CN115287353B - 一种肝癌血浆游离dna来源的甲基化标志物及用途 - Google Patents

一种肝癌血浆游离dna来源的甲基化标志物及用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种肝癌血浆游离DNA来源的甲基化标志物及用途，属于分子生物医学技术领域。本研究通过肝癌血浆cfDNA来研究肝癌和健康人的甲基化差异，并筛选出具有明显差异的甲基化区域，然后通过随机森林的方法，首次筛选出10个最佳的差异性甲基化区域(Differentially Methylated Region，DMR)建立肝癌甲基化风险预测模型，适用于预测早期肝癌发生的风险评估，适用于肝癌的筛查与诊断，用于筛查肝癌人群。

Description

一种肝癌血浆游离DNA来源的甲基化标志物及用途
技术领域
本发明涉及一种肝癌血浆游离DNA来源的甲基化标志物及用途，属于分子生物医学技术领域。
背景技术
肝癌是全球范围内高发的恶性肿瘤之一，位居我国肿瘤死亡第三位。原发性肝癌主要包括肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）、肝内胆管癌（IntrahepaticCholangiocarcinoma，ICC）和 HCC-ICC 混合型三种不同病理类型，其中HCC占85%-90%以上。和其他恶性肿瘤类似，肝癌的五年生存率与分期密切相关，早期局限性HCC可以通过手术切除、局部消融治疗或肝脏移植而治愈。因此，早期诊断是预防肝癌、提高肝癌患者生存率最重要的措施之一，开发应用简单、方便、快捷的肝癌诊断方法是目前研究的努力方向。
目前，肝脏超声检查（ultrasound，US）和甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）检测是国内外沿用多年的肝癌早期筛查方法。然而这两种传统筛查方法在特异性和敏感性上多有不足，无法满足目前精准诊断的临床需求。迄今为止，肝癌的早期筛查仍缺乏有效策略，国际上尚无明确可用肝癌早期预警标志物，因此对于鉴定肝癌早期诊断的生物标志物并开发相应的试剂盒，仍存在迫切需求。
最有希望突破肿瘤早诊难题的是肿瘤基因组学领域。即在肿瘤早期（I期II期）时应用肿瘤分子标记来检测肿瘤细胞基因组的突变、缺失、重排、甲基化、扩增和插入等特征，从而对肿瘤早期诊断、预后和治疗方法的选择提供指示。液体活检目前是最具潜力的肿瘤无创诊断和实时疗效监测手段，此外血液采集易于在人群筛查中普及，且不存在放射性等不良风险。
肿瘤在生长更新过程中，会不断地向血液中释放循环肿瘤细胞(circulatingtumor cells, CTCs)、循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)以及肿瘤外泌体（exosome）。其中ctDNA是存在于循环系统中、游离于细胞外、由肿瘤细胞释放的小片段DNA，主要来源于肿瘤细胞的分泌、坏死或凋亡，携带有肿瘤特异性突变信息。正常人血液中也会携带微量的循环游离（circulatingfree DNA, cfDNA）,不过缺少肿瘤相关的突变信息。因此基于血浆cfDNA检测能够区分出肿瘤人群和健康人群差异。由于肿瘤具有高度异质性，参与肿瘤发生的基因范围极广，导致同一肿瘤的不同患者之间也具有高度的个体差异性，使得在ctDNA中检测突变和结果分析异常复杂。
DNA甲基化与癌症的发生发展密切相关，尤其是CpG岛区的启动子超甲基化可能会导致抑癌基因沉默，进而影响肿瘤进程。由于DNA甲基化几乎在所有癌症中均有发现，且发生在癌前或者癌症早期阶段，因此，需要针对血浆游离DNA开发出能够对肝癌诊断的标志物。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是：针对现有技术中肝癌早筛缺少基于cfDNA来源的标志物的问题，提供了一种对血浆样本cfDNA进行WGBS测序，通过对高通量测序结果进行肝癌和健康人差异甲基化区域分析、构建模型，实现了对肝癌无创精准诊断的目的。
用于检测肝癌血浆游离DNA来源的甲基化标志物的试剂在用于制备对肝癌诊断试剂中的应用，所述的甲基化标志物包括10个甲基化区域，所述的甲基化区域在基因组上的位置如下所示：chr2:19555310-19555961，chr2:60441022-60441486，chr3:135853921-135854040，chr6:2783521-2783640，chr7:26853292-26853686，chr8:97773361-97773480，chr11:14786881-14787000，chr12:7061161-7061280，chr12:53592601-53592720，chr18:74101801-74101920。
所述的应用还包括如下步骤：S1：获取血浆样本，提取游离DNA，并构建甲基化测序文库，进行测序；S2：测序数据对比至参考基因组，获得标志物的测序数据结果；S3：获取每个标志物的区域上发生了甲基化的CpG位点的甲基化率数值；S4：将各个标志物的区域的甲基化率数值作为自变量，是否发生肝癌作为因变量，构建分类器，进行模型的训练后，得到分类模型；再根据分类模型对待测样本进行是否发生肝癌进行预测。
步骤S3中，甲基化率是通过在标志物的区域中发生了甲基化的CpG位点上的发生甲基化的reads数除以所述的CpG位点的总reads数计算得到。
所述的分类模型是以发生肝癌的概率作为输出值。
用于检测肝癌血浆游离DNA来源的甲基化标志物的试剂中还包括血浆游离DNA提取试剂盒。
所述的血浆游离DNA提取试剂盒中包括：裂解结合液、蛋白酶K、磁珠、第一洗涤液和第二洗涤液。
裂解结合液的组成包括： 1-5mol/L的Tris-HCl；100-500mmol/L的NaCl；100-500mmol/L的EDTA； 3-5mol/L的异硫氰酸胍；15％-20％的异丙醇；1%-5％的TritonX-100。
第一洗涤液组成包括：1-5mol/L的Tris-HCl；100-500mmol/L的NaCl；100-500mmol/L的EDTA； 3-5mol/L的异硫氰酸胍；50％-60％的乙醇；1%-5％的TritonX-100。
第二洗涤液组成包括：1-5mol/L的Tris-HCl；70-80%的乙醇。
所述的参考基因组是hg19版。
一种用于对肝癌甲基化诊断标志物进行筛选的系统，包括：
提取模块：获取肝癌和健康人血浆样本，采用上述提取cfDNA提取试剂盒进行cfDNA提取；
甲基化文库构建模块，用于对获得的肠癌组织样本进行亚硫酸盐处理并进行测序文库的构建；
测序模块，用于对甲基化文库进行全基因组甲基化高通量测序；
对比模块，用于将测序数据比对到参考基因组并获得每个甲基化区域中的发生了甲基化的CpG位点，并获得在所述的CpG位点上的有甲基化的reads数和未甲基化的reads数；
甲基化率数值计算模块，用于计算每个甲基化区域上的甲基化率；
第一筛选模块，用于挑选出健康人和肝癌患者中具有显著性差异的甲基化区域，作为第一筛选标志物结果；
第二筛选模块，用于对第一筛选标志物结果进行重要性排序，获得重要性靠前的甲基化区域，作为第二筛选标志物结果；
第三筛选模块，用于对第二筛选标志物按照对是否能够区分健康人和肝癌患者分类能力进行排序，获得预测性好的区域，作为用于对肝癌的诊断标志物。
所述的每个甲基化区域上的甲基化率是根据在这个区域上的全部的发生了甲基化的CpG位点上的有甲基化的reads数除以甲基化与未甲基化的总reads数计算得到。
第二筛选模块可以运行随机森林分类器。
第三筛选模块可以运行XGBoost (eXtreme Gradient Boosting)算法分类器。
一种计算机可读取介质，其记载有可以运行对肝癌进行诊断的计算机程序；所述的计算机程序包括执行以下步骤：
获得血浆样品进行提取后获得血浆cfDNA；
对血浆cfDNA进行甲基化建库和测序后得到的测序数据；
将测序数据比对到参考基因组并获得每个甲基化区域中的发生了甲基化的CpG位点，并获得在所述的CpG位点上的有甲基化的reads数和未甲基化的reads数；
计算每个甲基化区域上的甲基化率；
挑选出健康人和肝癌患者中具有显著性差异的甲基化区域，作为第一筛选标志物结果；
对第一筛选标志物结果进行重要性排序，获得重要性靠前的甲基化区域，作为第二筛选标志物结果；
对第二筛选标志物按照对是否是否能够区分健康人和肝癌患者的分类能力进行排序，获得预测性好的区域，作为用于对肝癌的诊断标志物。
有益效果：本发明首次提供了一种用于肝癌筛查的肝癌甲基化标志物诊断模型，该模型能够诊断出早期肝癌，具有通量高、检测特异性和敏感性高的优点。
附图说明
图1示出了本专利的流程图；
图2示出了血浆游离DNA样本提取流程图；
图3A示出了本专利提取方法提取的血浆游离DNA甲基化测序碱基质量图，图3B示出了本专利提取方法提取的血浆游离DNA甲基化测序碱基分布图；
图4示出了肝细胞癌和正常血浆游离DNA的差异甲基化区域的无监督层级聚类图；
图5示最佳建模DMR组合筛选；
图6示出了最佳10个甲基化标志物在肝细胞癌血浆和正常血浆样本中的箱型图。
图7A示出了10个甲基化标志物在训练集的受试者工作特征曲线（ROC）和相关曲线下面积（AUC）；图7B示出了10个甲基化标志物在验证集的受试者工作特征曲线（ROC）和相关曲线下面积（AUC）。
具体实施方式
下面结合具体实施例来对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明提供的从血浆中获得游离DNA的方法，可以较好地从血浆中获得适合于甲基化文库构建的DNA，这种提取方法主要是通过裂解消化、磁珠结合的方法获得了血浆中的游离DNA。
血浆样本来源于肝细胞癌患者和健康人。
表1 数据集样本类型及数量
从样本中对DNA进行提取，从样本中提取血浆游离DNA。血浆样本提取试剂盒以及提取步骤如下：
1）将样本置于离心机中离心获得含有游离DNA的血浆。
2）利用裂解结合液、蛋白酶K和磁珠对已离心的血浆样本进行裂解结合处理，获得裂解释放的DNA，以便磁珠与DNA结合，得到磁珠-DNA结合产物。裂解结合液的组成包括： 1-5mol/L的Tris-HCl；100-500mmol/L的NaCl；100-500mmol/L的EDTA； 3-5mol/L的异硫氰酸胍；15％-20％的异丙醇；1%-5％的TritonX-100。其中蛋白酶K使用量为100-200mg。优选地，裂解液组成：2.5mol/L的Tris-HCl；300mmol/L的NaCl；250mmol/L的EDTA； 4mol/L的异硫氰酸胍；16％的异丙醇；2.5％的TritonX-100，以及蛋白酶K 150mg。
3）使用洗涤液1、洗涤液2及无水乙醇分别对磁珠DNA结合产物进行清洗，以便回收纯化DNA。其中洗涤液1的组成：1-5mol/L的Tris-HCl；100-500mmol/L的NaCl；100-500mmol/L的EDTA； 3-5mol/L的异硫氰酸胍；50％-60％的乙醇；1%-5％的TritonX-100。根据本发明的具体示例，该结合液优选：2.5mol/L的Tris-HCl；300mmol/L的NaCl；250mmol/L的EDTA；3mol/L的异硫氰酸胍；50％的乙醇；2.5％的TritonX-100。其中洗涤液2的组成：1-5mol/L的Tris-HCl；70-80%的乙醇。根据本发明的具体示例，该结合液优选：2.5mol/L的Tris-HCl；80%乙醇。
4）使用无核酸酶水从磁珠上将DNA进行洗脱，以便得到纯化的DNA。
操作步骤如下：
1）肝细胞癌患者血浆和健康人血浆进行离心处理。4℃离心10min，获得上清。
2）取2mL已处理血浆样本，体积不足可以使用PBS补齐，中其中向加入2mL裂解结合液、200μL蛋白酶K和2.5mg磁珠，涡旋振荡30s，室温孵育10min。
3）置于磁力架上静置3min，静置1.5min时上下颠倒一次样本管，去除上清。
4）从磁力架上取下，加入3mL洗涤缓冲液1，涡旋混匀10s，室温孵育2min。
5）置于磁力架上静置3min，静置1.5min时上下颠倒一次样本管，去除上清。
6））从磁力架上取下，加入3mL洗涤缓冲液2，涡旋混匀10s，室温孵育2min。
7）置于磁力架上静置3min，静置1.5min时上下颠倒一次样本管，去除上清。
8）从磁力架上取下，加入3mL 100%乙醇，涡旋混匀10s，室温孵育2min。
9）置于磁力架上静置3min，静置1.5min时上下颠倒一次样本管，去除2mL上清。
10）余1mL上清液用1mL移液枪混匀后转移至新的1.5ml 离心管中，置于磁力架上静置2min，静置1min时上下颠倒一次样本管，静置后吸弃上清液（注意：将液体全部吸出，避免残留）。
11）室温开盖干燥45-55min（注意观察磁珠干燥状态，干燥时间根据实际情况调整）。
12）待磁珠干燥后将样本管从磁力架上取下，沿着管壁向磁珠上方加入30μL无核酸酶水，涡旋混匀，使磁珠从管壁上分离，完全混匀于无酶水中，室温孵育5min。
13）将样本管置于磁力架上静置2min，静置完成后，小心转移上清液至新的1.5mL离心管中。
实施例2
用实施例1中所述提取方法获得的游离DNA后，进行亚硫酸氢盐转化与回收，将提取的基因组DNA样本中添加内部对照，然后使用EZ DNA Methylation-Gold Kit（Zymoresearch公司）试剂盒将含有内部对照的DNA样本进行转化，具体提取步骤参见试剂盒操作说明书。
以转化后的游离DNA为模板进行文库构建，文库构建是为测序片段添加接头的过程。扩增后的DNA片段两端需要加上接头才能进行上机测序。文库构建使用Accel-NGSMethyl-Seq DNA Library Kit（Swift Biosciences公司）试剂盒进行建库，具体提取步骤参见试剂盒操作说明书。
针对上述得到的血浆游离DNA文库，采用Illumina公司Hiseq Xten测序仪进行全基因组甲基化测序（Whole Genome Bisulfite Sequencing，WGBS），测序完成下机后，使用bcl2fastq生成fastq文件。用FastQC软件对数据进行质量控制，Trimmomatic软件去除接头和低质量序列，得到的cleanData使用bismark进行基因组（hg19）的比对。比对后得到发生了甲基化的CpG位点，再根据获得的位点确定出在每个CpG位点甲基化的reads数和在这个位点区域上未甲基化的reads数。然后使用甲基化软件Methylkit和DSS鉴定差异甲基化区域（differential methylation regions，DMRs）。在一个DMR区域内含有一个或多个CpG位点，并将在这个DMR区域内所有CpG位点甲基化reads数之和除以在这个DMR区间内所有CpG位点甲基化与未甲基化总reads数之和，得到DMR的甲基化率。通过以上的测序和数据处理步骤，可以获得每个cfDNA样本中的每个DMR区域的甲基化率。
从健康人和肝癌患者中分别选取40例和30例作为训练集，剩余16例和10例作为验证集，将训练集样本通过对比健康人和肝癌患者的甲基化值，比较肝细胞癌血浆和健康人血浆样本，筛选出两个软件均有显著性差异的交集DMRs共204个（图 4）。对比健康人与肝癌可以看到显著差异，且早期肝癌中也观察到明显信号，表明肝癌的甲基化信号在早期中已出现。
实施例3：
采用机器学习方法（随机森林和LASSO）创建分类器，对上述筛选得到的204个DMR的预测能力（判断发生肝癌）进行排序，对训练集执行了5次重复随机计算。根据袋外误差逐步消除DMR，然后按5次重复计算重要性总名次从前到后对候选DMR进行排名（图5）。最终筛选出模型预测准确性最高的，用于肝细胞癌诊断的10个最优DMRs（图6）。10个最优DMRs的基因组位置及碱基序列分别如表2所示。采用上述10个DMRs作为诊断肝细胞癌cfDNA的甲基化标记物，用xgboost方法建立诊断回归模型，对验证集和训练集肝细胞癌血浆和健康人血浆样本进行诊断评分，如图7A和图7B所示，AUC结果显示能够稳定达到100%准确（AUC=1）的区分癌症与健康人。
表2 基因组位置及碱基序列
以上实施方式仅为对本专利的解释和说明，并不构成对本专利的保护范围的限制。
序列表
<110> 南京世和医疗器械有限公司
<120> 一种肝癌血浆游离DNA来源的甲基化标志物及用途
<150> 2022100764490
<151> 2022-01-24
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acagaagagg aggcgtcctc cccaccaata tgtctggtat ccctgggact ggttgggaag 60
ccacagggga aggaaatggt tagagcggct tctcagctgg ccctaggtgt caggagact 119
<210> 10
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgggtgagtc tggagaaaag gctgtttcct aagagtctcg ttgctagtcc tgctcggtca 60
catgacctca cctgtggtcc cgagcgatag tgggcagcac gcagttttat tacatgagg 119

Claims (5)

1.用于检测血浆游离DNA来源的甲基化标志物的试剂在制备肝细胞癌诊断试剂中的应用，其特征在于，所述的甲基化标志物是由10个甲基化区域所组成，所述的甲基化区域在参考基因组上的位置如下所示：chr2:19555310-19555961，chr2:60441022-60441486，chr3:135853921-135854040，chr6:2783521-2783640，chr7:26853292-26853686，chr8:97773361-97773480，chr11:14786881-14787000，chr12:7061161-7061280，chr12:53592601-53592720，chr18:74101801-74101920；
所述的参考基因组是hg19版。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用还包括如下步骤：S1：获取血浆样本，提取游离DNA，并构建甲基化测序文库，进行测序；S2：测序数据对比至参考基因组，获得标志物的测序数据结果；S3：获取每个标志物的区域上发生了甲基化的CpG位点的甲基化率数值；S4：将各个标志物的区域的甲基化率数值作为自变量，是否发生肝细胞癌作为因变量，构建分类器，进行模型的训练后，得到分类模型；再根据分类模型对待测样本进行是否发生肝细胞癌进行预测。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤S3中，甲基化率是通过在标志物的区域中发生了甲基化的CpG位点上的发生甲基化的reads数除以所述的CpG位点的总reads数计算得到。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的分类模型是以发生肝细胞癌的概率作为输出值。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，用于检测肝细胞癌血浆游离DNA来源的甲基化标志物的试剂中还包括血浆游离DNA提取试剂盒。
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