CN103898122A

CN103898122A - 烟粉虱MEAM1隐种瞬时感受器离子通道基因MEAM1 BtTrp及其应用

Info

Publication number: CN103898122A
Application number: CN201410153889.7A
Authority: CN
Inventors: 吕志创; 李倩; 万方浩; 周忠实; 郭建英
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-04-16
Filing date: 2014-04-16
Publication date: 2014-07-02

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及烟粉虱MEAM1隐种瞬时感受器离子通道基因MEAM1 BtTrp及其应用，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明从烟粉虱MEAM1隐种中克隆到瞬时感受器离子通道TRP(MEAM1 BtTrp)基因的cDNA，并通过饲喂MED BtTrp基因dsRNA结果导致烟粉虱MEAM1隐种在高温胁迫下存活率显著降低。本发明结果对于明确烟粉虱MEAM1 BtTrp隐种温度感知机制有重要意义，期望为进一步研究烟粉虱的温度适应机理和日后通过温度适应性控制烟粉虱危害的方法提供依据。

Description

烟粉虱MEAM1隐种瞬时感受器离子通道基因MEAM1 BtTrp及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及烟粉虱MEAM1隐种瞬时感受器离子通道基因MEAM1 BtTrp及其应用。

背景技术

在动物体中，许多细胞表面受体和离子通道的感受器随着环境变化的刺激影响动物行为。在众多离子通道中，瞬时感受器阳离子通道(transient receptor potential,TRP)最早发现于果蝇的视觉系统，几乎存在于每个器官。昆虫温度的感知与TRP有关，TRP是位于细胞膜上的一种非选择性阳离子通道跨膜蛋白质，当其被激活时，允许包括钙离子在内的阳离子进行跨膜运输。TRP作为感受器中的门控分子，起到外部环境和神经系统中介的作用，可以将温度刺激、化学刺激以及机械刺激等转化成内向电流。已有研究表明，TRP是生物感知外界温度的关键通道。基于TRP对生物体感知的重要作用，推测其是粉虱类进行温度适应并广泛扩散暴发的重要基础。

粉虱属于半翅目(Hemiptera)，粉虱科(Aleyrodidae)，是一类体型微小的植食性刺吸类害虫，主要集中在热带和亚热带地区。至2007年，记载的粉虱有1556种，其中报道最多、为害最为严重的是烟粉虱Bemisia tabaci Gennadius。烟粉虱是一个包含30个以上隐种的物种复合体。例如，MEAM1(Middle East Asia Minor1)具有很强的入侵性，属于全球入侵种，起源于中东-小亚细亚，现已广泛分布于世界各地，号称“超级害虫”，给许多国家和地区的农作物造成了毁灭性的灾害。温度是决定物种分布和扩散区域的重要影响因子，由此可见，对温度胁迫具有较高的适应能力是烟粉虱MEAM1隐种能广泛分布于世界各地关键因素之一。随着全球温度的变化，烟粉虱MEAM1隐种在不同地理环境下的成功适应，已经广泛引起了人们对其入侵机制的理论探讨，对于其温度适应性的分子机制更是近几年来的研究热点之一。昆虫温度耐受性的获得与热激蛋白(heat shock proteins,HSP)的分子伴侣作用有关，热激蛋白在生物热胁迫生态适应和进化上起着重要作用。前期研究表明热激蛋白基因在烟粉虱MEAM1隐种的温度耐受性中起关键性作用，为更好的理解烟粉虱MEAM1隐种温度适应能力，研究烟粉虱MEAM1隐种怎样感知外界温度并将其传递至体内的温度感知机制尤为重要。因此，研究烟粉虱MEAM1隐种的TRP基因及其在温度胁迫下的作用是回答其温度适应分子机制的核心内容之一。

RNA干扰（RNA interference,RNAi）现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA(double strand RNA,dsRNA)导入细胞后能特异性地降解该mRNA，从而产生相应的功能表型缺失。RNAi广泛存在于生物界，从低等原核生物到植物、真菌、无脊椎动物、哺乳动物中均发现有此种现象。近些年，RNAi技术在昆虫研究上得到越来越多的应用，通过RNAi技术沉默昆虫体内某些基因，使昆虫的某些能力增强或丧失，也能在特定时间抑制其功能基因表达使昆虫的发育停留在某个阶段，进而达到利用或防治其危害的目的。RNAi常用的导入方法有浸泡、饲喂、电穿孔、注射、病毒感染、干细胞移植、转基因等。在昆虫中，常用注射法和饲喂法进行RNAi效应的研究，即将目的基因的dsRNA或siRNA导入昆虫体内，进而实现干扰。由于烟粉虱个体体积小，注射dsRNA不易操作、费时等限制，而饲喂dsRNA具有简便、易于操作等特点而在烟粉虱研究中得以应用。

本发明从烟粉虱MEAM1隐种中克隆到MEAM1 BtTrp基因的cDNA，并提供MEAM1 BtTrp基因cDNA的克隆方法；并通过饲喂MEAM1 BtTrp基因dsRNA，进而导致烟粉虱MEAM1 BtTrp隐种成虫在高温胁迫下死亡率显著增加。本发明结果为明确MEAM1 BtTrp基因在烟粉虱MEAM1温度感知中的作用奠定基础，期望为进一步研究烟粉虱MEAM1的温度适应机理和日后通过温度适应性控制烟粉虱危害的方法提供依据。

发明内容

本发明的目的是提供烟粉虱MEAM1隐种瞬时感受器离子通道基因MEAM1BtTrp。

本发明的再一目的是提供上述烟粉虱MEAM1隐种瞬时感受器离子通道基因MEAM1 BtTrp的应用。

根据本发明的MEAM1 BtTrp基因的cDNA全长核苷酸序列如SEQ ID No.1所示：

ATGAAGCCGACGGAATCGAAGGAGGACCTTCTGGGGTCGAAGGAAAACCTAAAAAATCCCCGAGAGTCCTTGCAGTCCACCGGCGGCGAGGTTGCCCTCTCCCAAATCGAGAAAAGGTTCCTCTTGCTCAGCGAAAGGGGAGATATCGCCTCTGTCAAAAGGATAATCGCCGAGCACAAAGATCACCCAGAGCTATTGAACATCAATTGCGTTGATCCTCTGAATAGGTCAGCACTCATCGCAGCGATCGAAAATGAAAATATAGAGTTAATAAGAGTCCTCCTCGAACTTGGGATTGAAGTCAAGGATGCTCTTCTACATGCAATTAAGGAAGAGTACGTTGAAGCTGTGGAGATTCTACTTGAATGGGAAGAAAAAATCCACAAACCTGGGCAGCCTTATAGTTGGGAAGCCGTCGACAGGAGCTCTTCGACATTTACACCGGACATAACACCGCTCATATTGGCTGCTCATATGAACAATTACGAAATCCTGAAAATTTTGTTGGATCGAGGGGCCACACTCCCCGTGCCACACGATGTTAGGTGTGGCTGCGACGAATGTGTAACTTCAAGTGAGCAGGATTCTTTGCGACATTCACAAGCTCGGATCAACGCGTACAGAGCTTTAACCGCACCATCCCTCATAGCCCTCTCTTCCAGGGATCCCCTCCTTACCGCCTTCGAGTTATCATGGGAGCTGCGCAGACTCAGCAAGATGGAAGCGGAATTCCGCTCTGAATATAATGAAATGAGAGGTATTTGTCAGACATTTGCAACCTCCTTGCTAGACCACGCGCGAACCTCGTATGAACTGGAGGTGATGCTTAATCATAATCCTGATGGAGAGTCGTGGGAACCAGGAGAGAGGCAAACTCTGGAGAGACTGAAGCTAGCTATCAAATACAAACAAAAAGCGTTTGTTGCTCATCCAAATGTACAACAGCTGCTGGCAGCTATTTGGTATGATGGTCTCCCCGGATTTCGACGAAAAGGGATGATTGGTCAAGCTTTTGAGTGTGGAAAGTTAGGTGCAATGTTTCCTGTCTACGCAACCGTGTATTTGACAGCGCCTGAATCGGAGATGGGCCAGTTCATGAAAAAACCCTTTGTAAAGTTCATCTGTAATTCAACCTCCTACGCTTTCTTCCTGATGTTATTGGCCTTGGCATCACAAAGAGCGGAATTTCTTGCAATCGAATGGTTTGGACCCGACTGGATGAAAGAGATACTGAAAGAGTGGATTCGAAAGGAAAGAGGATCAATACCTGGTCTCATAGAATCCTTTATTATTTTGTATGTCATAAGTTTGATTTGGGGTGAAATGAGAGCATTGTGGTCTGGTGGCTTAGAGGACTATGTTTCAGATTTGTGGAATATAGTGGATTTCATCACCAATGTATTCTATATGATATGGATTTGTCTCAGAGGAACTGCGTATATCATTGTGCAAAGAGAGCATAAAAGTGGCCTCGATCCATGGTATCCTCGTGATAAGTGGGACATGTTTGATCCTCATCTTCTATCAGAAGGTGCGTTTGCAGCCAGTATGATCTTCAGTTTCTTAAAATTGGTTCATATCTTCAGTATCAATCCTCATCTTGGTCCATTGCAAATTTCGTTGGGACGAATGATTGTCGACATCATCAAATTTTTCTTCATCTACACATTGGTCCTTTTCGGTTATGGTTGTGGTATGAATCAGTTACTTTGGTACTATGCTGATCTTGAGAGGAAAAAGTGTTATCATCTCAACGAGGATTATGCTGATTTTGATGGTCAAGATAAAGCCTGTACAACATGGAGACGTTTTGCAAATTTATTTGAAACATCTCAGTCTCTGTTCTGGGCCAGTTTCGGTTTAGTTGATCTTGTATCGTTTGATCTGACTGGTATTAAGAGTTTCACCCGGTTTTGGGCTCTTCTGCTTTTCGGATCATACTCCGTTATCAATATCATTGTCCTGCTCAACATGTTGATTGCCATGATGTCCAACAGTTACCAAATCATCTCTGAACGATCCGATACTGAATGGAAATTTGCTCGAAGTGACCTATGGATCAGCTACTTTGAGGATGGCGACACTGTTCCCCCACCATTCAACCTATCACCATCCGTTAAATCTATGAAAAGAATGATGGGAATCAAAACTGGGAAAATCAGCACTGGTTCGATGAAGAACAAAAGTCGAGCTAAAGCTATGGAGCGTCACGAAGCAGTCATGAAACTATTGGTCAGGCGATATGTTGTGGCTGAGCAAAGGAAGAGAGATGAGTTCGGCATCACAGAAGATGATGTTATGGAAATTCGACAAGATATTTCAACCCTTCGTTTTGAACTGATCGATATCCTCCGAACGAACGGAATGAAGACACCGAGCGTGGACAAAGAGGATCAAGCAGTGGGCAAGAAAGGTCGTGTGATGGAGCGTCGTTTGCTGAAGGACTTCCAGATCGGCCTGGTTGAGGGTATAATTAGTGATGTTATATCTTCTGAGAAAGAGCCGAAAGATGTCTTCAGCAAAATTGCTCGCGCAATTGGTAAGGACTCTAGTGCTAAGAAAAAGGACTGGAACGCTATTGCCGCCAAGAAAGCATCCAGCCGCGAACTTATTGGAAGCACCAGCGAGGCTGTGGAGCGTCGGCAATCACGCCAGAGTTTGCGCCGGCACATCCTCGAACATCAAGGATCAGCAATGGCAAATATGGATCCCGAGAAGCTGGTTGAGTACAATCCCAAGTTGCAAGAATATGCACCTGCTGCTCGAATCGCCTATGCCAAATTCAAGATTTCCAAGATCAAGCAAGAATATGACGATAAAGGAAATGAAGAAGAAGGCAAAGACGATGTTTTCGAGCCTGCTACAGTAACAACGAAGGACGAAACAAAACCATCCCAAAGTGGCTCCATCGCACGGCCGAGACCCAAAAGCACCAAGAAACCACCCGCACCTGGAGCCATTCCAGGTCCCGACGATGGCAAGAAAGACTTCCGGTCGCGAACTCCGATCCAAGAAGATCCAAGAGAGGCTGGCCGCACTCCAACGCCAGAACCAATCAAAATGCTCAAGACATCGATTTCCTCTCTCAAGCAAGTATCAGTCGATCAAAAAGCTGGGCCATCAGACAAAAAACCCGCCGCCCCGGGGGCTCCGGCTCCGAAAGTAGAGGTCACCGCAGCTAAATCACCTGCAAAAACAGAGGCAGCCCCGGCAAAACCTGAAGAAAAGAAGCCCACACCTGCTAAACCAGAGGAAAAGAAGCCTGCCGCTGCTGCTGCTACGCCTAAAGCAGACGAAAAGAAGGACGAGAAGAAAGAAGAAAAGAAGGACGAGAAGAAAGATGAGAAGAAAGAGGAAAAGAAAGACGATAAAAAGCCGGGCCCTGCTCCGAAAAAACCAGATGATAAGGATAAGCCTCCCTCGCCGAAGAAAACGATGATCCACACAAAACCTGGTGGTAAATCAACAGTCACCGGCGAAGTACTGACTGGATGGTTGTAA

本发明还提供了所述烟粉虱MEAM1隐种瞬时感受器离子通道基因MEAM1BtTrp用于防治烟粉虱的应用。

本发明所获得的结果为明确MEAM1 BtTrp基因在烟粉虱MEAM1温度感知中的作用奠定基础，期望为进一步研究烟粉虱MEAM1的温度适应机理和日后通过温度适应性控制烟粉虱危害的方法提供依据。

附图说明

图1MEAM1 BtTrp基因的dsRNA处理对烟粉虱MEAM1隐种成虫耐热性的影响：比较饲喂MEAM1 BtTrp基因dsRNA、饲喂10%蔗糖溶液3h后烟粉虱MEAM1隐种成虫死亡率。所有数据均用SPSS16.0统计软件进行数据统计分析，显著性检验水平为P<0.05。

具体实施方式

实施例1：烟粉虱MEAM1 BtTrp基因全长cDNA序列克隆

1、提取总RNA：

取烟粉虱MEAM1隐种的成虫200头放入已灭过菌的研磨器中，加入1mL的Trizol溶液，研磨充分后，加入到1.5mL的离心管中。充分振荡混匀，室温放置5min；静置后加入0.2mL的氯仿，充分振荡混匀15s，室温放置5min，使用高速低温离心机12000rpm离心15min；取上清液于另一离心管中，加入等体积异丙醇，摇晃混匀，室温放置10min。在4℃下12000rpm离心15min；弃上清液，加入浓度75%的乙醇1mL，在4℃下12000rpm离心10min；弃上清液，并在超净工作台放置5min，加入50μL的DEPC水，在55-60℃水中5min使RNA沉淀充分溶解，-80℃超低温冰箱保存以备用。

2、烟粉虱MEAM1隐种cDNA合成：

采用Transgen公司的反转录试剂盒(Super Script First-Strand Synthesis System)说明进行。

3、PCR扩增MEAM1 BtTrp基因的中间片段：

（1）设计引物MEAM1 BtTrp-F和MEAM1BtTrp-R：

MEAM1BtTrp-F:5’-CCACCATTCAACCTATCAC-3’

MEAM1BtTrp-R:5’-AACATCGTCTTTGCCTTC-3’由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

（2）以cDNA为模板，PCR扩增烟粉虱MEAM1隐种MED BtTrp基因的中间片段：

反应体系为25μL：10×PCR reaction buffer2.5μL、dNTP Mix(10mM)0.5μL、Taq聚合酶(2.5U)0.5μL、上游引物和下游引物(10μM)各1.0μL、cDNA模板0.5μL、灭菌ddH₂O19.0μL。

反应条件为：94℃ 5min;94℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 1min,35个循环；72℃ 10min

（3）PCR产物纯化：利用Transgen公司的EasyPureTM Quick Gel Extraction Kit试剂盒将PCR产物进行切胶纯化。

（4）PCR产物连接、转化与鉴定：

连接：在0.2mL的离心管中加入以下试剂：上述PCR纯化产物4μL，pEASY-T1载体1μL，轻轻混合，室温反应20min，反应结束后置于冰上。

转化：将连接产物加到体积为50μL的Transl-T1感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴20min；42℃热激30s，立即置于冰上2min；加入500μL液体LB培养基，200rmp，37℃摇床孵育1h；取40μL X-gal（20mg/mL）和8μL的IPTG（500mM），混匀后均匀地涂于LB固体平板培养基上，37℃培养箱放置30min；取200μL菌液涂平板，37℃培养过夜。

鉴定：挑取白色单菌落于含Amp的LB液体培养基中摇床培养10h，菌液进行菌落PCR。菌落PCR反应体系为10μL：2×EasyTaq SuperMix5μL、M₁₃F上游和下游引物(10μM)各1.0μL、cDNA模板1.0μL、灭菌ddH₂O2.0μL。

菌落PCR反应条件为：94℃ 10min;94℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 1min,30个循环；72℃，10min。

琼脂糖凝胶电泳检测菌落PCR产物大小，选出重组克隆，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

4、烟粉虱MEAM1 BtTrp基因5’RACE和3’RACE获得

根据步骤3所获得的烟粉虱MEAM1 BtTrp基因的中间片段序列，设计5’RACE和3’RACE特异性引物，PCR扩增MED BtTrp基因的5’和3’端序列：

5’RACE Outer Primer:5’-TTGGCGGCAATAGCGTTCCAGTCC-3’

5’RACE Inner Primer:5’-CTCTTTGTCCACGCTCGGTGTCTT-3’

3’RACE Outer Primer:5’-ACACCGAGCGTGGACAAAGAGGA-3’

3’RACE Outer Primer:5’-CTATTGCCGCCAAGAAAGCATCCAG-3’

采用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit（Clonetch）试剂盒，并严格按照试剂盒说明书操作，扩增得到目的条带，将克隆测序后的序列利用DNAMAN和GENtle软件拼接,得到MEAM1BtTrp基因3501bp序列，所得的基因具有如SEQ IDNo.1所示的序列。

实施例2：MEAM1 BtTrp基因的dsRNA处理对烟粉虱MEAM1隐种耐热性的影响

1、dsRNA模板的制备：

加上T7启动子（下划线所示序列）后的引物序列：

T7+ MED BtTrp-F ：

TAATACGACTCACTATAGGGAGACCACGAAGACACCGAGCGTGGACAAAG；

T7+MED BtTrp-F ：

TAATACGACTCACTATAGGGAGACCACGGCAATAGCGTTCCAGTCCTTTT。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

总RNA提取及cDNA合成：同实施例1。

T7引物PCR扩增：

反应体系为50μL：10×PCR buffer5.0μL、dNTPs1.0μL、cDNA模板1.0μL、Primer-T7F 2.0μL、Primer-T7R 2.0μL、TransStart Taq DNA Polymerase1μL、ddH2O38.0μL。

反应条件：94℃ 5min；94℃ 30s,60℃ 30s,72℃ 30s,35个循环；72℃ 10min。

结果检测：确认所扩增的条带为目的条带。

T7引物扩增的PCR产物纯化：

使用Qiaquick PCR purification kit(Qiagen,Inc.,Hilden,Germany)试剂盒纯化PCR产物，按照试剂盒说明书进行操作。纯化所得的PCR产物即为本实验合成dsRNA的模板。

2、dsRNA的合成与纯化

使用RNAi Kit试剂盒合成和纯化dsRNA

3、dsRNA饲喂

Parafilm膜用DEPC水处理。在浓度为10％的蔗糖液中加入dsRNA，浓度为0.3～0.5μg/μL。根据本实验需求，对Parafilm膜夹营养液法（Miles et al.,1965）做了相应的改进：取初羽化的烟粉虱MEAM1隐种成虫约200头放人两端通透的玻璃管中（直径3cm，高8cm），玻璃管上端覆以两层Parafilm膜并在两膜间的空隙内加入含有dsRNA的10％的蔗糖液200～250μL，玻璃管下端覆以纱布以保持通气，玻璃管周围和下端用黑色塑料纸包裹有利于烟粉虱向顶端Paraflim膜聚集，从而更好的取食dsRNA混合液。将处理好的玻璃管放入人工气候箱中（温度25±0.2℃，24h光照，相对湿度为60-70%），饲喂3小时MEAM1BtTrp基因的dsRNA后，将烟粉虱收集于指型管中（长5cm，直径1.2cm），放入预热的高温水浴锅（MicroprocessorControl MPC Huber，德国）处理1h，处理温度为45℃。处理后的成虫在26℃常温下恢复1h，统计死亡率。本研究以饲喂不含dsRNA且灭菌处理过的10%蔗糖溶液和不饲喂任何溶液的烟粉虱MEAM1隐种作为对照，每组5个重复。利用SPSS16.0统计软件分析饲喂不同溶液后烟粉虱MEAM1隐种死亡率，结果如图1所示，饲喂MEAM1 BtTrp基因dsRNA的烟粉虱MEAM1隐种的死亡率显著高于饲喂蔗糖组和空白对照组死亡率（P<0.001），同时在NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）BLAST显示，所饲喂的靶序列片度为TRP基因特有的序列，由此确保了干扰效果为目的基因MEAM1 BtTrp所产生，因此，本发明表明MEAM1BtTrp基因在烟粉虱MEAM1隐种高温胁迫和高温感知中起着关键作用。

Claims

1.烟粉虱MEAM1隐种瞬时感受器离子通道基因MEAM1 BtTrp，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述烟粉虱MEAM1隐种瞬时感受器离子通道基因MEAM1 BtTrp用于防治烟粉虱的应用。