CN109234443A - 小麦6b染色体根系深度相关的kasp标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了小麦6B染色体根系深度相关的KASP标记及其应用。本发明提供了一种KASP引物，由序列表中序列1所示的引物1或其衍生物、序列表中序列2所示的引物2或其衍生物和序列表中序列3所示的引物3组成。本发明的KASP分子标记，能提供强选择位点，提高深根育种材料选择的准确性，实现分子标记辅助选择根系深度的目标。

Description

小麦6B染色体根系深度相关的KASP标记及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学及作物育种技术领域，具体地说，涉及小麦6B染色体根系深度相关的KASP标记及其应用。

背景技术

小麦是人类的三大口粮作物之一，也是干旱半干旱地区的主要粮食作物。干旱缺水严重制约着小麦生产的发展，为减轻干旱胁迫对其产量和品质的影响，每年需投入大量农业用水，因此，培育抗旱节水小麦品种是保障我国粮食安全和水资源安全的重要途径。根系是小麦吸收水分及最早感受土壤干旱的器官，优化根系性状有利于提高小麦抗旱性。研究发现深层根系有利于小麦吸收储藏在深层土壤中的水分，从而保证干旱环境下的籽粒灌浆，在田间自然条件下扎根深度每增加30cm，就能够在籽粒灌浆期多吸收相当于10mm降水量的水分，使得每公顷增产0.5t。不仅如此，不同土层根系的吸水能力存在较大差异，100cm以下的冬小麦根量仅占总根量的3％，但吸水量却所占总吸水量的20％。然而，复杂的根系表型鉴定过程极大的限制了根系性状在育种选择中的应用。分子标记能够为根系性状建立“分子指纹”，具有环境稳定性、操作简便性、评价客观性等优点，有望突破根系性状选择的技术瓶颈。因此，发掘小麦根系性状相关分子标记具有极高的理论和应用价值。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种KASP引物。

本发明提供的引物，由序列表中序列1所示的引物1或其衍生物、序列表中序列2所示的引物2或其衍生物和序列表中序列3所示的引物3组成。

上述引物中，所述序列表中序列1所示的引物1的衍生物为序列1所示的单链DNA分子的5'端连接一种荧光序列(实施例是FAM序列标签)；

所述序列表中序列2所示的引物2的衍生物为序列1所示的单链DNA分子的5'端连接另一种荧光序列(实施例是HEX序列标签)。

上述引物中，所述荧光基团序列为荧光序列FAM或荧光序列HEX。

上述引物中，所述引物1或其衍生物、所述引物2或其衍生物和所述引物3的摩尔比为1:1:1。

含有上述的引物的PCR试剂也是本发明保护的范围，在实施例中，带有FAM标签序列的正向引物F1、带有HEX标签序列的正向引物F2和反向引物R在KASP反应体系的终浓度均为0.6μM。

含有上述的引物或所述PCR试剂的试剂盒也是本发明保护的范围。

上述的引物或上述的PCR试剂或上述的试剂盒在如下1)-4)中至少一种中的应用也是本发明保护的范围：

1)鉴定或辅助鉴定小麦根系深度；

2)制备鉴定或辅助鉴定小麦根系深度产品；

3)检测或筛选或选育根系优良小麦；

4)制备检测或筛选或选育根系优良小麦产品。

上述应用中，所述根系优良小麦为深根小麦。

本发明的另一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定小麦根系深度的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：用上述的引物对待侧小麦进行KASP反应，检测反应产物，

反应产物产生序列2所示DNA分子5'端连接荧光序列的颜色的待测小麦的根系深度大于反应产物产生序列1所示DNA分子5'端连接荧光序列的颜色的待测小麦。

本发明第3个目的是提供一种选育根系优良的小麦的方法。

本发明提供的方法，为选育上述方法得到KASP扩增产物的颜色为序列2所示DNA分子5'端连接荧光序列的颜色的待测小麦，得到根系优良的小麦。

本发明的实验证明，本发明提供小麦分子育种领域用于筛选深根的分子标记(引物)及方法和应用。分析表明，基于SNP标记及其侧翼序列开发出的位于小麦6B染色体的KASP标记，能准确地对深根相关候选位点进行分型，预测小麦的根系深度。利用分子标记辅助选择育种技术能有效避免环境因素和人为误差对表型鉴定带来的影响。本发明的KASP分子标记，能提供强选择位点，提高深根育种材料选择的准确性，实现分子标记辅助选择根系深度的目标。

附图说明

图1为KASP标记在17份中国主推品种中的结果以及对应的根深对比结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。以下实施例中所涉及实验技术或操作方法，如无特殊说明，均为本领域已知的常规实验技术或操作方法。

实施例1、小麦根深相关SNP位点的定位及分子标记及检测方法的建立

一、自然群体

通过收集来自中国北方冬麦区和黄淮冬麦区的323份小麦种质组成自然群体。

二、管栽法鉴定自然群体根系深度

利用挖掘机挖掘180cm深度土坑。将相应长度的聚氯乙烯(PVC)管(厚度3.2mm、直径11cm)整齐排放于土坑中。裁剪相应长度的聚乙烯(PE)薄膜管(厚度0.2mm、直径10cm)，利用热封机将一端封口，并利用打孔器在封口上方3cm处打孔。将等量土壤(由壤土和复合有机肥混合而成，质量比为50∶1)装入薄膜管，土柱的土壤容重为1.13g cm^-3，随后将土柱放入PVC管中。每管浇水至80％田间持水量，播种8粒，覆土2cm，待幼苗长至三叶期时，间苗至3株。生长期间分别于越冬期、返青期及拔节期等量补水，每次补水至75％-80％田间持水量。孕穗期调查根系深度，即将土柱抽出，小心剖开PE管，从底端开始冲洗，当发现底部小麦根时，记录所在位置与茎基部的距离，即根系深度。试验重复三次，随机区组设计。

三、KASP标记的开发

为了方便对小麦候选材料根系深度的监测，设计如下KASP标记引物，按照KASP设计原则，基于差异位点(A/G)设计两条正向PCR引物(F1、F2)，并分别加上标签序列：FAM(5’GAAGGTGACCAAGTTCATGCT 3’)和HEX(5’GAAGGTCGGAGTCAACGGATT 3’)，同时设计一条通用反向引物R，引物序列如下所示：

正向引物F1：5’ACATCCACACCACCCATCCAAA 3’

带有FAM标签序列的正向引物F1：5’GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACATCCACACCACCCATCCAAA 3’(序列1：正向引物F1的5’端上FAM序列标签)

正向引物F2：5’ACATCCACACCACCCATCCAAG 3’

带有HEX标签序列的正向引物F2：5’GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACATCCACACCACCCATCCAAG 3’(序列2：正向引物F2的5’端上HEX序列标签)

反向引物R：5’ATAGGGGTGCTCCAGCATCGTG 3’(序列3)

四、KASP标记检测根系深度的方法建立

1、KASP标记PCR扩增

提取待测小麦品种基因组DNA为模板，用上述带有FAM标签序列的正向引物F1、带有HEX标签序列的正向引物F2和反向引物R进行PCR扩增。

KASP反应在384孔荧光定量板上进行，每孔的混合反应体系共计5.0μL。按照QuantStudio^TM 7Flex荧光定量仪(Applied Biosystems by Life Technologies)要求，KASP Low Mixture试剂购自LGC公司；引物由上海英俊生物技术有限公司合成。引物合成后将其稀释到100μM，KASP Primer mixture引物体系包括两条标签引物各12μL，一条通用反向引物为30μL，ddH₂O 46μL，共计100μL。反应混合体系如下所示：

表1KASP反应体系

上述Primer mixture中的带有FAM标签序列的正向引物F1、带有HEX标签序列的正向引物F2和反向引物R在KASP反应体系的终浓度均为0.6μM。

上述PCR扩增反应条件如下：95℃预变性15min；第一步扩增反应：95℃变性20sec，65℃梯度退火并延伸60sec，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低1℃；第二步扩增反应，95℃变性20sec，57℃退火并延伸60sec，30个循环；12℃保存。

使用QuantStudio^TM7Flex荧光定量仪收集扩增产物的荧光信号，得到不同品种的荧光颜色信号，带FAM序列标签的扩增产物为蓝色荧光信号，带HEX序列标签的扩增产物为红色荧光信号(FAM序列标签引物为A位点，HEX序列标签引物为G位点)。

结合323份小麦种质组成自然群体的根系检测结果(表2)，可见：

反应产物产生红色荧光的待测小麦的根系深度大于反应产物产生蓝色荧光的待测小麦。

表2KASP标记检测结果和根系结果

因此，可用带FAM序列标签的正向引物F1、带HEX序列标签的正向引物F2和反向引物R检测待测小麦的根系深度，具体方法如下：

用带FAM序列标签正向引物F1、带HEX序列标签正向引物F2和反向引物R对待测小麦进行KASP反应，检测KASP反应的荧光信号；反应产物产生红色荧光的待测小麦的根系深度大于反应产物产生蓝色荧光的待测小麦。

实施例2、KASP标记在检测深根小麦品种中的应用

一、待测样本

收集来自中国黄淮冬麦区和北方冬麦区小麦品种共17个，于2015-2016年种植于中国农业科学院作物科学研究所(品种信息如下表3所示)。

表3为品种信息

二、管栽法鉴定根系深度

方法与实施例1的二相同，测定17个小麦品种的根系深度，结果如下表1所示。

三、SNP位点AX-111468219的KASP标记检测

三、KASP标记检测

分别提取17个小麦品种于三叶期的叶片的基因组总DNA；

以基因组总DNA为模板，用带有FAM标签序列的正向引物F1、带有HEX标签序列的正向引物F2和反向引物R进行PCR扩增。

PCR扩增体系和PCR扩增条件同实施例1的四。

使用QuantStudio^TM7Flex荧光定量仪收集扩增产物的荧光信号。

反应产物产生红色荧光的待测小麦的根系深度大于反应产物产生蓝色荧光的待测小麦。

结果如表4所示：

有11个品种的扩增产物的荧光信号为蓝色，6个品种的扩增产物的荧光信号为红色。

表4KASP标记检测结果和根系结果

统计所有荧光信号为红色和所有荧光信号为蓝色的平均根系深度，结果如图1所示，可以看出，通过方差分析对比两组品种的根系深度在0.01水平上差异显著(P<0.01)，产生红色荧光的待测小麦所对应品种孕穗期平均根深为128.1cm，产生蓝色的对应品种孕穗期平均根深为92.5cm。

因此，产生红色荧光的小麦品种的根系深度大于产生蓝色荧光的小麦品种。

本发明的KASP分子标记，序列、引物明确，经案例实施，可直接用于分子标记辅助选择育种中。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>小麦6B染色体根系深度相关的KASP标记及其应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 46

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

gaaggtgacc aagttcatgc tacatccacac cacccatcca aa 46

<210> 2

<211> 46

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

gaaggtcgga gtcaacggat tacatccacac cacccatcca ag 46

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

ataggggtgc tccagcatcg tg 22

Claims (10)

1.一种KASP引物，由序列表中序列1所示的引物1或其衍生物、序列表中序列2所示的引物2或其衍生物和序列表中序列3所示的引物3组成。

2.根据权利要求2所述的引物，其特征在于：所述序列表中序列1所示的引物1的衍生物为序列1所示的单链DNA分子的5’端连接一种荧光序列；

所述序列表中序列2所示的引物2的衍生物为序列1所示的单链DNA分子的5’端连接另一种荧光序列。

3.根据权利要求2所述的引物，其特征在于：

所述荧光基团序列为荧光序列FAM或荧光序列HEX。

4.根据权利要求1-3中任一所述的引物，其特征在于：

所述引物1或其衍生物、所述引物2或其衍生物和所述引物3的摩尔比为1:1:1。

5.含有权利要求1-4中任一所述的引物的PCR试剂。

6.含有权利要求1-4中任一所述的引物或所述PCR试剂的试剂盒。

7.权利要求1-4中任一所述的引物或权利要求5所述的PCR试剂或权利要求6所述的试剂盒在如下1)-4)中至少一种中的应用：

1)鉴定或辅助鉴定小麦根系深度；

2)制备鉴定或辅助鉴定小麦根系深度产品；

3)检测或筛选或选育根系优良小麦；

4)制备检测或筛选或选育根系优良小麦产品。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述根系优良小麦为深根小麦。

9.一种鉴定或辅助鉴定小麦根系深度的方法，包括如下步骤：用权利要求2-4中任一所述的引物对待侧小麦进行KASP反应，检测反应产物，

反应产物产生序列2所示DNA分子5’端连接荧光序列的颜色的待测小麦的根系深度大于反应产物产生序列1所示DNA分子5’端连接荧光序列的颜色的的待测小麦。

10.一种选育根系优良的小麦的方法，为选育权利要求9所述方法得到KASP扩增产物的颜色为序列2所示DNA分子5’端连接荧光序列的颜色的待测小麦，得到根系优良的小麦。