字范围(例如，1至10)也包括对该范围内所有有理数(例如1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9和10)以及该范围内任何有理数的范围(例如2至8、1.5至5.5和3.1至4.7)的提及，因此，在此明确公开了文中明确公开的所有范围的所有子范围。这些只是具体的例子，所列举的最低值和最高值之间的所有可能的数值组合都应被视为在本申请中以类似方式明确说明。
在本说明书中，如果参考了专利说明书、其他外部文件或其他信息来源，这通常是为了提供讨论本发明特征的上下文。除非特别说明，对这些外部文件的引用不应理解为承认这些文件或这些信息来源在任何司法管辖区都是现有技术或构成本领域常规公知常识的一部分。
对于那些本发明相关技术的技术人员来说，不偏离所附权利要求书中定义的发明范围的情况下，对本发明的许多结构变化和广泛不同的实施方案和应用均已提示。本文的披露和描述纯粹是说明性的，不旨在以任何意义加以限制。
附图简述
本发明将参照附图进行描述。
图1-序列表
图2-研究计划的流程图。
图3-Aβ+、MCI和AD横断面队列的miRNA表达的加权倍数变化的森林图：线性混合效应模型包括Aβ+(n＝21)队列以及对MCI(n＝74)和AD(n＝63)队列的合并结果。每个疾病阶段的观察结果用菱形表示(Aβ+＝金色，MCI＝橙色，AD＝深红色)。菱形的宽度反映了估计的精确性(95％CI)；权重对应于来自研究的效应大小估计的反标准差(inversestandarddeviation)；X轴上的位置代表测量估计值(measure estimate)(倍数变化)，水平线表示微RNA表达″无变化″。正的效应大小代表微RNA表达的上调，负的效应大小代表微RNA表达的下调。数据是相对于HC组而言的。表5提供了估计概要。
图4-维恩图：显示元分析后保留的16个miRNA与疾病阶段的关联。
图5-miRNA的一致性排名和miRNA的诊断价值：a)用3个独立的标准对元分析中确定的16个miRNA分别进行排名(见表6)。(b)通过计算ROC曲线的AUC值(用归一化的Ct值进行逻辑回归)，与HC组相比，评估每个标志物(粗体)的诊断能力。每个ROC分析的结果显示在(c)。
图6-AIBL纵向队列中生物标志物miRNA表达的箱线图：在AIBL纵向队列中研究了生物标志物miRNA的表达(n＝21；Aβ+至MCI阶段和n＝18MCI至AD阶段；总MCI＝39)。
箱内的线显示miRNA表达的中位值(归一化Ct值)，且晶须代表95％CI。使用广义估计方程确定显著性差异(*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001)。散列线代表AIBL HC组的中位值，并且不包括在纵向分析中。
图7-生物信息学：显示由(a)Aβ+、MCI和AD相关的微RNA靶向的通路(参考表6)，(b)生物标志物微RNA的合并列表和(c)那些与centiloid值(淀粉样变)相关的。
发明详述
我们已经显示，在APPswe/PSEN1dE9转基因AD小鼠模型中，特定的血浆miRNA随着淀粉样变性而动态改变。在此和其他强化AD复杂起源的研究的基础上，我们试图收集标准化的生物流体(血浆)，并使用强大的miRNA分析平台(定量PCR TaqMan微流控阵列)来鉴定基于miRNA的独特生物标志物，有效反映认知疾病进展的各个阶段(参考图2)。
因此，我们使用TaqMan微流控阵列评估了充分表征的AD患者、轻度认知障碍(MCI)、认知正常但Aβ阳性(Aβ+)以及年龄和性别匹配的老年人的队列中血浆的miRNA水平。我们鉴定了一组miRNA，无论分析前如何处理，这些miRNA都会随着AD或MCI而一致地变化，但重要的是表明特定的微RNA的水平在疾病的进展过程中是动态的。目前描述的结果表明，有可能鉴定血浆中与疾病相关的miRNA的改变，并且miRNA标志物随着AD进展过程而变化。
定义
术语″认知障碍生物标志物″是指可用于评估个体已经或将要发展为显著的淀粉样蛋白水平、认知障碍或AD的可能性的生物标志物。生物标志物可以是特定miRNA、mRNA或蛋白质的存在、不存在或差异性表达。生物标志物也可以是miRNA的修饰形式、RNA的修饰形式(剪接变体)、DNA的修饰形式(如甲基化的)或蛋白质的修饰形式(如磷酸化的)，或代表miRNA、RNA、DNA或蛋白质的突变或等位变体。本文所述的认知障碍生物标志物组可以包括表1中所示的miRNA生物标志物的任何组合，以及任选地ApoE-ε4和β淀粉样蛋白。
术语″核酸″在本领域是众所周知的。本文所用的″核酸″一般指DNA、RNA或其衍生物或类似物的分子(一条或多条链)，其包含核碱基。核碱基包括例如在DNA中发现的天然存在的嘌呤或嘧啶基(例如，腺嘌呤″A″、鸟嘌呤″G″、胸腺嘧啶″T″或胞嘧啶″C″)或RNA中发现的天然存在的嘌呤或嘧啶基(例如，A、G、尿嘧啶″U″或C)。术语″核酸″包含术语″寡核苷酸″和″多核苷酸″，它们各自作为术语″核酸″的亚属。核酸单体″核苷酸″是指进一步包括″主链部分(backbone moiety)″的核苷。主链部分将一个核苷酸与另一个包含核苷酸的分子共价连接，或与另一个核苷酸共价连接，形成核酸。在天然存在的核苷酸中，″主链部分″通常包含磷部分，其共价连接至一个5碳糖。主链部分的连接通常发生在5碳糖的3′-或5′-位置。然而，其他类型的连接在本领域是已知的，特别是当核苷酸包含天然存在的5碳糖或磷部分的衍生物或类似物时。
短语″选择性(或特异性)杂交至″是指在严格的杂交条件下，当一个特定的核苷酸序列存在于复杂混合物(如，总的细胞或文库DNA或RNA)中时，一个分子主要与该特定的核苷酸序列结合、双链化或杂交(例如，至少50％的杂交分子)。在扩增反应中多核苷酸引物与多核苷酸模板特异性杂交(例如，在约60℃的退火温度)，当引物在包含多核苷酸的复杂混合物(例如，从细胞中分离出的多核苷酸)的反应混合物中扩增模板时，产生的扩增产物至少是最主要的扩增产物，且优选地是该反应的唯一显著的扩增产物(例如，代表该样本中所有扩增产物的至少90-95％)。扩增产物至少是最主要的扩增产物(例如，见Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork，N.Y.，第二版，1989))。
在两个或多个核酸或多肽序列的上下文中，术语″同一的″或″100％同一性″是指两个或多个序列或子序列是相同的序列。当在比较窗口或指定区域比较和对齐最大对应性时，如使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和视觉检查来衡量，如果两个序列有特定百分比的氨基酸残基或核苷酸是相同的(即，在指定区域具有60％同一性，任选地65％，70％，75％，80％，85％，90％或95％同一性，或者，当没有指定指定区域时，是在整个序列上的同一性)，则这两个序列″基本同一的″或一定百分数的同一性。通常地，一个序列作为参考序列，测试序列与之比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认的程序参数，也可以指定替代参数。然后，序列比较算法根据程序参数计算出测试序列相对于参考序列的序列同一性百分数。适用于确定序列同一性和序列相似性百分数的算法的例子是BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别在Altschul等人(Nuc.Acids Res.25：3389-402，1977)和Altschul等人(J.Mol.Biol.215：403-10，1990)中描述。实施BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心的网站ncbi.nlm.nih.gov公开获得。
术语″器皿″、″管″、″容器″、″微孔″等是指容纳反应物或试剂的物体，例如，在试剂盒中。
术语“预后(prognosis)”、“预测(prognostication)”、“预知(prognostic)”、“预测(predict)”、“诊断”、“诊断的”和相关术语在此用于指个体，表示估计认知功能结果的过程和结果，包括进展的概率，例如进展为AD的概率。这些术语也包括在术语″评估″和相关术语的范围内。应该理解的是，可以使用预后和结果预测的各种措施，例如认知能力下降的概率，且预后和/或预测往往表示为估计或概率，并不总是精确的。
″对照″样本或值是指作为参考的样本，通常是已知的参考，用于与测试样本或测试条件进行比较。例如，测试样本可以取自测试状况，例如取自显示认知能力下降迹象的个体，并与来自已知条件的样本进行比较，例如取自健康或认知正常的个体(阴性对照)，或取自已知有MCI或AD(阳性对照)的个体。对照也可以代表一个平均值或从一些测试或结果中收集的范围。对照也可以为反应条件准备。例如，核酸存在的阳性对照可以包括引物或探针，检测已知存在于样品中的序列，而阴性对照将不含核酸。本领域技术人员将认识到，可以为评估任何数量的参数而设计对照。对照可以为体外应用而设计。本领域技术人员将了解哪些对照在特定情况下是有价值的，并能够根据与对照值的比较来分析数据。对照对于确定数据的显著性也很有价值。例如，如果一个给定参数的值在对照中变化很大，测试样品中的变化将不被认为是显著的。
术语″疗法″在此与术语″治疗″同义。一种疗法可以包括一种或多种类型的疗法。例如，疗法可以包括认知疗法和药物疗法的组合。一种疗法或治疗可以在一定时期内进行一次或多次，然后是不进行治疗或疗法的时期。一个治疗周期可以持续几天或几周(在一个例子中，是四周)。可以进行一个或多个周期的治疗或疗法。例如，可以施用一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个周期的治疗或处理。在不同的周期中，疗法可以是相同的或不同的，例如，取决于应答。在一个疗法周期中，可以在单日、连续数日、或作为门诊病人或住院病人连续进行治疗。一次治疗可能持续若干分钟、若干小时或若干天，取决于具体方案。治疗周期可以每周、每两周或每月重复一次。一个治疗周期可以包括一个或多个治疗疗程。一个或多个治疗周期可统称为一个治疗″过程″。
本说明书和权利要求书中使用的术语″包含″意味着″至少部分由...组成″。在解释本说明书和权利要求书中包括术语″包含″的每项陈述时，除此之外的特征或以该术语为前导的特征也可以存在。相关术语如″包括″、″含有的″和″含有″应以相同方式解释。
在文中使用的术语“和/或”是指“和”或者“或”，或这两者。
在文中，名词后面的“(s)”是指该名词的复数和/或单数形式。
例如，文中的公式中使用的一般化学术语和生物术语具有它们通常的含义。
miRNA和其检测
微RNA(miRNA)是17-25个核苷酸的小RNA，在真核生物中作为基因表达的调节物发挥作用。miRNA最初作为长的初级转录本的一部分在细胞核中表达，称为初级miRNA(pri-miRNA)。这些转录本被加工成成熟的miRNA，它们是活性分子，可以将miRNA靶向至目标mRNA的3′非翻译区(3′-UTR)。
一个特定的miRNA可以被称为一个miRNA分子、一个miR、或其等同物或其来源或前体。一些miRNA分子是由几个前体编码的。也有可能一个前体可以导致几个成熟的miRNA分子。除非另有说明，术语″miRNA″是指经加工的miRNA，是在它从其前体切割后。
胞外miRNA在广泛的体液中自由循环。因此，在一些实施方案中，用于确定一个或多个miRNA生物标志物水平的生物样本是体液，如血液、血清、血浆、尿液、唾液、眼泪、汗液、精液、阴道分泌物、淋巴、支气管分泌物或CSF。在一些实施方案中，样本获自CSF以外的体液，特别是血浆。
生物样本中一个或多个miRNA生物标志物的水平可以通过任何合适的方法确定。一般来说，可以通过各种已知的mRNA检测方法，从样品(例如，分离的RNA样品)中检测和定量miRNA，所述mRNA检测方法包括例如基于扩增的方法(如，聚合酶链反应(PCR)、实时聚合酶链反应(RT-PCR)、定量聚合酶链反应(qPCR)、滚环扩增等)，基于杂交的方法(如，杂交阵列(如，微阵列)、NanoString分析、Northern印迹分析、支化DNA(bDNA)信号扩增和原位杂交)，以及基于测序的方法(如，下一代测序方法，例如，使用Illumina或IonTorrent平台)。其他示例性技术包括核糖核酸酶保护测定法(RPA)和质谱(参见例如，Zhang等人，MicroRNADetection and Pathological Functions，1.4章，Springer 2015)。
在一些实施方案中，RNA在分析前被转化为DNA(cDNA)。cDNA可以通过使用常规技术对分离的miRNA进行反转录而产生。miRNA反转录试剂盒是已知的和商业化的。合适的试剂盒的例子包括但不限于mirVana TaqMan miRNA转录试剂盒(Ambion，Austin，Texas USA)和TaqMan miRNA转录试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，Calif.)。通用引物或特异性引物，包括miRNA特异性茎环引物，均是已知的和商业可获得的，例如从AppliedBiosystems可获得。在一些实施方案中，在测量前扩增miRNA。在其他实施方案中，miRNA的水平是在扩增过程中测量的。又在其他实施方案中，在测量前不扩增miRNA的水平。下面将更详细地描述一些适合确定样品中miRNA水平的示例性方法。这些方法仅以说明的方式提供，对于技术人员来说，显然也可以使用其他合适的方法。
存在许多基于扩增的方法来检测miRNA核酸序列的水平，包括但不限于PCR、RT-PCR、qPCR和滚环扩增。此类方法也可用于检测DNA或mRNA，如ApoE-ε4。其他基于扩增的技术包括例如连接酶链反应、多重可连接的探针扩增、体外转录(IVT)、链置换扩增、转录介导的扩增、RNA(Eberwine)扩增，以及本领域技术人员已知的其他方法。
用于miRNA定量实时PCR的试剂盒是已知的，并且是商业可获得的。合适的试剂盒的例子包括但不限于TaqMan miRNA测定法(Applied Biosystems)和mirVana qRT-PCRmiRNA检测试剂盒(Ambion)。miRNA可以在逆转录酶之前连接到含有通用引物序列、聚腺苷酸化序列或适配体序列的单链寡核苷酸上，并使用与通用引物序列互补的引物、poly(T)引物或包含与适配体序列互补的序列的引物进行扩增。
目前描述的miRNA可以用miRNA阵列进行分离和/或检测，所述阵列是核酸分子(探针)的有序的大阵列或微阵列，所述核酸分子与多个miRNA分子或前体miRNA分子完全互补或几乎互补或相同，并以空间分离的组织形式放置在支持材料上。大阵列通常是其上点有探针的硝基纤维素或尼龙的薄片。微阵列将核酸探针定位得更密集，这样在通常1到4平方厘米的区域内可以容纳多达10000个核酸分子。微阵列可以通过将核酸分子，如基因、寡核苷酸等，点在基质上来制造，或在基质上原位制造寡核苷酸序列。点样的或制造的核酸分子可以以每平方厘米高达约30个不相同的核酸分子或更高的密度矩阵模式应用，例如，每平方厘米高达约100个甚至1000个。微阵列通常使用包被的玻璃作为固体支持物。通过拥有一个有序的miRNA互补的核酸样本阵列，每个样本的位置可以被追踪并与原始样本相联系。许多不同的核酸探针与固体支持物的表面稳定地缔合在一起的许多不同的阵列装置是本领域的技术人员已知的。
本说明中还包括用于检测认知障碍生物标志物组的试剂盒。该试剂盒可以包括与表1中所列的任何生物标志物以任何组合特异性杂交的寡核苷酸。在一些实施方案中，该试剂盒包括标记的探针(如，荧光的或其他非天然标记的)。在一些实施方案中，该试剂盒包括用于扩增例如RT-PCR的试剂，如缓冲剂和聚合酶。
本文所述的试剂盒可以设计为多重检测，与β淀粉样蛋白、认知障碍和AD相关的生物标志物在不同的容器中。该试剂盒可以包括至少一个微阵列，例如，用于检测本文所述的认知障碍生物标志物。试剂盒还可以包括消耗品(如，反应容器、试剂)和使用说明。
认知障碍和阿尔茨海默病的诊断和预测
目前所描述的生物标志物组试图提供一种更加量化的方法来预测个体的认知障碍和AD的进展。目前，通过注意到个体的混乱、健忘、社会退缩、视觉或空间理解力的丧失或情绪变化来检测到痴呆症和AD。
一些认知测试也是可获得的，包括迷你精神状态检查(Mini-Mental StateExamination；MMSE)、Mini-Cog测试、阿登布鲁克认知检查-修订版(ACE-R)和蒙特利尔认知评估。这些测试与目前描述的生物标志物组结合使用是有利的。
已经显示，认知疗法可以改善或维持有认知障碍的个体的认知能力。这些疗法可分为四类一般方法：(1)以认知为导向的治疗(如，现实导向，技能训练)；(2)以情感为导向的治疗(如，支持性治疗、验证/综合情感导向的护理、Snoezelen、回忆)；(3)以行为为导向的治疗(行为治疗)；以及(4)以刺激为导向的治疗(如，活动或娱乐治疗、艺术治疗、音乐治疗、运动、精神运动治疗)。参见例如Carrion等人(2018)，Dementia and GeriatricCognitive Disorders 46：1和美国精神病学协会的指南(Guidelines from the AmericanPsychiatric Association)。
在一些实施方案中，目前描述的生物标志物组与认知疗法结合使用，例如，以确定疗法的有效性或减缓认知下降。
在一些实施方案中，可以为个体进行脊髓穿刺以获得脑脊液(CSF)。测量CSF中的淀粉样蛋白(如，Aβ-42)和/或tau(如，总tau和磷酸化tau)水平可用于确认目前描述的认知障碍生物标志物组的结果，因为这些与AD患者脑中的斑块形成有关。
脑成像可用于诊断认知障碍，因为神经变性往往与AD症状的认知能力下降相平行，并先于认知能力的下降。四种成像方式是结构MRI、功能MRI、18F-2-氟-2-脱氧-D-葡萄糖(FDG)PET和淀粉样蛋白-PET。结构性或成分性异常可以用MRI扫描来监测，而FDG-PET监测葡萄糖代谢机制以鉴定脑活动减少的区域。在各种成像方法中，淀粉样蛋白-PET是最可靠的诊断成像工具，因为它通过利用淀粉样蛋白示踪剂来表征脑内聚集的Aβ的能力。尽管批准了成像生物标志物用于临床，并因其在准确诊断中的可靠性而认为是有利的，但与这些成像方式相关的经济负担和可及性问题仍然阻碍着它们在鉴定AD方面的全面应用。除了这些困难之外，MRI和FDG-PET扫描往往难以将AD与其他神经退行性疾病区分开来。因此，例如，如果个体中升高的结果又出现了，这些技术可以与目前描述的认知障碍生物标志物组有利地结合起来。
在一些实施方案中，本文描述的方法包括对预测会发展或有认知障碍的个体进行治疗，例如，由升高的认知障碍生物标志物特性确定。阿尔茨海默病和认知障碍不是完全可以治愈的，某些解决症状的药物选择是可获得的和正在开发中。这些药物包括某些抗淀粉样蛋白的抗体(如，阿杜那单抗(aducanumab)、更汀芦单抗(gantenerumab)、索拉珠单抗(solanezumab))、胆碱酯酶抑制剂、美金刚胺(memantine)、维罗司他(verubecestat)、右旋樟脑磺酸盐(1anabecestat)、杂芳基甲酰胺类(heteroaryl carboxamides)(参见US10487079)、(1R-反式)-N-[[2-(2，3-二氢-4-苯并呋喃基)环丙基]甲基]丙烯酰胺的代谢物(见US9617203)、吡咯并[3，2-d]嘧啶-2，4(3H,5H)-二酮衍生物(见US9440983)。关于AD和认知障碍治疗的更多信息可以在网站alz.org找到。
进一步包括根据本文所述的认知障碍生物标志物组所揭示的信息，用于治疗认知障碍或AD的用途，用于治疗例如上述的用途。这些治疗也可用于制造根据本文所述的认知障碍生物标志物组所揭示的信息治疗认知障碍或AD的药物。
以下非限制性的实施例是为了说明本发明，而决不是限制其范围。
实施例
我们试图关注在认知下降的特定阶段在血浆中有力地检测到的微RNA(miRNA)，这需要对miRNA的分离和分析方法进行标准化。我们试图鉴定反映认知障碍的进展和阿尔茨海默病(AD)的强大的基于微RNA的生物标志物组。
如表2所示，文献中报道的与AD相关的miRNA有显著的不同。表2还显示了我们的研究结果，其是使用标准化的样本类型和方法获得的结果，并与文献中报道的那些一起提供。
Figure BDA0004113632930000161
表2：研究结果。显示了我们的研究结果，其是使用标准化的样本类型和方法获得的，与文献中报道的结果一起提供。显示了所用生物样本的来源以及表达的方向。
队列和血液操作程序
Otago阿尔茨海默病(Otago-AD)：参与者是从奥塔哥(Otago)地区招募的。对医疗记录进行了审查，并由神经病学顾问和临床心理学家一致决定，诊断为可能的AD。如果个体符合美国国家神经和交流障碍与中风研究所和阿尔茨海默病及相关疾病协会(NINCDS-ADRDA；McKhann等人，1984)的标准，则将他们分类为AD参与者(n＝44)。对照组(n＝49；年龄和性别匹配)接受了同样深入的神经心理学测试和神经学评估。所有AD参与者都进行了神经影像学检查(MRI或CT)，并对图像和临床记录进行了检查，以排除混杂的合并症。血液处理程序的概述见表3。
Figure BDA0004113632930000171
表3：本研究中分析的每个队列用于处理和加工血液标本的程序。
ApoEε基因分型：根据制造商的说明，使用NucleoSpin Tissue XS试剂盒(Macherey-Nagel)从白血球中提取基因组DNA。通过TaqMan基因分型测定法(TaqMan SNPs；Rs429358/Rs7412；Life Technologies，Mulgrave，VIC，Australia)评估ApoE-ε4基因型。
MCI样本：血浆样本购自PrecisionMed Inc(Solano Beach，CA，USA)。这些样本包括来自MCI(n＝36)和对照组(n＝40)年龄和性别匹配的参与者的血浆。诊断是基于改良的ADAS-Cog、CDRs、Wechsler记忆量表和MMSE得分(大于2个区域的缺陷)以及CT或MRI成像。
来自澳大利亚老龄化成像、生物标志物和生活方式旗舰研究(AIBLl的样本：血浆样本由可能患有AD(n＝21)、MCI(n＝38)、Aβ+(n＝21)以及认知正常和Aβ-年龄和性别匹配的认知正常对照(n＝20)的人捐赠。诊断是基于临床评估(Ellis等人，2009。使用centiloid量表，即，淀粉样蛋白负载的总体测量，将参与者定义为Aβ+(＞45CL)或Aβ-(0-20CL)(Rowe等人，2018)。Aβ+参与者都转换为MCI阶段(n＝21)，且大多数MCI参与者转换为AD阶段(n＝18)。ApoE基因分型如所述进行(Gupta等人，2015)。
队列和纵向研究的人口统计学详情显示在表4中。缩略语如下。参与者：HC，认知正常的对照；Aβ+，认知正常的淀粉样蛋白阳性；Aβ-，认知正常的淀粉样蛋白阴性；MCI，轻度认知障碍；AD，阿尔茨海默病；F，女性；M，男性；MMSE，迷你精神状态检查；Apo Eε4，载脂蛋白Eε4；p值：学生t检验，与HC相比，p＜0.05。
横断面研究
Figure BDA0004113632930000181
纵向研究
Figure BDA0004113632930000182
表4：队列的人口统计学特征。缩略语：参与者：HC，认知正常对照；Aβ+，认知正常淀粉样蛋白阳性；Ab-，认知正常淀粉样蛋白阴性；MCI，轻度认知障碍；AD，阿尔茨海默病；F，女性；M，男性；MMSE，迷你精神状态检查；ApoEε4，载脂蛋白Eε4；P值：学生t检验(Student t-test)
微RNA表达谱(expression profiling)分析
使用TaqMan微流控阵列对微RNA表达谱进行了标准化。在比较了三种不同的提取方案(TRIzol/Norgen、MirVana、Norgen)后，使用MirVana Paris(Life Technologies，Cat#AM1556M)从血浆中分离RNA。在使用标准TaqMan微流控阵列(A卡片和B卡片)对784个微RNA进行初步筛选后，我们创建了定制设计的微流控阵列，代表186个在血浆中高度检测的或与神经系统疾病高度相关的微RNA，以及对照(U6 snRNA和ath-miR-159a)。这种方法成功地用在我们以前的工作，评估APP/PS1转基因小鼠模型中的衰老和淀粉样变性发展期间血浆中的微RNA水平(Ryan 2018)。
使用定制的Megaplex RT人引物池(Applied Biosystems)和TaqMan microRNA反转录试剂盒，将固定体积(3μl)的总RNA(～50ng)转化为互补DNA(cDNA)。使用定制的Megaplex PreAmp人引物池预扩增(12个循环)，然后qPCR(自动基线阈值；ViiA-7实时PCR仪器，Quantstudio Real-Time PCRv 1.3软件；Applied Biosystems)。使用计算环境R版本中的Bioconductor HTqPCR软件包1.10.0版(Dvinge等人，2009)进行原始Ct值分析。
3.3.4.排除不在所有样本中表达的或Ct＜12和＞33的微RNA。所有样本通过了miR-23a/miR-451的溶血测试(Blondal等人，2013)。
统计分析
横断面研究：在使用Norm Rank Invariant进行数据归一化后，使用经验贝叶斯调节的t检验鉴定差异表达的微RNA(病例/匹配的队列对照；p＜0.05)，并使用Benjamini和Hochberg程序调整p值以控制错误发现。使用Grubb检验来鉴定异常值。使用D’Agostino和Pearson综合正态性检验确认数据的正常分布(p＞0.05)。使用GraphPad Prism(第8版)处理数据并生成热图。
使用R软件包“metafor”(2.0-0版；可获自CRAN.R-project.org/package＝metafor)进行元分析(Meta-analyse)。Aβ+组选择固定效应模型，而MCI组和AD组选择随机效应模型(DerSimonian和Laird方法)。使用Cochran′s Q和I2统计量评估研究之间的估计异质性；当Qep＜0.1；则认为在AD组中I2(％)＞75％是显著异质的。结果以森林图(ForestPlot)可视化，显示集合的效应大小的估计，以及它们的置信区间(95％CI)。
单变量和多变量逻辑回归采用Forward：Wald方法(MedCalc，15.11.4版)。使用Hosmer-Lemeshow检验评估每个逻辑回归模型的拟合度(p＞0.05)。对总体的模型拟合度评估ROC曲线下面积(AUC)(P＜0.05)。使用Mantel-Cox方法(GraphPad Prism Version 8)进行Log-rank检验，以比较患病组和对照组的表达(归一化的Ct)；认为p＜0.05是显著的。
生物信息学分析：采用DIANA-microT v3.0(Tarbase v7.0)和miRTarBase(7.0版)，使用最严格的算法参数，以鉴定16个候选生物标志物miRNA的经验证靶。使用DAVID(v6.7)(http：//david.ncifcrf.gov)，我们关注在脑和血液中表达的基因。使用Enrichr工具(见网站amp.pharm.mssm.edu/Enrichr)搜索用户策划的Wikipathways，鉴定了这组中富含的生物途径。使用Kegg Mapper(https：//www.genome.jp/kegg/mapper.html)对与每个疾病状态相关的基因着色。
纵向研究：为了鉴定微RNA表达随疾病进展的变化，使用来自AIBL队列的纵向样本的亚组(Aβ+至MCI转换者，n＝21；MCI至AD转换者，n＝18)构建Kaplan-Meier图(GraphPadPrism，第8版)。Log-rank检验用于比较每个微RNA表达的分布(归一化的Ct)，并确定它们的表达是否与疾病从Aβ+到AD的进展相关；报告了中位数和95％CI；认为p＜0.05是显著的。AUC的确定同上；报告了95％CI。
使用广义估计方程(SPSS，25.0版)来确定纵向样本中的显著影响。因变量是研究的微RNA表达(归一化的Ct)。对工作相关矩阵结构使用复合对称性，并且对组的影响使用Wald卡方检验，随后对每组的估计边缘均数进行了配对比较。平均值差异在0.05水平上是显著的。
使用MedCalc软件15.11.4版，对可能解释微RNA不同表达的多个变量，包括归一化的Ct，生成Pearson相关系数r与P值。
生物信息学分析：采用DIANA-microT v3.0(Tarbase)和miRTarBase(7.0版)，使用最严格的算法参数，鉴定16个候选生物标志物miRNA的经验证靶。使用DAVID(v6.7)(http：//david.ncifcrf.gov)，我们关注在脑和血液中表达的基因。使用Enrichr工具(见网站amp.pharm.mssm.edu/Enrichr)搜索用户策划的Wikipathways，鉴定了这组中富含的生物途径。使用Kegg Mapper(https：//www.genome.jp/kegg/mapper.html)对与每个疾病状态相关的基因着色。
队列的特征
表4中总结了我们的研究中所使用的横断面和纵向队列的人口学和临床特征。对于奥塔哥-阿尔茨海默病研究(Otago-AD)，我们从奥塔哥地区招募了AD的志愿者队列(n＝93)，和年龄及性别匹配的健康对照(HC)参与者。我们发现AD和HC在MMSE评分(t(83)＝9.647，p＜0.0001)和ApoE基因型(t(86)＝-3.556，p＝0.003)方面有显著性差异。我们发现60％的AD参与者是ApoEε4等位基因的携带者(比值比(Odds ratio)：4.6203(95％CI 1.85-11.57)，这个数值与以前的文献高度一致。我们还从Precision Med(PMed；Solano Beach，USA)和澳大利亚影像生物标志物和生活方式研究(AIBL)获得了血浆样本和相关的人口统计学数据。PMed队列(n＝76)由MCI患者以及年龄和性别相匹配的HC参与者提供的血浆样本组成。PMed MCI组和HC组在MMSE评分方面存在显著差异(t(74)＝-18.872，p＜0.0001)；ApoE基因型无法获得。AIBL队列(n＝100)由患有MCI、AD的个体以及年龄和性别匹配的HC参与者捐赠的血浆样本组成，他们被确定为淀粉样蛋白阴性(Aβ-)或淀粉样蛋白阳性(Aβ+；centiloid量表：(-)0-20CL；(+)>45CL；表4)。所有MCI和AD参与者都是Aβ+。在HC组和MCI(t(56)＝-6.603，p＜0.001；(t(39)＝4.314，p＜0.0001)或AD(t(39)＝-6.990，p＜0.001；t(56)＝4.411，p＜0.001)之间发现MMSE评分和ApoE基因型都有显著性差异。我们发现68％的MCI参与者和76％的AD参与者是ApoEε4等位基因的携带者(比值比：MCI：12.28(95％CI3.00-50.01)；AD：14.17(3.04-66.75))。
鉴定差异表达的微RNA：横断面分析
尽管有许多研究，但研究队列内部的异质性、血液处理和miRNA分析方案似乎阻碍了基于miRNA的生物标志物组对AD预后或诊断的鉴定(meta；O’Bryant)。我们推断，为了使生物标志物是临床相关的，它应该独立于队列-队列的变化，但可能根据生物液体或选择的miRNA分析方法而变化。
此外，根据我们以前的工作，我们显示了特定的miRNA在淀粉样变性的发展过程中表达不同，我们推断特定miRNA的表达将随着AD的进展而变化。因此，为了鉴定跨队列相关的、但对疾病阶段特异的基于miRNA的生物标志物组，我们使用qPCR TaqMan微流控阵列来定量来自Aβ+、MCI(PMed，AIBL)和AD(Otago-AD，AIBL)队列相对于他们各自的HC而言在血浆中的微RNA。根据以下三个标准鉴定差异表达的miRNA：倍数变化(FC)±0.2，经验贝叶斯调节的t检验p＜0.05，和在所有样本中表达。发现在至少一个组中显著差异表达的miRNA(表1倍数变化)。
这种分析模式显示，在AD队列中改变的miRNA有相当大的相似性，75％改变的方向相同(59％上调；16％下调)。似乎在AD队列之间未被验证的miRNA在MCI组中也有很大的异质性。事实上，MCI组总体上显示出更大的异质性，只有大约50％的miRNA改变的方向相同(39％上调；9％下调)。有趣的是，在MCI组中持续上调的miRNA中，62％在Aβ+组也是上调的，且该Aβ+组中75％的该受调节的miRNA在AIBL-MCI组也是持续受调节的，这提供了这些miRNA在AD进展的早期被改变的结论。
专注于符合倍数变化标准(FC±0.2)的微RNA(n＝32)，我们发现miR-195-5p，一个已知靶向BACE1的3′UTR并在AD死后脑中减少的miRNA，在所有队列和疾病组中持续上调。此外，miR-885-5p显示在Aβ+组中是下调的，但在所有MCI和AD组中持续上调。
在AD组中，有10个微RNA似乎持续上调(miR-122-5p、miR-132-3p、miR-193b-3p、miR-1 95-5p、miR-320-3p、miR-365-3p、miR-378-3p、miR-486-3p、miR-532-5p、miR-885-5p)和5个下调(miR-27a-3p、miR-27b-3p、miR-142-3p、miR-324-5p和miR-652-3p，)。
在MCI组中，有9个微RNA持续上调(miR-27a-3p、miR-27b-3p、miR-132-3p、miR-148a-3p、miR-195-5p、miR-199a-3p、miR-335-5p、miR_483-5p、miR-885-5p，)和1个持续下调(miR-142-3p)。
这些分析显示，在保持血液成分和分析平台不变的情况下，有可能在独立的队列和不同的疾病阶段中鉴定miRNA表达模式的一致改变。
为了进一步审视这些发现，我们通过元分析汇集了同类队列之间的数据，以估计组合效应，并提高我们的统计能力。拟合元分析模型，获得每个miRNA的加权倍数变化(汇集的估计效应大小)(图3和表5)和它们的95％置信区间。通过对AD组的显著异质性过滤数据(Qep检验，I2统计)，得到一组16个推定的生物标志物微RNA(图3)。Venn Diagram(图4)总结了特定微RNA和疾病阶段的关联，其中miR-27b-3p和miR-885-5p在所有疾病组中都有显著性的调节。值得注意的是，这些miRNA也显示出低异质性(图3)。利用来自三个独立队列的数据，这些分析证实了特定的miRNA在Aβ+、MCI或AD组中相对于HC是动态表达的，并且可以获得一个统一的生物标志物标签。
Figure BDA0004113632930000221
Figure BDA0004113632930000231
表5：元分析和异质性检验的结果。效应大小(平均合并估计值)及其置信区间(95％CI)的概要。使用Cohran′s Q和I2统计量检验异质性。Qep是检验(残余)异质性的p值，p值＜0.05表示存在异质性。我们用0.10作为显著性的分界值，且I2＜50％(Higgins等人2003)。I2统计量是指在不同的研究中，观察到的总变异中由真正的异质性引起的百分数，较大的数值表明异质性的增加。
作为从这16个miRNA集合中确定候选miRNA生物标志物的优先次序的方法，我们接下来试图使用统计学一致性方法对单个miRNA的重要性进行排序(Wiedrick等人，2019和Lusardi等人，2017)，结合有差异表达分析的输出(p值)、归一化Ct值的分布(log-rank p值)和微RNA预测疾病组成员资格的能力(AUC)，参考表6。
Figure BDA0004113632930000241
表6：队列的一致性排名。对于每个疾病阶段，元分析中确定的16个miRNA中的每一个都用3个独立的标准进行了排名。然后将每个miRNA的3个排名相加，提供一个最终排名。较低的总排名和导致了最高的排名。3个排名标准是：(1)差异表达(p值；表1)，(2)归一化Ct值的分布(Log-rank检验；p值)和(3)预测能力(逻辑回归的AUC)。(1)AIBL，(2)PMed，(3)Otago队列。
如图5所示，获得了每个疾病阶段的推定生物标志物的优先顺序表。在AD组中，排名第一的微RNA具有最高的FC(表1)。然而，对于Aβ+组或MCI组来说，情况并非如此，因此支持使用这种一致性方法。接下来，我们通过ROC分析确定排名靠前的微RNA的组合预测疾病组成员资格的能力。为了符合Peduzzi等人(1996)的建议，对微RNA的数量进行了限制。得出的AUC是Aβ+：0.857(miR-29c-3p和miR-335-5p)；MCI：0.823(miR-142-3p、miR-324-5p、miR-195b-5p、miR-148a-3p)和AD：0.817(miR-27a-3p、miR-27b-3p、miR-122-5p、miR-193b-3p、miR-324-5p和miR-885-5p)。这一分析表明，独特的微RNA生物标志物标签反映了每个疾病阶段，并具有预后和诊断的作用。
miRNA表达：纵向分析
为了进一步探索miRNA生物标志物与疾病进展的关系，我们从AIBL队列中提取了一个纵向样本亚组，包括n＝21个个体，他们在被分类为Aβ+和MCI时捐赠了样本，以及n＝18个个体，他们在被分类为MCI和AD时捐赠了样本(表4；图2)。
我们使用广义估计方程(generalised estimating equation，GEE，表7)评估了我们的候选生物标志物表达与疾病进展的趋势，以考虑样本的纵向性质和由此产生的数据集缺乏独立性的情况。这一分析证实了这组微RNA在这一纵向队列的个体中的动态调节。在从Aβ+到MCI的转变中，显示有8个微RNA发生了明显的改变(上调：miR-27a-3p、miR-27b-3p、miR-122-5p；下调：miR-29c-3p、miR-142-3p、miR-195-5p、miR-324-5p、miR-335-5p)，以及在从MCI到AD的转变中，显示有4个微RNA明显下调(图6)。该组包括miR-27a-3p、miR-27b-3p，它们在Aβ+向MCI转变时都是上调的，以及包括miR-195-5p、miR-324-5p，它们在MCI向AD转变时都是下调的。这些结果强化了：微RNA水平的改变发生在疾病的早期，并可以是动态的。然而，这也显示了特定的微RNA(如miR-195-5p，miR-324-5p)在整个疾病中被持续调节。此外，这些结果表明，观察到的微RNA水平的变化并不仅仅是分析前处理的不同导致的结果，而且是确实反映了疾病的进展。
Figure BDA0004113632930000251
Figure BDA0004113632930000261
表7：广义估计方程(GEE)的输出。纵向样本用GEE(匹配对的广义模型；SPSS第8版)研究。因变量是研究的miRNA。复合对称性(Compound symmetry)被用于工作相关矩阵结构，Wald卡方测试了组的影响，随后对每个疾病阶段的估计边缘均数进行了配对比较。平均差异在0.05水平是显著的。粗体字是显著的变化。该表包括每个模型的估计边缘均数、SE和95％CI、模型的总体p值以及每个组别比较的p值。
接下来，为了探测miRNA的诊断应用，我们通过ROC分析评估了每一个预测疾病组成员资格的能力。所获得的AUC范围为0.5l至0.76，并且通过将ApoEε4作为一个因子，所获得的AUC范围显著增加至0.8至0.95(表8)。miR-29c-3p和miR-335-5p在Aβ+组显示最强的AUC，而miR-142-3p、miR-148a-3p和miR-27b-3p在MCI组最强，miR-27a-3p和miR-27b-3p在AD组最强。此外，我们用皮尔逊相关(Pearson correlation)发现，AD组的β淀粉样蛋白负载(centiloid值；表4)与miR-27a-3p(r＝0.466；p＝0.002)，miR-27b-3p(r＝0.391；p＝0.012)和miR-324-5p(r＝0.406；p＝0.009)显著性相关。这些分析共同表明，这些miRNA不仅随着AD的进展而变化，而且可能具有预后应用，特别是突出了miR-27a-3p、miR-27b-3p和miR-324-5p与淀粉样变性的关联。
Figure BDA0004113632930000262
Figure BDA0004113632930000271
表8：AIBL纵向队列。曲线下面积(AUC)估计值和95％CI用于建立AIBL队列中miRNA的预测能力(AB+，MCI和AD，从上到下)。使用归一化的Ct值建立AUC±ApoEε4状态。
推定的生物标志物微RNA与阿尔茨海默病之间的关系：生物学上的相关性
使用生物信息学方法，我们探测了候选微RNA生物标志物与AD分子病理学的关系。专注于与疾病阶段相关的特征(图5)，我们确定了有效的目标mRNA，并使用基因组富集工具Enrichr(Kuleshov等人，2016)解释了所得到的列表。显示了候选的Aβ+、MCI和AD生物标志物微RNA组的目标在AD相关的Wikipathways中显著性富集，这是每个疾病阶段(图7a)和组合(图7b)中确定的最高的过度代表的通路(overrepresented pathway)。所有微RNA靶点组合的通路分析还确定了神经营养素信号通路、MAPK信号通路和mTOR信号通路。神经营养素信号通路也在与centiloid值相关的微RNA的通路分析中被强调(图7c)，还对胰岛素抵抗和长时程增强作用进行了通路分析。与候选生物标志物微RNA先前已被证明在AD血浆和/或死后组织中发生改变(表2)的观察一起地，这一分析加强了候选微RNA生物标志物与AD进展阶段的病理学之间的联系。
讨论
小的非编码RNA，特别是微RNA，是神经退行性疾病的生物标志物和新的治疗剂的核心焦点。迄今为止，尽管有30多项研究提出了100个候选的微RNA，但对AD的血液生物标志物还没有达成共识。这种复制的失败可能是由于不一致的血液分级方法和微RNA分析的不同。通过保持血液级分和分析模式的恒定以及统计学上的一致性方法，我们已经确定了一套独特的与AD相关的血浆微RNA。重要的是，我们首次显示，血浆微RNA水平在症状表现之前就已经改变，并随着疾病的发展而动态变化。我们强调的单个微RNA以前都与AD有关，并且我们利用生物信息学显示了我们的候选微RNA汇聚于PI3K-Akt信号通路，这一通路与AD的分子病理学有明确的关系，包括神经纤维缠结以及小胶质和星形胶质炎症体调节。这使以下结论更有说服力，即我们研究中汇编的微RNA包含一套有效的AD相关生物标志物，并反映了脑中发生的疾病过程。
我们的工作特别强调升高的miR-29c-3p和miR-335-5p水平是早期淀粉样变性的新生物标志物。miR-29c-3p和miR-335-5p的水平先前已显示在AD生物流体中发生了改变(表2)，而且miR-29c-3p和BACE1以及miR-335-5p和Aβ的水平成负相关，这表明它们都直接促进了脑中的淀粉样蛋白水平。此外，已显示miR-29c-3p和miR-335-5p增强莫里斯水迷宫(Morris Water Maze)的记忆表现。miR-335-5p是一个神经元富集的微RNA，也是一个提议为AD相关基因网络的关键调节物，我们的生物信息学分析显示，这些微RNA一起映射到炎症反应和胶质细胞瘤以及PI3K和mTOR通路。事实上，已知miR-29c-3p保护小胶质细胞不被炎症体激活，这表明它在神经保护方面的作用。我们发现miR-335-5p在血浆中上调，支持Cheng等人的发现，他们显示这种微RNA在从AIBL-AD队列的血浆分离出的细胞外囊泡中上调。有趣的是，以前的两项研究显示，miR-335-5p在死后的脑中下调，从而表明AD与miR-335-5p输出到细胞外囊泡的增加有关。
在我们的生物标志物特征中，我们发现大多数微RNA的表达在疾病的发展过程中是变化的。然而，我们的横断面研究显示，miR-195-5p和miR-335-5p一直高于对照队列，但有趣的是，在AIBL纵向亚组中，我们发现它们的水平随着疾病的进展而降低，同时仍然高于对照水平。miR-195-5p的上调也可能是神经保护反应的一部分，因为这种微RNA同时抑制BACE1和APP的表达和抑制细胞凋亡。此外，已显示敲低miR-195-5p减少树突的长度和数量，而突触位置的分子：神经粒蛋白(neurogranin，NRGN)是miR-195-5p的有效靶点，其在AD死后组织和神经衍生的外泌体中的水平降低。
与疾病阶段相关的生物标志物微RNA组成的变化相伴随，我们观察到了映射到MCI和AD组的额外通路。特别是MCI分析，确定了AGE/RAGE通路和VEGFA-VEGFR2信号通路。这是有趣的，因为这两条通路也与神经保护有关。事实上，抑制晚期糖基化终产物及其受体已被提出是一种潜在的AD疗法，且miR-142，我们在MCI组中排名最靠前的微RNA，靶向RAGE通路。由于miR-142-3p直接靶向炎症途径，这导致了一个建议，即miR-142-3p靶标的去抑制最初可能与遏制神经炎症反应有关。虽然对神经炎症在AD中的作用有很多争论，但耐人寻味的是，最近，显示miR-142启动子的遗传变异(rs2526377：A>G)(其导致减少的表达)与AD的风险降低显著性相关。因此，有必要对miR-142在AD中的作用进行进一步调查。
在具有已发展的AD个体中，与淀粉样蛋白负载(centiloid值)相关的微RNA被映射到HIF-1信号通路。该信号通路与VEGF、MAPK和PI3K信号传导相互关联，并促进APP的淀粉样变性的加工。可塑性相关通路神经营养素信号传导和长时程增强作用也被映射到这个组中。先前已显示miR-27a-3p、miR-27b-3p和miR-324-5p在血液中或死后脑组织中有变化(参见表2)。事实上，已认为miR-324-5p的下调有助于老化过程中的突触丧失，而认为miR-27b-3p是一种促炎的微RNA，抑制肿瘤坏死因子α和白细胞介素-6的表达。有趣的是，miR-27a-3p靶向SERPINA3，所述SERPINA3编码与ApoE-ε4基因型、炎症和淀粉样蛋白聚合有关的丝氨酸蛋白酶抑制剂。这些生物信息学分析共同强调了候选生物标志物微RNA、炎症和淀粉样变性之间的强相关性，为这些血浆生物标志物反映脑内发生的疾病过程的结论提供了支持。
总之，我们的研究强调的血浆微RNA是通过使用多个队列的统计学一致性方法得出的，随着疾病的发展而变化，反映了AD神经病理学根本的已知步骤，因此在临床实践中可能用于疾病风险预测。我们的早期特征可能能够在个体出现症状之前预测潜在的病理学。这些数据是独特的，并需要通过对有症状之前的个体进行进一步的深入分析，并潜在地通过分析血浆或CSF中神经元外泌体衍生的微RNA来加强。了解其他内表型(endophenotype)(如ApoE-ε44状态)对这些微RNA血浆水平的影响以及研究队列的种族特点也很重要。这些数据对于改进纳入临床试验的标准将是非常有价值的，可以进一步检验目前可获得的认知行为和药物疗法，从而推迟疾病的发生。总的来说，我们已经显示生物标志物是动态的，随着疾病的发展而改变，强调了需要纵向生物标志物测试。过渡到我们后面的特征可能会进一步识别有危险的个体，并用于优先考虑那些进展更多的需要进行高度专业化测试的个体。
不旨在将本发明的范围仅仅限制在上述实施例。正如本领域技术人员所理解的那样，在不偏离所附权利要求书所示的本发明范围的情况下，许多变化都是可能的。
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Claims (38)

1.检测升高的认知障碍生物标志物组的方法，包括：
a)检测人的体液样本中miRNA生物标志物miR-29c-3p、miR-335-5p、miR-142-3p、miR-324-5p、miR-195-5p、miR-148-3p、miR-27a-3p、miR-27b-3p、miR-122-5p、miR-193b-3p、miR-342-3p和miR-885-5p的水平；和
b)当至少一种所述miRNA生物标志物的水平相对于健康对照水平上调或下调时，检测所述升高的认知障碍生物标志物组。
2.根据权利要求1所述的方法，其中怀疑所述人具有高的β淀粉样蛋白负荷或认知障碍或阿尔茨海默病。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述体液样品是血浆。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中步骤a)包括通过基于扩增的方法进行检测。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中步骤a)包括通过基于阵列的方法进行检测。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中当miR-29c-3p、miR-335-5p、miR-142-3p中的任何一个被上调或miR-122-5p、miR-342-3p、miR-885-5p中的任何一个被下调时，将所述人诊断为β淀粉样蛋白阳性。
7.根据权利要求6所述的方法，其还包括检测miR-27b-3p、miR-143-3p、miR-320a-3p、miR-532-5p、miR-193-3p、miR-324-5p、miR-365-3p、miR-148-3p、miR-195-5p、miR-27a-3p、miR-132-3p的水平。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中当miR-195-5p、miR-148-3p、miR-324-5p中的任何一个被上调或miR-142-3p被下调时，将所述人诊断为患有轻度认知障碍(MCI)。
9.根据权利要求8所述的方法，其还包括检测miR-885-5p、miR-483-5p、miR-132-3p、mir-199a-3p、miR-365-3p、miR-132-3p、miR-27a-3p、miR-27b-3p、miR-143-3p、miR-335-5p或let-7e-5p的水平。
10.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中当miR-122-5p、miR-193b-3p、miR-885-5p中的任何一个被上调或miR-27a-3p、miR-27b-3p、miR-324-5p中的任何一个被下调时，将所述人诊断为患有阿尔茨海默病。
11.根据权利要求10所述的方法，其还包括检测miR-486-3p、miR-486-5p、miR-342-3p、miR-378-3p、miR-365-3p、miR-132-3p、miR-195-5p、miR-335-5p、miR-30c-5p、miR-340-5p或miR-142-3p的水平。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括当检测到升高的认知障碍生物标志物组时，对所述人给予PET或MRI扫描或认知治疗。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括当检测到升高的认知障碍生物标志物组时，从所述人获得脊髓穿刺样本并检测淀粉样蛋白或tau的水平。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括检测所述体液样本中ApoE-ε4基因型的存在。
15.测量人中升高的认知障碍生物标志物组的方法，包括a)从所述人获得体液样本；b)确定生物样本中一组生物标志物的测量值，该组包含miR-29c-3p、miR-335-5p、miR-142-3p、miR-324-5p、miR-195-5p、miR-148-3p、miR-27a-3p、miR-27b-3p、miR-122-5p、miR-193b-3p、miR-342-3p和miR-885-5p，其中该测量包括测量该组中每种生物标志物的水平。
16.根据权利要求15所述的方法，其中怀疑所述人为具有β淀粉样蛋白阳性阶段、轻度认知障碍或阿尔茨海默病。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述体液样本是血浆。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中步骤b)包括通过基于扩增的方法进行测量。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的方法，其中步骤b)包括通过基于阵列的方法进行测量。
20.根据权利要求15至19中任一项所述的方法，其中当miR-29c-3p、miR-335-5p、miR-142-3p中的任何一个被上调或miR-122-5p、miR-342-3p或miR-885-5p被下调时，将所述人诊断为淀粉样蛋白阳性(Aβ+)。
21.根据权利要求20所述的方法，其还包括检测miRNA生物标志物miR-27b-3p、miR-143-3p、miR-320a-3p、miR-532-5p、miR-193-3p、miR-324-5p、miR-365-3p、miR-148-3p、miR-195-5p、miR-27a-3p、miR-132-3p的水平。
22.根据权利要求15至19中任一项所述的方法，其中当相对于健康对照水平而言miR-195-5p、miR-148-3p、mi-324-5p中的任何一个被上调或miR-142-3p被下调时，将所述人诊断为患有轻度认知障碍(MCI)。
23.根据权利要求22所述的方法，其还包括测量miR-885-5p、miR-483-5p、miR-
199a-3p、miR-365-3p、miR-132-3p、miR-27a-3p、miR-27b-3p、miR-143-3p、miR-335-5p或let-7e-5p的水平。
24.根据权利要求15至19中任一项所述的方法，其中当相对于健康对照水平而言miR-122-5p、miR-193b-3p或miR-885-5p中的任何一个被上调或者miR-27a-3p、miR-27b-3p或miR-324-5p中的任何一个被下调时，将所述人诊断为患有阿尔茨海默病。
25.根据权利要求24所述的方法，还包括测量miR-486-3p、miR-486-5p、miR-378-3p、miR-365-3p、miR-132-3p、miR-195-5p、miR-335-5p、miR-30c-5p、miR-340-5p或miR-142-3p的水平。
26.根据权利要求15至25中任一项所述的方法，其中所述方法还包括当检测到升高的认知障碍生物标志物组时，对所述人给予PET或MRI扫描或认知治疗。
27.根据权利要求15至26中任一项所述的方法，其中所述方法还包括当检测到升高的认知障碍生物标志物组时，从所述人获得脊髓穿刺样本并检测所述样本中淀粉样蛋白或tau的水平。
28.根据权利要求15至27中任一项所述的方法，还包括检测所述体液样本中ApoE-ε4基因型的存在。
29.确定认知障碍的进展的方法，包括
a)在第一时间从人获得第一体液样本；
b)在第一时间之后的第二时间从该人获得第二体液样本；
c)检测该第一体液样本中miRNA生物标志物miR-29c-3p、miR-335-5p、miR-142-3p、miR-324-5p、miR-195-5p、miR-148-3p、miR-27a-3p、miR-27b-3p、miR-122-5p、miR-193b-3p、miR-342-3p和miR-885-5p的水平；
d)检测该第二体液样本中miRNA生物标志物miR-29c-3p、miR-335-5p、miR-142-3p、miR-324-5p、miR-195-5p、miR-148-3p、miR-27a-3p、miR-27b-3p、miR-122-5p、miR-193b-3p、miR-342-3p和miR-885-5p的水平；
e)比较在该第一时间获取的miRNA生物标志物的水平，从而确定认知障碍的进展。
30.根据权利要求29所述的方法，其中当miR-29c-3p和miR-335-5p改变时，诊断该人为脑中可能有高β淀粉样蛋白负载。
31.根据权利要求29所述的方法，其中当miR-142-3p、miR-324-5p、miR-195、miR-148a-3p改变时，诊断该人为患有轻度认知障碍(MCI)。
32.根据权利要求29所述的方法，其中当miR-27a-3p、miR-27b-3p、miR-122-5p、miR-193b-3p、miR-324-5p改变时，诊断该人为患有阿尔茨海默病。
33.试剂盒，其包含
a)与miRNA生物标志物miR-29c-3p、miR-335-5p、miR-142-3p、miR-324-5p、miR-195-5p、miR-148-3p、miR-27a-3p、miR-27b-3p、miR-122-5p、miR-193b-3p、miR-342-3p和miR-885-5p中的各种miRNA生物标志物特异性杂交的寡核苷酸；和
b)特异性检测miRNA生物标志物miR-29c-3p、miR-335-5p、miR-142-3p、miR-324-5p、miR-195-5p、miR-148-3p、miR-27a-3p、miR-27b-3p、miR-122-5p、miR-193b-3p、miR-342-3p和miR-885-5p中的各种miRNA生物标志物的标记的探针。
34.确定人具有β淀粉样蛋白阳性阶段(Aβ+)的可能性的方法，包括
a)检测来自该人的体液样本中miRNA生物标志物miR-29c-3p、miR-335-5p、miR-
142-3p、miR-324-5p、miR-195-5p、miR-148-3p、miR-27a-3p、miR-27b-3p、miR-122-5p、miR-193b-3p、miR-342-3p和miR-885-5p的水平；和
b)当miR-29c-3p、miR-335-5p、miR-142-3p中的任何一个相对于健康对照水平上调或当miR-122-5p、miR-885-5p中的任何一个相对于健康对照水平下调时，确定该人可能患有MCI。
35.确定人患有轻度认知障碍(MCI)的可能性的方法，包括
a)检测来自该人的体液样本中miRNA生物标志物miR-29c-3p、miR-335-5p、miR-
142-3p、miR-324-5p、miR-195-5p、miR-148-3p、miR-27a-3p、miR-27b-3p、miR-122-5p、miR-193b-3p和miR-885-5p的水平；和
b)当miR-195-5p、miR-148-3p、miR-324-5p中的任何一个相对于健康对照水平上调或miR-142-3p相对于健康对照水平下调时，确定该人可能患有MCI。
36.确定人患有阿尔茨海默病(AD)的可能性的方法，包括
a)检测来自该人的体液样本中miRNA生物标志物miR-29c-3p、miR-335-5p、miR-142-3p、miR-324-5p、miR-195-5p、miR-148-3p、miR-27a-3p、miR-27b-3p、miR-122-5p、miR-193b-3p和miR-885-5p的水平；和
b)当miR-122-5p、miR-193b-3p或miR-885-5p中的任何一个相对于健康对照水平上调或miR-27a-3p、miR-27b-3p、miR-142-3p或miR-324-5p中的任何一个相对于健康对照水平下调时，确定该人可能患有AD。
37.根据权利要求34至36中任一项所述的方法，其中所述体液样本是血浆、脊髓穿刺液、血清、白血球或全血。
38.根据权利要求34至36中任一项所述的方法，还包括检测该体液样本中ApoE-ε4基因型的存在。
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