CN108728533B - 用于髓母细胞瘤分子分型的基因群以及snca基因作为4型髓母细胞瘤的生物标志物的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于髓母细胞瘤分子分型的基因群，所述基因群由总共32个基因中的一个或多个组成。本发明还公开了用于对髓母细胞瘤进行分子分型的试剂盒，以及该基因群在制备用于对髓母细胞瘤进行分子分型的试剂中的用途。此外，本发明还提供了SNCA基因作为髓母细胞瘤的诊断或诊断标志物的用途。

Description

用于髓母细胞瘤分子分型的基因群以及SNCA基因作为4型髓 母细胞瘤的生物标志物的用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年4月20日的申请号为201710260539.4的中国专利申请的权益，在此将其全部内容引入作为参考。
技术领域
本发明为生物技术领域，具体而言，本发明涉及一种可用于对髓母细胞瘤进行分子分型的基因群及其用途以及SNCA基因的新用途。
背景技术
髓母细胞瘤(medulloblastoma，MB)是儿童常见的恶性小脑胚胎性肿瘤。随着研究的不断深入，已发现髓母细胞瘤不是一种单一的疾病，目前公认它可以分为4种主要的分子亚型，即Wnt型(Wnt sungroup)、Shh型(Sonic hedgehog subgroup)、3型(3型)和4型(4型)，这些分子亚型在转录谱、细胞遗传学、流行病学、临床以及预后等方面都表现出各自不同的特点。其中，Wnt型患者预后最好，可以适当减少放化疗剂量，尽可能保护患儿的神经系统功能；3型患者中许多患者存在MYC基因扩增，预后最差，需要增加治疗强度以延长患者的生存时间。因此，对髓母细胞瘤的分型进行研究对于阐明发病机制、开展临床试验的、研发靶向治疗药物、改进临床治疗方案、分层管理危险以及个体化治疗都有重要意义。
在病理实验室，福尔马林固定、石蜡包埋(formalin-fixed paraffin embedded，FFPE)的标本是最常见的保存组织样本的方法，如果能够利用这种标本进行分子亚型的检测无疑会带来很大的便利，并且有利于对以往保存的标本进行研究。加拿大研究者应用nanoString nCounter技术建立了一种基于FFPE标本的MB分子亚型检测方法，这种方法可以利用从FFPE标本中提取到的已降解为小片段的RNA，通过序列特异的探针检测特定RNA的表达水平，对样本进行分子亚型的检测。这种方法对RNA的数量要求较少(100-200ng)，不需要酶促扩增，检测结果与利用基因组转录芯片分析获得的数据有较高的一致性，在近8年的FFPE标本中准确性≥95％，比较可靠、快速而且可重复性高，费用相对较低，适合在临床试验中应用。
基于nanoString nCounter技术，目前利用22个与MB分子亚型相关基因建立了针对髓母细胞瘤的分子亚型检测方法，该方法已被国际上公认为是对髓母细胞瘤进行分子亚型检测的金标准。然而，该方法仍有一定的局限性：该基因组合仅限于将MB中4个分子亚型进行诊断性区分，但没有进一步提供有关基因靶向治疗的潜在分子靶点和判断患者预后的信息；同时，该组合提供的的分子标志物仅基于RNA水平，而没有通过蛋白水平进行验证，从而限制了相关分子标志物在常规免疫组化方法中的应用前景。因此，本领域不仅需要找到更多的能够与髓母细胞瘤不同亚型显著相关的基因，以实现适用范围更广、检测方法更为多样地识别髓母细胞瘤分子亚型，而且应该整合更多以临床基因靶向治疗和预后判断为目标的基因，从而有助于实现开展有效检测与个性化用药，真正实现对患者的精准治疗。
此外，针对占患病人群比例最大的4型MB，目前尚缺少具有高特异性、高灵敏度的诊断标志物。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的发明人在已有22个标志基因的基础上，对大量可能与肿瘤诊断和靶向治疗相关的分子标志物进行了筛选，以期将不同MB亚型的更多潜在的特异性生物标志物整合到NanoString平台中，从而改善分型和诊断效率，并从中发现MB的新型治疗靶标。
基于大量研究，本发明的发明人选择出11个肿瘤相关基因与已知22个MB标志基因组成基因群，作为新的范围更广的NanoString MB分型基因群，其分型结果与22个经典标志基因的分型结果基本一致。并且，还从中选择出10个与髓母细胞瘤不同亚型显著相关的基因，作为可与已知22个标志基因相整合的基于nanoString nCounter技术、对髓母细胞瘤不同亚型进行检测的新的基因群。
在上述研究中，本发明的发明人还发现了SNCA基因与4型MB相关，可以作为4型MB的具有高特异性、高灵敏度的诊断标志物。
因此，本发明的一个目的是提供用于髓母细胞瘤分子分型的基因群，该基因群可以基于nanoString nCounter技术，对髓母细胞瘤进行不同亚型的区分或检测，或者特定亚型的识别或诊断，即进行分子分型。
本发明的另一个目的是提供一种试剂盒，该试剂盒可用于检测本发明的基因群，例如采用nanoString nCounter技术。
本发明的又一个目的是提供该基因群在制备用于诊断或检测髓母细胞瘤的试剂中的用途。
本发明还首次发现了SNCA基因可以作为髓母细胞瘤、特别是4型髓母细胞瘤的诊断标志物，因此本发明还就SNCA基因的这一新用途提供相关技术方案。
本发明的技术方案如下。
一方面，本发明提供一种用于髓母细胞瘤分子分型的基因群，所述基因群包括：
(1)WIF1基因、TNC基因、GAD1基因、DKK2基因、EMX2基因、PDLIM3基因、EYA1基因、HHIP基因、ATOH1基因、SFRP1基因、IMPG2基因、GABRA5基因、EGFL11基因、NRL基因、MAB21L2基因、NPR3基因、KCNA1基因、EOMES基因、KHDRBS2基因、RBM24基因、UNC5D基因、OAS1基因中的一个或多个；和
(2)ALK基因、TP53基因、MYCN基因、GLI1基因、MYC基因、SNCAIP基因、FGFR1基因、PDGFRA基因、CCND1基因、HNF4A基因和SNCA基因中的一个或多个。
本发明的发明人发现，在上述第(2)部分中的11个肿瘤相关基因中，有10个基因与髓母细胞瘤的不同亚型具有相关性：ALK、FGFR1、PDGFRA与WNT型相关；TP53、MYCN、GLI1、CCND1与SHH型相关；MYC与3型相关；SNCAIP、SNCA与4型相关。
因此，除了上述第(1)部分中的基因，优选地，所述基因群还包括上述第(2)部分中的ALK基因、FGFR1基因、PDGFRA基因，以及可选地其余基因中的一个或多个。该基因群可用于MB中的WNT型的特异性检测或诊断。
或者，优选地，所述基因群还包括上述第(2)部分中的TP53基因、MYCN基因、GLI1基因、CCND1基因，以及可选地其余基因中的一个或多个。该基因群可用于MB中的SHH型的特异性检测或诊断。
或者，优选地，所述基因群还包括上述第(2)部分中的MYC基因，以及可选地其余基因中的一个或多个。该基因群可用于MB中的3型的特异性检测或诊断。
或者，优选地，所述基因群还包括上述第(2)部分中的SNCAIP基因和/或SNCA基因，以及可选地其余基因中的一个或多个。该基因群可用于MB中的4型的特异性检测或诊断。
更优选地，除了上述第(1)部分中的基因，所述基因群还包括上述第(2)部分中的ALK基因、FGFR1基因、PDGFRA基因、TP53基因、MYCN基因、GLI1基因、CCND1基因、MYC基因以及SNCAIP基因和SNCA基因中的任一个或两个。
根据本发明的具体实施方式，除了上述第(1)部分中的基因，所述基因群还包括上述第(2)部分中的全部基因。
对于本发明采用的各个基因，其各自的序列可见本领域公知基因数据库。示例性地，各个基因分别包括如下表1所示的序列：
表1.基因序列
基因 数据库登录号 基因 数据库登录号 基因 数据库登录号
WIF1 NM_007191.4 GABRA5 NM_000810.3 ALK NM_004304.3
TNC NM_002160.3 EGFL11 NM_198283.1 TP53 NM_000546.2
GAD1 NM_000817.2 NRL NM_006177.3 MYCN NM_005378.4
DKK2 NM_014421.2 MAB21L2 NM_006439.4 GLI1 NM_005269.2
EMX2 NM_004098.3 NPR3 NM_001204375.1 MYC NM_002467.3
PDLIM3 NM_014476.4 KCNA1 NM_000217.2 SNCAIP NM_001242935.1
EYA1 NM_172059.2 EOMES NM_001278182.1 FGFR1 XM_006716303.1
HHIP NM_022475.1 KHDRBS2 NM_152688.2 PDGFRA NM_006206.3
ATOH1 NM_005172.1 RBM24 NM_153020.2 HNF4A NM_178850.1
SFRP1 NM_003012.4 UNC5D NM_080872.2 CCND1 NM_053056.2
IMPG2 NM_016247.2 OAS1 NM_001032409.1 SNCA NM_000345.2
本发明提供的任何基因群可采用本领域公知的任何技术进行检测，用于对髓母细胞瘤进行分型，包括检测或诊断。优选地，本发明提供的基因群以及下述各技术方案采用nanoString nCounter技术平台，例如nanoString
Figure BSA0000162634640000042
Prep Station和nanoString
Figure BSA0000162634640000043
Digital Analyzer。
另一方面，本发明提供用于对髓母细胞瘤进行分子分型的试剂盒，所述试剂盒包括本发明提供的任何基因群进行检测的试剂。
优选地，所述试剂盒包括采用nanoString nCounter技术对本发明提供的任何基因群进行检测的试剂；
更优选地，所述试剂包括以下中的一种或多种：
(1)RNA提取试剂；和/或
(2)对本发明提供的任何基因群进行检测的探针。
其中，所述探针优选用于nanoString nCounter技术，优选地，所述探针分别包括如下表2所示的序列中的任一个：
表2.探针序列
Figure BSA0000162634640000041
Figure BSA0000162634640000051
又一方面，本发明还提供本发明提供的任何基因群在制备用于对髓母细胞瘤进行分子分型的试剂中的用途。在本发明提供的任何基因群基础上，可以采用目前已知或以后开发的任何技术进行髓母细胞瘤的分子分型。
对于髓母细胞瘤，迫切需要更多亚型特异性的标志物来帮助诊断、判断预后以及精准治疗。本发明的发明人采用nanoString nCounter技术平台，在已有22个标志基因的基础上，增加了11个癌症相关基因，由此将部分经不同分子检测方法(二代测序、荧光原位杂交和免疫组化等)验证的与预后相关的基因(如：TP53、MYC和MYCN等)整合到这一检测平台中，改善髓母细胞瘤的临床分子检测效率，加强原有nanoString分子分型方法的可靠性，并使得该分型方法更全面、效率更高。采用这11个基因中的一个、多个乃至全部与已有22个标志基因相组合，所形成的新的基因群可以用于更准确、全面地对髓母细胞瘤进行分子分型；并且，本发明提供的新的基因群还可以提供部分潜在的基因靶向治疗的分子靶点(如：FGFR1和PDGFRA等)，从而实现已有分型方法不能实现的技术效果。
并且，在这11个癌症相关基因中，还发现了与特定MB亚型显着相关的基因，包括ALK、FGFR1、PDGFRA(WNT型)；TP53、MYCN、GLI1、CCND1(SHH型)；MYC(3型)；和SNCAIP、SNCA(4型)。由此针对性地，将新发现的亚型特异性基因与已有22个标志基因相组合，形成了针对特定MB亚型的基因群，可以用于不同亚型的特异性分子分型。
本发明还首次发现了SNCA基因可以作为髓母细胞瘤、特别是4型髓母细胞瘤的诊断标志物。因此，本发明提供SNCA基因作为髓母细胞瘤、优选4型髓母细胞瘤的诊断或检测标志物的用途。
因此，再一方面，本发明还提供SNCA基因在制备用于诊断或检测髓母细胞瘤的试剂中的用途。
优选地，所述髓母细胞瘤为4型髓母细胞瘤；
优选地，所述SNCA基因包括NM_000345.2所示的序列。
还一方面，本发明提供一种用于诊断或检测髓母细胞瘤的试剂盒，所述试剂盒包括对SNCA基因进行检测的试剂。
优选地，所述髓母细胞瘤为4型髓母细胞瘤；其中优选地，所述SNCA基因包括NM_000345.2所示的序列。
所述试剂优选为对SNCA基因的转录和/或表达进行检测的试剂；优选地，所述试剂包括以下中的一种或多种：SNCA基因的RNA提取试剂；RNA转录量检测试剂；蛋白表达量检测试剂；蛋白抗体等。
再一方面，本发明还提供SNCA基因在制备用于治疗髓母细胞瘤的药物中的用途。
SNCA基因首次被发现与4型髓母细胞瘤相关。具体地，发明人通过敲低和过表达SNCA基因实验发现，该基因具有抑制髓母细胞瘤侵袭性和诱导肿瘤细胞凋亡的作用。在髓母细胞瘤细胞中，SNCA的表达受表观遗传学的调控，使得其表达量低于在正常细胞中；同时，其在4型髓母细胞瘤中的表达高于其在其他亚型髓母细胞瘤中的表达。由于基因的表观遗传学改变可以通过药物进行逆转，因此，SNCA基因不仅可以作为针对4型髓母细胞瘤的新的诊断标志物，还可以作为髓母细胞瘤的潜在分子治疗靶点，有助于髓母细胞瘤患者的检测、分型与基因治疗。
附图说明
图1是采用本发明提供的由33个基因组成的基因群(A)和经典的22个基因组成的基因群(B)，基于nanoString nCounter技术平台对FFPE样品的分子分型结果。
图2是本发明提供的10个基因作为MB不同亚型特异性标志物的ROC曲线。
图3是SNCA基因在RNA水平上和蛋白质水平上与4型MB相关性的实验结果。
图4是质粒GV219的图谱，该质粒总共5427bp，主要元件包括：CMV启动子(232-819bp)，MCS(895-1000bp)，BGH poly A(1027-1251bp)，f1 ori(1297-1725 bp)，SV40启动子(1730-2073bp)，Neomycin(2135-2929bp)，SV40 poly A(3103-3233bp)，pUC ori(4286-3616bp)，Ampicillin(5291-4431bp)，AmpR启动子(5361-5333bp)；以及SNCA基因序列。
图5是SNCA基因在MB细胞中经siRNA转染被敲除后的实验结果。
图6是SNCA基因在MB细胞的伤口愈合与侵袭能力中作用的实验结果。
图7是SNCA基因在MB细胞的凋亡与增殖中作用的实验结果。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
其中，本发明采用的nanoString nCounter技术平台为nanoString
Figure BSA0000162634640000072
Prep Station和nanoString
Figure BSA0000162634640000073
Digital Analyzer。
关于数据统计分析，所有统计分析采用SPSS 20统计软件包进行。采用t检验确定组(组)之间的统计差异。采用ANOVA评估SNCA的表达与临床病理特征的关系。采用Spearman分析评估SNCA在RNA水平和蛋白质表达水平的相关性。P值＜0.05认为具有统计学意义。
实施例1 髓母细胞瘤分型以及特定亚型的相关标志基因的筛选
随机获得12个髓母细胞瘤患者的FFPE样品，采用商购试剂盒提取RNA并测定RNA浓度。
采用nanoString nCounter技术平台(内标基因为CLTC、GAPDH和TUBB)，针对以下基因，对提取到的RNA进行检测：
表3.候选基因
Figure BSA0000162634640000071
Figure BSA0000162634640000081
从22个公认分子亚型特异性基因中选择12个基因(每个亚型挑选3个)，通过Nanostring检测对MB进行分子亚型的初步判断，在此基础上进一步检测上述89个基因在MB中的表达，从中筛选出与MB分子亚型相关的可能成为分子治疗靶点的基因，同时选出采用其它技术方法(DNA二代测序、基因组表达芯片、荧光原位杂交和免疫组化等)检出的可能与MB分子亚型相关的基因共11个，分别是PDGFRA、FGFR1、ALK、CCND1、MYCN、TP53、GLI1、MYC、HNF4A、SNCAIP和SNCA。其中，潜在药物靶点的基因包括：PDGFRA、FGFR1和ALK；采用其它检测方法和技术平台证明与髓母细胞瘤分子亚型诊断或预后判断相关的包括：MYCN、TP53、MYC和SNCAIP；有国外文献报道的可能与髓母细胞瘤发生发展相关的、可能作为分子诊断和靶向治疗标志物的基因包括：CCND1、GLI1、HNF4A和SNCA。
实施例2 甲醛固定石蜡包埋样品的NanoString分型与免疫组织化学染色
采用实施例1中筛选出的11个肿瘤相关基因与已知22个与MB分子亚型相关基因(WIF1、TNC、GAD1、DKK2、EMX2、PDLIM3、EYA1、HHIP、ATOH1、SFRP1、IMPG2、GABRA5、EGFL11、NRL、MAB21L2、NPR3、KCNA1、EOMES、KHDRBS2、RBM24、UNC5D、OAS1)组成33个基因的基因群，与该已知22个基因的基因群进行基于Nano-String nCounter分析平台的MB样品分型比较，各基因的nanoString nCounter检测探针如上文表2中所示。
从来自北医三院、北京天坛医院、北京三博脑科医院和安徽省立医院的106名髓母细胞瘤(MB)患者获得甲醛固定石蜡包埋的样品(FFPE样品)。从75个MB样品的切片提取总RNA，基于Nano-String nCounter分析平台进行分析。涉及mRNA定量包括样品制备、杂交、检测和扫描等操作均基于本领域常规技术进行。通过Qubit(Thermo Fisher)测量RNA浓度。所有样品由至少80％的肿瘤细胞组成。原始NanoString数据使用nSolver AnalysisSoftware version 2.5(NanoString Technologies)进行标准化。采用R statisticalprogramming environment(version 3.1.1)进行统计分析。Kruskal-Wallis测试用于关联肿瘤类型和基因表达。所有实验重复两次。
对93个MB的切片样品进行α-synuclein的免疫组化染色。使用α-synuclein mAb(1∶1500；610787；BD Biosciences，San Jose，CA，USA)作为一抗，两位神经病理学家独立评估α-synuclein的染色结果，合并成共同得分，其中对每位患者评估肿瘤区域的细胞质和/或核中具有强α-synuclein免疫反应性染色的细胞比例，无信号或信号弱的评分为零；肿瘤血管中的红细胞作为阳性内标。
样品信息与相关结果如下表4和图1所示。
表4.髓母细胞瘤样品的临床病理信息与分型结果
Figure BSA0000162634640000091
Figure BSA0000162634640000101
MB，髓母细胞瘤；M，男；F，女；C，经典型；N/D，结节/促纤维增生型；EN，广泛结节型；L/A，大细胞/间变型；NA，无结果；免疫组化(％)：α-synuclein蛋白阳性表达的细胞占全部肿瘤细胞的百分比。
对72个样品进行了有效的分子分型，得到的分子分型结果为：11.11％(8/72)为WNT型，20.83％(15/72)为SHH型，25％(18/72)为3型，40.06％(31/72)为4型，其分型结果与采用22个经典基因的分型结果基本一致，结果分别见图1中的小图A和小图B，其中红色表示基因的高表达量，绿色表示基因的低表达量。同时发现了与MB分子亚型特异性相关的受表观遗传学调控的分子标志物以及潜在分子靶向治疗相关的分子靶点。
进一步测定上述11个肿瘤相关基因与髓母细胞瘤亚型的相关性，发现这些基因中有10个与髓母细胞瘤相关的不同亚型具有相关性：ALK、FGFR1、PDGFRA与WNT型相关；TP53、MYCN、GLI1、CCND1与SHH型相关；MYC与3型相关；SNCAIP、SNCA与4型相关。结果见图1中的小图A。
进一步评估上述10个基因作为区分髓母细胞瘤不同亚型的诊断标志物的准确性。基于每个基因在相应亚型中RNA表达量与其他3种亚型相比较(来自NanoString分析)，生成ROC曲线，用以评价该基因的表达变化对相应分子亚型预测的敏感性和特异性。得到的各自ROC曲线下面积AUC：PDGFRA、FGFR1和ALK在WNT型中分别为0.8594、0.9692和0.9626；CCND1、MYCN、TP53和GLI1在SHH型中分别为0.8259、0.9386、0.8371和0.9900；MYC在3型中为0.9033；SNCAIP和SNCA在4型中分别为0.9103和0.8875。结果见下表5和图2中的2A至2D。
表5. 10个标志基因与髓母细胞瘤不同亚型的ROC分析
基因 分子亚型 AUC SE 灵敏度(％) 特异性(％) p值
PDGFRA WNT 0.8594 0.0994 87.5 82.81 p＝0.0010
FGFR1 WNT 0.9692 0.0199 100 93.85 p＜0.0001
ALK WNT 0.9626 0.0323 85.71 96.92 p＜0.0001
CCND1 SHH 0.8259 0.0578 81.25 73.21 p＜0.0001
MYCN SHH 0.9386 0.0273 100 76.79 p＜0.0001
TP53 SHH 0.8371 0.0533 81.25 82.14 p＜0.0001
GLI1 SHH 0.99 0.0082 100 91.07 p＜0.0001
MYC 3型 0.9033 0.0373 83.33 87.04 p＜0.0001
SNCAIP 4型 0.9103 0.0325 83.87 82.93 p＜0.0001
SNCA 4型 0.8875 0.0385 87.1 80.49 p＜0.0001
从表5中可知，本发明首次发现SNCA基因与4型髓母细胞瘤相关，具有高特异性(87.1％)和高灵敏度(80.49％)。在RNA水平上，SNCA在4型MB中的表达要显著高于在WNT、SHH和3型MB中(P＜0.0001)，结果参见图3中的3A。SNCA基因的表达蛋白α-synuclein免疫反应性的比例也显著高于在WNT和SHH MB中，结果参见表6和图3中的3B；并且，SNCA在RNA和蛋白质水平上的表达有显著的相关性，结果参见图3中的3C。
表6.髓母细胞瘤中分子变化的显著性
Figure BSA0000162634640000121
Figure BSA0000162634640000131
+，阳性染色；-，阴性染色；
p*，比较的mRNA表达水平：4型vs WNT，SHH和3型；
Figure BSA0000162634640000132
比较的mRNA表达水平：4型vs MB的其他三种亚型；
Figure BSA0000162634640000133
比较的蛋白表达水平：4型vs WNT和SHH；
P§，SNCA在RNA和蛋白水平上的表达显示显著相关。
以下进行了SNCA基因作为4型髓母细胞瘤的新型、灵敏、特异性的表观遗传学诊断标志物的进一步鉴定。
实施例4 SNCA在MB细胞中的敲除和过表达
将Daoy、D283和D341细胞(来自ATCC)以4×104的细胞密度接种在6孔板中，采用Chemifect转染试剂(Feng Rui，China)根据制造商说明书，将3个SNCA siRNA中任一个(siRNA1、siRNA2、siRNA3)转染到细胞中，终浓度为20μmol/L。
以GV219(图4中的4A)为骨架，经由酶切位点XhoI/KpnI采用本领域常规方法插入SNCA基因片段，来构建质粒GV219-SNCA-wt。将构建好的GV219-SNCA-wt作为模板，以下序列分别作为正向引物和反向引物进行扩增：
SEQ-F(769-789bp)：CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG
SEQ-R(1101-1121bp)：CCCACTGTCCTTTCCTAATAA
验证得到的序列包含SNCA基因序列(图4中4B的斜体部分)，证明SNCA野生型质粒构建成功。使用Neofect试剂(Lingke Chuangzhi，China)根据制造商说明书，进行SNCA野生型质粒(GV219-SNCA-wt)和阴性对照质粒(GV219)的转染。
在SNCA敲除或过表达后24小时收获细胞，然后分别进行定量RT-PCR和蛋白质印迹分析。其中关于SNCA mRNA表达的RT-PCR，cDNA第一链合成使用5×all-in-one RT-mastermix(G486；Applied Biological Materials，Canada)，按照制造商说明进行。对于qRT-PCR反应，使用EvaGreen 29 qPCR mastermix-LR(G486；Applied BiologicalMaterials，Richmond，Canada)。操作程序对于3000p reader(Applied Biosystems，LifeTechnology)进行优化。通过使用ΔΔCT方法，对于目的基因计算相对基因表达，其中循环阈值针对β-catenin标准化。关于蛋白质印迹分析，使用α-synucleih mAb(1∶1000，610787；BD Biosciences)作为一抗，检测Daoy、D283或D341细胞中在3种SNCAsiRNA中任一个、GV219-SNCA-wt质粒或GV219质粒转染之前和之后的α-synuclein表达。β-Actin mAb(1∶1000，mAbcam 8226；Abcam，Cambridge，MA，USA)用作一抗内标。
上文中各siRNA、RT-PCR采用的引物序列见下表7。
表7敲除和过表达采用的引物序列
引物序列
RT-PCR SNCA 正义：5′-TGT AGG CTC CAA AAC CAA GG-3′
反义：5’-TGT CAG GAT CCA CAG GCA TA-3′
β-catenin 正义：5′-CTA GGC CAC AGA ATT GAA AGA TCT-3′
反义：5′-GTA GGT AAT TCT AGC ATC ATC C-3′
siRNA1 SNCA 正义：5′-GAG ACU AUG CAC CUA UAA ATT-3′
反义：5′-UUU AUA GGU GCA UAG UCU CAT-3′
siRNA2 SNCA 正义：5′-GCA AGU GAC AAA UGU UGG ATT-3′
反义：5′-UCC AAC AUU UGU CAG UUG CTT-3′
siRNA3 SNCA 正义：5′-GGG CAA GAA UGA AGA AGG ATT-3′
反义：5′-UCC UUC UUC AUU CUU GCC CTT-3′
SNCA在MB细胞系中的表达被siRNA抑制，结果如图5所示。其中图5A示出了α-synuclein(α-Syn)在髓母细胞瘤中的表达通过蛋白质印迹分析检测，在Daoy细胞中的表达水平高于在D283和D341中；图5B示出了在siRNA转染后24小时，在Daoy细胞中α-synuclein的表达被抑制；图5C示出了在siRNA转染后24小时，SNCA基因在Daoy细胞中的表达减少超过50％。实验重复至少2次；β-Actin为管家基因，N-con为阴性对照(不转染siRNA)。
实施例5 SNCA在MB细胞伤口愈合和侵袭能力中的作用
按照实施例4所述进行Daoy细胞的3个SNCA siRNA中任一个的转染。转染后24小时在汇合的细胞层上刮出一道线性划痕，然后洗涤细胞两次以去除脱离的细胞和残余，之后观察和测量24小时内划痕尺寸变化。实验重复三次。
结果见图6中的图6A，显示24小时内，该Daoy细胞在转染SNCA siRNA后与不转染siRNA的阴性对照(N-con)后相比，迁移能力显著增强。
使用Transwell chamber测定进行细胞侵袭实验。按照实施例4所述进行Daoy细胞的3种SNCA siRNA中任一个、GV219-SNCA-wt质粒或GV219质粒的转染，然后将细胞在具有涂布了25μL Matrigel(1：3；Corning，Corning，NY，USA)的8μm Transwell滤器的上层隔室中铺平板。之后，诱导该细胞朝着下层隔室中含10％FBS的培养基侵袭，时间为24小时。固定侵袭的细胞，用0.1％结晶紫染色，然后使用明视野显微镜分析。实验重复三次。
结果见图6中的图6B，显示24小时内，该Daoy细胞在转染SNCA siRNA后与不转染siRNA的阴性对照(N-con)后相比，侵袭能力显著增强；相比之下，过表达SNCA可以显著降低细胞的侵袭能力。
实施例6 SNCA在MB细胞凋亡中的作用
按照实施例4所述进行Daoy细胞的GV219-SNCA-wt质粒或GV219质粒的转染。
使用流式细胞术，按照制造商的说明，通过Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)检测试剂盒确定凋亡诱导。流式细胞术分析在BD FACS Canto II流式细胞仪(BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA)上进行，采用DIVA软件(BD Biosciences，Franklin Lakes)收集数据，采用FlowJo软件(Tree Star，Ashland，OR，USA)分析数据，其中使用适当的对照和门控。Annexin V-阳性和PI-阴性的细胞处于凋亡早期中，Annexin V-和PI-均阳性的细胞处于凋亡晚期或已经死亡。转染了空质粒的细胞和正常细胞用作对照。通过CCK-8(LifeScience，USA)，根据制造商的说明，检测细胞增殖。
结果如图7所示。相比正常细胞和阴性对照，过表达SNCA的MB细胞处于凋亡早期、凋亡晚期或已经死亡的比例要显著更高(P＜.0001)。而在MB细胞增殖方面，SNCA过表达之前和之后没有显著差别，表明SNCA可以促进MB细胞的凋亡活性，而对细胞增殖没有显著作用。
如上文实施例所示，通过免疫组化、启动子甲基化特异性PCR、焦磷酸测序、基因敲除、基因过表达、实时PCR分析、蛋白质印迹分析，以及经细胞伤口愈合的细胞迁移分析及侵袭分析、细胞增殖和凋亡分析等，研究了SNCA基因在正常细胞、MB细胞中的转录表达，以及SNCA基因与细胞迁移、侵袭、增殖和凋亡方面的作用，发现，SNCA基因敲除和基因过表达以及其他细胞实验证明SNCA基因具有抑制肿瘤侵袭和促进细胞凋亡的作用。因此，本发明首次鉴定了，SNCA基因是4型髓母细胞瘤的新型的灵敏、特异性的表观遗传学标志物。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
Figure ISA0000162634660000011
Figure ISA0000162634660000021
Figure ISA0000162634660000031
Figure ISA0000162634660000041
Figure ISA0000162634660000051
Figure ISA0000162634660000061
Figure ISA0000162634660000071

Claims (5)

1.一种用于对髓母细胞瘤进行分子分型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括对基因群的表达量进行检测的试剂，所述基因群包括：
WIF1基因、TNC基因、GAD1基因、DKK2基因、EMX2基因、PDLIM3基因、EYA1基因、HHIP基因、ATOH1基因、SFRP1基因、IMPG2基因、GABRA5基因、EGFL11基因、NRL基因、MAB21L2基因、NPR3基因、KCNA1基因、EOMES基因、KHDRBS2基因、RBM24基因、UNC5D基因、OAS1基因、ALK基因、TP53基因、MYCN基因、GLI1基因、MYC基因、SNCAIP基因、FGFR1基因、PDGFRA基因、CCND1基因和SNCA基因；
其中，ALK基因、FGFR1基因、PDGFRA基因与WNT型相关；TP53基因、MYCN基因、GLI1基因、CCND1基因与SHH型相关；MYC基因与3型相关；SNCAIP、SNCA基因与4型相关。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括采用nanoStringnCounter技术对权利要求1所述的基因群的表达量进行检测的试剂。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括：
(1) RNA提取试剂；和
(2) 对权利要求1所述的基因群进行检测的探针。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述探针包括SEQ ID NO. 1至SEQ IDNO. 30、SEQ ID NO. 32和SEQ ID NO. 33分别所示的序列。
5.检测权利要求1所述的基因群的表达量的试剂在制备用于对髓母细胞瘤进行分子分型的试剂中的用途。
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Medulloblastoma: Molecular Classification-Based Personal Therapeutics;Tenley C. Archer，Elizabeth L.Mahoney，Scott L.Pomeroy，等;《Neurotherapeutics》;20170406;第14卷;第267页右栏最后一段和268页左栏第1段 *
Rapid, reliable, and reproducible molecular sub-grouping of clinical medulloblastoma samples;Paul A Northcott,David J H Shih,Marc Remke，等;《Acta Neuropathol》;20111106;第123卷;表1、图1 *
The Shh Receptor Boc Promotes Progression of Early Medulloblastoma to Advanced Tumors;Frederic Mille,Lukas Tamayo-Orrego,Martin Le，等;《Developmental Cell》;20141013;第31卷(第1期);第3页左栏最后一段和右栏第一段，第5页右栏最后一段，第7页左栏第一段，第7页右栏第3段 *

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