CN108949980A - 一种检测肝细胞癌的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测肝细胞癌的试剂盒，属于医学检验技术领域。本发明检测肝细胞癌的试剂盒包含用于检测基因组中5个甲基化特异性位点的序列如SEQ ID NO.1‑10所示5对引物。提取待检测者血液的基因组DNA，使用重亚硫酸盐处理后这5对引物分别进行PCR扩增，扩增产物连接到克隆载体中克隆并测序，根据测序结果分析甲基化位点的个数；再提取待检测者血液的ctDNA检测其长度。若甲基化位点的个数为3个以上，则可判断待检测者患HCC；若甲基化位点的个数为1个或2个，且ctDNA长度小于245bp，则可判断待检测者患HCC。本发明用血量少、操作简便、成本低，准确率高，可用于HCC的早期诊断，适用于普查应用。

Description

一种检测肝细胞癌的试剂盒
技术领域
本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种检测肝细胞癌的试剂盒。
背景技术
随着医学技术的发展，癌症的检测技术已经越来越成熟，但是，对于癌症早期的检测方法的报道却寥寥无几。目前，肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)是一种成人最常见的原发性肝癌，也是造成全球癌症死亡的主要原因之一，但是HCC比较隐匿，目前HCC的检测方法主要依靠影像学和非特异性肿瘤标志物甲胎蛋白(AFP)的血液检测，而AFP通常只有在疾病发生到中晚期的时候才会升高。而且血液检测法(AFP法)灵敏度很低，使其临床应用很受限。患者确诊的时候往往已经到了中晚期，这个时候进行治疗效果不会很理想。因此一直以来，人们都希望能在早期发现HCC。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有HCC的早期检测技术不足，提供一种检测肝细胞癌的试剂盒。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种检测肝细胞癌的试剂盒，包含下述5对引物：
BMPR1A正向引物：5'-ATGGCATTCCTTCACTCG-3'，
BMPR1A反向引物：5'-CTCCTCCCTTCTCCTTCG-3'；
PSD正向引物：5'-AGCGATTCAAAGATGTGCG-3'，
PSD反向引物：5'-CCTAAGCAGGCTGAGGAAGA-3'；
PLAC8正向引物：5'-CTGTCCTCACTCATTCCCTG-3'，
PLAC8反向引物：5'-CTGCCAAACTTTCTCACCTT-3'；
ATAD2正向引物：5'-CGGCGACCCAACATAAAC-3'，
ATAD2反向引物：5'-GCTGCGGAGAACCACCAT-3'；
KLF3正向引物：5'-CTCACGAATACAAGATGGCTAC-3'，
KLF3反向引物：5'-AGCAATGTCAGGGCTCCA-3'。
这5对引物用于检测基因组中5个甲基化特异性位点。
进一步的，所述的试剂盒还包含提取基因组DNA的试剂、重亚硫酸盐、PCR试剂和提取ctDNA的试剂中一种、两种或多种的组合。本发明试剂盒基于的方法如下：提取待检测者血液的基因组DNA，使用重亚硫酸盐处理后再纯化，以纯化后的DNA为模板，使用上述5对引物分别进行PCR扩增，扩增产物电泳后回收纯化，连接到克隆载体中克隆并测序，根据测序结果分析甲基化位点的个数。再提取待检测者血液的ctDNA，通过电泳检测ctDNA的长度。若甲基化位点的个数为3个以上，则可判断待检测者患HCC；若甲基化位点的个数为1个或2个，且ctDNA长度小于245bp，则可判断待检测者患HCC。所述的试剂盒还可以包含完成上述方法的任意试剂。
本发明具有如下优点和有益效果：本发明相对于传统的甲胎蛋白检测法用血量少、操作简便、成本较低，且准确率高，可用于HCC的早期诊断，适用于普查应用。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
一、ctDNA的提取
将血液样品收集在StreckBCT管中，在4℃下储存，并在收集24小时内提取ctDNA。使用QIAamp公司的Circulating Nucleic Acid试剂盒，按照说明书中的操作步骤提取血浆中的ctDNA。
二、ctDNA长度的检测
将所提取的ctDNA使用琼脂糖凝胶电泳检查其长度，具体步骤为：
1)1g琼脂糖加入100mL 1×TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。冷却到60℃，加入100μL的0.5mg/mL EB，并摇匀。
2)用胶带将制胶板两端封好，插入梳子，将溶解的琼脂糖倒入，室温冷却凝固。
3)充分凝固后撕掉两端的胶带，将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。
4)用移液器吸取待检测得ctDNA 5μL于封口膜上，再加入1μL的6×载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。
5)打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约20min-40min。
6)将凝胶放入EB染液中染色5-10min，用清水稍微漂洗。
7)将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，可见到发出荧光的ctDNA条带。根据marker确定所检测ctDNA的长度。
三、ctDNA甲基化检测
(1)针对所要检测的5个位点，设计5对引物，序列分别如下：
BMPR1A正向引物：5'-ATGGCATTCCTTCACTCG-3'，
BMPR1A反向引物：5'-CTCCTCCCTTCTCCTTCG-3'；
PSD正向引物：5'-AGCGATTCAAAGATGTGCG-3'，
PSD反向引物：5'-CCTAAGCAGGCTGAGGAAGA-3'；
PLAC8正向引物：5'-CTGTCCTCACTCATTCCCTG-3'，
PLAC8反向引物：5'-CTGCCAAACTTTCTCACCTT-3'；
ATAD2正向引物：5'-CGGCGACCCAACATAAAC-3'，
ATAD2反向引物：5'-GCTGCGGAGAACCACCAT-3'；
KLF3正向引物：5'-CTCACGAATACAAGATGGCTAC-3'，
KLF3反向引物：5'-AGCAATGTCAGGGCTCCA-3'。
(2)用QIAGEN的DNA抽提试剂盒抽提血液样品中的基因组DNA，通过重亚硫酸盐处理后，再用QIAGEN的DNA clean-up kit纯化经重亚硫酸盐处理的DNA样品。
(3)以上述纯化后的DNA为模板，使用上述5对引物分别进行PCR扩增。
(4)PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后回收纯化，连接到pMD19-T(Takara)载体中克隆并测序，根据测序结果分析甲基化程度。
实施例2
按照实施例1中的方法进行双盲测试。
对象：2017年9月-2018年4月共有202名受试者入组，入组的患者符合《中国常见恶性肿瘤诊治规范》中原发性肝癌的诊断；年龄区间在18～70岁(含18岁、70岁)；有明确的可以测量的瘤体；入组前1个月未用放化疗等肿瘤治疗及免疫疗法；生存质量大于60分；预计受试者生存期大于3个月；理解并签署了知情同意书。
中医辨证按照《中药新药临床研究指导原则》，原发性肝癌属于脾肾两虚，瘀毒内阻型。症见脘腹胀满，纳呆少食，神疲乏力，腰膝酸软，右胁局部症积，刺痛拒按，发热，溲赤便溏，口干口苦等，舌质紫暗或暗红，舌体胖并有齿痕，苔白腻或黄腻，脉象沉细脉或脉涩。
方法：全部受试者来源于武汉科技大学附属医院、华中科技大学同济附属医院、华中科技大学协和附属医院等4家临床试验机构的住院患者。试验采用随机双盲、多中心、对照组的方法。采取10mL受试者的血液，对所有采集的血液按随机分层的中心编号，提取受试者的ctDNA，同时检测ctDNA的长度以及甲基化位点。对结果建立数据库，在盲态核查后锁定数据库，进行揭盲。
试验中共纳入病例202例，其中HCC患者100例，对照组102例。受测组中男性97例，女性105例；HCC患者组和对照组在性别、年龄、体重、疾病临床分期等方面差异均无统计学意义(P>0.05)。检测结果见下表1。
表1
a：若有1个以上的甲基化位点则推测患HCC；b：按照待检测者有1个或2个甲基化位点且ctDNA长度小于245bp时判断为患HCC的错判。
由表1数据可以看出，有1个甲基化位点的有10名待测者，有2个甲基化位点的有8名待测者，有3个甲基化位点的有8名待测者，有4个甲基化位点的有19名待测者，有5个位点的有58名待测者，共103个。根据有1个以上的甲基化位点判断待检测者患HCC时，有7个错判，准确率为93.2％。若将甲基化位点个数与ctDNA长度结合起来，当待检测者有3个以上的甲基化位点判断为患HCC，当待检测者有1个或2个甲基化位点且ctDNA长度小于245bp时判断为患HCC，有3个错判，准确率为97.1％。
上述结果表明本发明对待检测者是否患HCC有极高的准确率。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉科技大学
<120> 一种检测肝细胞癌的试剂盒
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggcattcc ttcactcg 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctcctccctt ctccttcg 18
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agcgattcaa agatgtgcg 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctaagcagg ctgaggaaga 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctgtcctcac tcattccctg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctgccaaact ttctcacctt 20
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cggcgaccca acataaac 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gctgcggaga accaccat 18
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctcacgaata caagatggct ac 22
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agcaatgtca gggctcca 18

Claims (2)

1.一种检测肝细胞癌的试剂盒，其特征在于：包含下述5对引物：
BMPR1A正向引物：5'-ATGGCATTCCTTCACTCG-3'，
BMPR1A反向引物：5'-CTCCTCCCTTCTCCTTCG-3'；
PSD正向引物：5'-AGCGATTCAAAGATGTGCG-3'，
PSD反向引物：5'-CCTAAGCAGGCTGAGGAAGA-3'；
PLAC8正向引物：5'-CTGTCCTCACTCATTCCCTG-3'，
PLAC8反向引物：5'-CTGCCAAACTTTCTCACCTT-3'；
ATAD2正向引物：5'-CGGCGACCCAACATAAAC-3'，
ATAD2反向引物：5'-GCTGCGGAGAACCACCAT-3'；
KLF3正向引物：5'-CTCACGAATACAAGATGGCTAC-3'，
KLF3反向引物：5'-AGCAATGTCAGGGCTCCA-3'。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：还包含提取基因组DNA的试剂、重亚硫酸盐、PCR试剂和提取ctDNA的试剂中一种、两种或多种的组合。
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