CN108060262A - 与小麦根系性状相关的kasp标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了与小麦根系性状相关的KASP标记及其应用。利用本发明的KASP标记专用引物可用于鉴定待测小麦的基因型为TT、CC还是CT，并根据待测小麦的基因型即可确定其根系表面积大小：TT基因型的待测小麦的根系表面积大于CT或CC基因型的待测小麦，进而可用于筛选根系性状优良的小麦品种，为选育高产稳产品质优良的小麦品种奠定理论基础且提供分子辅助选择手段。

Description

与小麦根系性状相关的KASP标记及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及与小麦根系性状相关的KASP标记及其应用。

背景技术

优良的根系形态和根际进程是植株养分高效利用的基础(Kaushik等，2017)，并在促进作物生长与产量形成方面起到关键支撑作用。由于生产上对氮肥的过度使用而引发一系列资源浪费与环境问题(chuan等，2015)，育种家们企图通过提高作物对肥料利用效率以同时满足增产与环境友好的双重需要。植物生长初期根系发育对养分施入极为敏感，利用遗传育种方法掌握与地上部生长发育相适应的、具有持久稳定活力的根系成为现代分子育种技术的重要环节。

分子标记辅助选择技术可跟踪转育或聚合根系基因，为培育具有优良根系且高产广适型小麦品种提供了有效技术手段。发掘控制根系性状基因及其基因标记是开展分子标记辅助育种的前提。为此，有关禾本科作物根系性状的基因定位和克隆工作相继开展，尤其在水稻和玉米中研究进展较大。例如，水稻第9染色体上携带的控制根系深度相关的QTL不仅利于提高植物抗旱性，而且可增强植物对根系营养元素的吸收，该基因的遗传区段RM242-RM201对应的标记已应用于分子辅助育种中，并获得了携带该基因且根系性状优良的株系(Steele等，2006)。此外，一个与玉米产量和根系相关的主效QTL已被发掘，并得到应用(Landi等，2010)。小麦基因组结构较水稻和玉米复杂，根系性状如根长度、表面积、体积和干物质重等受多基因控制，通常呈簇存在，主要分布于1D、2A、2D、3A、5A、6A和7D染色体上，单个QTL位点可解释表型变异的3.2％-19.6％，部分QTL存在上位效应。多数根部性状基因与肥水利用、农艺性状及产量性状相关基因相关联(Bai等，2013)，但鲜有紧密连锁标记的报道。

中麦895是中国农业科学院作物科学研究所、中国农业科学院棉花研究所以周麦16为母本、荔垦4号为父本杂交选育而成的半冬性多穗型中晚熟品种，具备叶片功能期长、分蘖能力强、灌浆速度快等特性。2009年9月通过国家黄淮麦区南片审定。在2013-2015年三年品种比较试验和大田示范中，中麦895表现出高产广适、抗病抗倒、灌浆后期耐高温等特点。扬麦16是长江中下游麦区种植面积最大的品种，具有灌浆速度快、粒重高等特点。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定小麦根系表面积的方法。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定小麦根系表面积的方法是检测待测小麦2B染色体210cM位置的基因的第36位脱氧核糖核苷酸的基因型是TT还是CC还是CT，根据所述待测小麦的基因型确定根系表面积：TT基因型的待测小麦的根系表面积大于CT或CC基因型的待测小麦；

所述TT基因型为2B染色体210cM位置的基因的第36位脱氧核糖核苷酸为T的纯合体；所述CT因型为2B染色体210cM位置的基因的第36位脱氧核糖核苷酸为C和T的杂合体；所述CC因型为2B染色体210cM位置的基因的第36位脱氧核糖核苷酸为C的纯合体；

所述2B染色体210cM位置的基因的核苷酸序列如序列4所示。

上述方法中，所述检测待测小麦2B染色体210cM位置的基因的第36位脱氧核糖核苷酸的基因型是TT还是CC还是CT的方法包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，采用KASP引物组进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，根据所述荧光信号判断待测小麦2B染色体210cM位置的基因的第36位脱氧核糖核苷酸的基因型是TT还是CC还是CT。

上述方法中，所述KASP引物组由上游引物F1、上游引物F2及下游引物R组成；

所述上游引物F1自5’端到3’端依次为FAM荧光序列和序列1第22-39位所示的单链DNA；所述上游引物F2自5’端到3’端依次为HEX荧光序列和序列2第22-39位所示的单链DNA；所述下游引物R为序列3所示的单链DNA。

上述方法中，所述FAM荧光序列为序列1第1-21位所示的单链DNA；所述HEX荧光序列为序列2第1-21位所示的单链DNA。

上述方法中，利用KlusterCaller^TM软件根据所述荧光信号判断基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller^TM软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的基因型为TT；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller^TM软件分析呈现红色，则所述待测小麦的基因型为CC；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller^TM软件分析呈现绿色，则所述待测小麦的基因型为CT。

上述方法中，所述PCR扩增的体系如下(总体积为5.2ul)：20ng/ul模板DNA 3.0ul，2×KASP reaction mix 2.0ul，引物混合试剂0.1ul，ddH₂O 0.1ul。2×KASP reaction mix包括荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，以及高保真的Taq酶，dNTP等。荧光探针A的序列为5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′，5′末端连接1个荧光基团FAM；荧光探针B的序列为5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′，5′末端连接1个荧光基团HEX；淬灭探针A的序列为5′-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3′，3′末端连接淬灭基团BHQ；淬灭探针B的序列为5′-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3′，3′末端连接淬灭基团BHQ。引物混合试剂包括引物F1、引物F2和引物R，引物F1和引物F2在PCR扩增体系中的终浓度均为0.134uM，引物R在PCR扩增体系中的终浓度为0.336uM。

所述PCR扩增采用Touch down PCR扩增程序，具体如下：94℃预变性15min；(Touchdown程序)94℃变性30s，61℃退火60s，72℃延伸30s，11个循环，每个循环退火温度下降0.6℃；(扩增程序)94℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸30s，26个循环；72℃延伸5min；10℃保存。

上述PCR扩增反应在PTC-200PCR扩增仪上进行，得到PCR扩增产物，然后将PCR扩增产物在PHERAstar^plus荧光酶标仪上用荧光照射进行基因分型，再利用KlusterCaller^TM软件读取分型后的数据。

上述小麦2B染色体210cM位置的基因也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供检测待测小麦2B染色体210cM位置的基因的第36位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质的新用途。

本发明提供了检测待测小麦2B染色体210cM位置的基因的第36位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质在如下(a1)-(a6)中任一种中的应用：

(a1)鉴定或辅助鉴定待测小麦根系表面积；

(a2)制备鉴定或辅助鉴定待测小麦根系表面积的产品；

(a3)选育小麦根系优良品种；

(a4)制备选育小麦根系优良品种的产品；

(a5)小麦育种；

(a6)制备小麦育种的产品。

本发明还有一个目的是提供如下(b1)-(b3)任一所述的产品：

(b1)上述KASP引物组；

(b2)含有(b1)所述的KASP引物组的PCR试剂；

(b3)含有(b1)所述的KASP引物组或(b2)所述的PCR试剂的试剂盒。

上述产品在如下(c1)-(c3)中任一种应用也属于本发明的保护范围：

(c1)鉴定或辅助鉴定待测小麦根系表面积；

(c2)选育小麦根系优良品种；

(c3)小麦育种。

本发明的最后一个目的是提供一种选育小麦根系优良品种的方法。

本发明提供的选育小麦根系优良品种的方法包括选择TT基因型的小麦品种进行育种的步骤；所述TT基因型为2B染色体210cM位置的基因的第36位脱氧核糖核苷酸为T的纯合体；所述2B染色体210cM位置的基因的核苷酸序列如序列4所示。

上述小麦根系优良品种是指根系表面积≥25.95cm²的小麦品种。

上述方法或应用或产品中，所述根系表面积为苗期根系表面积。

上述方法或应用或产品中，所述小麦具体为如下品种中的任一种或任几种：淮麦20、济麦19、济麦21、京双16、济麦22、晋麦45、良星66、周麦20、郑农21、洛麦26、中金13、绵阳26、烟农19、皖麦38、汶农14、小偃54、光泰68、先麦12、豫麦63、周麦16、周麦18、周麦22、周麦31、周麦32。

本发明提供了一个与小麦根系性状相关的SNP位点，并基于该位点开发了KASP标记专用引物。通过实验证明：利用本发明的KASP标记专用引物可用于鉴定待测小麦的基因型为TT、CC还是CT，根据待测小麦的基因型可确定其根系表面积：TT基因型的待测小麦的根系表面积大于CT或CC基因型的待测小麦，进而用于筛选根系性状优良的小麦品种，为选育高产稳产品质优良的小麦品种奠定理论基础且提供分子辅助选择手段。

附图说明

图1为扬麦16和中麦895在低氮浓度下长势图。左为扬麦16，右为中麦895。

图2为供试小麦品种根系表面积基因的KASP标记检测结果。

图3为一个SNP标记与QRSA.caas-2BL基因的连锁图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的所有引物均由北京奥科生物技术有限责任公司合成。

下述实施例中的所有小麦材料均来自中国农业科学院国家农作物种质保存中心。

实施例1、与小麦根系性状相关的KASP标记专用引物的获得

一、根系性状调查及SNP标记分析

1、根系性状调查

选用扬麦16(中国农业发展集团有限公司，品种权号：CNA20030436.4)/中麦895(河南新大农业发展有限公司，国审麦2012010)DH群体，包括亲本共200个家系作为实验材料进行根部试验，对根部性状进行调查。

根部试验采用水培法，即每种实验材料选取30粒种子。具体步骤如下：用10％H₂O₂浸泡处理种子15-20分钟，无菌水冲洗5-6次；然后从处理后的种子中选取饱满且大小一致的种子置于铺有滤纸的培养皿中，在培养箱暗室催芽；每种实验材料挑选发芽一致的幼苗培养，培养盘置于营养液中在可控温室内培养，营养液配置参照文献(Ren等，2012)中的方法。连续培养10天后对苗期根部性状进行调查。调查性状包括最长根长、侧根长、主根长、总根长、根系表面积、总根尖数和根系干重。扬麦16和中麦895在低氮浓度下长势图如图1所示。

2、SNP标记分析

SNP(单核苷酸多态性)标记在博奥生物有限公司(CapitalBio Corporation,Beijing,China；http://bioservices.capitalbio.com)利用Illumina SNP基因分型检测，主要分为以下步骤：1)将待测小麦实验材料基因组DNA进行全基因组扩增；2)扩增产物用随机内切酶酶切断化；3)将DNA片段与芯片进行杂交，芯片的微珠上连接有50-mers长度特异性捕获探针，gDNA酶切后产物与探针互补序列结合；4)清洗去除未杂交上的或错配杂交上的DNA片段；5)二硝基酚(dinitrophenol)和生物素(biotin)标记的核苷酸底物(A/T和C/G)在捕获探针上进行单碱基延伸，只有与gDNA发生互补结合的探针才能得到延伸；通过染色，A/T和C/G将分别标记不同的荧光染料；6)芯片扫描，并利用软件根据两种荧光判读并输出分型结果。

利用Illumina SNP基因分型研究平台对扬麦16/中麦895DH群体进行660k SNP芯片分型，包括BS、BobWhite、CAP、D_contig等系列标记，共计630518个，其中626276个SNP标记在扬麦16/中麦895DH群体内存在差异。

二、关联基因定位和连锁标记AX94849523的发现

利用SAS9.2软件(SAS Institute.2000)进行基本统计量、多重比较分析，并结合SAS的Glmselect程序对SNP数据和根系性状进行逐步回归，根据P值(P<0.01)判断关联位点。定位出AX94849523与位点QRSA.caas-2BL关联(P<0.001)。

三、AX94849523位点的等位基因特异标记鉴定

分别提取12个扬麦16/中麦895DH群体的全基因组DNA。以各个基因组DNA为模板用SNP标记AX94849536位点的等位基因特异标记KASP^TM基因分型检测，出现CC分型的片段(图2)。表明SNP标记AX94849523能够有效鉴定小麦品种根系表面积基因。

表1、AX94849523标记等位变异在扬麦16/中麦895DH群体中的分离

结果表明：AX94849523位点的基因型仅为TT时，与小麦品种具有较大根系表面积的表型相符，说明AX94849523位点能够有效鉴定小麦品种根系表面积基因及其基因型。

根据Wheat DArT maps Version 1.2(http://www.triticarte.com.au)和Allen等(2011)公布的小麦分子标记图谱，将标记AX94849523整合到小麦遗传图谱上，结果如图3所示。确定QRSA.caas-2BL在染色体2B上的210cM位置。

四、KASP标记专用引物的开发

本发明针对SNP位点(序列4第36位)开发的KASP标记专用引物由2条上游引物即引物F1和引物F2和1条下游引物即引物R组成。KASP标记专用引物序列如下：

引物F1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTTCTTCGCGCAGTTCGCT(序列1)；

引物F2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTTCTTCGCGCAGTTCGCC(序列2)；

引物R：GCGGTGTCGATCAGGACGAT(序列3)。

其中，序列1所示的引物F1中的下划线标注的序列为FAM荧光序列(5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’)，序列2所示的引物F2中的中的下划线标注的序列为HEX荧光序列(5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’)。引物F1与引物R组合可以扩增SNP位点基因型为CC的片段，引物F2与引物R组合可以扩增SNP位点基因型为TT的片段。

实施例2、SNP的应用

选用24个非扬麦16/中麦895DH群体的后代品种和扬麦16。其中24个非扬麦16/中麦895DH群体后代品种为测试组，扬麦16为对照组；包括淮麦20、济麦19、济麦21、京双16、济麦22、晋麦45、良星66、周麦20、郑农21、洛麦26、中金13、绵阳26、烟农19、皖麦38、汶农14、小偃54、光泰68、先麦12、豫麦63、周麦16、周麦18、周麦22、周麦31和周麦32。

一、检测不同品种的小麦的苗期根系性状

小麦品种苗期根系性状鉴定于2016年冬在中国农业科学院作物科学研究所温室中进行。每个品种选取饱满且大小一致的种子30粒，用10％的H₂O₂处理20-30分钟，无菌水冲洗5-6次；再将种子置于铺有滤纸的培养皿中，在培养箱中暗室催芽18-24h；然后挑选发芽一致的种子25粒置于发苗网上，生长6天后选取大小一致的麦苗10株转移至培养盘中，每个培养盘进行3次重复；再将培养盘置于营养液中在可控温室内进行培养。营养液配置参照文献(Ren Y,He X,Liu D,Li J,Zhao X,Li B,Tong Y,Zhang A,Li Z.Major quantitativetrait loci for seminal root morphology of wheat seedlings.Molecular Breeding,2012,30:139-148)中的方法。幼苗培养条件为温度22±1℃，相对湿度在50％-60％。每3天更换一次营养液，连续培养10天后对苗期根部进行收获。用扫描仪对各品种收获后的根系进行扫描，再用图像分析软件Win RHIZO(加拿大Regent Instruments公司)分析如下根部性状：最长根长、侧根长、主根长、总根长、根系表面积、总根尖数和根系干重。

二、检测不同品种小麦SNP位点的基因型

分别提取各个品种小麦的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用KASP标记专用引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。其中，携带荧光序列FAM的PCR扩增产物经荧光照射显示红色，而携带荧光序列HEX的PCR扩增产物经荧光照射显示蓝色。

PCR扩增体系如下(总体积为5.2ul)：20ng/ul模板DNA 3.0ul，2×KASP reactionmix 2.0ul，引物混合试剂(Assay mix)0.1ul，ddH₂O 0.1ul。2×KASP reaction mix包括荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，以及高保真的Taq酶，dNTP等。荧光探针A的序列为5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′，5′末端连接1个荧光基团FAM；荧光探针B的序列为5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′，5′末端连接1个荧光基团HEX；淬灭探针A的序列为5′-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3′，3′末端连接淬灭基团BHQ；淬灭探针B的序列为5′-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3′，3′末端连接淬灭基团BHQ。引物混合试剂中包括引物F1、引物F2和引物R，引物F1和引物F2在PCR扩增体系中的终浓度均为0.134uM，引物R在PCR扩增体系中的终浓度为0.336uM。

PCR扩增反应在PTC-200PCR扩增仪上进行，采用Touch down PCR扩增程序为：94℃预变性15min；(Touch down程序)94℃变性30s，61℃退火60s，72℃延伸30s，11个循环，每个循环退火温度下降0.6℃；(扩增程序)94℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸30s，26个循环；72℃延伸5min；10℃保存。

将PCR扩增产物在PHERAstar^plus荧光酶标仪上用荧光照射进行基因分型，然后在KlusterCaller^TM软件读取分型后的数据，仅显示蓝色图像则说明待测小麦2B染色体210cM位置的基因(序列4)的第36位SNP位点碱基均为T，该小麦基因型为TT；仅显示红色图像则说明待测小麦2B染色体210cM位置的基因(序列4)的第36位SNP位点碱基均为C，该小麦基因型为CC；显示绿色图像则说明待测小麦2B染色体210cM位置的基因(序列4)的第36位SNP位点碱基为C和T，该小麦基因型为CT。

对各小麦品种PCR扩增产物进行两两比较，若A小麦PCR扩增产物仅显示蓝色(序列4第36位脱氧核糖核苷酸为T的纯合体，基因型为TT)，B小麦的PCR扩增产物为仅显示红色(序列4第36位脱氧核糖核苷酸为C的纯合体，基因型为CC)或绿色(序列4第36位脱氧核糖核苷酸为C和T的杂合体，基因型为CT)，则A小麦的根系性状(根系表面积)优于B小麦。

上述各个小麦的基因型及其小麦根系性状(根系表面积)见表2所示。

表2、24个小麦品种的SNP位点的基因型和根系表面积结果

注：中麦895为CC；扬麦16为TT。

以上结果表明：淮麦20、济麦19、济麦21、京双16、良星66、郑农21、烟农19、光泰68和豫麦63在SNP位点的基因型均为TT，并且这些小麦均具有较大的根系表面积。从上述结果中还可看出，SNP位点的基因型为TT的小麦的根系表面积大于基因型为CT或CC的小麦。

上述结果表明，上述SNP位点可以快速、准确地鉴定小麦品种是否具有较大的根系表面积。

序列表

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>与小麦根系性状相关的KASP标记及其应用

<160>4

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

gaaggtgacc aagttcatgc tttcttcgcg cagttcgct 39

<210>2

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

gaaggtcgga gtcaacggat tttcttcgcg cagttcgcc 39

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>3

gcggtgtcga tcaggacgat 20

<210>4

<211>71

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>4

ttcgcgcagt tcgccaagtc gatgaccaag ctcgccagcg tgcccaagcc ggcgggcaac 60

gtcgggggag a 71

Claims (10)

1.一种鉴定或辅助鉴定小麦根系表面积的方法，是检测待测小麦2B染色体210cM位置的基因的第36位脱氧核糖核苷酸的基因型是TT还是CC还是CT，根据所述待测小麦的基因型确定根系表面积：TT基因型的待测小麦的根系表面积大于CT或CC基因型的待测小麦；

所述TT基因型为2B染色体210cM位置的基因的第36位脱氧核糖核苷酸为T的纯合体；所述CT因型为2B染色体210cM位置的基因的第36位脱氧核糖核苷酸为C和T的杂合体；所述CC因型为2B染色体210cM位置的基因的第36位脱氧核糖核苷酸为C的纯合体；

所述2B染色体210cM位置的基因的核苷酸序列如序列4所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述检测待测小麦2B染色体210cM位置的基因的第36位脱氧核糖核苷酸的基因型是TT还是CC还是CT的方法包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，采用KASP引物组进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，根据所述荧光信号判断待测小麦2B染色体210cM位置的基因的第36位脱氧核糖核苷酸的基因型是TT还是CC还是CT。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述KASP引物组由上游引物F1、上游引物F2及下游引物R组成；

所述上游引物F1自5’端到3’端依次为FAM荧光序列和序列1第22-39位所示的单链DNA；所述上游引物F2自5’端到3’端依次为HEX荧光序列和序列2第22-39位所示的单链DNA；所述下游引物R为序列3所示的单链DNA。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述FAM荧光序列为序列1第1-21位所示的单链DNA；所述HEX荧光序列为序列2第1-21位所示的单链DNA；

或，利用KlusterCaller^TM软件根据所述荧光信号判断基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller^TM软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的基因型为TT；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller^TM软件分析呈现红色，则所述待测小麦的基因型为CC；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller^TM软件分析呈现绿色，则所述待测小麦的基因型为CT。

5.检测待测小麦2B染色体210cM位置的基因的第36位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质在如下(a1)-(a6)中任一种中的应用：

(a1)鉴定或辅助鉴定待测小麦根系表面积；

(a2)制备鉴定或辅助鉴定待测小麦根系表面积的产品；

(a3)选育小麦根系优良品种；

(a4)制备选育小麦根系优良品种的产品；

(a5)小麦育种；

(a6)制备小麦育种的产品。

6.如下(b1)-(b3)任一所述的产品：

(b1)权利要求2中所述的KASP引物组；

(b2)含有(b1)所述的KASP引物组的PCR试剂；

(b3)含有(b1)所述的KASP引物组或(b2)所述的PCR试剂的试剂盒。

7.权利要求6所述的产品在如下(c1)-(c3)中任一种应用：

(c1)鉴定或辅助鉴定待测小麦根系表面积；

(c2)选育小麦根系优良品种；

(c3)小麦育种。

8.一种选育小麦根系优良品种的方法，包括选择TT基因型的小麦品种进行育种的步骤；所述TT基因型为2B染色体210cM位置的基因的第36位脱氧核糖核苷酸为T的纯合体；所述2B染色体210cM位置的基因的核苷酸序列如序列4所示。

9.根据权利要求5或7所述的应用或权利要求8所述的方法，其特征在于：所述小麦根系优良品种是指根系表面积≥25.95cm²的小麦品种。

10.一种DNA片段，其为小麦2B染色体210cM位置的基因；所述小麦2B染色体210cM位置的基因的核苷酸序列如序列4所示。