KR101583450B1 - 마이크로 rna id의 분석방법 및 이를 통해 도출한 대장암의 바이오마커 - Google Patents

마이크로 rna id의 분석방법 및 이를 통해 도출한 대장암의 바이오마커 Download PDF

Info

Publication number
KR101583450B1
KR101583450B1 KR1020140169452A KR20140169452A KR101583450B1 KR 101583450 B1 KR101583450 B1 KR 101583450B1 KR 1020140169452 A KR1020140169452 A KR 1020140169452A KR 20140169452 A KR20140169452 A KR 20140169452A KR 101583450 B1 KR101583450 B1 KR 101583450B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
microrna
rna
database
gene
micrornas
Prior art date
Application number
KR1020140169452A
Other languages
English (en)
Inventor
이정상
윤재중
Original Assignee
전주대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 전주대학교 산학협력단 filed Critical 전주대학교 산학협력단
Priority to KR1020140169452A priority Critical patent/KR101583450B1/ko
Priority to US14/954,806 priority patent/US20160152977A1/en
Application granted granted Critical
Publication of KR101583450B1 publication Critical patent/KR101583450B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B99/00—Subject matter not provided for in other groups of this subclass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 마이크로 RNA ID의 분석방법에 관한 것으로, 마이크로 RNA의 분석 능력을 향상시켜 마이크로 RNA를 정확히 분석하기 위한 것이고, 이를 통하여 암세포의 발현을 예측할 수 있는 마이크로 RNA ID의 분석방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 마이크로 RNA ID의 분석방법을 통하여 얻어진 마이크로 RNA ID 분석결과를 이용하여 대장암의 바이오마커에 적용하는 것이다.

Description

마이크로 RNA ID의 분석방법 및 이를 통해 도출한 대장암의 바이오마커{Analyzing method for micro RNA ID and Biomarkers related to colon cancer through this method}
본 발명은 마이크로 RNA ID의 분석방법에 관한 것으로, 더 구체적으로는 마이크로 RNA의 분석 능력을 향상시켜 마이크로 RNA를 정확히 분석하고, 이를 통하여 암세포의 발현을 예측할 수 있는 마이크로 RNA ID의 분석방법에 관한 것이다.
나아가 본 발명은 상기 마이크로 RNA ID의 분석방법을 통하여 얻어진 마이크로 RNA ID의 분석결과를 이용하여 도출한 바이오마커(Bio marker)에 관한 것이다.
마이크로 RNA(micro RNA, miRNA)는 1993년 미국 하버드대 빅터 앰브로스(Victor Ambros) 교수팀에 의해 처음으로 밝혀졌다. 예쁜 꼬마선충(Caenorhabditis elegans)의 발생시기를 조절하는 유전자를 찾던 중에 lin-4라고 명명된 짧은 RNA 단편이 LIN-14 단백질의 합성에 영향을 준다는 것을 발견하였으나, 이 후 같은 종에서 조절인자로서 역할을 하는 let-7이라고 명명된 RNA 단편이 추가로 발견되면서 마이크로 RNA의 존재와 기능에 대한 관심이 증가하게 되었다.
마이크로 RNA는 21개에서 25개의 뉴클레오티드(nucelotide)로 이루어진 작은 단일 가닥염기(single-strand nucleotide)로서 진핵생물에서 다양한 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. 선충(C. elegance)에서 발현되는 마이크로 RNA가 1993년 발견된 후에 현재까지 700종 이상이 인간세포에 존재하고 있음이 밝혀졌다.
마이크로 RNA의 생합성은 크게 두 가지 효소에 의해서 절단에 의해서 진행된다. 먼저 마이크로 RNA를 포함하고 있는 유전자가 RNA 중합효소 II 또는 III(RNA polymerase II/III)에 의해서 전사되어 다양한 크기의 마이크로 RNA 전사체(transcript)가 합성이 된다.
이러한 과정으로 합성된 초기 전사체(primary 마이크로 RNA, pri-miRNA)는 5‘말단에 cap(7-methylguanylate cap)과 3'말단에 poly[A] tail을 각각 가지고 있다. 초기 전사체는 핵 내에 존재하는 Drosha라는 RNA 절단효소와 DGCR8(DiGeorge critical region 8)로 구성된 microprocessor complex에 의해서 70여개의 뉴클레오티드 길이로 된 전구체(precursor 마이크로 RNA, pre-miRNA)로 가공된다. 전구체는 엑스포틴-5(exportin-5)와 Ran-GTP를 통해서 세포질로 나온 후에, 두 번째 절단효소인 Dicer와 TRBP(transactivating response RNA binding protein)에 의해서 20~25개의 뉴클레오티드로 구성된 성숙한 이중가닥의 마이크로 RNA로 가공된다.
이중가닥 중에서 한 가닥은 분해되고, 다른 가닥만이 Ago(Argonaute)와 함께 결합하여 RISC(RNA-induced silencing complex)를 구성한다. TRBP는 Ago와 마이크로 RNA의 결합을 유도하여 마이크로 RNA가 표적유전자의 발현을 조절할 수 있도록 한다. 일반적으로 마이크로 RNA는 단백질로 번역되지 않는 3' 말단(3' untranslated region, 3'UTR)에 결합하여 mRNA의 안정성(stability)을 낮추거나 번역율(translation efficiency)을 낮추어 표적유전자의 발현을 억제한다.
일부 마이크로 RNA는 자신의 프로모터와 전사인자(transcriptional factor)를 가지고 있지만, 대부분의 마이크로 RNA는 마이크로 RNA를 포함하는 유전자(host gene)의 프로모터와 전사인자에 의해서 전사된다. 또한 마이크로 RNA의 전사는 PDGF(platelet-derived growth factor)와 TGF-β(transforming growth factor-beta)와 같은 성장인자(growth factor)에 의해서 조절된다.
c-Myc은 E-box에 결합하여 암세포에서 발현이 증가되어 있는 마이크로RNA-17-92 cluster의 전사를 유도한다. 또한 miR-17-92 클러스터에 위치하는 6종의 마이크로 RNA가 세포주기(cell cycle)를 조절하여, c-Myc의 과발현이 암을 유도한다는 기전에 마이크로 RNA가 관여되어 있음을 알 수 있다. 전사인자에 의한 마이크로 RNA의 조절 이외에 마이크로 RNA의 발현은 DNA의 methylation이나 histone modification과 같은 후성학적(epigenetic) 요소에 의해서도 조절된다.
최근에는 생물학적으로 마이크로 RNA가 유전자의 발현을 조절하는 중요한 조절인자임이 밝혀지고, 또한 지금까지 동식물을 포함한 32가지의 종에서 15,172개의 마이크로 RNA가 발견됨에 따라 대량의 데이터를 처리하고 분석하기 위하여 생물정보학적 연구방법이 도입되었다.
마이크로 RNA들의 서열 및 정보, 특징들을 저장, 관리하는 데이터베이스들이 구축되었는데, miRBase, ASRP 및 마이크로 RNA Map 등이 널리 이용되는 대표적인 데이터베이스들이다. 또한, 마이크로 RNA 유전자 후보나 마이크로 RNA의 표적 유전자를 예측하는 다양한 알고리즘과 이를 적용할 수 있는 애플리케이션 개발도 활발히 진행되고 있다
마이크로 RNA 유전자의 후보를 예측하는 방법에는 일반적으로 RNA 구조(RNA conformation) 기반 검색, 유사한 서열을 가진 마이크로 RNA에 대한 호몰로지(homology) 11 검색, 마이크로 RNA 특성 값을 적용한 기계학습(machine-learning) 방법에 의한 접근 등이 사용된다.
RNA 구조를 기반으로 하는 검색은 pre-마이크로 RNA가 가지는 머리핀(hairpin) 구조 12의 물리화학적 특징을 이용하는 방법으로서, 특정 염기서열이 열역학적으로 안정한 머리핀 구조를 가질 수 있는 지를 계산하여 마이크로 RNA의 후보인지를 예측하는 과정이다.
호몰로지 검색에 의한 예측은 염기서열의 유사 정도를 확률적으로 계산하여 후보를 예측하는 방법으로서, 진화적으로 보존되어 있는 마이크로 RNA의 서열 예측에 매우 유용하게 적용된다. 기계학습 방법을 통한 예측은 생물정보학 연구에서 널리 사용하는 방법으로서, 이미 알려진 마이크로 RNA에 대한 염기서열이나 분포, 구조적 특이성, 진화보존성과 같은 특징들을 이용하여 반복적으로 학습(training)시킨 후에 새로운 염기서열 정보가 입력되었을 때 학습된 사항에 따라 결과를 예측해 주는 방법이다.
이와 관련한 종래기술로서, 한국 공개특허공보 제10-2013-0122541호(2013. 11. 07.)에서는 모세관 전기영동 시스템을 이용하여 다중 마이크로 RNA를 검출하는 것을 기술하고 있으나, 이와 같은 방법으로는 정확한 마이크로 RNA의 특성을 파악할 수 없다. 또한 한국 공개특허공보 제10-2014-0108913호(2014. 9. 15.)는 마이크로 RNA의 정량분석하는 방법에 관한 것이나, 이는 미지의 마이크로 RNA를 파악할 수 있는 정확성이 떨어지는 실정이다. 나아가 한국 공개특허공보 제10-2014-0114684호(2014. 9. 29.)는 마이크로 RNA의 탐색자동화 시스템에 관한 것이나, 단순한 레퍼런스 마이크로 RNA 데이터베이스(database)의 맵핑 툴을 이용하는 것으로 단순하게 동정하는 방법에 대해 개시되어 있을 뿐이며, 한국 등록특허 제10-0504039호(2005. 7. 19.)에서는 서열이 ncRNA인지의 여부를 컴퓨터적으로 동정하는 방법만이 개시되어 있다.
본 발명자는 이러한 종래 기술상의 문제점을 해결하고자 마이크로 RNA의 분석능력을 향상시킴으로써 효율적으로 분석 가능한 마이크로 RNA ID의 분석 방법을 연구하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 마이크로 RNA의 분석 능력을 향상시켜 마이크로 RNA를 정확히 분석하고, 이를 통하여 암세포의 발현을 예측할 수 있는 마이크로 RNA ID의 분석방법의 제공을 그 과제로 하는 것이다.
본 발명의 다른 과제는 상기 마이크로 RNA ID의 분석방법을 통하여 얻어진 마이크로 RNA ID 분석결과를 이용하여 바이오마커에 적용하는 것이고, 실제 이 방법으로 도출한 관련유전자를 조절하는 대장암의 바이오마커에 대한 것이다.
본원 발명은 (a) 미지의 바이오 시료를 준비하는 단계; (b) 상기 준비된 바이오 시료로부터 미지의 마이크로 RNA를 추출하는 단계; (c) 레퍼런스 마이크로 RNA 데이터베이스를 이용하여 상기 (b) 단계에서 추출된 RNA와 상기 RNA 데이터베이스를 비교하여 공통된 결과를 얻는 단계; (d) 상기 (c) 단계에서 얻어진 결과로부터 마이크로 RNA를 비교하기 위하여 정규분포화하여 기준양을 보정하여 얻는 단계; (e) 상기 (d) 단계에서 얻어진 기준양을 비교하기 위하여 정규분포화하여 얻어진 보정된 RNA 결과를 레퍼런스 마이크로 RNA 데이터베이스 이외의 다른 데이터베이스를 이용하며, read count가 5 이상인 것을 1차 분석하고, 다시 read count의 범위를 2.5< read count <5의 범위로 하여 2차 분석하는 단계; (f) 상기 (e)에서 분석된 결과를 이용하여 공통적으로 도출되는 결과로부터 마이크로 RNA의 ID를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로 RNA ID 분석방법의 제공을 그 과제로 하는 것이다.
또한 본 발명은 상기 마이크로 RNA ID의 분석방법을 통하여 얻어진 마이크로 RNA ID의 분석결과를 이용하는 대장암의 바이오마커를 제공한다.
한편, 본 발명에 의한 그 밖의 구체적인 과제의 해결수단은 발명의 상세한 설명에 기재되어 있다.
본 발명에 의한 마이크로 RNA ID 분석방법은 마이크로 RNA의 분석 능력을 향상시켜 마이크로 RNA를 정확히 분석할 수 있고, 이를 통하여 암세포의 발현을 예측할 수 있는 효과를 갖는다.
나아가 본 발명은 상기 마이크로 RNA ID의 분석방법을 통하여 얻어진 마이크로 RNA ID의 분석결과를 이용하여 대장암에 관련된 유전자를 조절하는 마이크로 RNA 바이오마커를 제공할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 본 발명에 따른 마이크로 RNA ID의 분석방법을 나타내는 흐름도이다.
도 2는 실시예 1로부터 얻어지는 종양 관련유전자(Oncogenes)를 조절하는 마이크로 RNA 클러스팅 분석결과(K-ras, PTEN, SMDA4, EGFR, PI3K)이다.
도 3은 실시예 3로부터 얻어지는 염증 관련유전자(Inflammatory-Genes)를 조절하는 마이크로 RNA 클러스팅 분석결과(p65, p50, IKB-α, IKB-β, COX-2)이다.
도 4는 실시예 2로부터 얻어지는 세포내 항산화방어 관련유전자(Cellular-Defence-Genes)를 조절하는 마이크로 RNA 클러스팅 분석결과(Keap1, Nrf2, HO-1)이다.
이하, 본 발명에 따른 마이크로 RNA ID의 분석방법을 도 1 내지 도 4를 참고하여 상세히 설명하기로 한다.
본원 발명에 의한 마이크로 RNA ID 분석방법은 (a) 미지의 바이오 시료를 준비하는 단계; (b) 상기 준비된 바이오 시료로부터 미지의 마이크로 RNA를 추출하는 단계; (c) 레퍼런스 마이크로 RNA 데이터베이스를 이용하여 상기 (b) 단계에서 추출된 RNA와 상기 RNA 데이터베이스를 비교하여 공통된 결과를 얻는 단계; (d) 상기 (c) 단계에서 얻어진 결과로부터 마이크로 RNA를 비교하기 위하여 정규분포화하여 기준양을 보정하여 얻는 단계; (e) 상기 (d) 단계에서 얻어진 기준양을 비교하기 위하여 정규분포화하여 얻어진 보정된 RNA 결과를 레퍼런스 마이크로 RNA 데이터베이스 이외의 다른 데이터베이스를 이용하며, read count가 5 이상인 것을 1차 분석하고, 다시 read count의 범위를 2.5< read count <5의 범위로 하여 2차 분석하는 단계; (f) 상기 (e)에서 분석된 결과를 이용하여 공통적으로 도출되는 결과로부터 마이크로 RNA의 ID를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
먼저, 마이크로 RNA ID의 분석방법은 초기단계로서, 미지(未知)의 바이오 시료를 준비하여야만 하는데, 이때 상기 미지의 바이오시료는 신선한 또는 냉동된 간암조직, 세포, 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 수득된 것일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
두 번째로 본원 발명은 상기 미지의 바이오시료로부터 마이크로 RNA를 포함하는 전체 RNA를 추출하는 하여야 하는데, 이때 추출방법은 당 업계에 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 추출용매로서 트리졸(trizol) 또는 트리톤(trton) X-100을 이용하여 추출할 수 있다.
세 번째로 본원 발명은 레퍼런스 마이크로 RNA 데이터베이스를 이용하여 상기 (b) 단계에서 추출된 마이크로 RNA와 상기 RNA 데이터베이스를 비교하여 결과를 얻을 수 있는데, 상기 레퍼런스 마이크로 RNA 데이터베이스는 당 업계에서 공지된 다양한 데이터베이스를 이용할 수 있으며, 바람직하게는 miRBase, ASRP, micro RNAMAP, miRGen, CoGemiR, miRZipTM을 이용할 수 있다.
삭제
나아가 레퍼런스 데이터베이스의 종양억제유전자 정보로부터 추출된 마이크로 RNA 염기서열과 비교하여 결과를 얻을 수 있다.
상기 레퍼펀스 데이터베이스의 종양유전자 및 종양억제유전자는 K-ras, TGF-β, TGF-BR2, Smads4, PTEN, PI3K, EGFR, VEGF, MYC, p53, APC, FOXO1m Braf, COX-2, HO-1, Sirt-1 등이 있다. 또한 레퍼런스 데이터베이스의 종양억제 유전자는 1종 이상의 조합을 통하여 비교결과를 얻을 수 있다.
상기 K-ras 유전자는 대장암의 발생에 연관된 여러 유전자 중 하나로 1967년 처음 발견되었으며 EGFR 세포 신호 전달 체계를 구성하고 있는 유전자 중 하나이다.
또한 TGF-β, TGF-BR2는 면역세포나 상피세포 암 증식을 강력하게 억제하는 기능을 하는데, 정상세포가 암세포로 변하게 되면 TGF-β, TGF-BR2의 세포 증식 억제 기능이 소실된다.
Smads는 Transforming growth factor(TGF)의 세포내 신호전달 매개체로 알려져 있으며, TGF-Ⅰ형 수용체에 의해 인산화되어 활성화된다. Smad-4는 종양의 발생 및 진행에 있어 중요한 인자로 알려져 있다. 실제적으로 여러 보고들에서 Smad의 돌연변이를 유발하여 이에 따른 종양세포의 변화를 관찰하고 Smad-4가 종양의 발생에 있어서 중요한 역할을 하고 있다.
PTEN 유전자는 여러 종류의 암의 발생과 진행을 막는 데에 핵심적인 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 지금까지의 연구 결과들을 종합적으로 판단하면 PTEN이 기능을 잃거나 PTEN에 돌연변이가 발생하면 악성 세포들이 통제되지 못하고 증식을 거듭하여 암으로 발전하게 된다는 것이다
세포 표면에서 암 형성 기능은 phosphoinositide 3-kinase(PI3K) 경로의 활성화에 대한 기여를 통해 이루어진다.
Vascular Endothelial Growth Factor(VEGF)의 역할은 혈관신생(angiogenesis) 유도와 혈관의 투과도(permeability)를 증가시키는 역할이다. 이러한 역할들이 수행되기 위해서는 세포들 간의 상호작용과 접착 등이 관여를 하게 된다.
MYC 유전자가 과잉 발현할 때 정상세포가 암세포가 되는 것으로 알려져 있다.
가족성 용종증(familial adenomatous polyposis)의 원인이 되는 유전자인 APC 유전자가 밝혀졌다. APC 유전자는 15개의 엑손으로 구성되어 있으며, 총 2,843개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 생성하는데, 이 단백질은 세포들 사이의 부착에 관여하는 단백질인 β-카테닌(catenin)이라는 단백질과 결합하여 세포 사이의 신호전달에 관여함으로써 세포의 성장 조절에 영향을 미친다.
p53은 암 억제 단백질로서, 인간은 TP53 유전자로 암호화 되어 있다. P53은 다세포 생물의 세포 주기에서 암 억제자로서 암을 예방하기에 중요하다.
COX-2는 일반적으로 종양이 발생된 조직에서 발현이 증가된다고 알려져 있다. COX-2의 과발현은 종양세포의 apoptosis를 억제하고 세포 분열을 촉진하는 등 악성종양의 발달에 관여된다고 알려져 있다.
SIRT-1은 유전자발현, 당 대사, 인슐린 생산, 염증반응, 뇌신경세포 보호 등에 관여하여 세포의 성장, 노화, 죽음을 제어하며, 조직 및 개체의 수준에서는 암, 대사질환, 비만, 염증질환, 당뇨, 심장질환, 뇌퇴행성 질환 등 다양한 노화질환의 발생에 관여하는 것으로 알려져 있다.
HO-1은 다양한 종류의 세포에서 ultraviolet radiation, 과산화수소, cytokine, 저산소 상태, glutathione(GSH) 소모 등에 의해 유도되며, 이는 일종의 스트레스(stress)에 대한 세포방어 메커니즘으로 생각할 수 있다. 반응산물 중 CO는 염증과련 인자들을 억제하며, heme 또는 다른 금속이온을 가지고 있는 효소들과 반응하여 구조를 변형시킴으로써 활성의 변화를 일으키며, 능동적 세포사멸을 억제한다.
HO-1 유전자 발현은 다양한 전사인자(transcription factor)들에 의해 조절되고 있으며, 그 중 대표적인 것으로 NF-E2-related factor-2(Nrf2)를 들 수 있다. Nrf2는 redox-sensitive transcription factor로서 다양한 항산화효소 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. Nrf2는 보통 세포질 내에서 Keap1과 inactive complex를 이루어 존재하고 있지만, 활성화되는 경우 핵 속으로 이동하여 antioxidant response elemnet(ARE)에 결합함으로써 NAD(P)H:quinone oxidoreductase(NQO1), glutathione Stransferase(GCS), g-glutamate cystein ligase(GCL), HO-1 등 여러 종류의 해독화/항산화 효소들의 발현을 증가시킨다. THP를 PC12 세포에 처리 시에 Nrf2을 활성화시켜, Nrf2가 ARE binding site에 결합하여 HO-1과 같은 항산화 효소를 발현시킴으로써 세포보호 효과를 나타낸다.
상기 레퍼런스 마이크로 RNA 데이터베이스 이외의 다른 데이터베이스를 이용하여 분석하기 위해서는 miRWalK, miRanda, miRDB, RNA-22, Targetscan, TarBase, miRecords, MiRscan, ProMiR, miRDeep, miRanalyzer, PicTar, DIANA-microT, RNAhybrid, Mir Target2 등을 이용할 수 있다. 또한 상기 다른 데이터 베이스는 1종 이상을 이용하여 분석할 수 있다. 상기 다른 데이터베이스의 분석을 통하여 미지의 바이오 시료의 마이크로 RNA의 ID를 얻을 수 있다.
한편, 상기 다른 데이터베이스를 이용할 때 read count를 0.1 < read count <20의 범위 내에서 사용할 수 있다. read count가 20을 초과하면, 정확도에 문제가 생기며, read count를 0.1 미만으로 하면, 분석을 위하여 너무 많은 시간이 소모되어 비효율적이다. 따라서 read count를 0.1 < read count <20의 범위에서 사용하고, 또한 read count를 두 번 분석하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 read count를 5이상으로 하여 1차 분석하고, 다시 read count의 범위를 2.5< read count < 5의 범위로 하여 2차 분석할 수 있다.
한편, 상기 마이크로 RNA ID의 분석방법을 통하여 얻어지는 분석결과를 바이오마커(Bio Marker)에 이용할 수 있다.
이하, 본 발명에 의한 마이크로 RNA ID의 분석방법에 대하여 바람직한 실시형태를 들어 자세하게 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐이고, 본 발명의 범위가 아래의 실시예에 한정된 것은 아니다.
<실험예 1> 냉동된 대장암 조직의 RNA 추출방법
냉동된 대장암 조직의 바이오 시료를 준비하고, 상기 준비된 바이오 시료로부터 트리졸(trizol)을 이용하여 RNA를 추출한다. 추출방법은 상기 바이오 시료 50~100㎎을 잘게 부수고, 트리졸 1㎖에 넣고, 클로로포름 0.2㎖를 첨가하여 실온에서 3분간 방치하고, 12000rpm에서 15분 동안 원심분리한다. 상등액을 새로운 튜브에 옮긴 후에 이소프로필알콜 0.5㎖를 가하여 10분간 방치한다. 다시 12000rpm에서 10분간 원심분리한 후에 상등액을 버리고 RNA 펠렛을 DEPC 처리한 75% 에탄올 1㎖를 가하고 테이핑한 다음 12000rpm에서 5분간 원심분리하고, 다시 상등액을 버리고, 나머지 RNA 펠렛을 10분간 실온에서 건조시킨다.
<실험예 2> 생체세포의 RNA 추출방법
생체세포의 시료를 준비하고, 상기 준비된 생체세포의 시료로부터 트리아졸을 이용하여 RNA를 추출한다. 추출방법은 상기 실험예 1과 같다.
<실험예 3> 체세포의 RNA 추출방법
체세포의 바이오 시료를 준비하고, 상기 준비된 바이오 시료로부터 트리졸을 이용하여 RNA를 추출한다. 추출방법은 상기 실험예 1과 같다.
실험예 1에서 제조된 RNA펠렛을 이용하고 공지의 전기영동시스템을 통하여 RNA의 염기서열을 파악한다. 파악된 염기서열은 레퍼런스 마이크로 RNA D/B를 이용하여 RNA 정보를 파악한다. 차례로 얻어진 RNA 정보에 대하여 정규분포화된 표로 만든다. 상기 정규분포화된 표는 기준 양을 보정하기 위한 것으로 정규분포화된 RNA 결과를 레퍼런스 마이크로 RNA D/B 이외의 다른 D/B인 miRWalK, miRanda, miRDB, RNA-22, Targetscan, TarBase를 이용하여 결과를 분석하고, 이로부터 마이크로 RNA ID를 파악하였다.
상기 정규분포화된 RNA 결과를 miRWalK, miRanda, miRDB, RNA-22, Targetscan, TarBase D/B를 이용하여 K-ras, PTEN, SMDA4, EGFR, PI3K에서 각각의 유전자가 read count가 5 이상인 것을 구하고, 다시 read count가 2.5 이상 5 이하인 범위의 유전자를 구할 수 있었다. 이렇게 구해진 각각의 종양유전자(Oncogenes) 클러스팅 분석결과를 도 2에 나타내었으며, 이와 같이 종양 관련유전자를 조절하는 마이크로 RNA 클러스팅 방법을 통하여 마이크로 RNA ID를 파악할 수 있었다.
실험예 2로부터 제조된 RNA펠렛을 이용하고 공지의 전기영동 시스템을 통하여 RNA의 염기서열을 파악한다. 파악된 RNA의 염기서열로부터 마이크로 RNA ID의 파악방법은 실시예 1과 동일하게 실시하였고, 도 3에 p65, p50, IKB-α, IKB-β에 대한 염증 관련유전자(Inflammatory-Genes)를 조절하는 마이크로 RNA 분석결과를 나타내었다.
실험예 3으로부터 제조된 RNA 펠렛을 이용하고 공지의 전기영동 시스템을 통하여 RNA의 염기서열을 파악한다. 파악된 RNA의 염기서열로부터 마이크로 RNA ID의 파악방법은 실시예 1과 동일하게 실시하였고, 도 4에 Keap 1, Nrf 2, HO-1에 대한 세포내 항산화방어 관련유전자(Cellular-Defence-Genes)를 조절하는 마이크로 RNA 클러스팅 분석결과를 나타내었다.
본 발명은 상기와 같이 실시예에 한하여 설명하였으나, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 아니하는 범위 내에서는 얼마든지 다양하게 변경하여 실시할 수 있음은 물론이다.

Claims (15)

  1. (a) 미지의 바이오 시료를 준비하는 단계;
    (b) 상기 준비된 바이오 시료로부터 미지의 마이크로 RNA를 추출하는 단계;
    (c) 레퍼런스 마이크로 RNA 데이터베이스를 이용하여 상기 (b) 단계에서 추출된 RNA와 상기 RNA 데이터베이스를 비교하여 공통된 결과를 얻는 단계;
    (d) 상기 (c) 단계에서 얻어진 결과로부터 마이크로 RNA를 비교하기 위하여 정규분포화하여 기준양을 보정하여 얻는 단계;
    (e) 상기 (d) 단계에서 얻어진 기준양을 비교하기 위하여 정규분포화하여 얻어진 보정된 RNA 결과를 레퍼런스 마이크로 RNA 데이터베이스 이외의 다른 데이터베이스를 이용하며, read count가 5 이상인 것을 1차 분석하고, 다시 read count의 범위를 2.5< read count <5의 범위로 하여 2차 분석하는 단계;
    (f) 상기 (e)에서 분석된 결과를 이용하여 공통적으로 도출되는 결과로부터 마이크로 RNA의 ID를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로 RNA ID 분석방법.
  2. 청구항 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 미지의 바이오시료는 신선한 또는 냉동된 대장암 조직, 세포, 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 수득되는 것을 특징으로 하는 마이크로 RNA ID의 분석방법.
  3. 청구항 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 RNA를 추출하기 위하여 트리졸(trizol) 또는 트리톤(triton) X-100을 사용하는 것을 특징으로 하는 마이크로 RNA ID의 분석방법.
  4. 청구항 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계의 레퍼런스 마이크로 RNA 데이터베이스는 miRBase, ASRP, 마이크로 RNAMAP, miRGen, CoGemiR, 또는 miRZipTM을 이용하는 것을 특징으로 하는 마이크로 RNA ID의 분석방법.
  5. 청구항 제4항에 있어서,
    상기 레퍼런스 마이크로 RNA 데이터베이스를 1종 이상을 이용하는 것을 특징으로 하는 마이크로 RNA ID의 분석방법.
  6. 삭제
  7. 청구항 제1항에 있어서,
    상기 (e) 단계의 다른 데이터베이스에는 miRWalK, miRanda, miRDB, RNA-22, Targetscan,TarBase, miRecords, MiRscan, ProMiR, miRDeep, miRanalyzer, Pic Tar, DIANA-microT, RNAhybrid, Mir Target2를 이용하는 것을 특징으로 하는 마이크로 RNA ID의 분석방법.
  8. 청구항 제7항에 있어서,
    상기 다른 데이터 베이스를 1종 이상을 이용하는 것을 특징으로 하는 마이크로 RNA ID의 분석방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 청구항 제1항에 있어서,
    상기 (f) 단계에서 얻어진 마이크로 RNA ID를 분석하여 종양유전자 및 종양억제유전자, 염증 관련유전자, 염증 관련전사인자, 세포내 항산화방어 관련유전자, 세포내 항산화방어 관련전사인자 중 어느 하나를 파악하는 것을 특징으로 하는 마이크로 RNA ID의 분석방법.
  12. 청구항 제11항에 있어서,
    상기 종양유전자 및 종양억제유전자는 K-ras, TGF-β, TGF-BR2, Smads4, PTEN, PI3K, EGFR, VEGF, MYC, p53, APC, FOXO1m Braf, Sirt-1인 것을 특징으로 하는 마이크로 RNA ID의 분석방법.
  13. 청구항 제11항에 있어서,
    상기 염증 관련유전자는 COX-2이고, 염증 관련전사인자는 p65, p50, IKB-α, IKB-β인 것을 특징으로 하는 마이크로 RNA ID의 분석방법.
  14. 청구항 제11항에 있어서,
    상기 세포내 항산화방어 관련 유전자는 HO-1이고, 세포내 항산화방어관련 전사인자 Nrf-2, Keap-1인 것을 특징으로 하는 마이크로 RNA ID의 분석방법.
  15. 청구항 제1항 내지 제5항, 제7항, 제8항, 제11항 내지 제14 중 어느 하나의 항의 마이크로 RNA ID 분석방법을 통하여 얻어진 마이크로 RNA ID 분석결과를 이용하는 대장암의 바이오마커.
KR1020140169452A 2014-12-01 2014-12-01 마이크로 rna id의 분석방법 및 이를 통해 도출한 대장암의 바이오마커 KR101583450B1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140169452A KR101583450B1 (ko) 2014-12-01 2014-12-01 마이크로 rna id의 분석방법 및 이를 통해 도출한 대장암의 바이오마커
US14/954,806 US20160152977A1 (en) 2014-12-01 2015-11-30 Analyzing method for micro rna id and biomarkers related to colon cancer through this method

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140169452A KR101583450B1 (ko) 2014-12-01 2014-12-01 마이크로 rna id의 분석방법 및 이를 통해 도출한 대장암의 바이오마커

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR101583450B1 true KR101583450B1 (ko) 2016-01-11

Family

ID=55169798

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020140169452A KR101583450B1 (ko) 2014-12-01 2014-12-01 마이크로 rna id의 분석방법 및 이를 통해 도출한 대장암의 바이오마커

Country Status (2)

Country Link
US (1) US20160152977A1 (ko)
KR (1) KR101583450B1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180031980A (ko) 2016-09-21 2018-03-29 전주대학교 산학협력단 마이크로 rna의 데이터 마이닝을 통한 마이크로 rna id의 분석방법
KR20190001799A (ko) 2017-06-28 2019-01-07 전주대학교 산학협력단 발현 유전자의 보정을 이용한 알츠하이머 바이오마커 마이크로 rna id의 분석방법

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140044375A (ko) * 2011-06-27 2014-04-14 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 알츠하이머병을 나타내는 마이크로rna 바이오마커들

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140044375A (ko) * 2011-06-27 2014-04-14 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 알츠하이머병을 나타내는 마이크로rna 바이오마커들

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180031980A (ko) 2016-09-21 2018-03-29 전주대학교 산학협력단 마이크로 rna의 데이터 마이닝을 통한 마이크로 rna id의 분석방법
KR101884073B1 (ko) 2016-09-21 2018-07-31 전주대학교 산학협력단 마이크로 rna의 데이터 마이닝을 통한 마이크로 rna id의 분석방법
KR20190001799A (ko) 2017-06-28 2019-01-07 전주대학교 산학협력단 발현 유전자의 보정을 이용한 알츠하이머 바이오마커 마이크로 rna id의 분석방법
KR101960597B1 (ko) 2017-06-28 2019-03-20 전주대학교 산학협력단 발현 유전자의 보정을 이용한 알츠하이머 바이오마커 마이크로 rna id의 분석방법

Also Published As

Publication number Publication date
US20160152977A1 (en) 2016-06-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Liu et al. Interplay between miRNAs and host genes and their role in cancer
White et al. MicroRNAs and their potential for translation in prostate cancer
Fu et al. miRNA biomarkers in breast cancer detection and management
Schultz et al. MicroRNA expression profiles associated with pancreatic adenocarcinoma and ampullary adenocarcinoma
Song et al. MicroRNAs in pathogenesis, diagnosis, and treatment of gastroesophageal cancers
Mirnezami et al. MicroRNAs: key players in carcinogenesis and novel therapeutic targets
Shenouda et al. MicroRNA function in cancer: oncogene or a tumor suppressor?
Slack et al. MicroRNA in cancer prognosis
Schanen et al. Transcriptional regulation of mammalian miRNA genes
Chen et al. Role of miR-143 targeting KRAS in colorectal tumorigenesis
Goto et al. Tumour-suppressive microRNA-224 inhibits cancer cell migration and invasion via targeting oncogenic TPD52 in prostate cancer
Heneghan et al. MicroRNAs as novel biomarkers for breast cancer
Yang et al. Identification of miR‐21 targets in breast cancer cells using a quantitative proteomic approach
Ortholan et al. MicroRNAs and lung cancer: new oncogenes and tumor suppressors, new prognostic factors and potential therapeutic targets
Munari et al. Clear cell papillary renal cell carcinoma: micro-RNA expression profiling and comparison with clear cell renal cell carcinoma and papillary renal cell carcinoma
Grimaldi et al. Non-coding RNAs as a new dawn in tumor diagnosis
Navarro et al. Prognostic implications of miR‐16 expression levels in resected non‐small‐cell lung cancer
Lahdaoui et al. miR-219-1-3p is a negative regulator of the mucin MUC4 expression and is a tumor suppressor in pancreatic cancer
Kozaki et al. Tumor‐suppressive micro RNA silenced by tumor‐specific DNA hypermethylation in cancer cells
Verghese et al. Small is beautiful: microRNAs and breast cancer—where are we now?
Cortinovis et al. MicroRNAs in non-small cell lung cancer: current status and future therapeutic promises
Zhang et al. Comprehensive gene and microRNA expression profiling reveals the crucial role of hsa-let-7i and its target genes in colorectal cancer metastasis
KR101884992B1 (ko) 조절 miRNA의 검출방법 및 이를 이용한 대장암 바이오마커
Li et al. Mutant p53 exerts oncogenic effects through microRNAs and their target gene networks
Ayub et al. Microdissecting the role of microRNAs in the pathogenesis of prostate cancer

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190509

Year of fee payment: 4