CN100519763C

CN100519763C - 与小麦纹枯病抗性qtl紧密连锁的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN100519763C
Application number: CNB2007100192798A
Authority: CN
Inventors: 任丽娟; 周淼平; 余桂红; 张旭; 陆维忠; 马鸿翔
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2007-01-11
Filing date: 2007-01-11
Publication date: 2009-07-29
Anticipated expiration: 2027-01-11
Also published as: CN101003839A

Abstract

本发明涉及一种与小麦纹枯病抗性QTL紧密连锁的分子标记及其应用，该分子标记gwm608、gwm88、wmc727、gwm410.2的大小分别为180bp、130bp、200bp和300bp。该分子标记可以用于小麦品种CI12633及其衍生品种或品系的基因型检测，以判断该品种或品系是否具有小麦纹枯病抗性。其优点在于：克服常规抗纹枯病育种周期长、效率低的不足，发挥分子标记辅助选择的特长，发展一种高效、快速的育种新技术。以及进行抗性鉴定方便，且不受环境条件的影响大大减少育种家的工作量，提高选择的准确性和育种效率。

Description

与小麦纹枯病抗性QTL紧密连锁的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及小麦育种和分子生物学领域，通过利用与小麦纹枯病抗性QTL紧密连锁的分子标记进行辅助育种，以提高小麦抗纹枯病育种的效率。

背景技术

小麦纹枯病，又称小麦尖眼点病(Wheat sharp eyespot)，是一种世界性病害，几乎遍布世界各温带小麦种植地区。近年来，随着施肥水平不断提高和耕作制度的改变，纹枯病在我国江淮流域和黄河中下游冬麦区广泛发生，每年遭受纹枯病危害的麦田面积约占种植面积的五分之一，经济损失在数十亿元以上。研究表明小麦纹枯病病菌是一种较顽固的土壤习居真菌，病原物在土壤里经多年累积，化学药剂防治效果逐渐下降，而且大规模使用化学药剂不仅对生态环境造成危害，而且增加了农业生产成本。筛选纹枯病抗源，选育和使用抗纹枯病小麦新品种无疑是解决这一问题最有效、经济的途径。

近年来小麦纹枯病的抗性遗传及抗病育种开始受到重视，但对小麦纹枯病的遗传基础研究还很少。刘朝晖等(1999)、张怀琼(1999)等分别通过对部分抗感亲本杂交组合的F₂和回交一代抗性调查，对纹枯病抗性遗传进行分析，结果却不尽相同。选育抗病新品种的工作由于纹枯病抗性鉴定受环境条件的影响较大及其遗传机制的复杂性而进展缓慢。分子标记技术的发展将为育种家提供一种有效的选择方法，提高育种的选择效率，加快抗性基因向适应性好的栽培品种中的转移。通过构建重要抗源的遗传图谱和数量性状位点(Quantitative Trait Loci，QTL)分析，可以找到与小麦纹枯病抗性QTL紧密连锁(或共分离)的分子标记。任丽娟(2004)、汤颋(2004)等对ARz/扬158F6重组自交系群体(RILs)进行SSR分析和QTL分析，检测到与小麦纹枯病抗病相关的6个QTLs，分别位于2D、3D、3B和7D上，单个位点可分别解释表型变异方差的9.0％、7.0％、7.0％、9.0％、14.0％和8.0％。初步认为在7D上有一个抗小麦纹枯病的主效QTL。张小村等(2005)利用川35050/山农483、鲁麦21/山农0431两个重组自交系群体(RILs)进行分子标记分析和QTL分析。在川35050/山农483重组自交系群体检测到一个加性QTL，位于1A染色体上，贡献率为21.57％，同时检测到4对QTL间互作位点，涉及7条染色体，互作总贡献率为52.23％。在另一个群体鲁麦21/山农0431，发现一个SSR标记xgwm526，位于2B染色体上。使用与某一特定抗源抗纹枯病性QTL紧密连锁的分子标记，可以对该特定抗源的后代及其衍生品种(系)在苗期进行早世代筛选，淘汰不抗病的植株，节约生产成本，提高育种和选择效率。

小麦品种CI12633是来自美国的抗白粉病的材料，经纹枯病鉴定为抗纹枯病的的材料(刘朝晖，2000；颜伟，2004)，目前已应用于小麦抗纹枯病育种中(蔡士宾，2005)，目前尚未有与纹枯病抗性主效QTL相连锁的分子标记报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供小麦抗纹枯病抗性QTL的分子标记及其在小麦抗纹枯病育种中的应用方法，用以界定与小麦品种CI12633的纹枯病抗性QTL相连锁的分子标记，通过检测这些分子标记可以预测小麦植株的纹枯病抗性，加快抗纹枯病小麦的选择进度，在生产上用于检测小麦品种的纹枯病抗性水平。

本发明目的是这样实现的：一种与小麦纹枯病抗性QTL紧密连锁的分子标记，其特征在于，用小麦品种CI12633的DNA，分别采用PCR引物对5’CGCTGAAAAGAAGTGCCGCATTATGA 3’和5’CGCTGCCTTTTCTGGATTGCTTGTCA 3’、5’CACTACAACTATGCGCTCGC3’和5’TCCATTGGCTTCTCTCTCAA3’、5’CATAATCAGGACAGCCGCAC 3’和5’TAGTGGCCTGATGTATCTAGTTGG 3’、5’GCTTGAGACCGGCACAGT3’和5’CGAGACCTTGAGGGTCTAGA3’进行PCR扩增，扩增产物在6％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，分别获得大小为180bp、130bp、200bp和300bp的分子标记gwm608、gwm88、wmc727、gwm410.2。

在本发明中：所述的小麦品种CI12633的DNA是指对CI12633小麦植株的叶片分离提取获得的DNA；所述的6％聚丙烯酰胺凝胶是指：100ml聚丙烯酰胺胶溶液中含有5.7克丙烯酰胺和0.3克甲叉双丙烯酰胺。

一种上述与小麦纹枯病抗性QTL紧密连锁的分子标记的应用，其特征在于：将分子标记gwm608、gwm88、wmc727、gwm410.2用于小麦品种CI12633及其衍生品种或品系的基因型检测，以判断该品种或品系是否具有纹枯病抗性。

在本发明的应用中：将小麦品种CI12633及其衍生品种或品系为父本或母本与其他小麦杂交并繁衍至F₂代以上，对小麦植株的叶片分离提取获取它们的DNA，然后用gwm608、gwm88、wmc727、gwm410.2的引物对这些DNA进行聚合酶链式反应(PCR)，评判这4个标记是否存在，来预测该品种或品系是否具有纹枯病抗性。

在本发明的应用中：所述小麦品种CI12633衍生品种或品系是指以小麦品种CI12633为亲本，通过常规杂交、或采用组织培养、或采用花药培养、或采用玉米与小麦杂交诱导单倍体，再用秋水仙素加倍获得双单倍体或采用遗传转化方法获得的小麦品种或品系。

在本发明的应用中：所述的基因型检测是指检测小麦品种CI12633及其衍生品种或品系的DNA中是否存在与小麦品种CI12633的纹枯病主效QTL相连锁的分子标记gwm608、gwm88、wmc727、gwm410.2；只有在3～4个分子标记同时出现时，则预测该小麦的纹枯病的抗性达到“中抗”以上水平，否则为“感”。

在本发明的应用中：所述的“中抗”以上水平是指小麦纹枯病达到“抗病”或“中抗”，小麦纹枯病的病情指数小于20％为“抗病”，病情指数达到20.1—35.0％为“中抗”，所述的“感”是指小麦纹枯病的病情指数在35％以上。

本发明的优点在于：本发明小麦抗纹枯病抗性QTLs的分子标记及其在小麦抗纹枯病育种中的应用，其优点在于：克服常规抗纹枯病育种周期长、效率低的不足，发挥分子标记辅助选择的特长，发展一种高效、快速的育种新技术。例如利用常规抗纹枯病育种方法选育一个新品种或新品系，往往需要6-8年，甚至更长时间，同时每代都需要对群体进行抗性鉴定，工作量很大。此外，抗纹枯病鉴定又往往受环境条件的影响，而分子标记辅助选择不受环境条件的影响，在低世代就可以对纹枯病抗性进行选择，将大大减少育种家的工作量，提高选择的准确性和育种效率。

附图说明

图1是CI12633的6B染色体抗性QTLs分析的LOD值分布图；

图2是CI12633的5A染色体抗性QTL分析的LOD值分布图。

具体实施方式

实施例1

小麦纹枯病抗源CI12633的测定

1、获取小麦品种CI12633的DNA

将小麦品种CI12633的植株的叶片采用CTAB提取方法进行分离提取获得的DNA。

2、对小麦品种CI12633的DNA进行检测，筛选出与小麦纹枯病抗性QTL紧密连锁的分子标记

利用PCR右边界引物和左边界的引物5’CGCTGAAAAGAAGTGCCGCATTATGA 3’和5’CGCTGCCTTTTCTGGATTGCTTGTCA3对获得的DNA进行扩增，扩增产物在6％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，获得大小为180bp的分子标记gwm608。

利用PCR右边界引物和左边界的引物5’CACTACAACTATGCGCTCGC3’和5’TCCATTGGCTTCTCTCTCAA3’对获得的DNA进行扩增，扩增产物在6％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，获得大小为130bp的分子标记gwm88。

利用PCR右边界引物和左边界的引物5’CATAATCAGGACAGCCGCAC 3’和5’TAGTGGCCTGATGTATCTAGTTGG3’对获得的DNA进行扩增，扩增产物在6％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，获得大小为200bp的分子标记wmc727。

利用PCR右边界引物和左边界的引物5’GCTTGAGACCGGCACAGT3’和5’CGAGACCTTGAGGGTCTAGA3’对获得的DNA进行扩增，扩增产物在6％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，获得大小为300bp的分子标记gwm410.2。

在本实施例中，6％聚丙烯酰胺凝胶是指：100ml聚丙烯酰胺胶溶液中含有5.7克丙烯酰胺和0.3克甲叉双丙烯酰胺。

通过Mapmanager软件进行QTLs分析，获得CI12633的6B染色体抗性QTLs的LOD值分布图(见图1)，其中：左边为6B染色体遗传连锁图；右边的曲线图为QTL的LOD值分布图。由图1可见，大小为180bp、130bp的分子标记gwm608、gwm88在该QTL两侧，与该QTL紧密连锁。

通过Mapmanager软件进行QTLs分析，获得CI12633的5A染色体抗性QTL的LOD值分布图(见图2)，其中：左边为5A染色体遗传连锁图；右边的曲线图为QTL的LOD值分布图。由图2可见，大小为200bp、300bp的分子标记wmc727、gwm410.2该QTL两侧，与该QTL紧密连锁。

实施例2

利用大小分别为180bp、130bp、200bp和300bp的分子标记gwm608、gwm88、wmc727和gwm410.2对小麦品种CI12633的衍生品系进行纹枯病抗性预测。

采用小麦品种CI12633与扬麦158杂交，繁衍到F₈代的后代，先从它们的叶片中分离DNA，然后用分子标记gwm608、gwm88、wmc727和gwm410.2的引物对这些DNA进行聚合酶链式反应(PCR)[分离提取DNA以及PCR扩增和电泳分离过程与实施例1相同]，评判这些DNA进行PCR后的分离物中是否至少存在三个上述标记，若同时存在三个以上所述标记，说明该品系纹枯病抗性达到“中抗”以上水平，不能同时存在三个以上所述标记则为“感”。定义小麦纹枯病的病情指数小于20％为“抗病”，病情指数达到20.1—35.0％，为“中抗”，病情指数在35.1％以上为“感病”。基于这些判定方法和标准对每个小麦植株的纹枯病抗性进行预测，随后利用接种纹枯病病原菌的方法测定受测样品的纹枯病实际抗性并与预测结果进行对比，预测结果与实测结果非常吻合。结果参见附表1。

表1 CI12633/扬麦158的F₈后代的部分植株纹枯病抗性预测及鉴定结果

注：E319～E429均为小麦品种CI12633扬麦158杂交后，繁衍到F₆代的株系号

+：表示标记存在；

-：表示标记不存在。

上述实施例不是对本发明的具体限制，在具体实施时，可以运用本发明涉及的大小分别为180bp、130bp、200bp和300bp的分子标记gwm608、gwm88、wmc727和gwm410.2对小麦品种CI12633的衍生品系进行纹枯病抗性预测。所述小麦品种CI12633衍生品种或品系是指以小麦品种CI12633为亲本，通过常规杂交、或采用组织培养、或采用花药培养、或采用玉米与小麦杂交诱导单倍体，再用秋水仙素加倍获得双单倍体或采用遗传转化方法获得的小麦品种或品系。

核苷酸或氨基酸序列表

<110>江苏省农业科学院

<120>与小麦纹枯病抗性QTL紧密连锁的分子标记及其应用

<160>4

<210>1

<211>26

<212>DNA

<213>普通小麦(Tritricum aestivm)

<400>1

cgctgaaaag aagtgccgca ttatga 26

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>普通小麦(Tritricum aestivm)

<400>2

ccctgccttt tctggattgc ttgtca 26

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>普通小麦(Tritricum aestivm)

<400>3

cactacaact atgcgctcgc 20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>普通小麦(Tritricum aestivm)

<400>4

tccattggct tctctctcaa 20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>普通小麦(Tritricum aestivm)

<400>5

cataatcagg acagccgcac 20

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>普通小麦(Tritricum aestivm)

<400>6

tagtggcctg atgtatctag ttgg 24

<210>7

<211>18

<212>DNA

<213>普通小麦(Tritricum aestivm)

<400>7

gcttgagacc ggcacagt 18

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>普通小麦(Tritricum aestivm)

<400>8

cgagaccttg agggtctaga 20

Claims

1、一种与小麦纹枯病抗性QTL紧密连锁的分子标记，其特征在于，用小麦品种CI12633的DNA，分别采用PCR引物对5’C G C T G A A A A G A A G T G C C G C A T T A T G A 3’和5’C G C T G C C T T T T C T G G A T T G C T T G T C A 3’、5’CACTACAACTATGCGCTCGC3’和5’TCCATTGGCTTCTCTCTCAA3’、5’C A T A A T C A G G A C A G C C G C A C3’和5’T A G T G G C C T G A T G T A T C T A G T T G G 3’、5’GCTTGAGACCGGCACAGT3’和5’CGAGACCTTGAGGGTCTAGA3’进行PCR扩增，扩增产物在6％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，分别获得大小为180bp、130bp、200bp和300bp的分子标记gwm608、gwm88、wmc727、gwm410.2。

2、根据权利要求1所述的小麦纹枯病抗性主效QTL紧密连锁的分子标记，其特征在于：所述的小麦品种CI12633的DNA是指对CI12633小麦植株的叶片分离提取获得的DNA；所述的6％聚丙烯酰胺凝胶是指：100ml聚丙烯酰胺胶溶液中含有5.7克丙烯酰胺和0.3克甲叉双丙烯酰胺。

3、一种如权利要求1所述的分子标记的应用，其特征在于：将分子标记gwm608、gwm88、wmc727、gwm410.2用于小麦品种CI12633及其衍生品种或品系的基因型检测，以判断该品种或品系是否具有纹枯病抗性；

所述小麦品种CI12633衍生品种或品系是指以小麦品种CI12633为亲本，通过常规杂交、或采用组织培养、或采用花药培养、或采用玉米与小麦杂交诱导单倍体，再用秋水仙素加倍获得双单倍体或采用遗传转化方法获得的小麦品种或品系；

判断该品种或品系是否具有纹枯病抗性的方法是：将小麦品种CI12633及其衍生品种或品系为父本或母本与其他小麦杂交并繁衍至F₂代以上，对小麦植株的叶片分离提取获取它们的DNA，然后用gwm608、gwm88、wmc727、gwm410.2的引物对这些DNA进行聚合酶链式反应PCR，评判是否存在与小麦品种CI12633的纹枯病主效QTL相连锁的分子标记gwm608、gwm88、wmc727、gwm410.2，来预测该品种或品系是否具有纹枯病抗性；只有在3～4个分子标记同时出现时，则预测该小麦的纹枯病的抗性达到“中抗”以上水平，否则为“感”；

所述的“中抗”以上水平是指小麦纹枯病达到“抗病”或“中抗”；小麦纹枯病的病情指数小于20％为“抗病”，病情指数达到20.1—35.0％为“中抗”；所述的“感”是指小麦纹枯病的病情指数在35％以上。