CN103013992B - 甜高粱高糖基因的scar标记 - Google Patents

Abstract

甜高粱高糖基因的SCAR标记，以甜高粱LTR102为母本，高粱654为父本。应用BSA法和RAPD技术筛选400个随机引物，其中引物S336扩增出差异谱带，共分离分析结果表明，120株后代中S336₁₁₁₉有3株重组，重组率为3.3%。将引物S336扩增出的RAPD片段回收纯化、克隆、测序。结果表明目的片段长度为1119bp。将这个标记命名为S336₁₁₁₉。根据测序结果设计一对特异性引物，进行特异性扩增将RAPD标记成功转化为SCAR标记，并用此标记对F₅代及部分高粱、甜高粱品种进行了快速的PCR检测，从甜高粱和高粱品种中找到了分子标记特异谱带，从而建立了甜高粱含糖量的SCAR标记快速检测方法，为快速筛选高含糖量优良品种的提供了依据，进而为实现分子标记辅助育种、缩短育种周期提供了技术保障。

Description

甜高粱高糖基因的SCAR标记

技术领域

本发明涉及甜高粱高糖基因的SCAR标记，特别是甜高粱高糖基因的标记的RAPD标记以及由该标记转化的SCAR标记，属于生物技术领域。 

背景技术

随着全球工业水平的提高能源消耗越来越大，石油化工等不可再生资源短缺是人们普遍关注的问题。我国是世界第二大能源消费国，对于再生能源物质的开发已成为农业生产中的重点。酒精是清洁汽油生产的主要替代物，车用乙醇汽油是在现有的车用汽油中加入改性后的燃料酒精，汽车动力性能增加,可防止在北方冬季汽油管冻结，也可大大减轻对臭氧层的危害,植物燃料酒精的利用具有环境和经济的双重效益。 

目前我国解决能源短缺问题主要是利用可再生能源来代替石化燃料，甜高粱酒精燃料的开发将对我国产业机构的调整、能源安全和环境保护起到举足轻重的作用。 

在我国农业生产中，甜高粱以其优良的品种特性已越来越受到关注，当前已经推广到24个省、市、自治区，仅北京、天津二市种植面积就达6万亩以上。甜高粱耐涝，耐旱，耐盐碱，被称为作物中的“骆驼”，甜高粱是C₄植物，具有极高的光合速率，生物学产量极高，它不仅每亩收获100～400kg的粮食，更重要的是每亩可产4000～5000kg富含糖分(含糖17%～21%)的茎秆。研究表明，每亩甜高粱每天合成的碳水化合物可生产3.2L酒精，是玉米的3.2倍、小麦的16倍。从榨汁后的残渣中还可获得占总收获量50%以上的酒精。所以说提高甜高粱的含糖量可以增加酒精的合成量，有助 于降低生产乙醇燃料的成本，从而促使乙醇燃料可以在世界范围内广泛地使用。除此之外，甜高粱的糖料价值和饲料价值也主要体现在其含糖量高于甜菜、玉米等经济作物。进一步提高甜高粱的含糖量即可迅速提升其利用价值，在生产实践中具有极其重要的意义，因此选育高含糖量的优良品种是科研工作者面临的重要的课题。 

选育甜高粱的优良品种是提高茎秆含糖量的最有效途径，而应用生物技术中的分子标记方法鉴选甜高粱新材料。通过加强对甜高粱抗病、抗虫、特别是含糖量等性状的遗传规律和分子标记研究，实现在实验室内的选择鉴定，将会大幅度提高选育的准确性和效率。 

长期以来，作物育种的选择都是依靠表现型进行的，而分子标记辅助选择MMAS(Molecular Marker-Assisted Selection)，将给传统的育种研究带来深刻变革。本发明应用RAPD和SCAR技术相结合，对高糖基因进行分子标记研究，以期通过标记筛选获得甜高粱高含糖量的新材料。 

发明内容

本发明的目的是针对上述现有技术的不足，而将RAPD和SCAR两种标记技术结合起来，以甜高粱LTR102（母本），高粱654（父本）以及它们杂交的F₅代为试材，筛选和甜高粱高糖基因紧密连锁的分子标记，并获得了一条甜高粱高糖基因的DNA特异谱带。 

本发明的目的一：应用PCR扩增技术获得了一个与甜高粱高糖基因紧密连锁的S336₁₁₁₉标记。 

本发明的目的二：将RAPD标记转化为稳定性、重复性强的SCAR标记，并用此标记对F₅代进行了检测，建立甜高粱高糖品种筛选的快速鉴定标准，为实践了分子标记辅助育种、缩短育种周期提供了技术保障。 

(1)F₅群体的构建： 

本发明以甜高粱LTR102为母本，高粱654为父本，杂交获得F₅代，其中87株高糖及33株低糖。 

应用分离群体分组分析法(Bulked Segregation Analysis)即BSA法。将F₅代分为高池及低池，高池和低池是分别由F₅代87株高糖株叶片及33株低糖株叶片提取DNA混匀而成，制备时每株均取10ngDNA。 

(2)确定提取甜高粱叶片总DNA的最佳方法。即CTAB-Ⅱ法。 

(3)应用PCR扩增仪，建立并优化了高粱RAPD反应体系，获得了稳定高效的RAPD扩增结果。 

(4)首次获得了与甜高粱高糖基因紧密连锁的RAPD标记。应用RAPD技术筛选400条随机引物，其中引物S336₁₁₁₉与甜高粱高糖基因紧密连锁。 

(5)首次对甜高粱高糖基因的RAPD标记进行克隆测序。将特异的S336₁₁₁₉DNA片段回收纯化之后，测序结果表明，片段长分别为1119bp。故将这个标记命名为S336₁₁₁₉。 

(6)首次将甜高粱高糖基因的RAPD标记转化为SCAR标记。对F₅代个体进行SCAR检测。高糖个体中也得到了S336₁₁₁₉特异谱带，而低糖个体则未见，从而为分子标记辅助育种提供了可靠的依据。 

本发明的特点在于：将该标记应用于甜高粱高糖品种的早期选择，淘汰低糖品种基因型，加快育种进程，节省选育所需的试验用地和成本，具有较大的实用价值。为分子标记辅助育种提供了依据，克服了那些由于表型鉴定困难用通常的方法辅助选择工作量非常巨大的困难，为实践分子标记辅助育种、缩短育种周期提供了技术保障。同时填补甜高粱高糖基因分子标记辅助选择研究的国、内外空白。 

附图说明：

图1为本发明的RAPD引物S336₁₁₁₉标记扩增甜高粱DNA的电泳图谱。 

图2是S336₁₁₁₉的回收克隆片段的电泳图谱。 

图3是S336₁₁₁₉SCAR标记对部分单株的检测结果。 

具体实施方式

参照图1，如图所示高粱654（父本）（1），甜高粱LTR102（母本）（2）,F₅高糖基因池(3),F₅低糖基因池(4),Marker（M）。 

参照图2，如图所示回收图片（1），母本（2），Marker（M）。 

参照图3,父本（1），母本（2），高糖基因池（3），低糖基因池（4），F₅高含糖单株（5-9），F₅低含糖单株（10-14），Marker（M）。 

1.材料和方法 

1.1试验材料 

甜高粱LTR102（母本），高粱654（父本）以及它们杂交的F₅代个体。 

1.2药品、仪器与设备 

400条随机引物（S1-S400），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。1U/μl Taq酶（Fermantous）；10mmol/L dNTPs，均购于上海生工生物工程技术服务有限公司。PCR仪：EN 61010-1。紫外透射反射分析仪，型号NT。 

1.3实验总体设计 

近等基因池的建立→基因组DNA的提取（CTAB法）→RAPD扩增→琼脂糖电泳→电泳谱带分析→数据处理分析→多态性片段的回收、纯化、克隆与鉴定、序列分析→RAPD标记转化为SCAR标记→用于高含糖量品种鉴定→确定鉴定方法→选育新品种 

1.4近等基因池的建立 

应用分离群体分组分析法(Bulked Segregation Analysis)即BSA法。将F₅代分为高糖基因池及低糖基因池，高糖基因池池和低糖基因池池是分别由F₅代87株高含糖植株叶片及33株低含糖植株叶片提取DNA混匀而成，制备时 每株均取10ngDNA。 

1.5RAPD分析 

PCR扩增反应系统总体积为25μL，含1倍扩增缓冲液，1.5U Taq酶，50ng的模板DNA，100μmol/L的dNTP，0.2μmol/L引物，上覆矿物油。反应程序为：预变性94℃3min→变性94℃20s，退火38℃30s，延伸72℃1min，循环35次→延伸72℃10min。 

用上海生物工程技术服务公司合成的400条随机引物（S1-S400），对亲本及高糖基因池、低糖基因池4个样品进行分析，如4个样品扩增出的RAPD产物带型相同，则无多态性，而如扩增产物中的带型有差异，则对这些引物进行重复并进行连锁分析。 

1.6产物检测 

扩增产物在1.4%含0.5μg/mLEB的琼脂糖凝胶中电泳，电压为每厘米3-4伏，电泳结果用紫外透射反射分析仪观察。 

1.7连锁分析 

当某一引物在鉴定的甜高粱高糖基因的F₅代分离群体(即高糖基因池及低糖基因池)及亲本间选到稳定的多态性片段(RAPD)标记后，取F₅抗、感单株各10株，用筛选到的引物进行分析。如果存在连锁关系进一步扩大群体分析，统计单株的RAPD标记，计算重组率和遗传距离。若RAPD标记与高糖基因紧密连锁，则进行多态性片段回收。 

交换型株数=高含糖单株样本群中不含多态性谱带的株数+低含糖单株样本群中含有多态性谱带的株数。 

再通过Mapmaker 3.0计算机软件分析，可将重组率转换为遗传距离即是图距单位(centimorgan，cM)。 

1.8多态性片段的回收、纯化、克隆与鉴定 

将回收纯化的片段克隆于pMD 18-T Vector载体上。在ABI PRISMTM 377XL测序仪上进行测序。 

1.9RAPD标记转化为SCAR标记 

根据测序结果，从序列两端按引物的要求设计出一对引物，引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。 

SCAR的PCR基本反应体系：10×Buffer 2.5μl，25mmol/L MgCl₂ 2.5μl，10mmol/L dNTPs 0.5μl，5U/μl Taq酶0.5μl，10μmol/μl上下游引物各0.2μl，20ng/μl DNA模版1.0μl，用ddwater补足25μl。 

扩增参数：94℃3min→（94℃变性30s→60℃退火30s→72℃延伸1min）35次循环→72℃延伸10min→4℃保存。 

用这对引物检测甜高粱LTR102（母本）、高粱654（父本）及二者杂交后的F₅高糖基因池、低糖基因池和F₅单株，比较其与RAPD分析的一致性和可靠性。 

实施实例1：与抗丝黑穗病基因连锁的RAPD多态性标记的获得 

本发明用400对（S1-S400）RAPD引物对亲本及其F₅代群体进行了标记分析。其中的337对引物扩增出产物，63对未扩增出产物，扩增率为84.25%。其中引物S336在亲本及其F₅代群体扩增出一条稳定的差异谱带，根据Maker显示片段大小大在1200bp左右，对这个差异谱带进行了共分离分析，共分析了120株F₅代个体，其中高含糖个体87株，低含糖个体33株，分析结果表明，重组率为3.3%（见图1）。 

实施实例2：与高糖基因连锁的RAPD标记的回收及测序 

将与高糖基因连锁的S336₁₁₁₉多态性片段回收测序，测序结果表明差异 片段大小为1119（见图2），故将这个标记命名为S336₁₁₁₉，该标记测序结果如下。 

多态性差异片段S336₁₁₁₉的测序结果： 

实施实例3：RAPD标记转化为SCAR标记 

根据特异片段S336₁₁₁₉两端序列和引物设计原则(避免发夹结构，适当的G+C含量)，在序列两端设计了一对特异性引物（引物序列见下表1），用这对引物检测甜高粱LTR102（母本）、高粱654（父本）及二者杂交后的F₅高糖基因池、低糖基因池和F₅单株，结果表明SCAR标记和RAPD标记的连锁性完全一致，PCR产物只为一条1119bp的条带，易于区分。这样就顺利地将RAPD标记转化为了稳定性重复性很好的SCAR标记（见图3）。 

表1SCAR引物序列 

Table 1 primer sequence of SCAR 

上述RAPD是Random Amplified Polymorphic DNA的缩写； 

上述SCAR是Sequence-Characterized Amplified Regions的缩写。 

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  沈阳师范大学

    

 

<120>  甜高粱高糖基因的SCAR标记

 

<130>  甜高粱含糖量的遗传研究及分子标记

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1119

<212>  DNA

<213>  Sweet Sorghum bicolor

 

 

<220>

<221>  gene

<222>  (11)..(1109)

<223>  n =a或g或c或t

 

<400>  1

tccccatcac atatcaagtg ctctcgtata tcactcgagt ctctccaaaa tgaattaaca     60

 

cactttctgc aagggcatag tatcttgtcc cctaccgctg aatttctaaa tgcaaaagct    120

 

aggaaactgt tgatcccttg caaatatgcc tttgtgtgcc tagcatcact attgatccat    180

 

gttttatcca taagtatttg tggggactga gcatgtacct gcagtacttg gatagttgac    240

 

tgcaagcaat gagaagagaa cgacgtcgat gcagcagatc tgcaacacac tggggttagt    300

 

gggccagctc cacaatactt tcacctaggg ggatgaaatg aatcagaaag aacaaatcaa    360

 

ttatgccagc ttctgcatga tctcttgaac ttagacatgc tggatgatct caaatataag    420

 

tgacacaaac agattcagaa aacatgaaaa ataatttctt tcgtagctag catctgtgat    480

 

ggaaaataag tgaaacagag aataatcaga aagcctgtgt gatgtagcct cagaattggt    540

 

actatacata catacataca tacatttaga agtaacatca ctaataaaga agcttatttt    600

 

tagctttcaa cacttgccaa cttatgtaca gatcagctat cagcatcctc taatatatct    660

 

ccaaacttag actacaaaat ttcataatag agggcaatta gaaattagat aaacaactga    720

 

cagctagcat ttgcatttcc cacaataagc aacataagta aaattagcag ctatacatgc    780

 

aaggataaac gtggaggcca agtgcgtacc tacaatactt gaatctgttg gctacaaata    840

 

atatgaagat gacatcggtg gtgtaggttt gcaactttgg gggagcacca cgagcagcct    900

 

tgtcgtgtgt cggtgaagaa gttcttatgt cggcctcatt gcagtttagt gcagcacttc    960

 

cttgccggtg tcggtgcaac agttacacgt tggcaagcct gctaagtttg aaaaaccaag   1020

 

tatgtagctt aagcatacac atatcaaact aacactgatg ggtttaggat aatatgtagt   1080

 

gaaccaaact ctaatatata cataagtgag tgatgggga                          1119

 

 

Claims (3)

1.甜高粱高含糖基因的SCAR标记S336₁₁₁₉，其序列为：

2.如权利要求1所述的甜高粱高含糖基因的SCAR标记S336₁₁₁₉，其特征在于扩增该标记引物序列为：

S336₁₁₁₉F：5’CTGTGTGATGTAGCCTC3’

S336₁₁₁₉R：5’ATCCTAAACCCATCAGTG3’。

3.一种检测甜高粱含糖量的快速PCR方法，PCR反应体系中含有权利要求2所述的引物S336₁₁₁₉F和S336₁₁₁₉R的核苷酸序列，上述PCR反应体系为：10×Buffer2.5μl，25mmol/L MgCl₂2.5μl，10mmol/L dNTPs0.5μl，5U/μl Taq酶0.5μl，10μmol/μl上下游引物各0.2μl，20ng/μl DNA模版1.0μl，用ddwater补足25μl；

扩增参数：94℃预变性3min，然后进行94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，变性、退火至延伸的过程设35次循环，最后72℃延伸10min，4℃保存；用这对引物检测甜高粱LTR102为母本、高粱654为父本及二者杂交后的F₅高糖基因池、低糖基因池和F₅单株中权利要求1的SCAR标记S336₁₁₁₉。

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