BRPI0715864A2 - biomarcadores para progressço de doenÇa de alzheimer - Google Patents

Abstract

Patente de Invenção:"BIOMARCADORES PARA PROGRESSçO DE DOENÇA DE ALZHEIMER". Esta invenção se refere, de modo geral, ao teste analítico de amostras de tecido in vitro, e, mais particularmente, a aspectos de polimorfismos genéticos associados com a conversão de Dano Cognitivo de Mile em demência, por exemplo, Doença de Alzheimer (AD). A Invenção proporciona mutações associadas à AD que são úteis no diagnóstico, prognóstico ou tratamento terapêutico de por exemplo, Doença de Alzheimer.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "BIOMARCADO- RES PARA PROGRESSÃO DE DOENÇA DE ALZHEIMER"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se geralmente ao teste analítico de amostra de tecido in vitro, e, mais particularmente, a aspectos de polimorfismos genéticos úteis na diagnose, prognose ou prevenção/tratamento terapêutico de demência, por exemplo, Doença de Alzheimer. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Aproximações médicas convencionais para diagnose e trata- mento de doença são baseadas em dados clínicos apenas, ou produzidos em conjunto com um teste diagnóstico. Tais práticas freqüentemente condu- zem a escolhas terapêuticas que não são ótimas para a eficiência da terapia de fármaco prescrita, ou para minimizar a probabilidade de efeitos colaterais para um indivíduo. Os diagnósticos de terapia específicos (a.k.a., teranósti- cos) em um campo de tecnologia médica emergente, que proporciona testes úteis para diagnose de uma doença, escolhem o regime de tratamento corre- to, e monitora uma resposta do indivíduo. Isto é, teranósticos são úteis para prognosticar e avaliar resposta de fármaco em indivíduos individuais, isto é, medicina individualizada. Testes teranósticos são também úteis para sele- cionar indivíduos para tratamentos que são particularmente similares para se beneficiar do tratamento, ou para proporcionar uma indicação antecipada e objetiva de eficiência de tratamento em indivíduos individuais, de modo que o tratamento pode ser alterado com um mínimo de retardo.

O progresso nos farmacogenéticos, que estabelece correlações entre respostas a fármacos específicos e ao perfil genético de pacientes in- dividuais, é fundamental ao desenvolvimento de novas aproximações tera- nósticas. Como tal, existe uma necessidade na técnica para avaliação de variações de paciente para paciente na seqüência de gene e expressão de gene. Uma forma comum de perfil genético está na identificação de varia- ções de seqüência de DNA denominadas polimorfismos de nucleotídeo sim- ples ("SNPs"), que são um tipo de mutação genética que conduz a variação paciente a paciente na resposta à fármaco individual. Segue-se que existe uma necessidade na técnica de identificar e caracterizar mutação genéticas, tais como SNPs, que são úteis para identificar os genótipos de indivíduos associados sensibilidade a fármaco, efeitos colaterais, ou dose ideal.

A demência é um distúrbio cerebral que afeta seriamente a ca- pacidade da pessoa efetuar as atividades diárias. A forma mais comum de demência entre pessoas mais idosas é a Doença de Alzheimer (AD), que inicialmente envolve as partes do cérebro que controla pensamento, memó- ria e linguagem. É estimado que mais de 4,5 milhões de americanos sofrem de AD. Este número é esperado quadruplicar até o ano 2050 com o enve- Ihecimento da população. A doença usualmente começa após os 60 anos de idade, e o risco aumenta com a idade. Enquanto pessoas mais jovens po- dem também ter AD, ela é muito menos comum. Cerca de 5 por cento dos homens e mulheres de idades de 65 a 74 têm AD, e quase a metade destes de idade de 85 anos e mais idosos podem ter a doença. A AD não é uma parte normal do envelhecimento. A(s) causa(s) de AD não são completa- mente conhecidas, e não existe cura. A progressão dos sintomas de AD po- de ser temporariamente reduzida para pessoas nos estágios mais iniciais e intermediários da doença, com administração de drogas, tais como tacrina (Cognex), donepezil (Aricept), rivastigmina (Exelon), ou galantamina (Ra- zadyne, anteriormente conhecida como Reminyl).

Dano cognitivo suave (MCI) é um estágio de transição entre as mudanças cognitivas de envelhecimento normal e os problemas mais sérios causados pela Doença de Alzheimer. MCI é diferente de ambas AD e mu- dança de memória relacionada à idade. Pessoas com MCI têm problemas adiantados de memória, mas elas não experimentam outras perdas, tais co- mo confusão, problemas de atenção, e dificuldade com linguagem. O MCI pode progredir, contudo, a Doença de Alzheimer. Consequentemente, existe uma necessidade na técnica de se identificar e caracterizar mutações gené- ticas, que sejam úteis para identificar os genótipos de indivíduos associados com o começo e/ou progressão de demência, por exemplo, Doença de Al- zheimer. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção proporciona novas mutações genéticas (is- to é, "mutações associadas à AD"), que são úteis como biomarcadores para identificar os genótipos de indivíduos associados com o começo e/ou pro- gressão de demência, por exemplo, Doença de Alzheimer. A invenção pro- porciona o uso de um composto Novartis, rivastigmina (Exelon), na produção de um medicamento para o tratamento de Doença de Alzheimer com uma toxicidade reduzida ou efeito aumentado em uma população de paciente selecionada, no qual a população de paciente é selecionada à base da pre- sença de pelo menos uma mutação de gene da invenção.

A invenção também proporciona um método para tratar Doença de Alzheimer em um indivíduo. O genótipo ou haplótipo do indivíduo é obtido em um local ou locais genéticos de pelo menos um gene selecionado a partir do grupo consistindo em: AK5; BAI3; BBX; C18orf20; C5orf3; CACNA2D1; CCDC2; CD47; CNTNAP5; GRIA1; LAMA3; LOC131368; LRRC19; MGC27434; NFKBIZ; PIK3C3; SLC1A3; SPAG16; ST3GAL3; TEK; e TNFSF11, de modo que o ge- nótipo e/ou haplótipo é indicativo de uma propensidade da Doença de Al- zheimer para responder à fármaco. Em seguida, uma terapia de uma anti- Doença de Alzheimer é administrada ao indivíduo, incluindo, mas não Iimita- do a, por exemplo, tacrina; donepezil; rivastigmina; galantamina; ou um a- gente de modulação de mutação associada à AD.

A invenção proporciona um método para identificar um indivíduo com uma enfermidade a qual uma mutação associada à Doença de Alzheimer da invenção é dita antes. O genótipo ou haplótipo do indivíduo é obtido em um local ou locais genéticos de pelo menos um gene selecionado a partir do grupo consistindo em: AK5; BAI3; BBX; C18orf20; C5orf3; CACNA2D1; CCDC2; CD47; CNTNAP5; GRIA1; LAMA3; LOC131368; LRRC19; MGC27434; NFKBIZ; PIK3C3; SLC1A3; SPAG16; ST3GAL3; TEK; e TNFSF11, e avalia- do para determinar a presença de uma mutação da invenção para identificar o indivíduo como tendo uma propensidade de ter uma enfermidade a qual uma mutação associada à Doença de Alzheimer é dita antes. A enfermidade a qual a mutação associada à Doença de Alzheimer é dita antes pode ser Doença de Alzheimer.

A invenção proporciona um método para determinar, antes da iniciação do tratamento, que o indivíduo deve estar incluído em um estudo de um agente terapêutico ou de estudo pela interrogação do genótipo e/ou haplótipo do indivíduo em um local ou locais genéticos de pelo menos um gene selecionado a partir do grupo consistindo em: AK5; BAI3; BBX; C18orf20; C5orf3; CACNA2D1; CCDC2; CD47; CNTNAP5; GRIA1; LAMA3; LOC131368; LRRC19; MGC27434; NFKBIZ; PIK3C3; SLC1A3; SPAG16; ST3GAL3; TEK; e TNFSF11 e, em seguida (i), incluindo o indivíduo no estudo se o genótipo é indicativo de uma propensidade a Doença de Alzheimer pelo indivíduo; (ii) exclusão do indiví- duo do estudo se o genótipo não é indicativo de uma propensidade a Doen- ça de Alzheimer pelo indivíduo; ou (iii) ambos (i) e (ii).

A invenção proporciona um método para determinar a receptivi- dade de um com uma enfermidade para tratamento pela obtenção do genó- tipo ou haplótipo do indivíduo em um local ou locais genéticos de pelo me- nos um gene selecionado a partir do grupo consistindo em: AK5; BAI3; BBX; C18orf20; C5orf3; CACNA2D1; CCDC2; CD47; CNTNAP5; GRIA1; LAMA3; LOC131368; LRRC19; MGC27434; NFKBIZ; PIK3C3; SLC1A3; SPAG16; ST3GAL3; TEK; e TNFSF11 e, em seguida, avaliando-se o genótipo e/ou haplótipo para determinar a presença de uma mutação ou polimorfismo da invenção, no qual a presença da mutação ou polimorfismo é indicativa de um indivíduo que é responsivo ao tratamento da enfermidade para identificar o indivíduo como responsivo ao tratamento da enfermidade.

A invenção proporciona um método para determinar, antes do tratamento, que o indivíduo desenvolverá toxicidade quando tratado com um composto pela obtenção do genótipo ou haplótipo do indivíduo em um local ou locais genéticos de pelo menos um gene selecionado a partir do grupo consistindo em: AK5; BAI3; BBX; C18orf20; C5orf3; CACNA2D1; CCDC2; CD47; CNTNAP5; GRIA1; LAMA3; LOC131368; LRRC19; MGC27434; NFKBIZ; PIK3C3; SLC1A3; SPAG16; ST3GAL3; TEK; e TNFSF1 (isto é "os genótipos ou haplótipos da invenção"); e, em seguida, avaliando-se o genótipo e/ou haplótipo para determinar a presença de uma mutação ou polimorfismo da invenção no qual a presença da mutação ou polimorfismo é indicativa de qual indivíduo desenvolverá toxicidade quando tratado de modo a identificar o indiví- duo como um indivíduo que desenvolverá toxicidade quando tratado.

A invenção adicionalmente proporciona kits de teste para: (a) uso na determinação quando um composto deve ser descontinuado para um indivíduo sendo tratado com um agente terapêutico ou de estudo; (b) uso na determinação que os indivíduos desenvolverão toxicidade; (c) para uso na determinação que os indivíduos estão desenvolvendo toxicidade quando tratados com um composto; e (d) para uso na determinação que os indiví- duos desenvolverão toxicidade quando tratados com um composto e não devem ser incluídos em um estudo daquele composto. Os kits incluem um reagente para detectar um polinucleotídeo ou polipeptídeo codificado por um gene tendo uma seqüência compreendendo uma mutação da invenção, em um recipiente adequado para contactar um fluido corpóreo com instruções para interpretar os resultados.

A invenção proporciona um método para monitorar a progressão ou desenvolvimento de toxicidade em um indivíduo quando tratado com um composto, por: (a) provisão de uma primeira amostra biológica de teste do indivíduo; (b) provisão de uma segunda amostra biológica de teste do indiví- duo que seja posterior em tempo do que a primeira amostra biológica de tes- te; (c) contactar as amostras biológica de teste com um reagente para detec- tar um polinucleotídeo ou polipeptídeo codificado por um gene tendo uma seqüência compreendendo uma mutação da invenção; (d) determinação do nível de expressão do polipeptídeo ou polinucleotídeo nas amostras biológi- cas de teste; e (e) comparar o nível do nível de polinucleotídeo ou polipeptí- deo na primeira amostra biológica de teste com o nível do polinucleotídeo ou polipeptídeo na segunda amostra biológica de teste, no qual um aumento ou uma diminuição no nível de polinucleotídeo ou polipeptídeo na segunda a- mostra biológica de teste relativo ao nível do polinucleotídeo ou polipeptídeo na primeira amostra biológica de teste indica a progressão ou desenvolvi- mento de toxicidade no indivíduo sendo tratado com o composto.

A invenção proporciona um método para determinar quando tra- tamento com um composto deve ser descontinuado em um indivíduo em risco de ter toxicidade durante ou após tratamento com o composto, por: (a) provisão de uma amostra biológica de teste e uma amostra de referência padrão; (b) contato da amostra biológica de teste com um reagente para de- tectar um polinucleotídeo ou polipeptídeo codificado por um gene tendo uma seqüência compreendendo uma mutação da invenção; (c) determinação do nível de expressão do polipeptídeo ou polinucleotídeo na amostra biológica de teste; e (d) comparação do nível do nível de polinucleotídeo ou polipeptídeo na amostra biológica de teste com o nível do polinucleotídeo ou polipeptídeo em uma amostra de referência padrão, no qual a similaridade entre o nível de polinucleotídeo ou polipeptídeo e o nível do polinucleotídeo ou polipeptídeo na amostra de referência padrão é indicativa do desenvolvimento de toxi- cidade no indivíduo e determina que o composto deve ser descontinuado.

A invenção proporciona um método para validar um composto como um alvo candidato para o tratamento de uma condição médica dita antes para estar associada com Doença de Alzheimer ou MCI por: (a) com- paração da freqüência de cada um dos genótipos ou haplótipos da invenção entre primeira e segunda populações, no qual a primeira população é um grupo de indivíduos tendo a condição médica, e a segunda população é um grupo de indivíduos que carecem da condição médica, e (b) tomada de uma decisão se adotar o composto para tratamento da condição médica; no qual se pelo menos um dos haplótipos está presente em uma freqüência na pri- meira população que é diferente da freqüência na segunda população em um nível estatisticamente significante, então a decisão é adotar o composto, e se nenhum dos haplótipos são vistos em uma freqüência diferente, em um nível estatisticamente significante, entre as primeira e segunda populações, em seguida a decisão é não adotar o composto.

A invenção também proporciona um sistema de computador pa- ra armazenagem e análise de dados de polimorfismo para um gene com: (a) uma unidade de processamento central (CPU); (b) uma interface de comuni- cação; (c) um dispositivo mostrador; (d) um dispositivo de entrada; e (e) uma base de dados contendo os dados de polimorfismo, no qual os dados de po- Iimorfismo compreendem os haplótipos da invenção. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Dano cognitivo suave, ou MCI, afeta muitas áreas de cognição e pode ser dividido em dois subtipos amplos. Um subtipo, MCI amnéstico, afe- ta significantemente a memória. O outro tipo, MCI não-amnéstico, não afeta. Outras funções, tais como linguagem, atenção e habilidades visuo-espaciais, podem ser prejudicadas em qualquer tipo. O predomínio exato de MCI foi estimado mais alto que 20 por cento da população não-dementada acima de 65 anos de idade. Cerca de um terço destes casos, contudo, têm variedade amnéstica que estava ligada a Alzheimer. MCI amnéstico (relacionado à memória) se converte em Alzheimer a uma taxa de 10 por cento a 15 por cento em um ano.

A presente invenção proporciona novas genéticas de mutação (isto é, "mutações associadas à AD"), que são úteis para identificar os genó- tipos de indivíduos associados com o começo e/ou progressão de demência, por exemplo, Doença de Alzheimer. Especificamente, 420 amostras de paci- ente a partir de ensaios clínicos InDDex (ENA713B IA07) foram genotipados usando-se a plataforma de genotipagem Affymetrix 100K, e análise de asso- ciação de genoma total foi realizada, em pontos simples e blocos de haplóti- po inferidos, usando-se o teste de caso de controle de Haploview (Barrett et ai, Bioinformatics 21:263-265 (2005)). (Ver geralmente EXEMPLO I). O fe- nótipo de efeito foi conversão ou não-conversão de MCI a AD.

A invenção proporciona vinte e cinco (25) mutações associadas à AD (por exemplo, MUT-1 a MUT-25) que são resumidas abaixo na TABE- LA 1. As mutações associadas à AD da TABELA 1 não foram previamente associadas com AD, embora várias delas estejam em trajetórias que esta- vam ligadas à doença. As mutações associadas à AD da presente invenção são úteis na diagnose, prognose ou tratamento terapêutico de demência, por exemplo, Doença de Alzheimer. Em um aspecto, as mutações associadas à AD da invenção são úteis como diagnóstico/marcadores dito antes de AD. Em outro aspecto, as mutações associadas à AD da invenção são úteis co- mo alvos para agentes úteis na prevenção ou tratamento de AD. TABELA 1 Mutações Associadas à AD da Invenção ι- Ο T £ π ε C GC α C α CJ SPAG16 CNTNAP5 GRIA1 I I I SCL1A3 C18orf20 dbSNP RS 1D Rs 10490502 Rs 1170585 Rs4415128 RS17126 Rs10491374 rs1833486 Alelo ml Ι- Ι- O Ι- CD I- Alelo <l Ο Ο < Ο O < Posição 214935064 ----------1 124721329 153057231 86116564 36703336 602111031 Cromo CM cg in N- ir> OO τ— Nome MUT-1 (SNP_A-1670809 MUT-2 (SNP_A-1750208 MUT-3 (SNP_A-1747985 MUT-4 (SNP_A-1672398 MUT-5 (SNP_A-1654099 MUT-6 (SNP_A-1653812 TABELA 1 -continuação- Mutacões Associadas à AD da Invenção L C τ α α ε C S CL C α C 5 3 ι i I I MGC27434 CACNA2D1 LRRC19 TEK CCDC2 NFKBIS LOC131368 C18orf20 dbSNP RS 1D --- --- Rs6465088 Rs 10505528 Rs929351 Rs10511798 Rs9290621 Rs4306624 Alelo OQ O Ι- l·- Ι- O l·- Alelo <l < Ο CD Ο < O Posição 86115205 129710034 81502544 ---- 27057529 103365250 60165056 Cromo N- OO N- cn CO OO T— Nome MUT-13 (SNP_A-1677855 MUT-14 (SNP_A-1659634 MUT-15 (SNP_A-1657336 MUT-16 (SNP_A-1742608 MUT-17 (SNP_A-1681449 MUT-18 (SNP_A-1674524 TABELA 1 -continuação- Mutações Associadas à AD da Invenção L. C ■C g π E C CC <L C Q3 j I AK5 I I LAMA3 CD47 BBX PIK3C3 CD47 dbSNP RS 1D Rs2622542 RS10518551 Rs1369308 RS1541836 Rs696365 Rs10502726 RS3804640 Alelo CQl CD I- O l·- l·- O Ι- Alelo <l O < < O O < Ο Posição 56479295 77566211 31572775 19749481 109243490 35487281 109276399 Cromo OO IO OO CO OO CO Nome MUT-19 (SNP_A-1689621 MUT-20 (SNP_A-1728960 MUT-21 (SNP_A-1666270 MUT-22 (SNP_A-1738563 MUT-23 (SNP_A-1748758 MUT-24 (SNP_A-1652367 MUT-25 (SNPA-1752416 E para ser apreciado que certos aspectos, modos, concretiza- ções, variações e características da invenção são descritos abaixo em vários níveis de detalhe de modo a proporcionar um entendimento substancial da presente invenção. Em geral, tal descrição proporciona novas mutações as- sociadas à AD1 incluindo SNPs1 úteis na diagnose e tratamento de indivíduos em necessidade destes. Consequentemente, os vário aspectos da presente invenção se referem à polinucleotídeos que codificam mutações associadas à AD da invenção, vetores de expressão que codificam os polipeptídeos mu- tantes associados à AD da invenção, e organismos que expressam os poli- nucleotídeos mutantes associados à AD e/ou polipeptídeos mutantes asso- ciados à AD da invenção. Os vários aspectos da presente invenção se rela- cionam adicionalmente a métodos de diagnóstico/teranóstico e kits que u- sam as mutações associadas à AD da invenção para identificar indivíduos predispostos à doença, ou para classificar indivíduos com relação à recepti- vidade de fármaco, efeitos colaterais, ou dose de fármaco ótimo. Em outros aspectos, a invenção proporciona métodos para validação de composto e um sistema de computador para armazenamento e análise de dados rela- cionados às mutações associadas à AD da invenção. Consequentemente, várias concretizações particulares que ilustram estes aspectos se seguem.

Definições. As definições de certos termos conforme usados neste relatório descritivo são providas abaixo. Definições de outros termos podem ser encontradas no glossário provido pelo Departamento de Energia dos Estados Unidos, Escritório de Ciência, Human Genome Project (http:// www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/glossary/). Na prática da presente invenção, muitas técnicas convencionais em biologia molecular, microbiologia e DNA recombinante são usadas. Estas técnicas são bem conhe- cidas e são explanadas em por exemplo, Current Protocols em Molecular Bio- Iogy, Vols. I-Ill1 Ausubel, ed. (1997); Sambrook et ai, Molecular Cloning: A La- boratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I e II, Glover D, ed. (1985); Oligonucleotide Synthesis, Gait, ed. (1984); Aeid Nu- eleie Hybridization, Hames & Higgins, Eds. (1985); Transeription and Trans- lation, Hames & Higgins, eds. (1984); Animal Cell Culture, Freshney, e<± (1986); Immobilized Cells e Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning-, a série, Methods in Enzymol. (Academic Press, Inc., 1984); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Millere Calos, Eds. (Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1987); e Methods in Enzymology, Vols. 154 e 155, Wu e Grossman, e Wu, Eds., respectivamente.

Conforme aqui usado, o termoo "alelo" significa uma forma parti- cular de um gene ou seqüência de DNA em uma localização cromossomal específica (local).

Conforme aqui usado, o termo "anticorpo" inclui, mas não é limi- tado a, anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, anticorpos humani- zados ou quiméricos, e fragmentos de anticorpo biologicamente funcionais suficientes para ligar o fragmento de anticorpo à proteína.

Conforme aqui usado, o termo "resposta clínica" significa qual- quer ou todas da seguinte: uma medida quantitativa da resposta, nenhuma resposta, e resposta adversa (isto é, efeitos colaterais).

Conforme aqui usado, o termo "ensaio clínico" significa qualquer estudo de pesquisa designado para coletar dados clínicos em respostas a um tratamento particular, e inclui, não é limitado a, ensaios clínicos de fase I, fase Il e fase III. Métodos padrões são usados para definir a população de paciente e registrar os indivíduos.

Conforme aqui usado, o termo "quantidade efetiva" de um com- posto é a quantidade suficiente para alcançar um efeito terapêutico e/ou pro- filático desejado, por exemplo, uma quantidade que resulta na prevenção de, ou uma diminuição nos sintomas associados com uma doença que está sendo tratada, por exemplo, as doenças associadas com polinucleotídeos mutantes associados à AD e polipeptídeos mutantes aqui identificados. A quantidade de composto administrada ao indivíduo dependerá do tipo e se- veridade da doença, e das características do indivíduo, tais como saúde ge- ral, idade, sexo, peso corpóreo e tolerância a fármacos. Ela dependerá tam- bém do grau, severidade e tipo de doença. O versado na técnica será capaz de determinar dosagens apropriadas dependendo destes e de outros fato- res. Tipicamente, uma quantidade efetiva dos compostos da presente inven- ção, suficiente para alcançar um efeito terapêutico ou profilático, varia de cerca de 0,000001 mg por kilograma de peso corpóreo por dia a cerca de 10.000 mg por kilograma de peso corpóreo por dia. Preferivelmente, as fai- xas de dosagem são de cerca de 0,0001 mg por kilograma de peso corpóreo por dia a cerca de 100 mg por kilograma de peso corpóreo por dia. Os com- postos da presente invenção podem também serem administrados em com- binação um com o outro, ou com um ou mais compostos terapêuticos adi- cionais.

Conforme aqui usado, "expressão" inclui, mas não está limitado

a, um ou mais dos seguintes: transcrição do gene em mRNA precursor; uni- ão e outro processamento do mRNA precursor para produzir mRNA maduro; estabilidade do mRNA; translação do mRNA maduro em proteína (incluindo uso de códon e disponibilidade de tRNA); e glicosilação e/ou outras modifi- cações do produto de translação, se requeridas para expressão e função corretas.

Conforme aqui usado, o termo "gene" significa um segmento de DNA que contém toda a informação para a biosíntese regulada de um produ- to de RNA, incluindo promotores, exons, introns, e outras regiões não- tranladadas que controlam a expressão.

Conforme aqui usado, o termo "genótipo" significa uma sequen- cia 5' a 3' não em fase de pares de nucleotídeo encontrados em um ou mais locais polimórficos em um local em um par de cromossomos homólogos em um indivíduo. Conforme aqui usado, genótipo inclui genótipo total e/ou um sub-genótipo.

Conforme aqui usado, o termo "local" significa uma localização em um cromossomo ou molécula de DNA correspondente a um gene, ou a uma característica física ou fenotípica.

Conforme aqui usado, o termo "agente de modulação de muta- ção associado à AD" é qualquer composto que altera (por exemplo, aumenta ou diminui) o nível de expressão, ou nível de atividade biológica de polipep- tídeo mutante associado à AD comparado ao nível de expressão ou ativida- de biológica de polipeptídeo mutante associado à AD na ausência do agente de modulação associado à AD. O agente de modulação de mutação associ- ado à AD pode ser uma molécula pequena, polipeptídeo, carboidrato, lipí- deo, nucleotídeo, ou combinação destes. O agente de modulação de muta- ção associado à AD pode ser um composto orgânico ou um composto inor- gânico.

Conforme aqui usado, o termo "mutante" significa qualquer vari- ação hereditária do tipo selvagem que é o resultado de uma mutação, por exemplo, polimorfismo de nucleotídeo simples ("SNP"). O termo "mutante" é usado permutavelmente com os termos "marcador", "biomarcador", e "alvo" através de todo relatório descritivo.

Conforme aqui usado, o termo "condição médica" inclui, mas não é limitado a, qualquer condição ou doença manifestada como um ou mais sintomas físicos e/ou psicológicos para qual tratamento é desejável, e inclui doenças e outros distúrbios anteriormente e recentemente identifica- dos.

Conforme aqui usado, o termo "par de nucleotídeos" significa os nucleotídeos encontrados em um local polimórfico nas duas cópias de um cromossomo de um indivíduo.

Conforme aqui usado, o termo "local polimórfico" significa uma posição dentro de um local no qual pelo menos duas seqüências alternativas são encontradas em uma população, a mais freqüente da qual tem uma fre- qüência de não mais do que 99%.

Conforme aqui usado, o termo "em fase" significa, quando apli- cado a uma seqüência de pares de nucleotídeos para dois ou mais locais polimórficos em um local, a combinação de nucleotídeos presente naqueles locais polimórficos em uma cópia simples do local é conhecido.

Conforme aqui usado, o termo "polimorfismo" significa uma dife- rença na seqüência de DNA entre indivíduos, ou variações genéticas. Varia- ções genéticas que ocorrem em mais do que 1% de uma população são consideradas polimorfismos úteis para análise de ligação genética. A varian- te de seqüência pode estar presente e uma freqüência significantemente maior do que 1%, tal como 5% ou 10 %, ou mais. Também, o termo pode ser usado para se referir a variação de seqüência observada em um indivíduo em um local polimórfico. Polimorfismos incluem substituições de nucleotídeo, inserções, anulações e microsatélites, e podem, mas não necessário, resul- tar em diferenças detectáveis na expressão de gene ou função de proteína.

Conforme aqui usado, o termo "polinucleotídeo" significa qual- quer RNA ou DNA, que pode ser RNA ou DNA não-modificado ou modifica- do. Polinucleotídeos incluem, sem limitação, DNA de trançado simples e du- plo, DNA que é uma mistura de regiões de trançado simples e duplo, RNA de trançado simples e duplo, RNA que é uma mistura de regiões de trançado simples e duplo, e moléculas híbridas compreendendo DNA e RNA que po- dem ser de trançado simples ou, mais tipicamente, de trançado duplo, ou uma mistura de regiões de trançado simples e duplo. Em adição, polinucleo- tídeo se refere a regiões de trançado triplo compreendendo RNA ou DNA, ou ambos RNA e DNA. O termo polinucleotídeo também inclui DNAs ou RNAs contendo uma ou mais bases modificadas, e DNAs ou RNAs com suportes modificados para estabilidade, ou por outras razões.

Conforme aqui usado, o termo "polipeptídeo" significa qualquer polipeptídeo compreendendo dois ou mais aminoácidos unidos um ao outro por ligações de peptídeo, ou ligações de peptídeo modificadas, isto é, peptí- deo isosteres. Polipeptídeo se refere a ambas cadeias curtas, comumente referidas como peptídeos, glicopeptídeos ou oligômeros, e a cadeias mais longas, geralmente referidas como proteínas. Os polipeptídeos podem con- ter aminoácidos diferentes dos 20 aminoácidos codificados de gene. Os po- lipeptídeos incluem seqüências de aminoácidos modificadas, ou por proces- sos naturais, tais como processamento pós-translacional, ou por técnicas de modificação químicas que são bem conhecidas na técnica. Tais modifica- ções são bem descritas em textos básicos e, em monografias mais detalha- das, bem como em uma literatura de pesquisa volumosa.

Conforme aqui usado, o termo "polimorfismo de nucleotídeo simples (SNP)" significa variabilidade de nucleotídeo em uma posição sim- ples no genoma, em que duas bases alternativas ocorrem em freqüência apreciável (isto é >1%) na população humana. Um SNP pode ocorrer dentro de um gene, ou dentro de regiões intergênicas do genoma. Sondas de SNP, de acordo com a invenção, são oligonucleotídeos que são complementares a um SNP, e sua(s) sequência(s) de ácido nucléico de flanqueamento.

Conforme aqui usado, o termo "indivíduo" significa que preferi- velmente o indivíduo é um mamífero, tal como um humano, mas pode tam- bém ser um animal, por exemplo, animais domésticos (por exemplo, cães, gatos e similares), animais de fazenda (por exemplo, vacas, ovelhas, porcos, cavalos e similares), e animais de laboratório (por exemplo, macaco cyno- molgus, ratos, camundongos, porquinhos-da-índia, e similares).

Conforme aqui usado, a administração de um agente ou fármaco a um indivíduo ou paciente inclui autoadministração e a administração por outro. É também para ser apreciado que os vários modos de tratamento ou prevenção das condições médicas conforme descritos são pretendidos para significarem "substancial", que inclui total, mas também menos do que tra- tamento ou prevenção total, e no qual algum resultado biologicamente ou medicamento relevante é alcançado.

Medicina Antes Mencionada. Em um aspecto, a presente inven- ção pertence ao campo de medicina antes mencionada em que ensaios di- agnósticos, ensaios prognósticos, ensaios clínicos farmacogenéticos e de monitoramento são usados para propostas prognósticas (ditas antes) para, desse modo, diagnosticar e tratar um indivíduo profilaticamente. Consequen- temente, um aspecto da presente invenção se refere a ensaios diagnósticos para determinação de proteína biomarcadora e/ou expressão de ácido nu- cléico (por exemplo, proteína MUT-1 a MUT-25 ou ácido nucléico) de uma amostra (por exemplo, sangue, soro, células, tecidos) para, desse modo, determinar se um indivíduo está apto a converter de MCI a AD.

Outro aspecto da invenção pertence ao monitoramento da influ- ência de agentes (por exemplo, fármacos, compostos) na expressão ou ati- vidade de biomarcador em ensaios clínicos conforme descrito em detalhes adicionais nas seções seguintes.

Um método exemplar para detecção da presença ou ausência de proteínas biomarcadoras ou genes da invenção em uma amostra envolve obtenção de uma amostra de um indivíduo de teste e contato da amostra com um composto ou um agente capaz de detectar a proteína ou ácido nu- cléico (por exemplo, mRNA, DNA genômico) que codifica a proteína biomar- cadora tal que a presença da proteína biomarcadora ou ácido nucléico é de- tectada na amostra. Um agente preferido para detecção de mRNA ou DNA genômico correspondente a um gene biomarcador ou proteína da invenção é uma sonda de ácido nucléico rotulada capaz de hibridizar-se a um mRNA ou DNA genômico da invenção. Sondas adequadas nos ensaios diagnósticos da invenção são aqui descritas.

Um agente preferido para detecção de proteína biomarcadora é um anticorpo capaz de se ligar à proteína biomarcadora, preferivelmente um anticorpo com um rótulo detectável. Anticorpos podem ser policlonais, ou, mais preferivelmente, monoclonais. Um anticorpo intacto, ou um fragmento deste (por exemplo, Fab ou F(ab')2) pode ser usado. O termo "rotulado", com relação à sonda ou anticorpo, é pretendido para envolver rotulação dire- ta da sonda ou anticorpo por acoplamento (isto é fisicamente se ligando) a uma substância detectável à sonda ou anticorpo, bem como rotulação indire- ta da sonda ou anticorpo por reatividade com outro reagente que é direta- mente rotulado. Exemplos de rotulação indireta incluem detecção de um an- ticorpo primário usando-se anticorpo secundário fluorescentemente rotulado e rotulação terminal de uma sonda de DNA com biotin, tal que ela pode ser detectada com streptavidin fluorescentemente rotulada.

O termo "amostra" é pretendido para incluir tecidos, células e fluidos biológicos isolados de um indivíduo, bem como tecidos, células e flui- dos presentes no interior de um indivíduo. Isto é, o método de detecção da invenção pode ser usado para detectar mRNA biomarcador, proteína, ou DNA genômico em uma amostra in vitro, bem como in vivo. Por exemplo, técnicas in vitro para a detecção de mRNA biomarcador incluem hibridiza- ções de Northern e hibridizações in situ. Técnicas in vitro para detecção de proteína biomarcadora incluem ensaios imunoabsorventes ligados à enzima (ELISAs), manchas de Western, imunoprecipitações e imunofluorescência. Técnicas in vitro para detecção de DNA genômico biomarcador incluem hi- bridizações de Southern. Além disso, técnicas in vivo para detecção de pro- teína biomarcadora incluem introdução, em um indivíduo, de um anticorpo antibiomarcador rotulado. Por exemplo, o anticorpo pode ser rotulado com um biomarcador radioativo cuja presença e localização em um indivíduo po- de ser detectada por técnicas de imagem padrões.

Em uma concretização, a amostra contém moléculas de proteína a partir do indivíduo de teste. Alternativamente, a amostra pode conter molé- culas de mRNA a partir do indivíduo de teste, ou moléculas de DNA genômi- co a partir do indivíduo de teste. Uma amostra preferida é uma amostra de soro isolada por um meio convencional de um indivíduo.

Os métodos adicionalmente envolvem obtenção de uma amostra de controle (por exemplo, amostra de um indivíduo sem demência não mos- trando sinal de AD) de um indivíduo de controle, contato da amostra de con- trole com um composto ou agente capaz de detectar proteína biomarcadora, mRNA, ou DNA genômico, tal que a presença de proteína biomarcadora, mRNA ou DNA genômico é detectada na amostra, e comparando a presen- ça de proteína biomarcadora, mRNA ou DNA genômico na amostra de con- trole com a presença de proteína biomarcadora, mRNA ou DNA genômico na amostra de teste.

Os métodos de diagnóstico aqui descritos podem adicionalmente serem utilizados para identificar indivíduos tendo, ou em risco de desenvol- ver uma doença ou distúrbio associado com expressão ou atividade de bio- marcador aberrante (isto é, tendo uma ou mais das mutações associadas à AD/genes da invenção). Conforme aqui usado, o termo "aberrante" inclui uma expressão ou atividade de biomarcador que se desvia da expressão ou atividade de biomarcador tipo selvagem. Expressão ou atividade aberrante inclui expressão ou atividade aumentada ou diminuída, bem como expressão ou atividade que não segue o modelo de desenvolvimento tipo selvagem de expressão, ou o modelo subcelular de expressão. Por exemplo, expressão ou atividade de biomarcador aberrante é pretendido incluir os casos em que uma mutação no gene biomarcador a ser subexpressa ou sobre-expressa, e situações em que tais mutações resultam em uma proteína biomarcadora não-funcional, ou uma proteína que não funciona em um modo tipo selva- gem, por exemplo, uma proteína que não interage com um Iigante de bio- marcador, ou uma que interage com um Iigante de não-proteína biomarcado- ra.

Além disso, os ensaios de prognóstico aqui descritos podem ser usados para determinar se a um indivíduo pode ser administrado um agente (por exemplo, um agonístico, antagonístico, peptidomimético, proteína, pep- tídeo, ácido nucléico, molécula pequena, ou outro candidato de fármaco), para reduzir o risco do começo ou progressão de demência, por exemplo, AD. Desse modo, a presente invenção proporciona métodos para determinar se um indivíduo pode ser efetivamente tratado com um agente para um dis- túrbio associado com expressão ou atividade de gene aumentada ou diminu- ída de uma ou mais das mutações associadas à AD/genes da invenção. O monitoramento da influência de agentes (por exemplo, fárma-

cos) na expressão ou atividade de genes pode ser aplicado não somente na classificação básica de fármaco, mas também em ensaios clínicos. Por e- xemplo, a eficiência de um agente determinada por um ensaio de classifica- ção conforme aqui descrito para modular (isto é, aumentar ou diminuir) ex- pressão de gene biomarcador, níveis de proteína, ou atividade regulada, po- de ser monitorada em ensaios clínicos de indivíduos que exibem Doença de Alzheimer ou sintomas relacionados à MCI pelo exame da transferência mo- lecular, e quaisquer mudanças na assinatura molecular durante tratamento com um agente.

Por exemplo, e não por meio de limitação, genes e suas proteí-

nas codificadas que são modulados em células pelo tratamento com um a- gente (por exemplo, composto, fármaco ou molécula pequena) que modulam a atividade do gene podem ser identificados. Em um ensaio clínico, as célu- las podem ser isoladas e o RNA preparado e analisado para os neveis de expressão de genes implicados associados à demência. Os níveis de ex- pressão de gene (por exemplo, uma expressão de modelo de gene) podem ser quantificados por análise de mancha de northern ou RT-PCR, conforme descrito aqui, ou, alternativamente, pela medição da quantidade de proteína produzida, por um dos métodos conforme aqui descrito. Desse modo, o mo- delo de expressão de gene pode servir como uma assinatura molecular, in- dicativa da resposta fisiológica das células ao agente. Consequentemente, este estado de resposta pode ser determinado antes, e em vários pontos durante tratamento do indivíduo com o agente.

Em uma concretização preferida, a presente invenção propor- ciona um método para monitoramento da eficiência de tratamento de um indivíduo com um agente (por exemplo, um agonístico, antagonista, pepti- domimético, proteína, peptídeo, ácido nucléico, molécula pequena, ou outro fármaco candidato identificado por ensaios de classificação aqui descritos), incluindo as etapas de (i) obtenção de uma amostra de pré-administração de um indivíduo antes da administração do agente; (ii) detecção do nível de ex- pressão de um gene ou combinação de genes, a proteína codificada pelos genes, mRNA, ou DNA genômico na amostra de pós-administração; (iii) ob- tenção de uma ou mais amostras de pós-administração do indivíduo; (iv) detecção do nível de expressão ou atividade da proteína biomarcadora, mRNA, ou DNA genômico nas amostras de pós-administração; (v) compara- ção do nível de expressão ou atividade da proteína biomarcadora, mRNA, ou DNA genômico na amostra de pré-administração com o um gene ou combi- nação de genes, a proteína codificada pelos genes, mRNA, ou DNA genômi- co na amostra ou amostras de pós-administração; e (vi) alteração da admi- nistração do agente ao indivíduo consequentemente. Por exemplo, adminis- tração aumentada do agente pode ser desejável para aumentar a expressão ou atividade dos genes a níveis mais baixos, isto é, para aumentar a eficiên- cia do agente proteger contra o começo ou progressão de AD. Alternativa- mente, administração diminuída do agente pode ser desejável para aumen- tar a expressão ou atividade do biomarcador a níveis mais baixos do que detectados, isto é, para diminuir a eficiência do agente, por exemplo, para evitar toxicidade. De acordo com tal concretização, expressão de gene ou atividade pode ser usada como um indicador da eficiência de um agente, mesmo na ausência de uma resposta fenotípica observável. Identificação e Caracterização de Variação de Seqüência de Gene. Devido a seu predomínio e natureza difundida, SNPs têm o potencial de ser ferramentas importantes para localização de genes que são envolvi- dos em condições de doença humana. Ver, por exemplo, Wang et ai, Scien- ce 280: 1077-1082 (1998). É aumentadamente claro que o risco de desen- volver muitos distúrbios comuns e o metabolismo de medicações usadas para tratar estas condições são substancialmente influenciados por varia- ções genômicas, embora os efeitos de qualquer uma variante possam ser pequenos.

Um SNP é referido para ser "aléiico" em que devido à existência do polimorfismo, alguns membros de uma espécie pode ter uma seqüência não-mudada (isto é, o alelo original), pelo que outros membros podem ter uma seqüência mudada (isto é, a variante ou alelo mutante).

Uma associação entre um SNP e um fenótipo particular não in- dica ou requer necessariamente que o SNP seja causativo do fenótipo. De fato, a associação pode meramente ser devido à proximidade do genoma entre um SNP e aqueles fatores genéticos atualmente responsáveis por um dado fenótipo, tal que o SNP e referidos fatores genéticos estão proxima- mente ligados. Isto é, um SNP pode estar em desequilíbrio de ligação ("LD") com a variante funcional "verdadeira". LD (a.k.a., associação alélica) existe quando alelos em duas localizações distintas do genome estão mais alta- mente associados do que esperado. Desse modo, um SNP pode servir como um marcador do que tem valor em virtude de sua proximidade a uma muta- ção que causa um fenótipo particular.

Na descrição dos locais polimórficos da invenção, referência é feita ao trançado de sentido do gene por conveniência. Conforme reconheci- do por aquele versado na técnica, contudo, moléculas de ácido nucléico con- tendo o gene podem ser moléculas de trançado duplo complementares e, desse modo, referência a um local particular no trançado de sentido se refe- re, bem como ao local correspondente no trançado de anti-sentido comple- mentar. Isto é, referência pode ser feita ao mesmo local polimórfico no tran- çado, e um oligonucleotídeo pode ser designado para hibridizar especifica- mente para qualquer trançado em uma região alvo contendo o local polimór- fico. Desse modo, a invenção também inclui polinucleotídeos de trançado duplo que são complementares ao trançado de sentido das variantes genô- micas aqui descritas.

Identificação e Caracterização de SNPs. Muitas técnicas diferen- tes podem ser usadas para identificar e caracterizar SNPs, incluindo polimor- fismo de conformação de trançado duplo (SSCP) análise heteroduplex por cromatografia líquida de alto desempenho de desnaturação (DHPLC) e se- quenciamento de DNA direto e métodos computacionais. Shi et al., Clin. Chem. 47:164-172 (2001). Existe uma abundância de informação de se- qüência nas bases de dados públicas.

Os métodos de digitação de SNP mais comuns atualmente in- cluem hibridização, extensão de iniciador, e métodos de clivagem. Cada um destes métodos deve estar ligado a um sistema de detecção apropriado. Tecnologias de detecção incluem polarização fluorescente (Chan et al., Ge- nome Res. 9:492-499 (1999)), detecção luminométrica de liberação de piro- fosfato (pirossequenciamento) (Ahmadiian et al., Anal. Biochem. 280:103-10 (2000)), ensaios de clivagem baseados em transferência de energia de res- sonância de fluorescência (FRET), DHPLC, e espectometria de massa (Shi, Clin. Chem. 47:164-172 (2001); Patente dos Estados Unidos N2 6.300.076 B1). Outros métodos de detecção e caracterização de SNPs são aqueles descritos nas Patentes dos Estados Unidos N-s 6.297.018 e 6.300.063.

Os polimorfismos podem também serem detectados usando-se produtos comercialmente disponíveis, tais como tecnologia INVADER® (dis- ponível de Third Wave Technologies Inc. Madison, Wisconsin, USA). Neste ensaio, um oligonucleotídeo "invasor" à montante específico e uma sonda à jusante sobrepondo-se parcialmente junta formam uma estrutura específica quando ligadas a gabarito de DNA complementar. Esta estrutura é reconhe- cida e cortada em um local específico pela enzima de Clivagem, resultando na liberação na aba 5' do oligonucleotídeo da sonda. Este fragmento então serve como o oligonucleotídeo "invasor" com relação a alvos secundários sintéticos e sondas de sinal fluorescentemente rotuladas secundárias conti- das na mistura de reação. Ver também, Ryan D et al., Molecular Diagnosis 4(2): 135-144 (1999) e Lyamichev V et al., Nature Biotechnology 17: 292-296 (1999), ver também Patentes dos Estados Unidos Nas 5.846.717 e 6.001.567.

A identidade de polimorfismos pode também ser determinada

usando-se uma técnica de detecção em desacordo incluindo, mas não limi- tada a, o método de proteção de RNase usando-se ribosondas (Winter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:7575 (1985); Meyers et al., Science 230:1242 (1985)), e proteínas que reconhecem desequiparações de nucleotídeo, tal como a proteína E. coli mutS (Modrich P, Ann Rev Genet 25:229-253 (1991)). Alternativamente, alelos variantes podem ser identificados por aná- lise de polimorfismo de conformação de trançado simples (SSCP) (Orita et al., Genomics 5:874-879 (1989); Humphries et al., in Molecular Diagnosis of Genetic Doenças, R. Elles, ed., pp. 321-340 (1996)), ou eletroforese de gel de gradiente de desnaturação (DGGE) (Wartell et al., NucL Acids. Res. 18:2699-2706 (1990); Sheffield et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:232-236 (1989)). Um método de extensão de primer mediado por polimerase pode também ser usado para identificar os polimorfismos. Vários tais métodos foram descritos na literatura de patente e científica, e incluem o método "Genetic Bit Analysis" (WO 92/15712) e a análise de bit genético mediado por ligase/polimerase (Patente dos Estados Unidos Ns 5.679.524). Métodos relacionados são descritos em WO 91/02087, WO 90/09455, WO 95/17676, e Patente dos Estados Unidos Nes 5.302.509 e 5.945.283. Iniciadores pro- longados contendo um polimorfismo podem ser detectados por espectrome- tria de massa conforme descrito na Patente dos Estados Unidos N- 5.605.798. Outro método de prolongamento de iniciador é PCR de alelo es- pecífico (Ruafio et al., NucL Acids. Res. 17:8392 (1989); Ruafio et al., NucL Acids. Res. 19: 6877-6882 (1991); WO 93/22456; Turki et al., J. Clin. Invest. 95:1635-1641 (1995)). Em adição, polimórficos locais múltiplos podem ser investigados por amplificação simultaneamente de regiões múltiplas do ácido nucléico usando-se conjuntos de iniciadores específicos de alelo conforme descrito no pedido de patente PCT WO 89/10414. Haplotipagem e Genotipagem de Oligonucleotídeos. A invenção proporciona métodos e composições para haplotipagem e/ou genotipagem do gene em um indivíduo. Conforme aqui usado, os termos "genótipo" e "ha- plótipo" significam o genótipo ou haplótipo contendo o par de nucleotídeos ou nucleotídeo, respectivamente, que está presente em uma ou mais dos polimórficos locais aqui descritos, e podem opcionalmente também incluir o par de nucleotídeos ou nucleotídeo presentes em um ou mais dos polimórfi- cos locais adicionais no gene. Os polimórficos locais adicionais podem ser atualmente polimórficos locais ou locais conhecidos que são subseqüente- mente descobertos.

As composições da invenção contêm sondas de oligonucleotí- deo e iniciadores designados para hibridizar especificamente para uma ou mais regiões alvos contendo, ou que são adjacentes a, um local polimórfico. As composições de oligonucleotídeo da invenção são úteis nos métodos pa- ra genotipagem e/ou haplotipagem de um gene em um indivíduo. Os méto- dos e composições para estabelecer o genótipo ou haplótipo de um indiví- duo nos locais polimórficos aqui descritos são úteis para estudar o efeito dos polimorfismos na etiologia de doenças afetadas pela expressão e função da proteína, estudando a eficácia que objetivam fármacos, prognosticando a susceptibilidade do indivíduo a doenças afetadas pela expressão e função da proteína, e prognosticando a receptividade do indivíduo a fármacos que objetivam o produto de gene.

A genotipagem de oligonucleotídeos da invenção pode ser imo- bilizada ou sintetizada em uma superfície sólida tal como um microchip, go- ta, ou lâmina de vidro. Ver, por exemplo, WO 98/20020 e WO 98/20019.

A genotipagem de oligonucleotídeos pode hibridizar a uma regi- ão alvo localizada um a vários nucleotídeos à jusante de um dos locais poli- mórficos aqui identificados. Tais oligonucleotídeos são úteis nos métodos de prolongamento de iniciador mediado por polimerase para detectar um dos polimorfismos aqui descritos e, portanto, tais genotipagens de oligonucleotí- deos são referidas aqui como "oligonucleotídeos de prolongamento de inici- ador". Método de Genotipagem Direta da Invenção. Um método de ge- notipagem da invenção pode envolver isolamento de um indivíduo de uma mistura de ácido nucléico compreendendo as duas cópias de um gene de interesse ou fragmento deste, e determinação da identidade do par de nu- cleotídeos em um ou mais dos locais polimórficos nas duas cópias. Confor- me será prontamente compreendido pelo versado na técnica, as duas "có- pias" de um gene em um indivíduo podem ser o mesmo alelo, ou podem ser alelos diferentes. Em uma concretização particularmente preferida, o método de genotipagem compreende determinar a identidade do par de nucleotídeos em cada local polimórfico. Tipicamente, a mistura de ácido nucléico é isolada de uma amostra biológica tomada do indivíduo, tal como uma amostra de sangue ou amostra de tecido. Amostras de tecido adequadas incluem san- gue total, esperma, saliva, lágrimas, urina, material fecal, suor, resíduos bu- cais, pele e cabelo.

Método de Haplotipagem Direta da Invenção. Um método de

haplotipagem da invenção pode inciuir isolar de um indivíduo uma molécula de ácido nucléico contendo somente uma das duas cópias de um gene de interesse, ou um fragmento deste, e determinar a identidade do nucleotídeo em um ou mias dos locais polimórficos naquela cópia. Métodos de haploti- pagem direta incluem, por exemplo, tecnologia CLASPER System™ (Paten- te dos Estados Unidos N2 5.866.404), ou PCR de faixa ampla de alelo espe- cífico (Michalotos-Beloin et al., Nucl. Acids. Res. 24: 4841-4843 (1996)). O ácido nucléico pode ser isolado usando-se qualquer método capaz de sepa- rar as duas cópias do gene ou fragmento. Conforme será prontamente apre- ciado por aquele versado na técnica, qualquer clone individual proporcionará somente informação de haplótipo em uma das duas cópias de gene presen- tes em um indivíduo. Em uma concretização, um par de haplótipos é deter- minado para um indivíduo pela identificação da seqüência em fase de nucle- otídeos em um ou mais dos locais polimórficos em cada cópia do gene que está presente no indivíduo. Em uma concretização preferida, o método de haplotipagem compreende identificar a seqüência em fase de nucleotídeos em cada local polimórfico em cada cópia do gene. Em ambos métodos de genotipagem e haplotipagem, a identida- de de um nucleotídeo (ou par de nucleotídeos) em um local polimórfico pode ser determinada pela amplificação de regiões alvos contendo os locais poli- mórficos diretamente de uma ou ambas cópias do gene, ou fragmentos des- tes, e sequenciamento das regiões amplificadas por métodos convencionais. O genótipo ou haplótipo para o gene de um indivíduo pode também ser de- terminado por hibridização de uma amostra nucléica contendo uma ou am- bas cópias do gene a séries e subséries de ácido nucléico, tal como descrito em WO 95/11995.

Método de Genotipagem Indireta usando Polimórficos Locais no

Desequilíbrio de Ligação com um Polimorfismo Alvo. Em adição, a identida- de dos alelos presentes em qualquer dos locais polimórficos da invenção pode ser indiretamente determinado por genotipagem de outros locais poli- mórficos em desequilíbrio de ligação com aqueles locais de interesse. Con- forme descrito acima, dois locais são referidos por estarem em desequilíbrio de ligação se a presença ue uma variante particular em um local é indicativa da presença de outra variante em um segundo local. Stevens JC, Moi Diag. 4: 309-317 (1999). Locais polimórficos em desequilíbrio de ligação com os locais polimórficos da invenção podem estar localizados em regiões do mes- mo gene, ou em outras regiões genômicas.

Amplificação de uma Região de Gene Alvo. As regiões alvos podem ser amplificadas usando-se qualquer método de amplificação dire- cionada de oligonucleotídeo, incluindo, mas não limitado a, reação de cadeia de polimerase (PCR). (Patente dos Estados Unidos N2 4.965.188), reação de cadeia de Iigase (LCR) (Barany et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:189- 193 (1991); pedido de patente PCT publicado WO 90/01069), e ensaio de ligação de oligonucleotídeo (OLA) (Landegren et ai, Science 241: 1077- 1080 (1988)). Oligonucleotídeos úteis como iniciadores ou sondas em tais métodos devem hibridizar especificamente a uma região do ácido nucléico que contém ou é adjacente ao local polimórfico. Tipicamente, os oligonucleo- tídeos estão entre 10 e 35 nucleotídeos em comprimento e, preferivelmente, entre 15 e 30 nucleotídeos em comprimento. Mais preferivelmente, os oligo- nucleotídeos são 20 a 25 nucleotídeos de comprimento. O comprimento exa- to do oligonucleotídeo dependerá de muitos fatores que são rotineiramente considerados e praticados pelo versado na técnica.

Outros procedimentos de amplificação de ácido nucléico conhe- cidos podem ser usados para amplificar a região alvo incluindo sistemas de amplificação baseados em transcrição (Patente dos Estados Unidos Ns 5.130.238; EP 329.822; Patente dos Estados Unidos N2 5.169.766, pedido de patente PCT publicado WO 89/06700) e métodos isotérmicos (Walker et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:392-396 (1992)).

Hibridização de Oligonucleotídeo Específico de Alelo a um Gene Alvo. Um polimorfismo na região alvo pode ser ensaiado antes ou após am- plificação usando-se um de vários métodos baseados em hibridização co- nhecidos na técnica. Tipicamente, oligonucleotídeos específicos de alelo são utilizados na realização de tais métodos. Os oligonucleotídeos específicos de alelo podem ser usados como pares de sondas diferentemente rotulados, com um membro do par mostrando urna equiparação perfeita para uma vari- ante de uma seqüência alvo, e o outro membro mostrando uma equiparação perfeita a uma variante diferente. Em algumas concretizações, mais do que um local polimórfico pode ser detectado uma vez usando-se um conjunto de oligonucleotídeos específicos de alelo, ou pares de oligonucleotídeos. Prefe- rivelmente, os membros do conjunto têm temperaturas de fusão dentro de 5°C, e, mais preferivelmente, dentro de 2°C, um do outro, quando hibridiza- ção a cada um dos locais polimórficos é detectada.

A hibridização de um oligonucleotídeo específico de alelo a um polinucleotídeo alvo pode ser realizada com ambas entidades em solução, ou tal hibridização pode ser realizada quando ou o oligonucleotídeo ou o po- linucleotídeo alvo é covalentemente ou não-covalentemente fixado a um produto sólido. A fixação pode ser mediada, por exemplo, por interações de anticorpo-antígeno, poli-L-Lys, streptavidin ou avidin-biotin, pontes de sal, interações hidrofóbicas, ligações químicas, reticulação de UV, cozedura, etc. O oligonucleotídeo específico de alelo pode ser sintetizado diretamente no suporte sólido, ou fixado ao suporte sólido subsequente a síntese. Suportes sólidos adequados para uso nos métodos de detecção da invenção incluem substratos produzidos de silício, vidro, plástico, papel, e similares, que po- dem ser formados, por exemplo, em cavidades (como em placas de 96 cavi- dades), lâminas, chapas, membranas, fibras, aparas, pratos e gotas. O su- porte sólido pode ser tratado, revestido ou derivatizado para facilitar a imobi- lização do oligonucleotídeo específico de alelo ou ácido nucléico alvo.

Determinação de Genótipos e Haplótipos de População e Corre- lação dos mesmos com um Traço. A invenção proporciona um método para determinação da freqüência de um genótipo ou haplótipo em uma popula- ção. O método compreende determinação do genótipo ou todo haplótipo pa- ra um gene presente em cada membro da população, no qual o genótipo ou haplótipo compreende o par de nucleotídeo ou nucleotídeo detectado em um ou mais dos locais polimórficos no gene, e calculando a freqüência na qual o genótipo ou haplótipo é encontrado na população. A população pode ser uma população de referência, uma população de família, uma população de mesmo sexo, ou uma população de traço (por exemplo, um grupo de indiví- duos exibindo um traço de interesse, tal como uma condição médica ou res- posta a um tratamento terapêutico).

Em outro aspecto da invenção, os dados de freqüência para ge- nótipos e/ou haplótipos encontrados em uma população de referência são usados em um método para identificação de uma associação entre um traço e um genótipo ou um haplótipo. O traço pode ser qualquer fenótipo detectá- vel, incluindo, mas não limitado a, susceptibilidade a uma doença ou respos- ta a um tratamento. O método envolve obtenção de dados na freqüência dos genótipos ou haplótipos de interesse em uma população de referência, e comparando os dados à freqüência dos genótipos ou haplótipos em uma população que exibe o traço. Os dados de freqüência para um ou ambos das populações de referência e traço podem ser obtidos por genotipagem ou haplotipagem de cada indivíduo nas populações usando um dos métodos descritos acima. Os haplótipos para a população de traço podem ser deter- minados diretamente ou, alternativamente, pelo genótipo dito antes para a- proximação de haplótipo descrita acima. Os dados de freqüência para as populações de referência e/ou traço são obtidos pela avaliação de dados de freqüência anteriormente de- terminados, que podem estar na forma escrita ou eletrônica. Por exemplo, os dados de freqüência podem estar presentes em uma base de dados que seja acessível a um computador. Uma vez que os dados de freqüência se- jam obtidos, as freqüências dos genótipos ou haplótipos de interesse nas populações de referência e de traço são comparadas.

Quando os polimorfismos estão sendo analisados, um cálculo pode ser realizado para corrigir uma associação significante que pode ser encontrada por chance. Para métodos estatísticos úteis nos métodos da in- venção, ver Statistical Methods in Biology, 3rd edition, Bailey NTJ, (Cambrid- ge Univ. Press, 1997); Watermoan MS, Introduction to Computational Bio- logy (CRC Press, 2000) e Bioinformatics, Baxevanis AD & Ouellette BFF edi- tors (John Wiley & Sons, Inc., 2001).

Em outra concretização, os dados de freqüência de haplótipo para grupos diferentes são examinados para determinar se eles são consis- tentes com o equilíbrio de Hardy-Weinberg. D.L. Hartl et ai, Principies of Population Genomics, 3rd Ed. (Sinauer Associates, Sunderland, MA, 1997).

Em outra concretização, análise estatística é realizada pelo uso de testes padrões ANOVA com uma correção de Bonferroni ou um método de auto- carregamento que simula a correlação genótipo fenótipo muitas vezes e calcula um valor de significância. ANOVA é usado para testar hipótese sobre se uma resposta variável é causada por ou se correlaciona com um ou mais traços ou variáveis que podem ser medidas. LD Fisher & G vanBelle, Biostatistics: A Methodology for the Health Sciences, Ch. 10 (Wiley-lnterscience, New York, 1993).

Em uma concretização para prognosticar um par de haplótipo, a análise inclui uma etapa de transferência, conforme se segue: Primeiro, cada um dos possíveis pares de haplótipo é comparado aos pares de haplótipo na população de referência. Geralmente, somente um dos pares de haplótipo na população de referência se equipara a um possível par de haplótipo e este par é transferido para o indivíduo. Ocasionalmente, somente um hapló- tipo representado nos pares de haplótipo de referência é consistente com um possível par de haplótipo para um indivíduo, e, em tais casos, o indivíduo é transferido para um par de haplótipo contendo este haplótipo conhecido e um novo haplótipo derivado pela subtração do haplótipo conhecido a partir do par de haplótipo possível.

Em outra concretização, um genótipo ou haplótipo detectável que está em desequilíbrio de ligação com um genótipo ou haplótipo de inte- resse pode ser usado como um marcador substituto. Um genótipo que está em desequilíbrio de ligação com outro genótipo é indicado onde um genótipo ou haplótipo particular para um dado gene é mais freqüente na população que também demonstra o marcador substituto potencial do que na popula- ção de referência. Se a freqüência é estatisticamente significante, então o genótipo marcador é dito antes daquele genótipo ou haplótipo, e pode ser usada como um marcador substituto.

Outro método para encontrar correlações entre teor de haplótipo e respostas clínicas usa modelos ditos antes baseados nos algoritmos de otimização de minimização de erro, um dos quais é um algoritmo genético. Ver, R Judson, "Genetic Algorithms e Their Uses in Chemistry" in Reviews in Computational Chemistry, Ch. 10, KB Lipkowitz & DB Boyd, eds. (VCH Pu- blishers, New York, 1997) pp. 1-73. Recozimento simulado (Press et a/., Numérica! Recipes in C: The Art of Scientific Computing, Ch). 10 (Cambridge University Press, Cambridge, 1992), redes neurais (E Rich & K Knight1 Artifi- cial Intelligence, 2nd Edition, Ch). 10 (McGraw-Hill, New York, 1991), méto- dos de declínio de gradiente padrões (Press et al., supra Ch. 10), ou outras aproximações de otimização global ou local (ver discussão em Judson, su- pra) podem também serem usados.

Correlação de Genótipo ou Haplótipo Objeto para Resposta de Tratamento. Em concretizações preferidas, o traço é susceptibilidade a uma doença, severidade de uma doença, o estágio de uma doença ou resposta a um fármaco. Tais métodos têm aplicabilidade no desenvolvimento de testes de diagnóstico e tratamento terapêuticos para todas aplicações farmacoge- néticas onde existe o potencial para uma associação entre um genótipo e um resultado de tratamento, incluindo medições de eficiência, medições far- macocinéticas e medições de efeito colateral.

Em outra concretização preferida, o traço de interesse é uma resposta clínica exibida por um paciente a algum tratamento terapêutico, por exemplo, resposta a um fármaco objetivado, ou a um tratamento terapêutico para uma condição médica.

Para deduzir uma correlação entre uma resposta clínica a um tratamento e um genótipo ou haplótipo, dados de genótipo ou haplótipo são obtidos nas respostas clínicas exibidas por uma população de indivíduos que receberam o tratamento, daqui por diante a "população clínica". Estes dados clínicos podem ser obtidos pela análise dos resultados de um ensaio clínico que já foi efetuado, e/ou pelo desenvolvimento e efetuação de um ou mais novos ensaios clínicos.

Os indivíduos incluídos na população clínica são usualmente graduados para a existência da condição médica de interesse. Esta gradua- ção de pacientes potenciais pode empregar um exame físico padrão ou um ou mais testes de laboratório. Alternativamente, a graduação de pacientes pode usar haplotipagem para situações onde existe uma forte correlação entre par de haplótipo e susceptibilidade ou severidade de doença.

O tratamento terapêutico de interesse é administrado a cada in- divíduo na população de ensaio, e cada resposta do indivíduo ao tratamento é medida usando-se um ou mais critérios predeterminados. É contemplado que em muitos casos, a população de ensaio exibirá uma faixa de respostas e que o investigador escolherá o número de grupos de respostas (por exem- plo, baixo, médio, alto) composto pelas várias respostas. Em adição, o gene para cada indivíduo na população de ensaio é genotipado e/ou haplotipado, que pode ser feito antes ou após administração do tratamento.

Estes resultados são então analisados para determinar se qual- quer variação observada na resposta clínica entre grupos de polimorfismo é estatisticamente significante. Métodos de análise estatística, que podem ser usados, são descritos em L.D. Fisher & G. vanBelle, Biostatistics: A Metho- dology for the Health Sciences (Wiley-lnterscience, New York, 1993). Esta análise pode também incluir um cálculo de regressão do qual locais polimór- ficos no gene contribuem mais significantemente às diferenças no fenótipo.

Após ambos dados clínicos e de polimorfismo foram obtidos, correlações entre resposta de indivíduo e teor de genótipo ou haplótipo são criadas. Correlações podem ser produzidas de vários modos. Em um méto- do, os indivíduos são agrupados por seu genótipo ou haplótipo (ou par de haplótipo) (também referido como um grupo de polimorfismo), e, em segui- da, os desvios médios e padrão das respostas clínicas exibidos pelos mem- bros de cada grupo de polimorfismo são calculados.

A partir da análise acima descrita, o versado na técnica que di- agnostica a resposta clínica como uma função de teor de genótipo ou hapló- tipo pode prontamente construir um modelo matemático. A identificação de uma associação entre uma resposta clínica e um genótipo ou haplótipo (ou par de haplótipo) para o gene pode ser a base para desenvolvimento de um método diagnóstico para determinar aqueles indivíduos que responderão ou não ao tratamento, ou, alternativamente, responderão a um nível inferior e, desse modo, podem requerer mais tratamento, isto é, uma dose maior de um fármaco. O método diagnóstico pode tomar uma de várias formas: por exemplo, um teste de DNA direto (isto é, genotipagem ou haplotipagem de um ou mais dos locais polimórficos no gene), um este sorológico, ou uma medição de exame físico. O único requerimento é que exista uma boa corre- lação entre os resultados do teste diagnóstico e o genótipo ou haplótipo sub- jacente. Em uma concretização preferida, este método diagnóstico usa o método de haplotipagem dito antes acima descrito.

Transferência de um Indivíduo a um Grupo de Genótipo. Con- forme um dos técnicos no assunto compreenderá, existe um certo grau de incerteza envolvido na efetuação desta determinação. Portanto, os desvios padrões dos níveis de grupo de controle seriam usados para produzir uma determinação probabilística, e os métodos desta invenção seriam aplicáveis sobre uma ampla faixa de probabilidade baseada nas determinações de grupo de genótipo. Desse modo, por exemplo, e não por meio de limitação, em uma concretização, se o nível medido da expressão de produtos de gene cai dentro de desvios padrões de 2,5 da média de qualquer dos grupos de controle, então aquele indivíduo pode ser transferido àquele grupo de genó- tipo. Em outra concretização, se o nível medido da expressão de produto de gene cai dentro de desvios padrões de 2,0 da média de qualquer dos grupos de controle, então aquele indivíduo pode ser transferido àquele grupo de genótipo. Em ainda outra concretização, se o nível medido da expressão de produto de gene cai dentro de desvios padrões de 1,5 da média de qualquer dos grupos de controle, então aquele indivíduo pode ser transferido àquele grupo de genótipo. Em ainda outra concretização, se o nível medido da ex- pressão de produto de gene é 1,0 ou menos dos desvios padrões da média de qualquer dos grupos de controle, então aquele indivíduo pode ser transfe- rido àquele grupo de genótipo.

Desse modo, este processo permite determinação, com vários graus de probabilidade, cujo grupo um indivíduo específico deve ser coloca- do em, e tal transferência para um grupo de genótipo então determinaria a categoria de risco na qual o indivíduo deve ser colocado.

Correlação entre Resposta Clínica e Genótipo ou Haplótipo. De modo a deduzir uma correlação entre resposta clínica a um tratamento e um genótipo ou haplótipo, é necessário obter-se dados nas respostas clínicas exibidas por uma população de indivíduos que recebeu o tratamento, daqui por diante a "população clínica." Este dado clínico pode ser obtido pela aná- lise dos resultados de um ensaio clínico que já foi efetuado, e/ou o dado clí- nico pode ser obtido pela delineação e efetuação de um ou mais novos en- saios clínicos.

Os níveis de controle padrões da expressão de produto de gene,

desse modo determinados nos grupos diferentes de genótipo ou haplótipo, seriam então comparados com o nível medido de uma expressão de produto de gene em um dado paciente. Esta expressão de produto de gene pode ser o mRNA característico associado com aquele grupo de genótipo particular, ou a expressão de polipeptídeo de produto de gene daquele grupo de genó- tipo ou haplótipo. O paciente pode então ser classificado ou transferido para um grupo de genótipo ou haplótipo particular baseado em quão similar os níveis medidos foram comparados aos níveis de controle para um dado gru- po.

Sistema de Computador para Armazenamento ou Amostragem de Dados de Polimorfismo. A invenção também proporciona um sistema de computador para armazenamento e amostragem de dados de polimorfismo determinados para o gene. O sistema de computador compreende uma uni- dade de processamento de computador, um mostrador, e uma base de da- dos contendo os dados de polimorfismo. Os dados de polimorfismo incluem os polimorfismos, os genótipos e os haplótipos identificados para um dado gene em uma população de referência. Em uma concretização preferida, o sistema de computador é capaz de produzir um mostrador descrevendo ha- plótipos organizados de acordo com seus relacionamentos evolutivos. Um computador pode implementar qualquer ou todas operações analíticas e ma- temáticas envolvidas na prática dos métodos da presente invenção. Em adi- ção, o computador pode executar um programa que gera visualizações (ou telas) descritas em um dispositivo mostrador, e com o qual o usuário pode interagir para visualizar e analisar grandes quantidades de informação rela- cionada ao gene e sua variação genômica, incluindo localização de cromos- somo, estrutura de gene, e família de gene, expressão de dados de gene, dados de polimorfismo, dados de seqüência genética, e dados clínicos de população (por exemplo, dados de origem etnogeográfica, respostas clíni- cas, genótipos, e haplótipos para uma ou mais populações). Os dados de polimorfismo aqui descritos podem ser armazenados como parte de uma base de dados relacionais (por exemplo, um exemplo de uma base de dados de Oracle, ou a conjunto de arquivos ASCII). Estes dados de polimorfismo podem ser armazenados no disco rígido do computador, ou podem, por e- xemplo, serem armazenados em um CD-ROM, ou em um ou mais outros dispositivo de armazenamento acessíveis pelo computador. Por exemplo, os dados podem ser armazenados em uma ou mais bases de dados em comu- nicação com o computador, via uma rede.

Diagnósticos Baseados em Ácido nucléico. Em outro aspecto, a invenção proporciona sondas de SNP1 que são úteis na classificação de in- divíduos de acordo com seus tipos de variação genética. As sondas de SNP, de acordo com a invenção, são oligonucleotídeos que discriminam entre SNPs em ensaios de discriminação alélica convencional. Em certas concre- tizações preferidas, os oligonucleotídeos de acordo com este aspecto da invenção são complementares a alelo do SNP e sua(s) sequência(s) de áci- do nucléico de flanqueamento, mas não para qualquer outro alelo do SNP, e sua(s) sequência(s) de ácido nucléico de flanqueamento. Oligonucleotídeos de acordo com esta concretização da invenção podem discriminar entre SNPs em vários modos. Por exemplo, sob condições de hibridização estrin- gentes, um oligonucleotídeo de comprimento apropriado hibridizará para um SNP, mas não para qualquer outro. O oligonucleotídeo pode ser rotulado usando-se um radiorótulo ou um rótulo molecular fluorescente. Alternativa- mente, um oligonucleotídeo de comprimento apropriado pode ser usado co- mo um iniciador para PCR1 no qual o nucleotídeo 3' terminal é complementar a um alelo contendo um SNP, mas não para qualquer outro alelo. Nesta con- cretização, a presença ou ausência de amplificação por PCR determina o haplótipo do SNP.

Os fragmentos genômicos e de cDNA da invenção compreen- dem pelo menos um local polimórfico identificado aqui, têm um comprimento de pelo menos 10 nucleotídeos, e podem variar até o comprimento total do gene. Preferivelmente, um fragmento de acordo com a presente invenção está entre 100 e 3000 nucleotídeos em comprimento, e, mais preferivelmen- te, entre 200 e 2000 nucleotídeos em comprimento, e, mais preferivelmente, entre 500 e 1000 nucleotídeos em comprimento. Kits da Invenção. A invenção proporciona kits de detecção de

ácido nucléico e polipeptídeo úteis para haplotipagem e/ou genotipagem do gene em um indivíduo. Tais kits são úteis para classificação de indivíduos para a proposta de classificação de indivíduos. Especificamente, a invenção envolve kits para detecção da presença de um polipeptídeo ou ácido nucléi- co correspondente a um marcador da invenção em uma amostra biológica, por exemplo, qualquer fluido corpóreo incluindo, mas não limitado a, soro, plasma, linfa, fluido cístico, urina, fluido cerebroespinhal, fluido ascites ou sangue, e incluindo amostras de biópsia de tecido do corpo. Por exemplo, o kit pode compreender um composto ou agente rotulado capaz de detectar um polipeptídeo ou um mRNA que codifica um polipeptídeo correspondente a um marcador da invenção em uma amostra biológica, e meios para deter- minar a quantidade do polipeptídeo ou mRNA na amostra, por exemplo, um anticorpo que se liga ao polipeptídeo, ou uma sonda de oligonucleotídeo que se liga ao DNA ou mRNA que codifica o polipeptídeo. Os kits podem tam- bém incluir instruções para interpretação dos resultados obtidos usando o kit.

Em outra concretização, a invenção proporciona um kit compre-

endendo pelo menos dois oligonucleotídeos de genotipagem acondicionados em recipientes separados. O kit pode também conter outros componentes, tais como tampão de hibridização (onde os oligonucleotídeos são para se- rem usados como uma sonda) acondicionado em um recipiente separado. Alternativamente, onde os oligonucleotídeos são para serem usados para amplificar uma região alvo, o kit pode conter, acondicionado em recipientes separados, uma polimerase e um tampão de reação otimizado para prolon- gamento de iniciador mediado pela polimerase, tal como no caso de PCR. Em uma concretização preferida, tal kit pode compreender adicionalmente um meio de coleta de amostra de DNA.

Para kits baseados em anticorpo, o kit pode compreender, por exemplo, (1) um primeiro anticorpo, por exemplo, fixado a um suporte sólido, que se liga a um polipeptídeo correspondente a um marcador ou a invenção; e, opcionalmente (2) um segundo anticorpo diferente que se liga a, ou ao polipeptídeo, ou ao primeiro anticorpo, e é conjugado a um rótulo detectável.

Para kits baseados em oligonucleotídeo, o kit pode compreen- der, por exemplo, (1) um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo detectavelmente rotulado, que hibridiza a uma seqüência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo correspondente a um marcador da invenção; ou (2) um par de iniciadores úteis para amplificação de uma molécula de ácido nucléico correspondente a um marcador da invenção.

O kit pode também compreender, por exemplo, um agente de tamponamento, um conservante, ou um agente de estabilização de proteína. O kit pode compreender adicionalmente componentes necessários para de- tecção do rótulo detectável, por exemplo, uma enzima ou um substrato. O kit pode também conter uma amostra de controle, ou uma série de amostras de controle, que pode ser ensaiada e comparada à amostra de teste. Cada componente do kit pode ser encerrado dentro de um recipiente individual, e todos dos vários recipientes podem estar dentro de um acondicionamento simples, junto com instruções para interpretação dos resultados dos ensaios realizados usando-se o kit. Seqüências de Ácido nucléico da Invenção. Em um aspecto, a

invenção compreende um ou mais polinucleotídeos isolados. A invenção também envolve variantes alélicas dos mesmos, isto é, formas alternativas que ocorrem naturalmente dos polinucleotídeos isolados que codificam poli- peptídeos mutantes que são idênticos, homólogos ou relacionados àqueles codificados pelos polinucleotídeos. Alternativamente, variantes que não o- correm naturalmente podem ser produzidas por técnicas de mutagênese, ou por técnicas de síntese direta bem conhecidas na técnica.

Consequentemente, seqüências de ácido nucléico capazes de hibridizar em baixa estringência com quaisquer seqüências de ácido nucléico que codificam polipeptídeo mutante da presente invenção são considerados estarem dentro do escopo da invenção. Condições de estringência padrões são bem caracterizadas nos textos de clonagem de biologia molecular pa- drão. Ver, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed., Sambrook, Fritsch, & Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); DNA Cloning, Volumes I e II, D.N. Glover, ed. (1985); Oligonucleotide Synthesis, M.J. Gait, ed. (1984); Nucleic Acid Hybridization, B.D. Hames & S.J. Higgins1 eds (1984).

Vetores de Expressão Recombinantes. Outro aspecto da inven- ção compreende vetores contendo uma ou mais seqüências de ácido nucléi- co que codificam um polipeptídeo mutante. Na prática da presente invenção, muitas técnicas convencionais em biologia molecular, microbiologia e DNA recombinante são usadas. Estas técnicas são bem conhecidas e são expia- nadas em, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Vols. I-IlI, Ausubel1 ed. (1997); Sambrook et aí., Molecular Cloning: A Laboratory Ma- nual, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I e II, Glover, Ed. (1985); Oligonucleotide Synthesis, Gait, Ed. (1984); Nucleic Acid Hibridization, Ha- mes & Higgins, Eds. (1985); Transcription and Translation, Hames & Higgins, Eds. (1984); Animal Cell Ctvlture1 Freshney1 ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press1 1986); Perbal1 A Praetieal Guide to Molecular Clo- ning·, the series Methods in Enzymology, (Academic Press1 Inc., 1984); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Miller & Calos, Eds. (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1987); e Methods in Enzymology, Vols. 154 e 155, Wu & Grossman, e Wu, Eds., respectivamente.

Para expressão recombinante de um ou mais dos polipeptídeos da invenção, o ácido nucléico contendo toda ou uma porção de seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo é inserido em um vetor de clona- gem apropriado, ou um vetor de expressão (isto é, um vetor que contém os elementos necessários para a transcrição e translação da seqüência de co- dificação de polipeptídeo inserida) por técnicas de DNA recombinante bem conhecidas na técnica.

No relatório descritivo, "plasmídeo" e "vetor" pode ser usado permutavelmente, visto que o plasmídeo é a forma mais comumente usada de vetor. Contudo, a invenção é pretendida para incluir tais outras formas de vetores de expressão que não são tecnicamente plasmídeos, tais como ve- tores virais (por exemplo, retrovírus defectivos de replicação, adenovírus e adeno-vírus associados), que servem funções equivalentes. Tais vetores virais permitem infecção de um indivíduo e expressão naquele indivíduo de um composto. Beckerefa/., Meth. Cell Biol. 43: 161-89 (1994). Dentro de um vetor de expressão recombinante, "operavelmente ligado" é pretendido para significar que a seqüência de nucleotídeo de interesse é ligada às seqüên- cias regulatórias em uma maneira que permite expressão da seqüência de nucleotídeo (por exemplo, em um sistema de transcrição/translação in vitro, ou em uma célula hospedeira quando o vetor é introduzido na célula hospe- deira). O termo "seqüência regulatória" é pretendido para incluir promotores, intensificadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação). Tais seqüências regulatórias são descritas, por exemplo, em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods In Enzymo- Iogy (Academic Press, San Diego, Calif., 1990). Seqüências regulatórias in- cluem aquelas que direcionam expressão constitutiva de uma seqüência de nucleotídeo em muitos tipos de célula hospedeira, e aquelas que direcionam expressão da seqüência de nucleotídeo somente em certas células hospe- deiras (por exemplo, seqüências regulatórias específicas de tecido). Será apreciado por aqueles técnicos no assunto que o projeto do vetor de expres- são pode depender de tais fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada no nível de expressão de polipeptídeo desejado, etc. Os vetores de expressão da invenção podem ser introduzidos em células hos- pedeiras para, desse modo, produzir polipeptídeos ou peptídeos, incluindo polipeptídeos de fusão, codificados por ácidos nucléicos conforme descrito (por exemplo, polipeptídeos mutantes e polipeptídeos de fusão derivados de mutante, etc).

Células Hospedeira que Expressam Polipeptídeo. Outro aspecto da invenção pertence a células hospedeiras que expressam polipeptídeo, que contêm um ácido nucléico que codifica um ou mais polipeptídeos mutan- tes da invenção. Os termos "célula hospedeira" e "célula hospedeira recom- binante" são usados permutavelmente aqui. É compreendido que tais termos se referem não somente a célula objeto particular, mas também a progenia ou progenia potencial de tal célula. Devido a certas modificações poderem ocorrer em gerações sucedidas devido a, ou mutação, ou influências ambi- entais, tal progenia não pode, de fato, ser idêntica á célula original, mas está ainda incluída dentro do escopo do termo conforme aqui usado. Uma célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica ou eucariótica. Sambrook et ai. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989).

DNA de vetor pode ser introduzido em células procarióticas ou eucarióticas, v/a técnicas convencionais de transformação ou transfecção. Conforme aqui usado, os termos "transformação" e "transfecção" são pre- tendidos para se referirem a uma variedade de técnicas reconhecidas na arte para introdução de ácido nucléico estranho (por exemplo, DNA) em uma célula hospedeira, incluindo co-precipitação de fosfato de cálcio ou cloreto de cálcio, transfecção mediada por DEAE dextran, lipofecção, ou eletropora- ção. Métodos adequados para células hospedeiras de transformação ou transfecção podem ser encontrados em Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989), e outros manuais laboratoriais. Métodos tais como eletroporação, bombardeio de partícula, co-precipitação de fosfato de cálcio e transdução viral para introdução de DNA em células são conhe- cidos na técnica; portanto, a escolha do método pode ocorrer com a compe- tência e preferência do versado na técnica.

Para preparar uma célula recombinante da invenção, o isogene desejado pode ser introduzido em uma célula hospedeira em um vetor tal que o isogene permanece extracromossomal. Em tal situação, o gene será expresso pela célula a partir da localização extracromossomal. Em uma con- cretização preferida, o isogene é introduzido em uma célula de tal modo que ele se recombina com o gene endógeno presente na célula. Vetores para a introdução de genes ambos para recombinação e para manutenção extra- cromossomal são conhecidos na técnica, e qualquer vetor adequado ou construção de vetor podem ser usados na invenção.

Os vetores de expressão recombinantes da invenção podem ser designados para expressão de polipeptídeos mutantes em células procarióti- cas ou eucarióticas. Por exemplo, polipeptídeo mutante pode ser expresso em células bacteriais tais como Escherichia coli (£. coli), células de inseto (usando-se vetores de expressão de baculovírus), células fungais, por e- xemplo, levedura, ou células de mamífero. Células hospedeiras adequadas são discutidas adicionalmente em Goeddel, Expression Gene Technology: Methods In Enzymology (Academic Press, San Diego, Calif., 1990).

A expressão de polipeptídeos em procariótes é mais freqüente- mente efetuada em E. coli com vetores contendo promotores constitutivos ou induzíveis que direcionam a expressão de ou polipeptídeos de fusão ou de não-fusão. Vetores de expressão de fusão típicos incluem pGEX (Pharmacia Biotech lnc; Smith & Johnson, Gene 67: 31 40 (1988)), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass., USA) e pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N.J., USA) que fundem glutationa S transferase (GST), polipeptídeo de ligação de mal- tose E, ou polipeptídeo A, respectivamente, ao polipeptídeo recombinante alvo. Exemplos de vetores de expressão de não-fusão induzíveis adequados E. coli incluem pTrc (Amrann et al., Gene 69: 301 315 (1988)) e pET 11d (Studier et ai, Gene Expression Technology: Methods In Enzymology (Aca- demic Press, San Diego1 Calif., 1990) pp. 60-89. Outras estratégias são des- critas por Gottesman, Gene Expression Technology: Methods In Enzymology (Academic Press, San Diego, Calif., 1990) pp. 119-128 e by Wada, et al., Nuci Acids Res. 20: 2111 2118 (1992)).

O vetor de expressão de polipeptídeo pode ser um vetor de ex- pressão de levedura. Exemplos de vetores para expressão em levedura Saccharomyces cerivisae incluem pYepSed (Baldari et al., EMBO J. 6: 229 234 (1987)), pMFa (Kurjan & Herskowitz, Cell 30: 933-943 (1982)), pJRY88 (Schultz et al., Gene 54: 113 123 (1987)), pYES2 (InVitrogen Corporation, San Diego, Calif. USA), e picZ (InVitrogen Corp, San Diego, Calif., USA). Alternativamente, polipeptídeo mutante pode ser expresso em células de inseto usando-se vetores de expressão de baculovírus. Vetores de baculoví- rus disponíveis para expressão de polipeptídeos em células de inseto culti- vadas (por exemplo, células SF9) incluem a série pAc (Smith et aí., Moi CeH. Biol. 3: 2156 2165 (1983)) e a série pVL (Lucklow & Summers, Virology 170: 31 39 (1989)). O ácido nucléico da invenção pode ser expresso em células de mamífero usando-se um vetor de expressão de mamífero tal como pCDM8 (Seed, Nature 329: 842 846 (1987)), ou pMT2PC (Kaufman et al., EMBO J. 6: 187 195 (1987)). Para outros sistemas de expressão adequados para ambas células procarióticas e eucarióticas, ver, por exemplo, Capítulos 16 e 17 de Sambrook et ai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989). Elementos regulatórios específicos de tecido e desenvolvimentalmen- te regulados são conhecidos na técnica. Para uma discussão da regulação de expressão de gene usando-se genes de anti-sentido, ver, por exemplo, Weintraub et ai., "Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis," Trends in Genetics 1(1) (1986).

Uma célula hospedeira que inclui um composto da invenção, tal como uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica na cultura, pode ser usada para produzir (isto é, expressar) polipeptídeo mutante recombinante. A purificação de polipeptídeos recombinantes é bem conhecida na técnica, e inclui técnicas de purificação de troca de íons, ou técnicas de purificação de afinidade, por exemplo, com um anticorpo para o composto.

Animais Transgênicos. Organismos recombinantes, isto é, ani- mais transgênicos, que expressam um gene variante da invenção são prepa- rados usando-se procedimentos padrão conhecidos na técnica. Animais transgênicos que conduzem as constructos da invenção podem ser produzi- dos por vários métodos conhecidos àqueles técnicos na técnica. Ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos Ns 5.610.053 e "The Introduction of Foreign Genes into Mice" e as referências aqui citadas, em: Recombinant DNA, Eds. J.D. Watson, M. Gilman, J. Witkowski & M. Zoller (W.H. Freeman e Company, New York) pp. 254-272. Animais transgênicos expressam esta- velmente um isogene humano e que produzem proteína humana podem ser usados como modelos biológicos para estudo de doenças relacionadas à expressão e/ou atividade anormal, e para classificação e ensaio de vários fármacos candidatos, compostos, e regimes de tratamento para reduzir os sintomas ou efeitos destas doenças.

Caracterização de Nível de Expressão de Gene. Métodos para detectar e medir níveis de mRNA (isto é, nível de transcrição de gene) e ní- veis de produtos de expressão de genes de polipeptídeo (isto é, nível de translação de gene) são bem conhecidos na técnica, e incluem o uso de mi- croséries de nucleotídeo e métodos de detecção de polipeptídeo envolvendo espectrômetros de massa e/ou técnicas de detecção e quantificação de anti- corpo. Ver também, Tom Strachan & Andrew Read, Human Molecular Gene- tics, 2nd Edition. (John Wiley e Sons, Inc. Publication, New York, 1999)). Determinação de Transcrição de Gene-Alvo. A determinação do nível do produto de expressão do gene em uma amostra biológica, por e- xemplo, o tecido ou fluidos corpóreos de um indivíduo, pode ser realizada em uma variedade de modos. O termo "amostra biológica" é pretendido para incluir tecidos, células, fluidos biológicos e isolados destes, isolado de um indivíduo, bem como tecidos, células e fluidos presentes dentro de um indi- víduo. Muitos métodos de detecção de expressão usam RNA isolado. Para métodos in vitro, qualquer técnica de isolamento de RNA que não selecione contra o isolamento de mRNA pode ser utilizada para a purificação de RNA de células. Ver, por exemplo, Ausubel et al., Ed., Curr. Prot. MoL Biol. (John Wiley & Sons, New York, 1987-1999).

Em uma concretização, o nível do produto de expressão de mRNA do gene alvo é determinado. Métodos para medir o nível de um mR- NA específico são bem conhecidos na técnica, e incluem análise de Nor- thern Blot1 PCR de transcrição reversa e PCR quantitativa de tempo real, ou por hibridização a uma série ou microssérie de oligonucleotídeo. Em outras concretizações preferidas, a determinação do nível de expressão pode ser realizada pela determinação do nível do produto de expressão de proteína ou polipeptídeo do gene em fluidos corpóreos ou amostras de tecido incluin- do, mas não limitadas a, sangue ou soro. Grandes números de amostras de tecido podem ser prontamente processados usando-se técnicas bem conhe- cidas àqueles versados na técnica, tais como, por exemplo, o processo de isolamento de RNA de etapa simples da Patente dos Estados Unidos N2 4.843.155.

O mRNA isolado pode ser usado na hibridização ou ensaios de

amplificação que incluem, mas não estão limitados a, análise de Southern ou Northern, análise de PCR e séries de sonda. Um método de diagnóstico pre- ferido para a detecção de níveis de mRNA envolve contactar o mRNA isola- do com uma molécula de ácido nucléico (sonda) que pode hibridizar ao mR- NA codificado pelo gene sendo detectado. A sonda de ácido nucléico pode ser, por exemplo, um cDNA de comprimento total, ou uma porção deste, tal como um oligonucleotídeo de pelo menos 7, 15, 30, 50, 100, 250 ou 500 nu- cleotídeos em comprimento, e suficiente para hibridizar especificamente sob condições estringentes a um mRNA ou DNA genômico que codifica um mar- cador da presente invenção. Outras sondas adequadas para uso nos ensai- os diagnósticos da invenção são descritas aqui. A hibridização de um mRNA com a sonda indica que o marcador em questão está sendo expresso.

Em um formato, as sondas são imobilizadas em uma superfície sólida e o mRNA é contactado com as sondas, por exemplo, em uma série de chip de gene Affymetrix (Affymetrix, Calif. USA). Um versado na técnica pode prontamente adaptar métodos de detecção de mPNA conhecidos para uso na detecção do nível de mRNA codificado pelos marcadores da presen- te invenção.

Um método alternativo para determinação do nível de mRNA correspondente a um marcador da presente invenção em uma amostra en- volve o processo de amplificação de ácido nucléico, por exemplo, por RT- PCR (a concretização experimental colocada na Patente dos Estados Uni- dos N2 4.683.202); reação de cadeia Iigase (Barany et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:189-193 (1991)), replicação de seqüência autossustentada (Guatelli et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 1874-1878 (1990)); sistema de amplificação transcricional (Kwoh et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 1173- 1177 (1989)); Q-Beta Replicase (Lizardi et ai., BioL Technology 6: 1197 (1988)); replicação de círculo de laminação (Patente dos Estados Unidos N2 5.854.033); ou qualquer outro método de amplificação de ácido nucleico, seguido pela detecção das moléculas amplificadas usando-se técnicas bem conhecidas àqueles técnicos no assunto. Estes esquemas de detecção são especialmente úteis para a detecção das moléculas de ácido nucléico se tais moléculas estão presentes em números muito baixos. Conforme aqui usado, "iniciadores de amplificação" são definidos como sendo um par de moléculas de ácido nucléico que pode enrijecer as regiões 5' ou 3' de um gene (mais ou menos, respectivamente, ou vice-versa), e contêm uma região curta entre as mesmas. Em geral, iniciadores de amplificação são de cerca de 10-30 nucleotídeos em comprimento e flanqueiam uma região de cerca de 50-200 nucleotídeos em comprimento. PCR quantitativa de tempo real (RT-PCR) é um modo de avaliar os níveis de expressão de gene, por exemplo, de genes da invenção, por exemplo, aqueles contendo SNPs e polimorfismos de interesse. O ensaio de RT-PCR utiliza uma transcriptase reversa de RNA para catalisar a síntese de um trançado de DNA de um trançado de RNA1 incluindo um trançado de mRNA. O DNA resultante pode ser especificamente detectado e quantifica- do, e este processo pode ser usado para determinar os níveis de espécies específicas de mRNA. Um método para se fazer isto é TAQMAN® (PE Ap- plied Biosystems, Foster City, Calif., USA) e explora a atividade de nuclease 5' de AMPLITAQ GOLD® DNA polimerase para clivar uma forma específica de sonda durante uma reação de PCR. Isto é referido como uma sonda TAQMAN®. Ver Luthra et al, Am. J. Pathol 153: 63-68 (1998); Kuimelis et al, Nucl. Acids Symp. Ser. 37: 255-256 (1997); e Mullah et al., Nucl. Acids Res. 26(4)(: 1026-1031 (1998)). Durante a reação, a clivagem da sonda se- para um corante reportador e um corante debelador, resultando em fluores- cência aumentada do reportador. O acúmulo de produtos de PCR é detecta- do diretamente por monitoramento do aumento na fluorescência do corante reportador. Heid et al, Genome Res. 6(6): 986-994 (1996)). Quanto mais alto o número de cópia de partida de ácido nucléico alvo, mais breve um aumento significante na fluorescência é observado. Ver Gibson, Heid & Wil- liams etal., Genome Res. 6: 995-1001 (1996).

Outras tecnologias para medição do estado transcricional de uma célula produz reuniões de fragmentos de restrição de complexidade limitada para análise eletroforética, tais como métodos combinando digestão de enzima de restrição dupla com iniciadores de fase (ver, por exemplo, EP 0 534858 A1), ou métodos de seleção de fragmentos de restrição com locais mais próximos a uma extremidade de mRNA definida. (Ver, por exemplo, Prashar & Weissman, Proc. Natl Acad. Sei. USA 93(2) 659-663 (1996)).

Outros métodos reúnem estatisticamente amostra de cDNA, tais como por sequenciamente de bases suficiente, por exemplo, 20-50 bases, em cada um de cDNAs múltiplos para identificar cada cDNA, ou por sequen- ciamento de alvos curtos, por exemplo, 9-10 bases, que são geradas em P°si?oes conhecidas relativas a um modelo de trajetoria de extremidade de mRNA. Verj por exemplo, Velculescu, Science 270: 484-487 (1995). Os ni- veis de cDNA nas amostras sao quantificados e a media, desvio medio e padr§o de cada cDNA e determinado usando-se meio estatistico padrao bem conhecido aquele versado na tecnica. Norman T.J. Bailey, Statistical Methods In Biology, 3rd Edition (Cambridge University Press, 1995).

Detecgao de Polipeptideos. Metodos de Detecgao lmunologica. Expressao da proteina codificada pelos genes da invengao pode ser detec- tada por uma sonda que e detectavelmente rotulada, ou que pode ser sub- sequentemente rotulada. O termo "rotulada", com relagao a sonda ou anti- corpo’ e pretendido para envolver rotulagao direta da sonda ou anticorpo por acoplamento, isto e, Iigando fisicamente uma substancia detectavel a sonda ou anticorpo, bem como rotuIagao indireta da sonda ou anticorpo por reativi- dade com outro reagente que e diretamente rotulado. Exemplos de rotulagao indireta incluem detecgao de um anticorpo primario usando um anticorpo secundario fluorescentemente rotulado e rotulagao final de uma sonda de DNA com biotin tal que ela pode ser detectada com streptavidin fluorescen- temente rotulada. Geralmente, a sonda e um anticorpo que reconhece a pro- teina expressa. Uma variedade de formatos pode ser empregada para de- terminar se uma amostra contem uma proteina-alvo que se Iiga a um dado anticorpo. Metodos de imunoensaio uteis na detecgao de polipeptideos-alvo da presente invengao incluem, mas nao estao Iimitados a, por exemplo, manchamento de ponto, manchamento de western, chips de proteina, en- sa'os de Iigagao de proteina competitivos e nao-competitivos, ensaios imu- nosorventes Iigados a enzima (ELISA), imuno-histoquimica’ classificagao de celula ativada de fluorescencia (FACS), e outras comumente usadas e am- plamente descritas na Iiteratura de patente e cientifica, e muitas empregadas comercialmente. Um versado na tecnica pode prontamente adaptar meto- dos de detecgao de proteina/anticorpo para uso na determinagao se celulas expressam um marcador da presente invengao, e a concentragao relative daquele produto de expressao de polipeptideo especifico no sangue ou ou- tros tecidos corporeos. As proteinas de individuos podem ser isoladas usan- do-se tecnicas que sao bem conhecidas aqueles tecnicos no assunto. Os metodos de isolamento de proteina empregados podem, por exemplo, ser tais como aqueles descritos em Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988)).

Para uma produgao de anticorpos a uma proteina codificada por um dos genes revelados, varios animais hospedeiros podem ser imunizados por injegao com ο polipeptideo, ου uma porgao deste. Tais animais hospe- deiros podem incluir, mas nao Iimitados a, coelhos, camundongos e ratos. Varios adjuvantes podem ser usados para aumentar a resposta imunologica, dependendo das especies hospedeiras incluindo, mas nao Iimitadas a, Fre- und's (completa e incompleta), geis minerals, tais como hidroxido de alumi- nio; substancias ativas de superficie, tais como lisolecitin, poliois pluronicos, polianions, peptideos, emulsoes de oleo, Iapa haemocianin e dinitrofenol; e adjuvantes humanos potencialmente uteis, tais como bacille Camette-Guerin (BCG) e Corynebacterium parvum.

Anticorpos monoclonais (mAbs), que sao populag5es homoge- neas de anticorpos a um antigeno particular, podem ser obtidos por qualquer tecnica que proporciona a produgao de moleculas de anticorpo por Iinhas de celula continuas na cultura. Estas incluem, mas nao estao Iimitadas a, a tec- nica de hibridoma de Kohler & Milstein1 Nature 256: 495-497 (1975); e Pa- tente dos Estados Unidos N2 4.376.110; a tecnica de hibridoma de celula B humana de Kosbor et al„ Immunol. Today 4: 72 (1983); Cole et a 1., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030 (1983); e a tecnica de EBV-hibridoma de Cole et al., Monoclonal Antibodies e Cancer Therapy (Alan R. Liss, Inc., 1985) pp. 77-96.

Em adigao, tecnicas desenvolvidas para a produgao de "anticor- pos quimericos" (ver Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851- 6855 (1984); Neuberger et al., Nature 312: 604-608 (1984); e Takeda et al., Nature 314: 452-454 (1985)), por uniao de genes de uma molecula de anti- corpo de camundongo de especificidade de antigeno apropriado junto com genes de uma molecula de anticorpo humano de atividade biologica apropri- ada podem ser usadas. Um anticorpo quimerico e uma molecula na qual porg6es diferentes sao derivadas de especies de animal diferentes, tais co- mo aquelas tendo uma regiao variavel ou hipervariavel derivada forma uma murina mAb e uma regiao constante de imunoglobulina humana.

Alternativamente, as tecnicas descritas para a produgao de anti-

corpos de cadeia simples (Patente dos Estados Unidos N- 4.946.778; Bird, Science 242: 423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988); e Ward et al., Nature 334: 544-546 (1989)) podem ser adaptadas para produzir anticorpos de cadeia simples de gene diferencial- mente expressos.

Tecnicas Citeis para a produgao de "anticorpos humanizados" podem ser adaptadas para produzir anticorpos para as proteinas, fragmen- tos, ou derivados destes. Tais tecnicas sao reveladas nas Patentes dos Es- tados Unidos Nes 5.932.448; 5.693.762; 5.693.761; 5.585.089; 5.530.101; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.661.016; e 5.770.429.

Anticorpos ou fragmentos de anticorpo podem ser usados em metodos, tais como manchas de Western, ou tecnicas de imunofluorescen- cia, para detectar as proteinas expressas. Em tais usos, e geralmente prefe- rivel imobilizar ou ο anticorpo ou proteinas em um suporte solido. Suportes de fase solida ou transportadores adequados incluem qualquer suporte ca- paz de se Iigar a um antigeno ou a um anticorpo. Suportes ou transportado- res bem conhecidos incluem vidro, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextran, nailon, amilases, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, gabros e magnetita.

Um metodo iitil, para facilidade de detecgao, e ο sanduiche ELI-

SA, do qual um niimero de variag5es existe, todos dos quais sao pretendi- dos para serem usados nos metodos e ensaios da presente invengao. Con- forme aqui usado, "ensaio de sanduiche" e pretendido para envolver todas as variag5es na tecnica de dois Iocais basica. Tecnicas de imunofluorescen- cia e sao ambas muito bem estabelecidas na tecnica. Contudo1 outras mole- culas reportadoras, tais como radioisotopes, moleculas quimiluminescente

ou bioluminescente podem tambem ser empregadas. Sera prontamente apa- rente ao versado na tecnica como variar ο procedimento para adequar ο uso requerido.

O monitoramento de genoma total de proteina, isto e, ο "proteo- me," pode ser efetuado pela construgao de uma microserie na qual Iocais de Iigagao compreendem anticorpos imobilizados, preferivelmente monoclonais, especificos a uma pluralidade de especies de proteina codificadas pelo ge- noma da celula. Preferivelmente, os anticorpos estao presentes por uma fra- gao substancial das proteinas codificadas, ou pelo menos para aquelas pro- teinas relevantes para testar ou confirmar um modelo de rede biologica de interesse. Conforme notado acima, metodos para produgao de anticorpos monoclonais sao bem conhecidos. Ver1 por exemplo, Harlow & Lane, Anti- bodies: A Laboratory Manuaf (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1988)). Em uma concretizagao preferida, anticor- pos monoclonais ocorreram contra fragmentos de peptideo sinteticos desig- nados baseados na sequencia genomica da celula. Com tal serie de anticor- po, proteinas da celula sao contactadas a serie e sua Iigagao e medida com ensaios conhecidos na tecnica.

Detecgao de Polipeptideos. Eletroforese de Gel Bi-Dimensiona/. Eletroforese de gel bidimensional e bem conhecida na tecnica e tipicamente envolve focalizagao isoeletrica ao Iongo de uma primeira dimensao, seguida por eletroforese de SDS-PAGE ao Iongo de uma segunda dimensao. Ver, por exemplo, Hames et al., Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Ap- proach (IRL Press, New York, 1990); Shevchenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14440-14445 (1996); Sagliocco et al., Yeast 12: 1519-1533 (1996); e Lander, Science 274: 536-539 (1996).

Detecgao de Polipeptideos. Espectroscopia de Massa. A identi- dade, bem como nivel de expressao de polipeptideo aIvo pode ser determi- nada usando-se tecnicas de espectroscopia de massa (MS). Metodologia de analise baseada em MS e Citil para analise de polipeptideo alvo isolado, bem como analise de polipeptideo alvo em uma amostra biologica. Formatos MS para uso na analise de um polipeptideo alvo incluem tecnicas de ionizagao

(I), tais como, mas nao Iimitadas a, desorgao a laser auxiliada por matriz (MALDI), ionizagao de eletropulverizagao continua ου pulsada (ESI) e meto- dos relacionados, tais como ionpulverizagao ou termopulverizagao, impacto de agrupamento massivo (MCI). Tais fontes de ion podem ser equiparadas com formatos de detecgao, incluindo tempo de voo linear ou nao-linear re- flectron (TOF)1 setor magnetico simples ou miiltiplo quadruplo, simples ou mCiltiplo, ressonancia de ciclotron de ion de transformada de Fourier (FTI- CR), armadilha de ion, e combinag;5es destes, tais como armadilha de i- on/TOF. Para ionizagao, numerosas combinag5es de matriz/comprimento de onda (por exemplo, desorgao a laser auxiliada por matriz (MALDI)), ou com- binagoes de solvente (por exemplo, ESI) podem ser empregadas.

Para analise de espectroscopia de massa (MS), ο polipeptideo- alvo pode ser solubilizado em uma solugao apropriada ou sistema de rea- gente. A selegao de um solugao ou sistema de reagente, por exemplo, um solvente organico ou inorganico dependera das propriedades do polipepti- deo aIvo e do tipo de MS realizada, e e baseada nos metodos bem conheci- dos na tecnica. Ver, por exemplo, Vorm et a/·, Anal. Chem. 61: 3281 (1994) for MALDI; e Valaskovic et a/., Anal. Chem. 67: 3802 (1995), para ESI. MS de peptideos tambem e descrito, por exemplo, no Pedido PCT Internacional N2 WO 93/24834 e Patente dos Estados Unidos Ns 5.792.664. Um solvente e selecionado que minimiza ο risco que ο polipeptideo-alvo sera decomposto pela energia introduzida para ο processo de vaporizagao. Um risco reduzido de decomposigao de polipeptideo-alvo pode ser alcangado, por exemplo, pelo embutimento da amostra em uma matriz. Uma matriz adequada pode ser um composto organico, tal como um agCicar, por exemplo, uma pentose ou hexose, ou um polissacarideo, tal como celulose. Tais compostos sao decompostos termoliticamente em CO2 e H2O tal que nenhum residuo e for- mado que conduz a reag5es quimicas. A matriz tambem pode ser um com- posto inorganico, tal como nitrato de amonia, que e decomposto essencial- mente sem deixar qualquer residuo.〇 uso destes e outros solventes e co- nhecido aqueles tecnicos no assunto. Ver, por exemplo, Patente dos Esta- dos Unidos N- 5.062.935. Eletropulverizagao MS foi descrita por Fenn et a!.,

J. Phys. Chem. 88: 4451-4459 (1984); e Pedido PCT N- WO 90/14148; e aplicag5es atuais sao resumidas em artigos de revisao. Ver Smith et al., A- nal. Chem. 62: 882-89 (1990); e Ardrey, Spectroscopy 4: 10-18 (1992).

A massa de um polipeptideo-alvo determinada por MS pode ser comparada a massa de um polipeptideo conhecido correspondente. Por e- xemplo, onde ο polipeptideo aIvo e uma proteina mutante, ο polipeptideo conhecido correspondente pode ser a proteina nao-mutante correspondente, por exemplo, proteina tipo selvagem. Com ESI，a determinagao de pesos moleculares em quantidades de femtomole de amostra e muito precisa devi- do a presenga de picos de ion mCiltiplos, todos dos quais podem ser usados para calculo de massa. Niveis sub-attomole de proteina foram detectados, por exemplo, usando-se ESI MS (Valaskovic et al., Science 273: 1199-1202 (1996)) e MALDI MS (Li etal., J. Am. Chem. Soc. 118: 1662-1663 (1996)).

Desorgao a Laser Auxiliada por Matriz (MALDI). O nivel da pro- teina-alvo em uma amostra biologica, por exemplo, fluido corporeo ou amos- tra de tecido, pode ser medido por meio de metodos espectrometricos de massa (MS) incluindo, mas nao Iimitados a, aquelas tecnicas conhecidas na tecnica como desorgao/ionizagao a laser auxiliada por matriz, espectrometria de massa de tempo de voo (MALDhTOF-MS), e superficies aumentadas para desorgao/ionizagao a laser, espectrometria de massa de tempo de voo (SELDhTOF-MS) conforme adicionalmente descrita abaixo. Metodos para realizagao de MALDI sao bem conhecidos aqueles tecnicos no assunto. Ver, por exemplo, Juhasz et al., Analysis, Anal. Chem. 68: 941-946 (1996), e ver tambem, por exemplo, Patentee dos Estados Unidos Nss 5.777.325; 5.742.049; 5.654.545; 5.641.959; 5.654.545 e 5.760.393 para descrig5es de MALDI e protocolos de extragao retardados. Numerosos metodos para aper- feigoar resoIugao sao tambem conhecidos. MALD卜TOF-MS foi descrito por Hillenkamp et al., Biological Mass Spectrometry, Burlingame & McCIoskey, eds. (Elsevier Science Publ., Amsterdam, 1990) pp. 49-60.

Uma variedade de tecnicas para detecgao de marcador usando espectroscopia de massa pode ser usada. Ver Bordeaux Mass Spectrometry Conference Report, Hillenkamp1 Ed., pp. 354-362 (1988); Bordeaux Mass

Spectrometry Conference Report, Karas & Hillenkamp, Eds., pp. 416-417 (1988); Karas & Hillenkampl Anal. Chem. 60: 2299-2301 (1988); e Karas et a/., Biomed. Environ. Mass Spectrum 18: 841-843 (1989). O uso de feixes de laser em TOF-MS e mostrado, por exemplo, nas Patentes dos Estados Uni- dos Nss 4.694.167; 4.686.366, 4.295.046 e 5.045.694, que sao aqui incorpo- radas por referencia em suas totalidades. Outras tecnicas de MS perm item a volatilizagao bem sucedida de biopolimeros de alto peso molecular, sem fragmentagao, e tern capacitado uma ampla variedade de macromoleculas biologicas serem analisadas por espectrometria de massa.

Superficies Aumentadas para Desorgao/lonizagao a Laser (SELDI). Outras tecnicas sao usadas que empregam novas composigdes de elemento de sonda de MS com superficies que permitem que ο element。de sonda participe ativamente na captura e redugao de analitos especificos, descritos como Affinity Mass Spectrometry (AMS). Ver patentes SELDI, Pa- tentes dos Estados Unidos Nes 5.719.060; 5.894.063; 6.020.208; 6.027.942; 6.124.137; e Pedido de Patente dos Estados Unidos N2 U.S. 2003/0003465. Varios tipos de novos elementos de sonda de MS foram designados com Superficies Aumentadas para Captura de Afinidade (SEAC). Ver Hutchens & Yip, Rapid Commun. Mass Spectrom. 7: 576-580 (1993). Elementos de son- da de SEAC foram usados com sucesso para recuperar e amarrar classes diferentes de biopolimeros, particularmente proteinas, por exploragao do que e conhecido sobre as estruturas da superficie de proteina e reconhecimento molecular bioespecifico. Os dispositivos de captura de afinidade imobilizada no elemento de sonda de MS, isto e, SEAC, determina a Iocalizagao e afini- dade (especificidade) do analito para a superficie de sonda, portanto ο pro- cesso de MS anaIitico subsequente e eficiente.

Dentro da categoria geral de SELDI estao tres subcategorias separadas: (1) Superficies Aumentadas para Desorgao Pura (SEND), onde as superficies do elemento de sonda, isto e, amostra apresentando meio, sao designadas para conter Moleculas de Absorgao de Energia (EAM) ao inves de "matriz" para facilitar desorgao/ionizagOes de analitos adicionados diretamente (puros) a superficie. (2) SEAC, onde as superficies do elemento

de sonda, isto e, amostra apresentando meio, sao designadas para conte- rem dispositivos de captura de afinidade quimicamente e/ou biologicamente definidos para facilitar ou a fixagao especifica ou nao-especifica ou adsorgao (assim denominado redugao ou amarragao) de analitos para a superficie de sonda, por uma variedade de mecanismos para Fixagao e Liberagao Foto- instavel (SEPAR)1 onde as superficies de elemento de sonda, isto e, amostra apresentando meio, sao designadas ou modificadas para conterem um ou mais tipos de moleculas de reticulagao quimicamente definidas para servir como dispositivos de redugao covalentes. As especificidades quimicas que determinam ο tipo e niimero da fixagao de molecula fotoinstavel apontam entre a amostra de SEPAR apresentando meio (isto e, superficie de elemen- to de sonda) e ο analito (por exemplo, proteina) podem envolver qualquer um ou mais de um nCimero de residuos diferentes ou estruturas quimicas no analito (por exemplo, residuos His, Lys1 Arg1 Tyr1 Phe e Cys no caso de pro- teinas e peptideos).

Polipeptideos de Funcionalizagao. Um polipeptideo de interesse

tambem pode ser modificado para facilitar conjugagao a um suporte solido. Uma porgao quimica ou fisica pode ser incorporada no polipeptideo em uma posi^ao apropriada. Por exemplo, um polipeptideo de interesse pode ser modificado pela adigao de um grupo funcional apropriado ao terminal carbo- xila ou terminal amino do polipeptideo, ou a um aminoacido no peptideo, (por exemplo, a uma cadeia lateral reativa, ou ao suporte de peptideo. O versado na tecnica reconhecera, contudo, que tal modificagao, por exemplo, a incorporagao de uma porgao de biotin, pode afetar a capacidade de um reagente particular interagir especificamente com ο polipeptideo e, conse- quentemente, considerara este fator, se relevante, na selegao de quao me- Ihor modificar um polipeptideo de interesse. Um aminoacido que ocorre natu- ralmente normalmente presente no polipeptideo tambem pode conter um grupo funcional adequado para conjugagao do polipeptideo ao suporte soli- do. Por exemplo, um residuo de cisteina presente no polipeptideo pode ser usado para conjugar ο polipeptideo a um suporte contendo um grupo suIfidri- Ia atraves de uma Iigagao de disulfeto, por exemplo, um suporte tendo resi-

duos de cisteina fixados ao mesmo. Outras IigagSes que podem ser forma- das entre dois aminoacidos, incluem, mas nao estao Iimitadas a, por exem- plo, Iigag5es de monossulfeto entre dois residuos de lantionina, que sao a- minoacidos que nao ocorrem naturalmente que podem ser incorporados em um polipeptideo; uma Iigagao de Iactama formada por uma reagao de tran- samidagao entre as cadeias laterals de um aminoacido acidico e um amino- acido basico, tais como entre ο grupo y-carboxila de Glu (ou grupo aIfa car- boxila de Asp) e ο grupo amino de Lys; ou uma Iigagao de Iactona produzida, por exemplo, por uma reticulagao entre ο grupo hidroxi de Ser e ο grupo car- boxila de Glu (ou grupo aIfa carboxila de Asp). Desse modo, um suporte so- lido pode ser modificado para conter um residuo de aminoacido desejado, por exemplo, um residuo Glu, e um polipeptideo tendo um residuo Ser, par- ticularmente um residuo Ser no terminal N ou terminal C, pode ser conjuga- do ao suporte solido atraves da formagao de uma Iigagao de Iactona. O su- porte nao necessita ser modificado para conter ο aminoacido particular, por exemplo, Glu, onde e desejado formar uma Iigagao similar a Iactona com um Ser no polipeptideo, mas pode ser modificada, ao inves, para conter um gru- po carboxila accessivel, proporcionando, desse modo, uma fungao corres- pondente ao grupo aIfa carboxila de Glu.

Funcionalidades Reativas de Tioi Uma funcionalidade reativa de tiol e particularmente Citil para conjugagao de um polipeptideo a um suporte solido. Uma funcionalidade reativa de tiol e um grupo quimico que pode rea- gir rapidamente com uma porgao nucleofilica de tiol para produzir uma Iiga- gao covalente, por exemplo, uma Iigagao de disulfeto ou uma Iigagao de tioe- ter. Uma variedade de funcionalidades reativas de tiol e conhecida na tecni- ca, incluindo, por exemplo, haloacetilas, tal como iodoacetila; diazocetonas; epoxi cetonas, carbonilas aIfa- e beta-insaturadas, tais como alfa-enonas e beta-enonas; e outros aceitadores reativos de Michael, tal como maleimida; haletos acidos; haletos de benzila; e similares. Ver Greene & Wuts, Protecti- ve Groups in Organic Synthesis, 2nd Edition (John Wiley & Sons, 1991). Se desejado, os grupos tiol podem ser bloqueados com um gru-

po de protegao fotoclivavel, que, em seguida, pode ser seletivamente cliva-

do, por exemplo, por fotolitografia, para proporcionar porgdes de uma super- ficie ativada para imobilizagao de um polipeptideo de interesse. Grupos de protegao fotoclivaveis sao conhecidos na tecnica (ver, por exemplo, Pedido de Patente Internacional PCT publicado N2 WO 92/10092; e McCray et a/., Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 18: 239-270 (1989)), e podem ser seleti- vamente desbloqueados por irradiagao de areas selecionadas da superficie usando-se, por exemplo, uma mascara de fotolitografia.

Ligantes. Um polipeptideo de interesse pode ser fixado direta- mente a um suporte via um ligante. Quaisquer ligantes conhecidos aqueles tecnicos no assunto como sendo adequados para Iigagao de peptideos ou aminoacidos a suportes, ou diretamente ou via um espagador, podem ser usados. Por exemplo, ο polipeptideo pode ser conjugado a um suporte, tal como gota, atraves de meios de um espagador variavel. Ligantes incluem ligantes de amida de Rink (ver, por exemplo, Rink, Tetrahedron Lett. 28: 3787 (1976)); ligantes de tritila cloreto (ver, por exemplo, Leznoff, Ace Chem. Res. 11: 327 (1978)); e ligantes Merrifield (ver, por exemplo, Bodansky et a/., Peptide Synthesis, 2nd Edition (Academic Press, New York, 1976)). Por e- xemplo, ligantes tritila sao conhecidos. Ver, por exemplo, Patentes dos Esta- dos Unidos Nss 5.410.068 e 5.612.474. Ligantes de amino tritila sao tambem conhecidos. Ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos Ns 5.198.531. Outros ligantes incluem aqueles que podem ser incorporados em proteinas de fusao e expressos em uma celula hospedeira. Tais ligantes podem ser aminoacidos selecionados, substratos de enzima ou qualquer peptideo ade- quado. O ligante pode ser produzido, por exemplo, por selegao apropriada de iniciadores quando do isolamento do acido nucleico. Alternativamente, eles podem ser adicionados por modificagao pos-translacional da proteina of interesse. Ligantes que sao adequados para Iigar quimicamente peptideos a suportes, incluem Iigagoes de disulfeto, Iigagoes de tioeter, Iigagoes de disiH- feto obstruida e Iigag5es covalentes entre grupos reativos livres, tais como grupos amina e tiol.

Ligantes Clivaveis. Um ligante pode proporcionar uma Iigagao

reversivel tal que ela e clivada sob as condigdes selecionadas. Em particu-

lar, ligantes seletivamente clivaveis, incluindo ligantes fotoclivaveis (ver Pa- tente dos Estados Unidos N2 5.643.722), Iigantes acidos clivaveis (ver Fat- to m et a/·, Infect. Immun. 60: 584-589 (1992)), Iigantes acidos instaveis (ver Welhoner et a/., J. Biol. Chem. 266: 4309-4314 (1991)), e Iigantes sensiveis a calor sao iiteis. Uma Iigagao pode ser, por exemplo, uma Iigagao de disul- feto, que e quimicamente clivavel por mercaptoetanol ou ditioeritrol; uma Ii- gagao de biotin/streptavidin, que pode ser fotoclivavel; um derivado heterobi- funcional de um grupo de tritila eter, que pode ser clivado pela exposigao a condig5es acidas ou sob condig5es de MS (ver Koster et al, Tetrahedron Lett. 31: 7095 (1990)); uma Iigagao mediada por levulinila, que pode ser cli- vada sob condiq;5es quase neutras com um tampao de hidrazinio/acetato; uma Iigagao arginina-arginina ou uma Iigagao Iisina-Iysina1 qualquer da qual pode ser clivada por uma endopeptidase, tal como tripsina; uma Iigagao de pirofosfato, que pode ser clivada por uma pirofosfatase; ou uma Iigagao de ribonucleotideo, que pode ser clivada usando-se uma ribonuclease, ou pela exposigao a condigao alcalina. Um reticulador fotoinstavel, tal como 3-amino- (2-nitrofenila)acido propionico pode ser empregada como um meio para cli- var um polipeptideo de um suporte solido. Brown et al., Mol Divers, pp. 4-12 (1995); Rothschild et al., NucL Acids. Res. 24: 351-66 (1996); e Patente dos Estados Unidos Ns 5.643.722. Outros Iigantes incluem Iigantes de RNA que sao clivaveis por ribozimas e outras enzimas de RNA e Iigantes1 tais como os varios dominios, tais como CH1, CH2 e CH3, a partir da regiao constante de IgGI humano. Ver, Batra et al., Mol Immunol 30: 379-396 (1993).

CombinagSes de quaisquer Iigantes sao tambem contempladas aqui. Por exemplo, um Iigante que e clivavel sob condigdes de MS, tais como uma Iigagao de silila ou Iigagao fotoclivavel, pode ser combiriada com um ligante, tal como uma Iigagao de avidin biotina, que nao e clivada sob estas condigoes, mas pode ser clivada sob outras condig5es. Ligantes instaveis acidos sao Iigantes quimicamente clivaveis particularmente Citeis para espec- trometria de massa, especialmente para MALDhTOF, porque a Iigagao ins- tavel de acido e clivada durante condicionamento do polipeptideo-alvo apos adigao de uma solugao de matriz 3-HPA. A Iigagao instavel acida pode ser

introduzida como um grupo ligante separado, por exemplo, um grupo tritila instavel acido, ou pode ser incorporada em um Iigante sintetico pela introdu- Qao de uma ou mais pontes de silila usando-se diisopropilsilila, formando, desse modo, um Iigagao de diisopropilisilila entre ο polipeptideo e ο suporte solido. A Iigagao de diisopropilisilila pode ser clivada usando-se condigdes suavemente acidas, tais como acido trifluoroacetico 1,5% (TFA) ou solugao matriz 3-HPA/1 % TFA MALDI-TOF. Metodos para a preparagao de Iigag5es de diisopropilisilila e analogos destas sao bem conhecidos na tecnica. Ver, por exemplo, Saha etal., J. Org. Chem. 58: 7827-7831 (1993).

Uso de uma Ferramenta de Pino para Imobilizar um Polipepti- deo. A imobiliza$ao de um polipeptideo de interesse a um suporte solido u- sando uma ferramenta de pino pode ser particularmente vantajosa. Ferra- mentas de pino incluem aquelas aqui reveladas ou, de outro modo, conheci- das na tecnica. Ver, por exemplo, Pedido dos Estados Unidos Nes De Serie 08/786.988 e 08/787.639; e Pedido PCT Internacional N2WO 98/20166.

Uma ferramenta de pino em uma serie, por exemplo, uma serie 4x4, pode ser aplicada a cavidades contendo polipeptideos de interesse. Onde a ferramenta de pino tem um grupo funcional fixado a cad a ponta do pino, ou a um suporte solido, por exemplo, contas funcionalizadas ou contas paramagneticas sao fixadas a cada pino, os polipeptideos em uma cavidade podem ser capturados (capacidade de 1 pmol). Durante a eta pa de captura, os pinos podem ser mantidos em movimento (vertical, curso de 1-2 mm) pa- ra aumentar a eficiencia da captura. Onde uma reagao, tal como transcrigao in vitro esta sendo realizada nas cavidades, ο movimento dos pinos pode aumentar a eficiencia da reagao. A imobilizagao adicional pode resultar pela aplicagao de um campo eletrico para a ferramenta de pino. Quando uma voltagem e aplicada a ferramenta de pino, os polipeptideos sao fixados ao anodo ou ao catodo, dependendo de sua carga liquida.

Para mais especificidade, a ferramenta de pino (com ou sem voltagem) pode ser modificada para ter conjugado a esta um reagente espe- cifico para ο polipeptideo de interesse, tal que somente os polipeptideos de interesse estao Iigados pelos pinos. Por exemplo, os pinos podem ter ions de niquel fixados, tal que somente polipeptideos contendo uma sequencia de poli-histidina sao ligados. Similarmente1 os pinos podem ter anticorpos especificos para um polipeptideo aIvo fixados nestes, ou a gotas que, por sua vez, estao fixadas aos pinos, tal que somente os polipeptideos-alvo, que contem ο epitopo reconhecido pelo anticorpo, sao ligados pelos pinos.

Os polipeptideos capturados podem ser analisados por uma va-

riedade de meios incluindo, por exemplo, tecnicas espectrometricas, tais como UVA/IS, IR, fluorescencia, quimiluminescencia, espectroscopia de RMN, MS1 ou outros metodos conhecidos na tecnica, ou combinag5es des- tes. Se condigoes impedem analise direta de polipeptideos capturados, os polipeptideos podem ser Iiberados ou transferidos dos pinos, sob condigoes tais que as vantagens da concentragao da amostra nao sao perdidas. Con- sequentemente, os polipeptideos podem ser removidos dos pinos usando-se um volume minimo de eluente, e sem qualquer perda de amostra. Onde os polipeptideos estao ligados as gotas fixadas aos pinos, as gotas contendo os polipeptideos podem ser removidas dos pinos e medigoes feitas diretamente a partir das gotas.

As ferramentas de pino podem ser Citeis para imobilizagao de polipeptideos de interesse de maneira espacialmente enderegada em uma serie. Tais series espacialmente enderegavel ou series pre-enderegaveis sao Uteis em uma variedade de processos, incluindo, por exemplo, controle de qualidade e diagnosticos de sequenciamento de aminoacido. As ferramentas de pino descritas nos Pedidos dos Estados Unidos Nss 08/786.988 e 08/787.639 e Pedido PCT Internacional Ns WO 98/20166 sao ferramentas de dispensa em serie e paralelo que podem ser empregadas para gerar series de multielementos de polipeptideos em uma superficie do suporte solido. A superficie de serie pode ser plana, com gotas ou geometricamente alterada para incluir cavidades, que podem conter contas. Em adigao, geometrias de MS podem ser adaptadas para acomodagao de um aparelho de ferramenta de pino.

Outros Aspectos do Estado Biologico. Em varias concretizagdes

da invengao, aspectos do estado de atividade biologica, ou aspectos mistu-

rados podem ser medidos de modo a obter farmaco e respostas de trajeto- ria. As atividades de proteinas relevantes a caracterizagao da fungao da ce- Iula podem ser baseadas em tais medig5es. As medigoes da atividade po- dem ser realizadas por qualquer meio funcional, bioquimico ou fisico para a atividade particular sendo caracterizada. Onde a atividade envolve uma transformagao quimica, a proteina celular pode ser contactada com substra- tes naturais, e a taxa de transformagao medida. Onde a atividade envolve associagao em unidades multimericas, por exemplo, associagao de um complexo de Iigagao de DNA ativado com DNA, a quantidade de proteina associada ou consequencias secundarias da associagao, tais como quanti- dades de mRNA transcrito, podem ser medidas. Tambem1 onde somente uma atividade funcional e conhecida, por exemplo, como no controle de ciclo de celula, ο desempenho da fungao pode ser observado. Embora conheci- das e medidas, as mudangas nas atividades de proteina a partir dos dados de resposta sao analisadas pelos metodos desta invengao. Em concretiza- goes alternativas e nao-limitativas, os dados de resposta podem ser forma- dos de aspectos misturados do estado biologico de uma celula. Os dados de resposta podem ser construidos de, por exemplo, mudangas em certas a- bundancias de mRNA, mudangas em certas abundancias de proteina, e mu- dangas em certas atividades de proteina. O EXEMPLO seguinte e apresentado de modo a ilustrar mais

totalmente as concretizagoes preferidas da invengao. Este EXEMPLO nao e construido como Iimitando ο escopo da invengao, conforme definida pelas reivindicag5es em anexo. EXEMPLOI

VARREDURA GENOMICA AFFYMETRIX 100K EM PACIENTES A PARTIR DO ENSAIO InDDEx

Introdugao e sumario. A proposta deste EXEMPLO e descrever estudos de associagao genetica que identificam vinte e cinco (25) mutag5es associadas a AD da invengao. A analise de genoma ampla para estudos de associagao genetica somente se tornou possivel dentro de dois anos passa- dos. A Investigagao no Retardo para Diagnose de Doenga de Alzheimer

Com ensaio clinico Exelon (InDDex; ENA713B IA07) seguiu pacientes que sofrem de MCI e deu ou Exelon (rivastigmina) em varias doses ou placebo e seguiu sua conversao em AD. O ensaio tinha um componente de coleta de DNA opcional, em que 442 amostras foram coletadas.

Para identificar a variagao genetica que contribuiu para conver- sao de MCI em AD, 420 amostras de paciente a partir do ensaio clinico InD- Dex (ENA713B IA07) foram genotipadas usando-se a plataforma de genoti- pagem Affymetrix 100K, e analise de associagao de genoma total foi realiza- da, em pontos simples e inferidos blocos de haplotipo, usando-se ο teste de caso de controle de Haploview. O fenotipo resultante foi conversao ou nao- conversao de MCI a AD. A aproximagao de genoma amplo nao-inclinada dos presentes estudos conduziu a identificagao de mutag5es, e regioes geneti- cas nao foram previamente Iigadas a AD.

Os criterios comumente usados para uma diagnose de MCI am- nestetico incluem, mas nao estao Iimitados a, por exemplo, memoria defici- ente; julgamento essencialmente normal, percepgao de mortes de raciocinio; atividades grandemente normais de vida diaria; desempenho reduzido nos testes de memoria comparados a outras pessoas de idade similar e antece- dente educacional; e ausencia de demencia. Os fatores de risco para MCI amnestico (relacionado a memoria) sao os mesmos coriforme aqueles para Alzheimer, e incluem historia de familia; geneticas e idade. MCI e contrasta- do com AD, que e a perda de capacidades intelectuais e sociais severa bas- tante para interferir com ο funcionamento diario. A demencia ocorre em pes- soas com Doenga de Alzheimer porque ο tecido saudavel do cerebro dege- nera, causando um declinio constante na memoria e capacidades mentais. Metodos. O DNA foi extraido de amostras de sangue coletadas.

A preparagao-alvo, hibridizagao em microseries, varredura e captura de da- dos foram todas realizadas conforme descrito nos protocolos Affymetrix para a plataforma 100K. Por Ciltimo, 420 das 442 amostras de DNA foram genoti- padas com sucesso, com as outras 22 retiradas por raz5es de qualidade ou quantidade de DNA.

Os dados do genotipo foram carregados de GCOS na facilidade

de hibridizagao de chip para ο servidor BMD, e exportados para um servidor Linux em Haploview .ped input format, junto com equiparagao .info format annotation files. (Amostras com uma taxa de chamada de <90% ou mais do que uma desequiparagao entre os ensaios duplicados Hindlll e Xbal foram excluidos dos conjuntos de dados). Dados (conversao/nao-conversao) a par- tir da base de dados clinicos ENA713B IA07 foram fundidos nos dados do genotipo, e analise de caso de controle foi realized a em uma base per- cromosomo em Haploview com os seguintes parametros: "-nogui -check - assocCC -Blocooutput GAB -hwcutoff 0.00001 -maxDistance 200". De outro modo, ajustes de falha foram usados. Os arquivos de saida per-cromossomo foram montados em arquivos de genoma amplo simples, importados para um servidor Windows e fundidos em SAS.

Os resultados superiores, ambos blocos de ponto simples e ha- plotipo foram ranqueados pelo valor Haploview cN-quadrado provido, com resultados de ponto simples tambem ranqueados por um Fisher's Exact Test, e anotados com dados de ensaio a partir da base de dados Affymetrix. Nenhum dos resultados de ponto simples encontra significancia de estudo simples (p = 0,05) apos uma penalidade de Bonferroni para testes miiltiplos (n = 109780 testes informativos), nem qualquer dos testes de ponto simples e haplotipo combinados encontram um Iimite de significancia de estudo am- plo (p = 0,05) em teste de permutagao em Haploview.

Resultados. Marcador simples e analise de haplotipo foram rea- Iizados atraves do genoma, alelo ou haplotipos associados com conversao de AD. Os resultados foram estratificados por genera, estado APOE E4, e brago de tratamento. O Genotipagem de Chip Affymetrix 100K utilizada nos presentes estudos e similar em mecanismo as microsseries para perfilamen- to de expressao. O conjunto de dois chips usado nestes estudos proporcio- nou dados de genotipo para >100.000 SNPs constantemente distribuidos atraves do genoma. Quatrocentas e vinte (420) de 442 amostras do ensaio Exelon InDDex foram hibridizadas com sucesso aos chips de genopitagem usados nos presentes estudos. A complexidade do genoma foi reduzida, via digestao com enzimas de restrigao e amplificada, hibridizada em chips, e

escaneada. Alguns 4,8 milh5es de genotipos foram gerados. Etapas OC de Genotipo. Serie Affymetrix 100K foi avaliada por comparagao de 30 SNPs redundantes e comparagao de genero entre pares de Xbal e Hindlll. Um chip foi eliminado se existe mais do que uma desequi- paragao. Uma amostra foi eliminada se > 1 faIta chip. Chips com "taxas de- nominadas per amostra" de > 90% foram incluidos na analise. Um resumo do desempenho da Serie Affymetrix 100K e provido na TABELA 2A abaixo.

TABELA 2A Desempenho da Serie Affymetrix 100K Experiment。de Primeiro Passo Repetigoes NCimero de pacientes :442 Niimero de preps de DNA :884 (2 chips/paciente) 159 Niimero de sucesso de prep de DNA :793 (89,70 %) 136 (85,5%) Niimero de DNA posto nos chips :793 124 Niimero de chips passados :758 (95,5%) 122 (98%) Taxa de chamada media por chip :96% 96,6%

O nCimero de amostras de paciente com 2 chips bem-sucedidos foi 420 (95%). O nCimero de amostras de paciente com 1 ensaio falho/chip foi 17 (3,9%). O niimero de amostras de paciente com 2 ensaios falhos/chips

foi 5 (1,1%). A reprodutibilidade observada de desempenho de ensaio para os estudos da invengao foi 99,9%. Oito amostras de um controle positive* provido por Affymetrix tambem indica uma taxa de precisao de 99,9% para genotipos denominados.

Conforme mostrado na TABELA 2B, nao existe diferengas significantes entre ο estudo clinico total e ο estudo de varredura de genoma para caracteristi-

cas demograficas, MMSE de Iinha base, e taxa de conversao de AD. TABELA 2B Caracteristicas Demoqraficas e Ponto Final Clinico Primario Variavel Todas as Pacentes* Popula?ao de verredura de genoma Exelon Placebo Exelon Placebo Niimero de individuos Idade Generot Feminino% Raga1 Caucasianas% Educagao, anos MMSE na Iinha base Convertido a AD1 % η = 508 n=510 70.30(7.35) 70.63(7.60) 53,15 51,37 97,24 96,86 10.97(4,01) 11.09(4.15) 27.02 (2.64) 26.90(2.79) 17.32 21.37 η = 211 η= 208 70.82(7.29) 70.61 (7.54) 53,08 48,08 94,79 95,19 11.59(2.78) 11.65(4.50) 26.82 (2.78) 26.85(2.81) 17.06 17.31 Valores sao medios (SD). *Pacientes arrolados e completados no estudo clinico. **Pacientes consentidos para estudo farmacogeneticos e passados com sucesso na varre- dura de 100K

Analise de Haplotipo. Para cada haplotipo, todas as frequencias de

haplotipo para casos e controles foram estimadas. Cada haplotipo foi testado para associagao com conversao de AD. Todas as associagoes foram ranquea- das pelo valor ρ (chi-quadrado) para priorizar ο reforgo. Para a avaliagao de blo- cos de haplotipo, 16.858 blocos de haplotipo foram identificados atraves do ge- noma, utilizando ο metodo de (Gabriel et al., Science 296:2225-2229 (2002)) Quinze (15) associagdes superiores foram observadas pela ava- Iiagao de bloco de haplotipo (isto e, haplotipos da invengao) sao resumidos abaixo na TABELA 3. 圳sy θρ d jo|BA 8Ζ3Ό 1.000 Z£V0 IZ9Q I Ζ02Ό 6妁0 Ι-29Ό Z9S0 LO O O d JO|eA 90-80ε/"8 963Ό 926Ό ZZVO WSO ； 008Ό 6εεο t78S0 eeso I- 8S LOOOOO OO CO O O O "D to 86981 ψ O 260. L 600Ό 卯90 οοε*ο ι ！--- ！ 0.064 ！--- 0.916 0.300 69εο O CO CO <D O ^^ O (‘) 0Ό99 ： ε Vi彐av丄 ω Ό (/> Φ ο N CD Q： ο" to CC O 卞 Ό'^εΐ-Ό'δ £9-119 tLl-ZZl LQVl^ iVZ-ZQi ε6:ΐ·ε9 'PZ-Zii m:OZS ‘92:9“ 0U:99S >2:914 丨 221-16Ρ '£Ρ'96 \ Zil QlS '9Z-9U \ 09Z-ZZP '9S:98 I I 16.3 : 123.7, 22.0: Ζ9:ε09 iL-IZi SQJOlBUi S0|8|V < < < < QO ω" ω CD CQ oq" < < m ω < < < < Bpuenbajj ΙΛ τ— ο" 9W0 _o|den CQ CD CQ QQ CQ CQ ^ I tn CO τ— IO CNJ IO LO S τ— 卜 寸 ίϊ CO τ- ι < 卜 CO IO τ (Λ CD I < σ> ο τ- ι < 卜 卜 OO in 卜 τ- ι < CO O CD σ> CD τ- ι < CO IO CO ΙΛ 卜 τ- ι < N- OO CO LO N- τ- ι < CQ ω < ι CO ⑦ O CO CO τ- ι < ο O O 沄 Q. Z W D- Z CO CL Z ω CL Z ω D. Z ω Q- Z CO DL Z CO Q. Z W O O m CL 2 co ο ε CO ifi E ο O 卜 C\J S8J0|BUI S0|9|V

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W-S9 ooom Resultados combinados de associates geneticas observadass-

por avaliagdes de ponto simples e haplotipo, ranqueados por resultado chi-quadrado, sao resumidos na TABELA 4 abaixo.

TABELA4 SNP ou Bloco Cromossomo Chi Quadrado valor ρ 7-Bloco 357-AABBBBBB 7 19.771 8.73E-06 i 2-Bloco 978-ABB 2 18.638 1.58E-05 _J SNP_A-1747985 5 17.868 2.37E-05 U SNP_A-1728960 1 17.434 2.97E-05 J SNP_A-1744334 7 17.365 3.08E-05 / 3-Bloco 882-BAABB 3 17.154 3.45E-05 I SNP_A-1708263 5 16.620 4.57E-05 I SNP_A-1653812 18 16.537 4.77E-05 I SNP_A-1754998 1 16.423 5.07E-05 SNP_A-1654099 5 16.398 5.13E-05 5-Bloco 1111-AABABBBBBB 5 16.362 5.23E-05 4-Bloco 160-BABA 4 16.277 5.47E-05 SNP_A-1659634 8 16.141 5.88E-05 1-BIoco 119-AB 1 16.010 6.30E-05 SNP_A-1671292 5 15.932 6.56E-05 SNP_A-1694932 6 15.707 7.39E-05 SNP_A-1684457 8 15.702 7.42E-05 SNP_A-1750208 2 15.614 7.77E-05 8-Bloco 940-ABAB 8 15.573 7.94E-05 SNP_A-1672398 7 15.531 8.12E-05 SNP_A-1651422 1 15.506 8.22E-05 15-Bloco 352-AA 15 15.376 8.81 E-05 7-Bloco 605-ABB 7 15.292 9.21 E-05 3-Bloco 949-BBBB 3 15.276 9.29E-05 6-Bloco 431-BBB 6 15.262 9.36E-05 SNP_A-1670809 2 15.252 9.41 E-05 2-Bloco 1390-BBBA 2 15.192 9.71 E-05 1-BIoco 1192-AA 1 14.931 0.0001 SNP A-1690321 15 14.461 0.0001 SNP A-1657336 7 14.414 0.0001 TABELA 4 -continuacao- SNP ou Bloco Cromossomo Chi Quadrado valor id SNP_A-1689062 3 14.741 0.0001 SNP_A-1686758 15 14.461 0.0001 SNP_A-1663754 22 14.555 0.0001 SNP_A-1713325 6 14.917 0.0001 5-Bloco 498-BBB 5 13.462 0.0002 7-Bloco 558-AA 7 14.301 0.0002 10-Bloco 201-AABBBB 10 13.645 0.0002 11-BIoco 351-BBB 11 13.497 0.0002 SNP_A-1689777 17 13.834 0.0002 SNP_A-1697299 3 14.367 0.0002 SNP_A-1646220 13 14.045 0.0002 SNP_A-1649117 3 13.873 0.0002 SNP_A-1677855 7 13.605 0.0002 SNP_A-1642608 6 13.428 0.0002 SNP_A-1744891 9 13.950 0.0002 SNP_A-1712558 5 13.462 0.0002 SNP_A-1672476 7 13.486 0.0002 SNP—A-1648183 11 13.509 0.0002 SNP_A-1666270 15 14.360 0.0002 SNP—A-1663412 4 14.111 0.0002 SNP_A-1689621 8 14.363 0.0002 SNP_A-1674524 18 14.248 0.0002 3-Bloco 631-BB 3 12.935 0.0003 6-Bloco 213-BABB 6 13.227 0.0003 SNP_A-1648505 11 13.002 0.0003 SNP_A-1674414 18 12.861 0.0003 SNP_A-1752407 2 12.797 0.0003 SNP_A-1758088 6 12.949 0.0003 SNP A-1651632 11 13.171 0.0003 SNP A-1652367 18 13.405 0.0003 SNP A-1752416 3 13.202 0.0003 SNP A-1714418 8 13.048 0.0003 SNP A-1681449 3 12.913 0.0003 SNP A-1657052 2 13.116 0.0003 TABELA 4 -continuacao- SNP ou Bloco Cromossomo Chi Quadrado valor D SNP A-1748758 3 13.371 0.0003 SNP A-1668805 2 12.949 0.0003 1-BIoco 156-BAAAA 1 12.734 0.0004 2-Bloco 82-ABA 2 12.685 0.0004 2-Bloco 1516-ABBB 2 12.488 0.0004 3-Bloco 631-AA 3 12.659 0.0004 6-Bloco 982-AAABABAABB 6 12.507 0.0004 8-Bloco 417-AA 8 12.657 0.0004 8-Bloco 682-BAAB 8 12.553 0.0004 10-Bloco 98-BA 10 12.480 0.0004 13-Bloco 183-ABBAAAAABAAB 13 12.483 0.0004 17-Bloco 423-ABBB 17 12.716 0.0004 SNP A-1681731 3 12.659 0.0004 SNP_ A-1658214 5 12.611 0.0004 SNP_ A-1673435 13 12.674 0.0004 SNP A-1713453 12 12.752 0.0004 SNP_ A-1747301 16 12.371 0.0004 SNP A-1746683 22 12.508 0.0004 6-Bloco 62-AA 6 12.289 0.0005 13-Bloco 55-BA 13 11.995 0.0005 13-Bloco 182-BBB 13 11.992 0.0005 17-Bloco 423-BAAA 17 12.255 0.0005 SNP_A-1755442 18 12.024 0.0005 SNP—A-1729831 16 12.137 0.0005 SNP_A-1725694 1 12.209 0.0005 SNP—A-1722723 11 11.948 0.0005 SNP—A-1737843 5 12.016 0.0005 SNP_A-1690009 18 12.024 0.0005 TABELA 4 -continuacao- SNP ou Bloco Cromossomo Chi Quadrado valor ρ SNP_A-1709339 14 11.965 0.0005 SNP_A-1703326 6 11.997 0.0005 SNP A-1644949 14 12.139 0.0005 SNP—A-1721181 3 12.286 0.0005 SNP—A-1713954 8 12.306 0.0005 SNP_A-1753986 3 12.260 0.0005 SNP_A-1714568 13 12.262 0.0005 SNP—A-1728025 10 12.300 0.0005

Conforme mostrado na Tabela 5, as associag5es geneticas su- periores envolvem SNPs em ou perto de GRIA1 (Receptor de glutamato, ionotropico, AMPA 1), AK5 (Adenilato kinase 5), SLC1A3 (Familia de trans- portador de soluto 1 (transportador de glutamato de aIta afinidade de glial), membro 3), BAI3 (inibidor de angiogenese especifica de cerebro 3) e CAC- NA2D1 (canal de calcio, dependente da voltagem, subunidade alfa 2/delta 1).

TABELA5 GENES ASSOCIADOS COM CONVERSAO DE MC AAD Genes Associagao neurologica conhecida? Comentarios GRIA1 X Receptor de glutamate AK5 Especifico de cerebro SLC1A3 X Transportador de glutamato BAI3 Especifico de cerebro CACNA2D1 Canal de calcio

Associagao de Marcador Simples. Avaliagao de associagao de marcador simples para conversao de MCI a AD foi realizada em 109.768

marcadores. Frequencias de alelo foram comparadas entre 72 casos e 347 controles. As 25 mutagdes de gene de ponto simples superiores (biomarca- dores da invengao) identificaram como associadas com conversao de MCI em AD sao resumidas na TABELA 6. 寸ε 寸Z2001AI

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10

15

20

25

EQUIVALENTES

Os detalhes de uma ou mais concretizagoes da invengao sao colocados na descriQao acima acompanhante. Embora quaisquer metodos e material's similares ou equivalentes aqueles aqui descritos possam ser usa- dos na pratica ou teste da presente invengao’ os metodos e materials prefe- ridos sao agora descritos. Outras caracteristicas, objetivos e vantagens da invengao serao a pa rentes a partir da descrigao e das re i vindicates. No re- lat0rio descritivo e reivindicag5es em anexo, as formas singulares incluem referentes plurais, a menos que ο contexto determine claramente de outro modo. A menos que de outro modo definido, todos os termos tecnicos e ci- entificos usados aqui tem ο mesmo significado conforme comumente com- preendido por um versado na tecnica a qual esta invengao pertence. Todas as referencias aqui citadas sao aqui incorporadas por referenda em sua to- talidade e para todas as propostas para a mesma extensao como se cada publicagao objeto, patente, ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referencia em sua totali- dade para todas as propostas.

A presente invengao nao e para ser Iimitada em termos das con- cretizaQoes particulares descritas neste pedido, que sao pretendidos como ilustra95es simples de aspectos objetos da i门vengao. Muitas modificagoes e variagoes desta invengao podem ser feitas sem fugir de seu espirito e esco- po，conforme sera aparente aqueles versados na tecnica. Metodos e apare- Ihos funcionalmente equivalentes dentro do escopo da invengao, em adigao aqueles aqui enumerados, serao aparentes aqueles tecnicos no assunto a partir das descrigoes precedentes. Tais modificag5es e variagdes sao pre- tendidas para cairem dentro do escopo das reivindicagoes em anexo. A pre- sente invengao e para ser Iimitada somente pelos termos das reivindicag5es em anexo, junto com ο escopo total de equivalentes a qual tais reivindica-

Q5es sao intituladas.

Claims (23)

1. Uso de rivastigmina (ExeIon) na fabricagao de um medica- mento para ο tratamento de Doenga de Alzheimer com uma toxicidade redu- zida ou efeito aumentado em uma populagao selecionada de individuo’ no qual a populagao de individuo e selecionada na base da presenga de pelo menos uma muta^ao de gene selecionada a partir do grupo consistindo em: MUT-1; MUT-2; MUT-3; MUT-4; MUT-5; MUT-6; MUT-7; MUT-8; MUT-9; MUT-10; MUT-11; MUT-12; MUT-13; MUT-14; MUT-15; MUT-16； MUT-17; MUT-18; MUT-19; MUT-20; MUT-21; MUT-22; MUT-23; MUT-24; MUT-25.

2. Metodo para tratamento de Doenq:a de Alzheimer em um indi- viduo, compreendendo as etapas de: (a) obtengao do genotipo ou haplotipo do individuo em um local genetico ou Iocais de pelo menos um gene selecionado a partir do grupo consistindo em: AK5; BAI3;已BX; C18orf20; C5orf3; CACNA2D1; CCDC2; CD47; CNTNAP5; GRIA1; LAMA3; LOC131368; LRRC19; MGC27434; NFKBIZ; PIK3C3; SLC1A3; SPAG16; ST3GAL3; TEK; e TNFSF11, no qual ο genotipo e/ou haplotipo e indicativo de uma propensidade de ter Doenga de Alzheimer; e (b) administragao de uma terapia de anti-Doen^a de Alzheimer ao individuo.

3. Metodo, de acordo com a reivindicagao 2，no qual a terapia de antidoenga de Alzheimer e selecionada a partir do grupo consistindo em: tacrina; donepezil; rivastigmina; galantamina; e memantina.

4. Metodo, de acordo com a reivindicagao 2，no qual ο genotipo e heterozigoto, com pelo menos um dos alelos contendo um polimorfismo genetico e/ou mutagao selecionados a partir do grupo consistindo em: MUT- 1； MUT-2; MUT-3; MUT-4; MUT-5; MUT-6; MUT-7; MUT-8; MUT-9; MUT-10; MUT-11; MUT-12; MUT-13; MUT-14; MUT-15; MUT-16; MUT-17; MUT-18; MUT-19; MUT-20; MUT-21; MUT-22; MUT-23; MUT-24; MUT-25..

5. Metodo, de acordo com a reivindicagao 2, no qual ο gen0tipo e homozigoto, com pelo menos um dos alelos contendo uma mutagao e/ou polimorfismo de: MUT-1; MUT-2; MUT-3; MUT-4; MUT-5; MUT-6; MUT-7; MUT-8; MUT-9; MUT-10; MUT-11; MUT-12; MUT-13; MUT-14; MUT-15； MUT-16; MUT-17; MUT-18; MUT-19; MUT-20; MUT-21; MUT-22; MUT-23; MUT-24; e MUT-25.

6. Metodo, de acordo com a reivindicagao 2’ no qual a terapia de antidoenga de Alzheimer e a administragao de uma quantidade terapeutica- mente efetiva de um agente que aumenta ou diminui ο nivel de expressao de um gene compreendendo uma mutagao genetica ou polimorfismo seleciona- dos a partir do grupo consistindo em: MUT-1 ； MUT-2; MUT-3; MUT-4; MUT- 5; MUT-6; MUT-7; MUT-8; MUT-9; MUT-10; MUT-11; MUT-12; MUT-13; MUT-14; MUT-15; MUT-16; MUT-17; MUT-18; MUT-19; MUT-20； MUT-21； MUT-22; MUT-23; MUT-24; e MUT-25.

7. Metodo para identificagao de um individuo com uma enfermi- dade para qual uma mutagao associada a Doenga de Alzheimer identificada na TABELA 1 e dita antes, compreendendo as etapas de: (a) obtengao do genotipo ou haplotipo do individuo em um local genetico ou Iocais de pelo menos um gene selecionado a partir do grupo consistindo em: AK5; BAI3; BBX; C18orf20; C5orf3; CACNA2D1 ； CCDC2; CD47; CNTNAP5; GRIA1; LAMA3; LOC131368; LRRC19; MGC27434; NFKBIZ; PIK3C3; SLC1A3; SPAG16; ST3GAL3; TEK; e TNFSF11; (b) avaliagao do genotipo e/ou haplotipo para determinar a pre- senga de uma mutagao ou polimorfismo selecionado a partir do grupo con- sistindo em: MUT-1; MUT-2; MUT-3; MUT-4; MUT-5; MUT-6; MUT-7; MUT-8; MUT-9; MUT-10; MUT-11; MUT-12; MUT-13; MUT-14; MUT-15; MUT-16； MUT-17; MUT-18; MUT-19; MUT-20; MUT-21; MUT-22; MUT-23; MUT-24; e MUT-25, no qual a presenga da mutagao ou polimorfismo e indicativa de uma propensidade do individuo ter uma enfermidade para qual a mutagao associada a Doenga de Alzheimer identificada na TABELA 1 e dita antes; e (c) identificagao do individuo como tendo uma propensidade de ter uma enfermidade para qual uma mutagao associada a Doenga de Al- zheimer identificada na TABELA 1 e dita antes.

8. Metodo, de acordo com a reivindicagao 7, no qual a enfermi- dade para qual as mutag6es associadas a Doenga de Alzheimer identificada na TABELA 1 sao ditas antes e Doenga de Alzheimer

9. Metodo para determinagao, antes da iniciagao de tratamento, se um individuo deve ser incluido em um estudo de um agente terapeutico ou de estudo, compreendendo: (a) interrogagao do genotipo e/ou haplotipo do individuo em um local genetico ou Iocais de pelo menos um gene selecioriado a partir do gru- po consistindo em: AK5; BAI3; BBX; C18orf20; C5orf3; CACNA2D1; CCDC2; CD47; CNTNAP5; GRIA1; LAMA3; LOC131368; LRRC19; MGC27434； NFKBIZ; PIK3C3; SLC1A3; SPAG16; ST3GAL3; TEK; e TNFSF11; (b) em seguida: (i) inclusao do individuo no estudo se ο genotipo e indicati- vo de uma propensidade a Doenga de Alzheimer pelo individuo; (ii) exclusao do individuo do estudo se ο genotipo nao e indicativo de uma propensidade a Doenga de Alzheimer pelo individuo; ou (iii) ambos (i) e (ii).

10. Metodo para determinar a receptividade de um individuo com uma enfermidade para tratamento, compreendendo as eta pas de: (a) obtengao do genotipo ou haplotipo do individuo em um local genetico ou Iocais de pelo menos um gene selecioriado a partir do grupo consistindo em: AK5; BAI3; BBX; C18orf20; C5orf3; CACNA2D1 ； CCDC2; CD47; CNTNAP5; GRIA1; LAMA3; LOC131368; LRRC19; MGC27434; NFKBIZ; PIK3C3; SLC1A3; SPAG16; ST3GAL3; TEK; e TNFSF11; (b) avaliagao do genotipo e/ou haplotipo para determinar a pre- senga de uma mutagao ou polimorfismo selecionados a partir do grupo con- sistindo em: MUT-1 ； MUT-2; MUT-3; MUT-4; MUT-5; MUT-6; MUT-7; MUT-8; MUT-9; MUT-10; MUT-11; MUT-12; MUT-13; MUT-14; MUT-15; MUT-16; MUT-17; MUT-18; MUT-19; MUT-20; MUT-21; MUT-22; MUT-23; MUT-24; e MUT-25, no qual a presenga da mutagao ou polimorfismo e indicativa de um individuo que e responsivo a tratamento da enfermidade; e (c) identificagao do individuo como responsivo ao tratamento da enfermidade.

11. Metodo para determinagao, antes do tratamento, de um indi- viduo que desenvolvera toxicidade quando tratado com um composto; com- preendendo: (a) obtengao do genotipo ou haplotipo do individuo em um local genetico ou Iocais de pelo menos um gene selecionado a partir do grupo consistindo em: AK5; BAI3; BBX; C18orf20; C5orf3; CACNA2D1 ； CCDC2; CD47; CNTNAP5; GRIA1; LAMA3; LOC131368; LRRC19; MGC27434; NFKBIZ; PIK3C3; SLC1A3; SPAG16; ST3GAL3; TEK; e TNFSF11; (b) avaliagao do genotipo e/ou haplotipo para determinar a pre- senga de uma mutagao ou polimorfismo selecionados a partir do grupo con- sistindo em: MUT-1 ； MUT-2; MUT-3; MUT-4; MUT-5; MUT-6; MUT-7; MUT-8; MUT-9; MUT-10; MUT-11 ； MUT-12; MUT-13； MUT-14; MUT-15； MUT-16； MUT-17; MUT-18; MUT-19; MUT-20; MUT-21; MUT-22; MUT-23; MUT-24; e MUT-25, no qual a presenga da mutagao ou polimorfismo e indicativa de um individuo que desenvolvera toxicidade quando tratado com ο composto; e (c) identificagao do individuo como um individuo que desenvol- vera toxicidade quando tratado com ο composto.

12. Metodo para monitorar a progressao ou desenvolvimento de toxicidade em um individuo sendo tratado com um composto, ο metodo compreendendo: (a) provisao de uma primeira amostra biologica de teste do indi- viduo; (b) provisao de uma segunda amostra biologica de teste do indi- viduo que e mais posterior em tempo do que a primeira amostra biologica de teste; (c) contactar a amostra biologica de testes com um reagente pa- ra detectar um polinucleotideo ou polipeptideo codificado por um gene tendo uma sequencia compreendendo uma mutagao selecionada a partir do grupo consistindo em: MUT-1; MUT-2; MUT-3; MUT-4; MUT-5; MUT-6; MUT-7; MUT-8; MUT-9; MUT-10; MUT-11; MUT-12; MUT-13; MUT-14; MUT-15； MUT-16; MUT-17; MUT-18; MUT-19; MUT-20; MUT-21； MUT-22; MUT-23; MUT-24; e MUT-25; (d) determinagao do nivel de expressao do polipeptideo ou poli- nucleotideo na amostra biologica de testes; e (e) compara^ao do nivel do nivel de polinucleotideo ou polipef^^ ‘ tideo na primeira amostra biologica de teste com ο nivel do polinucleotid& ou polipeptideo na segunda amostra biologica de teste, no qual um aument<^> ou uma diminuigao no nivel de polinucleotideo ou polipeptideo na segund^^ amostra biologica de teste relativo ao nivel do polinucleotideo ou polipeptf一 deo na primeira amostra biologica de teste indica a progressao ou desenvol— vimento de toxicidade no individuo sendo tratado com ο composto.

13.

Metodo para determinagao de quando tratamento com um

composto deve ser descontinuado em um individuo em risco de ter toxicidade durante ou apos tratamento com ο composto, compreendendo as etapas de:

(a) provisao de uma amostra biologica de teste;

(b) contato da amostra biologica de teste com um reagente para detecgao de um polinucleotideo ou polipeptideo codificado por um gene ten-

do

uma

sequencia

compreendendo

uma

mutagao selecionado a partir do grupo consistindo em: MUT-1 ； MUT-2; MUT-3; MUT-4; MUT-5; MUT-6; MUT- 7; MUT-8; MUT-9; MUT-10; MUT-11; MUT-12; MUT-13; MUT-14; MUT-15； MUT-16; MUT-17; MUT-18; MUT-19; MUT-20; MUT-21 ； MUT-22; MUT-23; MUT-24; e MUT-25, (c) determinagao do nivel de expressao do polipeptideo ou poli- nucleotideo na amostra biologica de teste; e (d) comparagao do nivel do nivel de polinucleotideo ou polipep- tideo na amostra biologica de teste com ο nivel do polinucleotideo ou poli- peptideo em uma amostra de referencia padrao, no qual similaridade entre ο nivel de polinucleotideo ou polipeptideo e ο nivel do polinucleotideo ou poli- peptideo na amostra de referencia padrao e indicativa do desenvolvimento de toxicidade no individuo e determina que ο composto deve ser desconti- nuado.