CN104278027A

CN104278027A - 一种鉴定猪的肌内脂肪含量高低的方法及其专用引物对

Info

Publication number: CN104278027A
Application number: CN201410409049.2A
Authority: CN
Inventors: 王立贤; 张龙超; 王立刚; 李娜
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS; Tianjin Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science
Priority date: 2014-08-19
Filing date: 2014-08-19
Publication date: 2015-01-14
Anticipated expiration: 2034-08-19
Also published as: CN104278027B

Abstract

本发明公开了一种鉴定猪的肌内脂肪含量高低的方法及其专用引物对。本发明公开一种扩增含有g.38240C>A多态性位点的DNA片段的引物对。本发明公开的方法可对待选猪进行早期筛选，有效地缓解实际生产中的选取优良种猪时间长的问题，降低了育种花费，有效降低或提高实际生产中的猪肌内脂肪含量，该方法准确度高，检测费用低，并可实现自动化检测，在猪的育种方面具有很高的实践应用价值。

Description

一种鉴定猪的肌内脂肪含量高低的方法及其专用引物对

技术领域

本发明涉及一种鉴定猪的肌内脂肪含量高低的方法及其专用引物对，属于生物技术领域。

背景技术

猪肉质品质是猪的重要经济性状，它与人们的肉食营养、肉食品加工和养猪业经济效益都密切相关。因此，猪肉质品质研究已成为肉食品加工和猪遗传育种领域的一个重要组成部分，世界各国相关科技工作者也将猪肉质品质作为研究的重点与热点。肌内脂肪，俗称大理石花纹，对于猪肉的品质评定是一个必不可少的指标，其重要性表现在对肌肉组织的感观、可口性、加工及储藏性能均有影响。肌内脂肪含量与肉质的嫩度、风味和多汁性呈正相关，适宜的肌内脂肪含量可产生较为理想的口感，是决定肉质的重要性状，也符合我国传统烹饪文化对风味的要求，因此，肌内脂肪含量已成为重要的肉质指标纳入猪的育种计划。尽管大多肉质性状的遗传力较低，但肌内脂肪呈中等遗传力，表明肉质性状可以通过育种获得较大的遗传改进。

有研究对猪肉肌内脂肪含量QTL进行定位分析，将这一肉品质性状QTL定位于12号染色体上,定位区间为42-43Mb(Ma J,Ren J,Guo Y,Duan Y,Ding N,Zhou L,Li L,Yan X,Yang K,Huang L,Song Y,Xie J,Milan D,Huang L.Genome-wideidentification of quantitative trait loci for carcass composition and meatquality in a large-scale White Duroc x Chinese Erhualian resource population.Anim Genet.2009,40(5):637-647.)。也有全基因组关联研究(GWAS)，将肌内脂肪含量性状全基因组显著关联区间定位于12号染色体上43-55Mb区间(Luo W,Cheng D,Chen S,Wang L,Li Y,Ma X,Song X,Liu X,Li W,Liang J,Yan H,Zhao K,WangC,Wang L,Zhang L.Genome-wide association analysis of meat quality traitsin a porcine Large White×Minzhu intercross population.J Int Biol Sci.2012；8(4):580-595.)。MAP2K4基因位于此QTL和GWAS显著区间内，且有研究表明，MAP2K4(mitogen-activated protein kinase kinase4)可作为肌内脂肪含量性状候选基因(Ramayo-Caldas Y,Fortes MR,Hudson NJ,Porto-Neto LR,Bolormaa S,BarendseW,Kelly M,Moore SS,Goddard ME,Lehnert SA,Reverter A.A marker-derived genenetwork reveals the regulatory role of PPARGC1A,HNF4G,and FOXP3inintramuscular fat deposition of beef cattle.J Anim Sci.2014；92:2832-2845.)。综合，MAP2K4基因作为肌内脂肪含量性状候选基因，具有很高的研究价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定猪的肌内脂肪含量高低的方法及其专用引物对。

本发明提供一种扩增含有g.38240C>A多态性位点的DNA片段的引物对；

所述g.38240C>A多态性位点为GenBank Accession Number为NC_010454.3的序列的自5’末端起第38240位；

所述GenBank Accession Number为NC_010454.3的序列的更新日为2013年9月29日。

上述引物对中，所述引物对由SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子组成。

一种鉴定或辅助鉴定猪的肌内脂肪含量高低的试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒包含上述任一所述的引物对。

一种鉴定或辅助鉴定猪的肌内脂肪含量高低的方法也属于本发明的保护范围，该方法为：纯合CC基因型的猪的肌内脂肪含量大于杂合AC基因型的猪的肌内脂肪含量，杂合AC基因型的猪的肌内脂肪含量大于纯合AA基因型的猪的肌内脂肪含量；

所述纯合CC基因型的猪为g.38240C>A多态性位点的碱基均为C的猪；

所述杂合AC基因型的猪为g.38240C>A多态性位点的碱基为A和C的猪；

所述纯合AA基因型的猪为g.38240C>A多态性位点的碱基均为A的猪；

上述方法中，所述纯合CC基因型、杂合AC基因型或纯合AA基因型的判定方法如下：以猪的基因组DNA为模板，以上述任一所述的引物为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，如果PCR扩增产物自5’末端起第216位的碱基均为C，则所述猪的基因型为纯合CC基因型，如果PCR扩增产物自5’末端起第216位的碱基为A和C，则所述猪的基因型为杂合AC基因型，如果PCR扩增产物自5’末端起第216位的碱基均为A，则所述猪的基因型为纯合AA基因型。

一种选育高肌内脂肪含量的猪的方法也属于本发明的保护范围，是选择纯合CC基因型的猪进行选育；

上述方法中，所述纯合CC基因型的判定方法如下：以猪的基因组DNA为模板，以上述任一所述的引物为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，如果PCR扩增产物自5’末端起第216位的碱基均为C，则所述猪的基因型为纯合CC基因型。

一种选育低肌内脂肪含量的猪的方法也属于本发明的保护范围，是选择纯合AA基因型的猪进行选育；

上述方法中，所述纯合AA基因型的判定方法如下：以猪的基因组DNA为模板，以上述任一所述的引物为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，如果PCR扩增产物自5’末端起第216位的碱基均为A，则所述猪的基因型为纯合AA基因型。

上述任一所述的方法中，所述猪为大民杂交猪，由大白猪和民猪杂交得到。

上述任一所述的引物对、上述试剂盒和/或上述任一所述的方法在猪的选育中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述猪为大民杂交猪，由大白猪和民猪杂交得到。

本发明使用测序的方法检测g.38240C>A多态性位点处的碱基，判别猪个体的基因型，从而对猪肌内脂肪含量性状进行选择，可使猪平均肌内脂肪含量增大约1.25％，获得高肌内脂肪含量的猪。本发明提供的方法可对待选猪进行早期筛选，有效地解决实际生产中的选取优良种猪时间长的问题，降低了育种花费，有效降低或提高实际生产中的猪的肌内脂肪含量，该方法准确度高，检测费用低，并可实现自动化检测，在猪的育种方面具有很高的实践应用价值。

附图说明

图1为AA基因型个体和CC基因型个体g.38240C>A多态性位点附近序列的测序结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

大民杂交猪(Sus scrofa)，由大白猪和民猪杂交获得，该猪购自中国农业科学院北京畜牧兽医研究所昌平畜禽实验基地。

下述实施例中的GenBank Accession Number为NC_010454.3的序列均是指更新日为2013年9月29日的GenBank Accession Number为NC_010454.3的序列。

实施例1、鉴定猪的肌内脂肪含量高低

一、猪g.38240C>A多态性位点的确定

(一)以两头大民杂交猪为实验材料，分别提取其耳缘组织的基因组DNA。

(二)引物的设计与合成

根据猪MAP2K4基因的基因组序列(该序列位于GenBank Accession Number：NC_010454.3中),设计并合成如下引物：

U(上游引物)：5’-CACAGAGTAGATGCTTTTGG-3’(SEQ ID No.1)；

D(下游引物)：5’-GAGGAGTGGCGTGATTC-3’(SEQ ID No.2)。

(三)PCR扩增

分别以步骤(一)得到的大民杂交猪的基因组DNA为模板，以U和D为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，分别命名为产物1和产物2。

PCR扩增体系：基因组DNA200ng，10×PCR扩增缓冲液5μl，dNTPs终浓度为10mM，上、下游引物各50ng，Taq DNA聚合酶0.75U，Mg²⁺2.5mmol/L，用ddH₂O补足体系至50μl。

PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性20s，58.5℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸10min。

(四)测序及序列分析

将产物1和产物2进行测序，得到产物1的序列(如SEQ ID No.3所示)和产物2的序列(如SEQ ID No.4所示)。SEQ ID No.3和SEQ ID No.4只存在一个碱基的差异，均为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4中自5’末端起第216位，该处的碱基为C或A，如图1中箭头所示，该位点为GenBank Accession Number为NC_010454.3序列的自5′末端起第38240位，因此将该位点命名为g.38240C>A。

在GenBank Accession Number为NC_010454.3的序列自5′末端第38240位的碱基(或步骤(三)得到的PCR扩增产物自5’末端起第216位的碱基)均为C的个体，该个体为纯合型个体，将该个体的基因型命名为纯合CC基因型，在GenBank AccessionNumber为NC_010454.3的序列自5′末端第38240位的碱基(或步骤(三)得到的PCR扩增产物自5’末端起第216位的碱基)均为A的个体，该个体为纯合型个体，将该个体的基因型命名为纯合AA基因型，在GenBank Accession Number为NC_010454.3的序列自5′末端第38240位的碱基(或步骤(三)得到的PCR扩增产物自5’末端起第216位的碱基)为C和A的个体，该个体为杂合型个体，将该个体的基因型命名为杂合AC基因型。

二、g.38240C>A多态性位点与猪的肌内脂肪含量的关联性分析

为确定g.38240C>A多态性位点与猪的肌内脂肪含量性状是否相关，以593头大民杂交猪为实验材料，进行如下试验：

(一)提取每头猪的耳缘组织的基因组DNA，分别按照步骤一中(三)的方法进行PCR扩增，得到各PCR扩增产物，按照步骤一中(四)的方法确定每头猪的基因型是纯合CC、杂合AC还是纯合AA。

(二)用索氏提取法检测每头猪的肌内脂肪(IMF)含量。

结果如表1所示。

表1表明，纯合CC基因型的猪的肌内脂肪含量高于杂合AC基因型的猪的肌内脂肪含量，杂合AC基因型的猪的肌内脂肪含量大于纯合AA基因型的猪的肌内脂肪含量。

(三)对猪的基因型与猪肌内脂肪含量以最小二乘法开展关联分析，具体方法可参见文献“Zhang L,Wang L,Li Y,Li W,Yan H,Liu X,Zhao K,Wang L.A substitutionwithin erythropoietin receptor gene D1domain associated with litter size inBeijing Black pig,Sus scrofa.Anim Sci J.2011；82(5):627-632”。

所用模型如下：

Y＝S+P+B+G+e

其中Y为性状测定值，S为性别效应，P为胎次效应，B为屠宰批次效应，G为基因型效应，e为残差效应。

结果如表1所示。

表1 猪的基因型与猪的肌内脂肪含量的关联性分析

注：同列上标不同字母表示差异显著(P<0.001)

表1表明，在猪的肌内脂肪含量性状中，纯合CC基因型的猪的肌内脂肪含量显著大于杂合AC基因型的猪的肌内脂肪含量，杂合AC基因型的猪的肌内脂肪含量显著大于纯合AA基因型猪的肌内脂肪含量，纯合CC基因型猪的肌内脂肪含量比纯合AA基因型猪的肌内脂肪含量高约1.25％(P<0.001)。

结果表明，本发明用GenBank Accession Number为NC_010454.3的序列自5’末端起第38240位单核苷酸多态性鉴定猪的肌内脂肪含量的结果与猪的肌内脂肪含量的实际测定结果一致。在实际的猪育种中，为获得更高肌内脂肪含量的猪，最好选择纯合CC基因型的猪进行育种。

Claims

1.一种扩增含有g.38240C>A多态性位点的DNA片段的引物对；

2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于：所述引物对由SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子组成。

3.一种鉴定或辅助鉴定猪的肌内脂肪含量高低的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1或2所述的引物对。

4.一种鉴定或辅助鉴定猪的肌内脂肪含量高低的方法，该方法为：纯合CC基因型的猪的肌内脂肪含量大于杂合AC基因型的猪的肌内脂肪含量，杂合AC基因型的猪的肌内脂肪含量大于纯合AA基因型的猪的肌内脂肪含量；

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述纯合CC基因型、杂合AC基因型或纯合AA基因型的判定方法如下：以猪的基因组DNA为模板，以权利要求1或2所述的引物为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，如果PCR扩增产物自5’末端起第216位的碱基均为C，则所述猪的基因型为纯合CC基因型，如果PCR扩增产物自5’末端起第216位的碱基为A和C，则所述猪的基因型为杂合AC基因型，如果PCR扩增产物自5’末端起第216位的碱基均为A，则所述猪的基因型为纯合AA基因型。

6.一种选育高肌内脂肪含量的猪的方法，是选择纯合CC基因型的猪进行选育；

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述纯合CC基因型的判定方法如下：以猪的基因组DNA为模板，以权利要求1或2所述的引物为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，如果PCR扩增产物自5’末端起第216位的碱基均为C，则所述猪的基因型为纯合CC基因型。

8.一种选育低肌内脂肪含量的猪的方法，是选择纯合AA基因型的猪进行选育；

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述纯合AA基因型的判定方法如下：以猪的基因组DNA为模板，以权利要求1或2所述的引物为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，如果PCR扩增产物自5’末端起第216位的碱基均为A，则所述猪的基因型为纯合AA基因型。

10.权利要求1或2所述的引物对、权利要求3所述的试剂盒和/或权利要求4-9任一所述的方法在猪的选育中的应用。