CN113521291B - Znf143-mdig-cdc6轴在肝细胞癌中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种ZNF143‑MDIG‑CDC6轴在肝细胞癌中的应用。具体地，本发明提供了一种活性成分组合及其用于协同治疗肝癌用途，所述活性成分组合包括第一活性成分锌指蛋白ZNF143抑制剂，第二活性成分细胞分裂周期蛋白CDC6抑制剂，和/或第三活性成分矿物粉尘诱导基因MDIG抑制剂。本发明方法可有效抑制肝细胞癌发展和转移。

Description

ZNF143-MDIG-CDC6轴在肝细胞癌中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及ZNF143-MDIG-CDC6轴在肝细胞癌中的应用。
背景技术
原发性肝癌(Primary liver cancer)是常见的恶性程度极高的肿瘤。发病率位居恶行肿瘤第六位，死亡率位居第四位。原发性肝癌根据其病理组织学类型分为肝细胞肝癌(Hepatocel lular carcinoma,HCC)、肝内胆管癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)，肝细胞-胆管细胞混合性癌(HCC-ICC混合型)，其中肝细胞肝癌约占90％。
在治疗方面，目前早期肝癌的治疗还是以手术为主，早期肝癌的外科治疗依旧是肝癌病人提高生存期的重要手段，但因为肝癌病人很多都伴随着肝硬化，在确诊时大部分病人已达中晚期，能获得手术切除机会的病人很少。但目前传统的化疗药物，在肝癌中的治疗效率均不高，且毒副作用大，不但会激活乙肝病毒复制，还会损害病人的肝功加重病人的肝炎肝硬化，并不会为肝癌病人带来生存收益。近年来针对晚期肝癌的系统性治疗的药物非常少，且目前肝癌的治疗方式尚不能取得良好的效果。
因此，本领域急需一种有效用于治疗肝细胞癌的新靶点和新思路。
发明内容
本发明的目的是提供一种有效用于治疗肝细胞癌的新靶点和新思路。
在本发明的第一方面，提供了一种活性成分组合，所述活性成分组合包括第一活性成分锌指蛋白ZNF143抑制剂，第二活性成分细胞分裂周期蛋白CDC6抑制剂，和/或第三活性成分矿物粉尘诱导基因MDIG抑制剂。
在另一优选例中，所述抑制剂选自下组：靶向ZNF143蛋白和/或CDC6蛋白和/或MDIG蛋白的抗体或小分子抑制剂、ZNF143基因和/或CDC6基因和/或MDIG基因靶向核酸分子或基因编辑器、或其组合。
在另一优选例中，所述基因编辑器包括DNA基因编辑器和RNA基因编辑器。
在另一优选例中，所述基因编辑器包括gRNA和基因编辑蛋白。
在另一优选例中，所述gRNA是引导基因编辑蛋白特异性结合ZNF143蛋白和/或CDC6蛋白对应基因的RNA。
在另一优选例中，所述基因编辑蛋白选自下组：CasRx、Cpf1、Cas9、Cas13a、Cas13b、Cas13c、或其组合。
在另一优选例中，所述的ZNF143抑制剂选自：小分子抑制剂YPC-21661、YPC-22026、或其组合。
在另一优选例中，所述的CDC6抑制剂选自：BCR/ABL激酶抑制剂STI571、磷酸肌醇3-激酶/AKT途径抑制剂LY294002、Janus激酶/信号转导子和激活剂的转录途径抑制剂AG490、AR信号抑制剂enzalutamide(ENZ)和Chk1/2抑制剂AZD7762，或其组合。
在另一优选例中，所述的MDIG抑制剂选自：JNK抑制剂SP600125(Calbiochem)、STAT3抑制剂V(InV)(Stattic，圣克鲁斯)、Akt抑制剂Wortmannin、jumonji组蛋白脱甲基酶抑制剂JIB-04、C-myc抑制剂佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯，或其组合。
在本发明的第二方面，提供了一种如本发明第一方面所述的活性成分组合的用途，所述活性成分组合用于制备协同治疗肝癌的药物组合物或药盒。
在另一优选例中，所述的药物组合物或药盒用于治疗哺乳动物或施用于哺乳动物，更佳地所述哺乳动物为啮齿类动物(如小鼠、大鼠)或人。
在另一优选例中，所述的肝癌包括临床上确诊的肝癌，和合并存在病灶组织中ZNF143表达异常的肝癌癌前病变。
在另一优选例中，所述的ZNF143表达异常，包括但不限于，ZNF143基因突变、ZNF143基因扩增、或其组合。
在另一优选例中，所述的肝癌癌前病变选自下组：肝硬化、肝细胞不典型增生、腺瘤样增生、腺瘤样增生、慢性肝炎、乙型肝炎病毒(HBV)感染、丙型肝炎病毒(HCV)感染、酒精性肝病、脂肪性肝病、或其组合。
在另一优选例中，所述的肝癌是原发性肝癌。
在另一优选例中，所述的原发性肝癌选自下组：肝细胞肝癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)、肝内胆管癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)、肝细胞-胆管细胞混合性癌(HCC-ICC混合型)、或其组合；优选地，选自肝细胞肝癌。
在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括ZNF143抑制剂、CDC6抑制剂、和/或MDIG抑制剂，以及药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物还包括额外的治疗药物(如抗肿瘤剂)。
在另一优选例中，所述的药物组合物还包括化疗剂、检测点抑制剂、CAR-T细胞、或其组合。
在另一优选例中，所述的化疗剂包括顺铂、紫杉醇。
在本发明的第四方面，提供了一种药盒，所述药盒包括：
(a)第一制剂，所述第一制剂含有ZNF143抑制剂以及药学上可接受的载体；
(b)第二制剂，所述第二制剂含有CDC6抑制剂以及药学上可接受的载体；
(c)第三制剂，所述第三制剂含有MDIG抑制剂以及药学上可接受的载体；和/或
(d)说明书，所述说明书描述了将培干扰素和原癌基因产物靶向抑制剂联用以治疗肿瘤的方法。
在另一优选例中，所述的第一制剂、第二制剂和第三制剂是各自独立的。
在另一优选例中，所述的第一制剂、第二制剂和第三制剂为冻干制剂或液态制剂。
在本发明的第五方面，提供了一种体外非治疗性的协同抑制肿瘤细胞生长的方法，包括步骤：向肿瘤细胞培养体系中加入本发明第一方面所述活性成分组合和/或第三方面所述的药物组合物，从而协同抑制肿瘤细胞生长。
在另一优选例中，所述方法包括：将肿瘤细胞与ZNF143抑制剂、CDC6抑制剂、和/或MDIG抑制剂一起混合培养。
在另一优选例中，所述的肿瘤细胞包括处于对数生长期的肿瘤细胞。
在另一优选例中，所述的肿瘤细胞的数量为103-108个/ml。
在另一优选例中，所述的培养时间为0.1-120小时，较佳地1-96小时。
在另一优选例中，所述的肿瘤细胞为肝癌细胞。
在另一优选例中，所述的肝癌细胞为分离的人肝癌细胞。
在另一优选例中，所述的肝癌细胞选自：MHCC-97L、MHCC-LM3、Li-7、Hep 3B、MHCC-97H、或其组合。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了ZNF143在肝细胞癌及其他肿瘤中的表达情况。(A)TCGA数据库中ZNF143在49对肝细胞癌及癌旁组织中的表达情况。(B)Q-PCR实验检测ZNF143在人肝细胞癌组织及癌旁组织中的mRNA表达情况。(C,D)Western Blot实验检测ZNF143在人肝细胞癌及癌旁组织中的蛋白表达。(E)HCCDB数据库中ZNF143在各种肿瘤及癌旁组织中的表达情况。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，t-test(下同)。
图2显示了ZNF143的表达在肝细胞癌中的临床意义分析。(A)Kaplan-Meier分析ZNF143的表达水平与肝细胞癌患者总生存期(OverallSurvival，OS)之间的关系。(B)TCGA数据库中，ZNF143在不同级别的肝细胞癌中的表达情况。
图3显示了ZNF143在肝细胞癌细胞系中的表达。(A)Q-PCR检测ZNF143在肝细胞癌细胞系中的mRNA表达水平。(B)Western Blot实验检测ZNF143在肝细胞癌细胞系中的蛋白表达水平。
图4显示了细胞癌细胞系中，ZNF143干扰及过表达感染效果验证。(A)Q-PCR检测在肝细胞癌细胞系中ZNF143外源性干扰以及过表达的mRNA表达。(B)Western Blot检验ZNF143外源性干扰以及过表达的蛋白水平改变。
图5显示了ZNF143促进肝细胞癌细胞体外增殖，克隆形成的能力。(A,B)MTT实验检测ZNF143对肝细胞癌细胞增殖能力的影响。(C,D)平板克隆实验检测ZNF143对肝细胞癌细胞克隆形成能力的影响。(E)TCGA数据库中，ZNF143与Ki67及增殖细胞核抗原(PCNA)的相关性。
图6显示了ZNF143促进肝细胞癌细胞的肿瘤生长。(A)ZNF143过表达后，Li-7细胞的裸鼠皮下成瘤图及瘤重统计(n＝9)。(B)ZNF143稳定干扰后，MHCC-97H的裸鼠皮下成瘤图及瘤重统计(n＝9)。(C)免疫组化检测Ki67在ZNF143稳定干扰及过表达后的肿瘤组织中的表达。(D,E)ZNF143在肿瘤组织中的蛋白表达情况。
图7显示了ZNF143促进肝细胞癌细胞G1/S期转换。(A)流式细胞计数检测ZNF143稳定过表达的MHCC-LM3细胞周期变化。(B)Thymidine同步化后，ZNF143稳定过表达的MHCC-LM3细胞周期变化。(C)流式细胞计数检测ZNF143稳定干扰的MHCC-97H细胞周期变化。(D)Thymidine同步化后，ZNF143稳定干扰的MHCC-97H细胞周期变化。
图8显示了ZNF143可以激活CDC6的表达。(A)Q-PCR实验检测ZNF143过表达及干扰后，S期相关基因的表达。(B)Western Blot实验检测ZNF143干扰及过表达后CDC6的蛋白表达水平。
图9显示了ZNF143通过降低H3K9me3的富集从而激活CDC6的表达。(A)CDC6启动子区引物设计的模式图。(B-D)ChIP-QPCR检测ZNF143稳定过表达的MHCC-LM3及Li-7细胞中H3K9me3、H3K4me3、H3K27me3在CDC6启动子区的富集情况。(E)ChIP-QPCR检测ZNF143稳定干扰的MHCC-97H及Hep 3B细胞中H3K9me3在CDC6启动子区的富集情况。
图10显示了ZNF143可以激活MDIG的表达。(A)Q-PCR检测ZNF143过表达后KDM4A、KDM4B、KDM4C、KDM4D及MDIG的变化。(B)Western Blot实验检测ZNF143干扰及过表达后MDIG蛋白水平的变化。
图11显示了ZNF143可以直接激活MDIG的表达。(A)JASPAR数据库中ZNF143可以识别的靶区域。(B)ZNF143在MDIG启动子区域可能识别的结合位点。(C)双荧光素酶报告基因实验检测ZNF143对MDIG启动子区域的转录活性。(D)ChIP实验检测ZNF143可以直接结合到MDIG的启动子区域。
图12显示了ZNF143通过促进MDIG的表达促进肿瘤生长。裸鼠皮下成瘤实验检测，ZNF143过表达及MDIG干扰的情况下，Li-7细胞的肿瘤生长能力。
图13显示了ZNF143、MDIG、CDC6呈正相关性。(A)TCGA数据库中，ZNF143、MDIG及CDC6的相关性。(B)Q-PCR检测在肝细胞癌病人癌组织中，ZNF143、MDIG及CDC6的相关性。(C)免疫组化示例肝细胞癌病人中，ZNF143、MDIG、CDC6的蛋白表达。(D)ZNF143、MDIG、CDC6的免疫组化染色在肝细胞癌病人癌组织中的统计。(E)噻嘧啶处理24小时并释放后，在不同时间点ZNF143、MDIG及CDC6的蛋白表达水平变化。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现在肝细胞癌病人癌组织中存在着显著上调的ZNF143-MDIG-CDC6调控轴，具体地，ZNF143通过激活MDIG进而促进CDC6的表达，促进肝细胞癌细胞的增殖能力促进肿瘤生长。进一步，还发现在小鼠荷瘤实验中，抑制癌细胞中ZNF143或MDIG，能抑制肿瘤生长能力。在此基础上，本发明人完成了本发明。
术语
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
序列同一性通过沿着预定的比较窗(其可以是参考核苷酸序列或蛋白的长度的50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％)比较两个对齐的序列，并且确定出现相同的残基的位置的数目来确定。通常地，这表示为百分比。核苷酸序列的序列同一性的测量是本领域技术人员熟知的方法。
肝细胞癌与其分子病理改变
原发性肝癌(Primary liver cancer)是常见的恶性程度极高的肿瘤。发病率位居恶行肿瘤第六位，死亡率位居第四位。根据国家癌症中心最新统计，中国肝癌发病率位居恶行肿瘤第四位，死亡率位居恶性肿瘤的第二位。原发性肝癌根据其病理组织学类型分为肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)、肝内胆管癌(Intrahepaticcholangiocarcinoma,ICC)，肝细胞-胆管细胞混合性癌(HCC-ICC混合型)，其中肝细胞肝癌约占90％。
肝癌最常见的原因是在很多基础疾病的基础上由慢性肝炎或肝硬化，感染乙型肝炎病(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)以及酒精性或脂肪性肝病等的基础上发生的。基因突变在肝细胞癌的发生发展中发挥着驱动的作用，常见的肝细胞癌突变包括TERT、CTNNB1、TP53、AXIN1、RB1、ARID1A、ARID2、NFE2L2等。
在本发明的一个实施例中，发现锌指蛋白143在肝细胞癌组织中存在明显的高表达。在本发明的另一个实施例中，发现对于肝细胞癌病人，锌指蛋白143表达升高与肝细胞癌不良预后呈正相关。由此本发明首次关注了与肝细胞癌病理过程中，锌指蛋白143的作用机制与应用潜力。
锌指蛋白143及其功能
锌指蛋白143(Zinc Finger Protein 143，ZNF143)，又名硒半胱氨酸tRNA转录激活因子Staf(selenocysteine tRNA gene transcription activatingfactor，hStaf)，是锌指结构C2H2型转录因子，其人ZNF143基因位于11号染色体上，有20个外显子。
目前，研究表明ZNF143在多种肿瘤中高表达并与肿瘤的恶性表型密切相关。研究结果显示，ZNF143过表达促进上皮间质转化进而促进胃癌细胞的迁移和侵袭。同时，在其他肿瘤如乳腺癌等还有一些功能相反的报道。另外，ZNF143与化疗耐药相关，ZNF143在一些顺铂耐药的肿瘤中高表达，另外顺铂及其他DNA损伤相关试剂可以诱导ZNF143的表达，并结合在顺铂所修饰的DNA，进而促进顺铂的耐药。目前，至于ZNF143与肝细胞癌的关系还没有相关确切的研究。
在本文中，“锌指蛋白143”、“ZNF143”可以互换，如无特殊表明种属来源，均代指人的锌指蛋白143的基因或蛋白。
矿物粉尘诱导基因及其功能
矿物粉尘诱导基因MDIG(Mineral dust-induced gene,MDIG)，也称为MINA53(myc-induced nuclear antigen with amolecular weight of 53kDa,MINA53)，RIOX2(ribosomal oxygenase 2)，或者NO52(nucleolar protein 52)，位于人3号染色体上，有13个外显子。有研究显示，MDIG可以通过表观遗传改变调控细胞周期依赖性激酶CDK的表达促进胶质母细胞瘤增殖和肿瘤形成。另外，在抗癌药物方面的研究显示，MDIG与肺癌化疗耐药及免疫调控相关。
本发明证明，在肝癌中MDIG可以促使H3K9me3的去甲基化；MDIG在肿瘤中的表达明显高于癌旁组织，且其表达升高与肿瘤的不良预后相关。在肝细胞癌中，MDIG的过表达可以促进了肝细胞癌细胞的增殖、细胞迁移和侵袭。这与MDIG在其他肿瘤如乳腺癌的报道相反。
细胞分裂周期蛋白6及其功能
细胞分裂周期蛋白CDC6(cell division cycle 6)，位于17号染色体上，有13个外显子。研究显示，CDC6在DNA复制的早期阶段起调节作用，即在复制开始时，DNA结合复合体(起始识别复合体，即ORC)首先识别并结合DNA复制起始位点，然后招募CDC6及其他蛋白，从而DNA复制起始。因此，CDC6是DNA复制所必须的蛋白。
目前，研究表明CDC6在前列腺癌、胰腺癌等肿瘤组织中的表达明显高，且其表达升高与肿瘤的恶性表型密切相关。干扰CDC6可以抑制骨肉瘤细胞的增殖，侵袭能力，并促使细胞周期阻滞。
本发明证明，CDC6在肝细胞癌组织中表达升高，与肝细胞癌转移相关。
ZNF143-MDIG-CDC6调节轴
在本文中，发明人在肝细胞癌组织中首次发现了一条全新的肿瘤细胞生长调节通路——ZNF143-MDIG-CDC6调节轴。具体地，ZNF143通过与MDIG启动子结合，激活MDIG的组蛋白去甲基化酶活性，抑制CDC6启动子H3K9me3富集，CDC6转录上调。所述ZNF143-MDIG-CDC6调节轴上调，与肝细胞癌中肿瘤细胞增殖、细胞迁移和侵袭相关。
抑制剂和药物组合物
利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与所述基因或蛋白发生相互作用的物质，尤其是抑制剂等。
可用于本发明的抑制剂(或拮抗剂)包括任何可以抑制基因或其编码蛋白的表达和/或活性的物质。
例如，所述抑制剂包括抗体、核酸的反义RNA、siRNA、shRNA、miRNA、基因编辑器、或活性抑制剂。
一种优选的ZNF143的抑制剂指的是能够抑制ZNF143表达的基因编辑器。
优选的，本发明的ZNF143的抑制剂包括靶向ZNF143基因序列的抑制剂。本发明ZNF143抑制剂所作用的对象包括体细胞，尤其是ZNF143高表达的体细胞。
在一种优选的实施方式中，抑制ZNF143的方法和步骤包括利用ZNF143的抗体中和其蛋白，利用病毒(如腺相关病毒)携带的shRNA或siRNA或基因编辑器进行ZNF143基因的沉默。
抑制率一般为达到至少50％以上的抑制，优选为60％、70％、80％、90％、95％的抑制，可以基于常规技术，例如流式细胞术、荧光定量PCR或Western blot等方法对抑制率进行控制和检测。
本发明的抑制剂(包括抗体、反义核酸、基因编辑器以及其他抑制剂)，当在治疗上进行施用(给药)时，可抑制目的蛋白的表达和/或活性，进而抑制JEV病毒复制，从而预防和/或治疗肝细胞癌。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：局部、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、局部给药、自体细胞提取培养后回输等。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明抑制剂(如抗体、基因编辑器、反义序列(如siRNA)、或抑制剂)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克-10毫克/千克体重。
候选药物或治疗剂
在本发明中，还提供了一种利用本发明的动物模型，筛选治疗肝细胞癌的候选药物或治疗剂的方法。
在本发明中，候选药物或治疗剂是指已知具有某种药理学活性或正在被检测的可能具有某种药理学活性的物质，包括但不限于核酸、蛋白、糖类、化学合成的小分子或大分子化合物、细胞等。候选药物或治疗剂的给药方式可以是口服、静脉注射、腹腔注射、皮下注射、椎管给药或直接脑内注射。
本发明的主要优点包括：
1.本发明初次证实了，肝细胞癌患者的肿瘤组织中存在一条肿瘤细胞生长调节通路——ZNF143-MDIG-CDC6调节轴，即ZNF143通过与MDIG启动子结合，激活MDIG的组蛋白去甲基化酶活性，抑制CDC6启动子H3K9me3富集，CDC6转录上调。
2.本发明进一步发现，肝细胞癌中ZNF143-MDIG-CDC6调节轴上调，与肝细胞癌中肿瘤细胞增殖、细胞迁移和侵袭相关。
3.根据本发明提出的肝细胞癌的“ZNF143-MDIG-CDC6”调节轴机制，本发明提出了一种肝细胞癌治疗方案，通过抑制“ZNF143-MDIG-CDC6”调节轴可以有效抑制肝细胞癌发展和转移。
4.本发明提出了一种ZNF143抑制剂和MDIG抑制剂的用途，可用于制备肝细胞癌治疗的药物。
5.本发明提出了一种肝细胞癌的筛选方法，能简单高效地预测肝细胞癌的预后和复发几率。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
除非特别说明，否则本发明实施例中所用材料和试剂均为市售产品。
实施例1 ZNF143在肝细胞癌组织中的表达明显高于癌旁组织
1.1数据库分析ZNF143在肝细胞癌组织及癌旁组织中的表达
本实施例中肝细胞癌病人基因的mRNA及临床病理学特征等相关资料根据相关要求下载于TCGA数据库(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)、cBioPortal数据库(http://www.cbioportal.org/)及HCCDB数据库(http://lifeome.net/database/hccdb/home.html)。本实施例中部分数据直接通过cBioPortal数据库、TCGA数据库及HCCDB数据库进行结果分析并下载。
结果：TCGA数据库中ZNF143在肝细胞癌中的表达明显高于癌旁组织(图1A)。且HCCDB数据库中ZNF143的表达在部分肿瘤中如胶质瘤(GBM)、胆管癌(CHOL)、肝细胞癌(HCC)等肿瘤中的表达明显高于癌旁组织，其中肝细胞癌组织中有明显的表达升高(图1E)。
1.2通过Q-PCR及Western-Blot的方法验证肝细胞癌及癌旁组织中mRNA及蛋白的表达
本发明各实施例所涉及的肝细胞癌组织及配对的癌旁组织取自于广西肿瘤研究所(南宁，中国)，浙江大学(杭州，中国)及启东肝癌研究所(启东，中国)。所有病人前期均未经过放化疗等任何相关治疗，所有病人均知情并签署知情同意书。本研究由上海交通大学医学院附属仁济医院伦理委员会所批准。如上述途径获得人肝细胞癌组织及配对的癌旁组织的新鲜样品中提取RNA和蛋白，获得的RNA和蛋白样品储存在-80℃中待用。
1.2.1使用试剂盒PrimeScriptTM RT Reagent Kit(RR037A,TaKaRa Bio公司,日本)，将RNA样品反转录成cDNA。所用试剂盒TB GreenTM Premix Ex TaqTM II(RR820A,TaKaRa Bio公司,日本)，进行Q-PCR(即时荧光定量PCR)检测人肝细胞癌组织及配对的癌旁组织中的ZNF143的mRNA表达水平。其中，使用的实时荧光定量PCR引物序列如下所示：
基因 引物序列(5'-3') SEQ ID NO.:
ZNF143-F CGCAGTCTGACACCATCTTG 1
ZNF143-R CCAATCATTCCAGTACCTGCT 2
GAPDH-F AGAAGGCTGGGGCTCATTTG 3
GAPDH-R AGGGGCCATCCACAGTCTTC 4
结果：Q-PCR结果显示，30对肝细胞癌病人中，ZNF143在肝癌组织中的mRNA表达水平明显高于癌旁组织(图1B)。
1.2.2按照BCA法测量蛋白浓度，在蛋白上清样品中中加入DTT(dithiothreitol，Sigma-Aldrich公司)进行蛋白质变性。然后通过蛋白印迹实验Western Blot，测定人肝细胞癌组织及配对的癌旁组织中的ZNF143的蛋白相对含量。其中，使用的蛋白质免疫印迹所用抗体信息如下所示：
抗体名称 来源 货号 稀释比例 公司
ZNF143 Mouse sc-100983 1:200 Santa Cruz
HRP-β-actin Mouse A3854 1:10000 Sigma-Aldrich
HRP-anti-Mouse IgG Goat A4416 1:3000 Sigma-Aldrich
Western Blot实验结果，显示大约有41.7％的病人中，ZNF143在肝细胞癌组织的表达高于癌旁组织2倍以上(图1C，D)。
1.3 ZNF143在肝细胞癌中的表达与预后的关系
在TCGA数据库中，分析ZNF143的表达与临床预后之间的关系。
结果：在肝细胞癌中，ZNF143表达升高的肝细胞癌病人，其预后明显不良(图2A)。并且其表达水平与肝细胞癌的恶性成都呈增相关(Ⅲ+Ⅳ级的肝细胞癌明显高于Ⅰ+Ⅱ级的肝细胞癌)(图2B)。
实施例2 ZNF143稳定干扰及ZNF143过表达肝细胞癌细胞系的建立
2.1应用Real-time PCR(Q-PCR)及Western Blot实验检测了ZNF143在实验室常用肝细胞癌细胞系中的mRNA及蛋白表达水平。使用的肝细胞癌细胞系信息如下所示：
细胞系 来源
MHCC-97L 复旦大学附属中山医院肝癌研究所
MHCC-LM3 复旦大学附属中山医院肝癌研究所
MHCC-97H 复旦大学附属中山医院肝癌研究所
Huh7 日本理化学研究所细胞库
Li-7 中国医学科学院上海细胞生化研究所细胞库
Hep3B 美国类型菌种收集中心ATCC细胞库
结果：ZNF143在MHCC-97H及Hep 3B细胞系中的表达比较高，而在永生化的肝细胞Li-7，MHCC-97L等其他细胞系中的表达比较低(图3A，B)。
2.2本实验选择ZNF143表达相对比较低的MHCC-97L,MHCC-LM3,Li-7细胞通过病毒转染构建ZNF143稳定过表达的细胞株，而在ZNF143表达相对比较低的MHCC-97H以及Hep 3B细胞株中将ZNF143进行稳定干扰。
(1)ZNF143过表达质粒购自上海吉凯公司cDNA(NM_003442.6)，其病毒载体为GV492载体，其元件顺序为：Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin；其测序引物为：
引物 序列 SEQ ID NO.:
Ubi-F GGGTCAATATGTAATTTTCAGTG 5
FLAG-R-2 CCTTATAGTCCTTATCATCGTC 6
(2)ZNF143干扰质粒购自上海吉凯公司，其病毒载体为GV248载体，其原件序列为：hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin；其测序引物为：
引物 序列 SEQ ID NO.:
H1-F GGAAAGAATAGTAGACATAATAGC 7
Ubi-R ATGTCCTTCTGCTGATACTGGG 8
ZNF143干扰序列为：
名称 靶向序列 SEQ ID NO.:
shZNF143#1 CACTCTGTTGCTATGGTTA 9
shZNF143#2 ACACTCATTCCAAACCTTA 10
shZNF143#3 TACAAGAGTAACTGCTAAA 11
shNC TTCTCCGAACGTGTCACGT 12
然后用Q-PCR及Western Blot的方法，进行ZNF143mRNA及蛋白干扰以及过表达检测。
结果：与对照相比，ZNF143在MHCC-97L,MHCC-LM3,Li-7细胞中的表达水平明显升高，而在MHCC-97H及Hep 3B细胞中，ZNF143的表达明显被敲低(图4A，B)。提示ZNF143稳定干扰及过表达细胞系建系成功。
实施例3 ZNF143在肝细胞癌发生发展中所发挥的功能
3.1ZNF143对肝细胞癌细胞的体外增殖能力的影响
MTT实验方法简述如下：取对数生长的细胞用胰酶消化下来离心，一般按照不同的细胞将1000-3000个细胞接种到96孔板中。待细胞贴壁后，在第一天需要测量的孔内加入10微升MTT溶液(5mg/ml)，37℃细胞培养箱培养4个小时。吸弃上清，在每个孔中加入150微升DMSO溶解。吹打混匀后，吸出100微升，加入新的96孔板中。用酶标仪在570nm吸光度下测量吸光度。然后用同样的方法测量其他时间点的吸光度，然后做增值曲线。
平板克隆形成实验方法简述如下：取对数生长的细胞，用胰酶消化下来离心，取1000-2000个细胞接种到6孔板中，10-14天后，可看到细胞长成单克隆。将培养基弃去，加入10％中性福尔马林室温固定30min。用PBS冲洗两遍，加入吉姆萨染色4个小时。用清水缓慢冲洗干净，晾干后扫描并Image J统计克隆形成数。
结果：稳定过表达ZNF143的MHCC-97L,MHCC-LM3,Li-7细胞，其增殖能力明显增强。而敲低ZNF143后的Hep 3B以及MHCC-97H细胞的增殖能力明显减弱(图5A，B)。平板克隆形成实验结果显示，ZNF143可以促进细胞的克隆形成能力(图5C，D)。TCGA数据库分析结果显示，ZNF143与Ki67以及PCNA均呈明显的正相关(图5E)。
3.2ZNF143对肝细胞癌细胞的裸鼠皮下成瘤能力的影响
将稳定过表达ZNF143的Li-7细胞以及稳定干扰ZNF143的MHCC-97H细胞，注入裸鼠皮下，四周后，无痛苦处死小鼠，拍照，并称取瘤重来验证ZNF143对肿瘤生长的影响。
结果：ZNF143过表达的Li-7细胞株可以明显促进肝细胞癌细胞的肿瘤生长，而ZNF143敲低的MHCC-97H，其肿瘤生长能力明显减弱(图6A，B)，同时，肿瘤组织中，ZNF143的蛋白水平依旧维持着干扰以及过表达的状态(图6D，E)。此外，通过Ki67免疫组化染色，显示ZNF143过表达后，其Ki67的表达水平明显增高，干扰ZNF143后，Ki67的表达水平明显降低(图6C)。
实施例4 ZNF143促进肝细胞癌细胞生长的机制
4.1 ZNF143促进肝细胞癌细胞G1/S期转换
选择ZNF143稳定干扰及过表达的细胞系MHCC-97H及MHCC-LM3后进行细胞周期分析。
细胞周期的检测方法简述如下：将稳定感染的细胞胰酶消化细胞计数后接种到6孔板内，每孔1×106个细胞(依次接种未处理组，0时及24时的细胞)。第二天当细胞贴壁后，将处理组更换为含有2mM Thymidine的完全培养基，使细胞同步化在G1/S期。24小时后将培养基更换为不含药物的完全培养基(此时记为0时)，胰酶消化，收取未处理组及0时的细胞。收取细胞样品用70％的乙醇轻轻吹匀固定，-20℃保存。用同样的方法收取24小时的细胞。然后对70％乙醇固定的细胞进行PI染色：弃PBS上清,加入PI染色液(含50μg/mL PI，100μg/mL RNase，0.2％Triton X-100的PBS)，4℃避光孵育30分钟，然后每个样品进行流式分析细胞周期检测。最后用Modfit 3.2软件进行细胞周期细胞数分析。
结果：与空载Vector相比，ZNF143稳定过表达的MHCC-LM3细胞，其G1期的细胞比例明显降低，而S期细胞数明显增加(图7A)。而干扰ZNF143后，MHCC-97H细胞的G1期细胞比例明显升高，而S期细胞数目明显减少(图7C)。然后噻嘧啶(Thymidine)处理细胞，将肿瘤细胞同步化到G1/S期，弃去含噻嘧啶的培养基，24小时以后，ZNF143过表达的MHCC-LM3细胞S期比例升高，G1期细胞比例减少(图7B)。与对照相比，ZNF143干扰的MHCC-97H细胞G1期细胞比例增加，而S期细胞比例减少(图7D)。
4.2 ZNF143促进CDC6的表达升高
通过Q-PCR检测了ZNF143干扰以及过表达后一些与G1/S期转换相关的基因CCNA2、DHFR、MCM3、TK1及CDC6的mRNA水平的表达。使用的引物序列如下所示：
基因名称 引物序列 SEQ ID NO.:
CDC6-F TGCAGTTCAATTCTGTGCC 13
CDC6-R AATAGCTCTCCTGCAAACATCC 14
CCNA2-F TTATTGCTGGAGCTGCCTTT 15
CCNA2-R CTCTGGTGGGTTGAGGAGAG 16
DHFR-F CACAAGGAGCTCATTTTCTTTCC 17
DHFR-R AGTTTAAGATGGCCTGGGTGA 18
MCM3-F AGTTCGTCCCAAAGTCGTCC 19
MCM-R CCTGGATGGTGATGGTCTGG 20
TK1-F TGCTCAGTACAAGTGCCTGG 21
TK1-R TCGTCGATGCCTATGACAGC 22
GAPDH-F AGAAGGCTGGGGCTCATTTG 23
GAPDH-R AGGGGCCATCCACAGTCTTC 24
然后通过Western-Blot实验验证CDC6在蛋白水平的变化情况。
结果：Q-PCR结果显示ZNF143可以激活G1/S期转换基因CDC6，CCNA2等的表达，其中，以CDC6的变化最为明显(图8A)。Western-Blot结果证实，ZNF143过表达可以激活CDC6的表达，而敲低ZNF143后，CDC6的表达明显降低(图8B)。
4.3ZNF143降低CDC6启动子区H3K9me3的富集
通过染色质免疫沉淀ChIP联合Q-PCR实验，检测在ZNF143过表达后具有转录激活的组蛋白H3K4me3及具有转录抑制作用的组蛋白H3K9me3及H3K27me3在CDC6启动子区的富集情况。
实验方法简述如下：使用Mill ipore试剂盒(17-10086，磁珠染色质免疫沉淀试剂盒)进行染色质免疫沉淀，然后获得的纯化DNA进行QPCR分析。其中，使用的6对引物的位置如图9A所示，其序列信息如下：
基因名称 引物序列 SEQ ID NO.:
CDC6-promoter+0.2kb-F CAGTTATGCGTGGTGTGAAGG 25
CDC6-promoter+0.2kb-R AGCACCCGCCACATTTAGTC 26
CDC6-promoter-0.2kb-F CCCGCTTTACCCAGAGTCG 27
CDC6-promoter-0.2kb-R ACAGAGCCTTTCGCCTTGG 28
CDC6-promoter-0.6kb-F CTGTTTCTCACCTTTGAAGCAC 29
CDC6-promoter-0.6kb-R GTTAGAGGTCACAGCATCTTGG 30
CDC6-promoter-1.1kb-F GTGACCTTGGGCAAGTTTACTC 31
CDC6-promoter-1.1kb-R GGGCTGTGCTCAGTATTTTACC 32
CDC6-promoter-1.4kb-F ATGGCACGGCACTCAAGC 33
CDC6-promoter-1.4kb-R GGTGGAGTACATTTCGTGAAGG 34
CDC6-promoter-1.8kb-F TGGCTGGGCACACATTACC 35
CDC6-promoter-1.8kb-R GCATGAACCACCGCTCTTG 36
结果：ChIP-QPCR结果证明，H3K4me3、H3K9me3、H3K27me3在ZNF143过表达后在肝细胞癌细胞系Li-7及MHCC-LM3细胞中都存在一定的改变，其中以组蛋白H3K9me3的富集的降低最为明显(图9B-D)。在稳定敲减ZNF143后的MHCC-97H及Hep3B细胞中，ChIP-QPCR结果显示，ZNF143干扰后可以增加H3K9me3在CDC6启动子区的富集情况(图9E)。
4.4 ZNF143通过激活MDIG的表达改变了CDC6启动子区的富集
H3K9me3特异性的组蛋白去甲基化酶主要涉及KDM4A、KDM4B、KDM4C、KDM4D及MDIG分子。通过Q-PCR检测ZNF143过表达和后这些分子的mRNA水平的变化。并通过Western-Blot实验验证MDIG在蛋白水平的变化。其中，使用的引物的序列信息如下：
Figure BDA0002456416540000161
Figure BDA0002456416540000171
结果：ZNF143过表达后可以激活MDIG的表达(图10A)。Western Blot结果显示,ZNF143过表达可以提高MDIG的蛋白水平，ZNF143敲低后可以抑制MDIG的变化(图10B)。
4.5 ZNF143可以直接转录激活MDIG的表达
通过JASPAR软件对ZNF143所能靶向的模体在MDIG启动子区域进行分析(图11A)。结果如图11B所示，发现两个ZNF143可能的结合位点①和②。
进一步通过双荧光素酶实验，验证结合位点①和②的功能。双荧光素酶实验的原理是利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特性，把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因的上游，构建成荧光素酶报告质粒。然后转染细胞，适当刺激后裂解细胞，测定荧光素酶活性；同时为了减少内在的变化因素对实验精确性的影响，将带有海参荧光素酶基因的质粒作为对照质粒与报告基因治理共转染细胞，提供转录活力的内对照。
针对这两个结合位点，分别构建野生型及突变型质粒载体。双荧光素酶所用质粒是：pGL3-enHancer载体质粒和pRL-TK质粒(美国Promega生物公司)。根据UCSC网站(http://genome.ucsc.edu/)预测MDIG基因的promoter区域，设计引物。其中，MDIG启动子区域通过如下所示的引物克隆获得。
Figure BDA0002456416540000172
然后将将纯化的MDIG启动子DNA及pGL3-enHancer载体连接得到pGL3-enHancer载体质粒。将pGL3-enHancer载体质粒和pRL-TK质粒瞬时转染进入细胞，再测定启动子区活性计算为：萤火虫荧光值比海肾荧光值。
再通过染色质免疫沉淀ChIP实验(Millipore试剂盒，型号17-10086)验证结果。其中，用到的引物序列如下所示：
基因名称 引物序列 SEQ ID NO.:
MDIG promoter-F GAACACCGCCGGGTAGCC 51
MDIG promoter-R GAGAGCGCCCCACTCACC 52
结果：ZNF143可以促进MDIG启动子区域的转录活性，突变位点①，其活性消失，说明ZNF143可以激活MDIG启动子区域位点①的转录活性(图11C)。ChIP实验结果证实，ZNF143可以直接结合到MDIG启动子区域位置①，并发挥转录激活的作用(图11D)。
实施例5干扰MDIG的表达抑制ZNF143过表达的肿瘤生长
如实施例2所用的方法，在ZNF143稳定过表达的Li-7细胞中干扰MDIG的表达，获得的转基因Li-7细胞。其中MDIG干扰序列为：
名称 靶向序列 SEQ ID NO.:
shMDIG#2 GGCUCGAAUGUGUACAUAATT 53
shMDIG#3 GGUGGAAUCCACAACUGUUTT 54
shNC UUCUCCGAACGUGUCACGUTT 55
使用上述方法获得的转基因Li-7细胞，注入裸鼠皮下，四周后，无痛苦处死小鼠，拍照，并称取瘤重来验证ZNF143对肿瘤生长的影响。
结果：通过裸鼠皮下成瘤实验结果证实，ZNF143过表达所引起的肿瘤生长能力被抑制(图12)。
实施例6 MDIG及CDC6在肝癌组织中高表达
如实施例1所述方法，通过TCGA数据库分析及Q-PCR方法，检测人肝细胞癌及癌旁组织样品中MDIG及CDC6的表达。
结果：无论是在TCGA数据库还是在人肝细胞癌组织标本中，MDIG及CDC6的表达均高于癌旁组织(图13A，B)。另外，意外地发明人发现，通过噻嘧啶将肝细胞癌细胞阻滞在G1/S期并释放后，ZNF143、MDIG的蛋白水平变化一致(图13E)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海市肿瘤研究所
<120> ZNF143-MDIG-CDC6轴在肝细胞癌中的应用
<130> P2020-0197
<160> 55
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgcagtctga caccatcttg 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccaatcattc cagtacctgc t 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
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aggggccatc cacagtcttc 20
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ggaaagaata gtagacataa tagc 24
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cagtccctac tcgtgatgct c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccgatgactc ttgtgaagca gc 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
gacttcgtct gccaaaggtg ga 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
cctgaacgct atgacctgtg ga 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
tctcctgggt aactggactt cc 22
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
cgacgcgtct gggcgagagt gagacct 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
ggaagatctc cacgtgtgcg actctctg 28
<210> 49
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
gcacggcccg gagcgtgttt gcgcggaccc gcctccagcc gctgcg 46
<210> 50
<211> 97
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
ggaagatctc cacgtgtgcg actctctgta accaaggctt ccgcgaccct acccctagat 60
ccgggcccca tttgcccgga cccagtctcc ggggagg 97
<210> 51
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
gaacaccgcc gggtagcc 18
<210> 52
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
gagagcgccc cactcacc 18
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
ggcucgaaug uguacauaat t 21
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
gguggaaucc acaacuguut t 21
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
uucuccgaac gugucacgut t 21

Claims (25)

1.一种活性成分在制备用于治疗肝癌的药物组合物或药盒中的用途，其特征在于，所述活性成分包括第一活性成分锌指蛋白ZNF143抑制剂，其中，所述的ZNF143抑制剂为shRNA。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物组合物或药盒还用于抑制细胞分裂周期蛋白CDC6。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的活性成分还包括：第二活性成分细胞分裂周期蛋白CDC6抑制剂，和/或第三活性成分矿物粉尘诱导基因MDIG抑制剂，
其中，所述的CDC6抑制剂选自：BCR/ABL激酶抑制剂STI571、磷酸肌醇3-激酶/AKT途径抑制剂LY294002、Janus激酶/信号转导子和激活剂的转录途径抑制剂AG490、AR信号抑制剂enzalutamide和Chk1/2抑制剂AZD7762，或其组合；
所述的MDIG抑制剂选自：JNK抑制剂SP600125、STAT3抑制剂V、Akt抑制剂Wortmannin、jumonji组蛋白脱甲基酶抑制剂JIB-04、C-myc抑制剂佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯，或其组合。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物组合物或药盒还包括选自下组的组分：靶向CDC6蛋白和/或MDIG蛋白的抗体或小分子抑制剂、靶向CDC6基因和/或MDIG基因的靶向核酸分子或基因编辑器、或其组合。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的ZNF143抑制剂选自下组：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11。
6.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述基因编辑器包括gRNA和基因编辑蛋白。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的gRNA是引导基因编辑蛋白特异性结合CDC6蛋白对应基因的RNA。
8.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的基因编辑蛋白选自下组：CasRx、Cpf1、Cas9、Cas13a、Cas13b、Cas13c、或其组合。
9.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物或药盒用于治疗哺乳动物或施用于哺乳动物。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的哺乳动物为啮齿类动物或人。
11.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肝癌包括临床上确诊的肝癌。
12.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肝癌为ZNF143表达异常的肝癌，其中ZNF143表达异常包括ZNF143基因突变、ZNF143基因扩增、或其组合。
13.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肝癌是原发性肝癌。
14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述的原发性肝癌选自下组：肝细胞肝癌、肝内胆管癌、肝细胞-胆管细胞混合性癌、或其组合。
15.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物包括ZNF143抑制剂、CDC6抑制剂和MDIG抑制剂，以及药学上可接受的载体。
16.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物还包括额外的治疗药物，所述的额外的治疗药物为抗肿瘤剂。
17.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物还包括化疗剂、检测点抑制剂、CAR-T细胞、或其组合。
18.如权利要求17所述的用途，其特征在于，所述的化疗剂包括顺铂、紫杉醇。
19.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药盒包括：
(a)第一制剂，所述第一制剂含有ZNF143抑制剂以及药学上可接受的载体，所述的ZNF143抑制剂为shRNA；和
(b)第二制剂，所述第二制剂含有CDC6抑制剂和/或MDIG抑制剂以及药学上可接受的载体；和
(c)说明书，所述说明书描述了将第一制剂和第二制剂联用以治疗肿瘤的方法，所述肿瘤为肝癌。
20.如权利要求19所述的用途，其特征在于，所述的第一制剂、第二制剂是各自独立的。
21.如权利要求19所述的用途，其特征在于，所述的第一制剂、第二制剂为冻干制剂或液态制剂。
22.一种体外非治疗性的抑制肿瘤细胞生长的方法，其特征在于，包括步骤：向肿瘤细胞培养体系中加入ZNF143抑制剂，从而抑制肿瘤细胞生长；其中，所述ZNF143抑制剂为shRNA，并且所述的肿瘤细胞为肝癌细胞。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：将肿瘤细胞与ZNF143抑制剂、CDC6抑制剂和MDIG抑制剂一起混合培养。
24.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤细胞的数量为103-108个/ml。
25.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述的肝癌细胞选自：MHCC-97L、MHCC-LM3、Li-7、Hep 3B、MHCC-97H、或其组合。
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CN101033489A (zh) * 2007-02-01 2007-09-12 中山大学 一种与原发性肝癌相关的cdc6基因的单核苷酸多态位点及其应用

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