CN111926058A - 一种基于化学酶切法构建dna二代测序文库试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于化学酶切法构建DNA二代测序文库试剂盒，所述试剂盒自带的模块包括酶切试剂、加A尾、加接头、PCR扩增、杂交试剂、捕获试剂和PCR富集；自行采购的商业试剂有：纯化磁珠‑贝克曼；链霉亲和素磁珠‑thermo；RNA探针‑安捷伦和乙醇‑分析纯，本发明样本产量更高，较物理打断，化学酶切对低起始量DNA建库更友好，样本通量灵活，可同时酶切1‑96个样本，省时高效，建库成本降低，减少样本转管的次数，可以降低样本转管错误造成的样本混淆错误，提高了操作可控性，低质量低投入量的DNA通过酶切建库，其复杂度及插入片段均在可控范围内，适用范围广且数据可靠。
Description
技术领域
本发明涉及试剂盒技术领域，特指一种基于化学酶切法构建DNA 二代测序文库试剂盒。
背景技术
FFPE(Formalin-Fixed and Parrffin Embedded)是通过使用石蜡包埋处理福尔马林固定的样本，在常温下可长久保存，因此该处理模式是对肿瘤样本最常用的样本储存手段。FFPE样本具有以下特点： 1)核酸发生降解。福尔马林的固定容易使组织中的核酸发生不同程度的降解，石蜡的高温渗入过程进一步加速核酸的降解，保存的时间及环境也会使得核酸发生降解。2)分子之间交联。福尔马林的固定容易使组织中分子间交联。因此，如何使得FFPE提取的样本DNA在低质量及低起始量下，依然能够建库信息完整，是一个难题。
目前的建库技术主要依托于NGS，通过DNA片段化、末端修复、加接头、扩增、杂交捕获等，获得可上机测序的文库。通过上述建库过程可知，操作繁琐，极易丢失原始模板信息。因此，报证低质量低投入量的DNA建库可行，是本专利的出发点。本专利通过建立化学酶切的可操作程序及样本质控方式，根据样本情况选择最优的酶切条件，以此来建立一个完整的文库。相较于物理打断方式，化学酶切不仅适用样本质量范围广，对其样本起始投入量要求也低，但是建库质量在各方面均不亚于物理打断的数据。
因此，化学酶切满足FFPE样本的建库，并在成本、通量、质量、起始量等方面具有比物理打断显著的优势。
发明内容
针对以上问题，本发明提供了一种基于化学酶切法构建DNA二代测序文库试剂盒，样本产量更高，较物理打断，化学酶切对低起始量 DNA建库更友好，其打断后经过建库产量更高，复杂度也更高，样本通量灵活，可同时酶切1-96个样本，省时高效，建库成本降低，省却了特殊仪器及耗材，使得建库成本有了一定的下降空间，减少样本转管的次数，可以降低样本转管错误造成的样本混淆错误，提高了操作可控性，低质量低投入量的DNA通过酶切建库，其复杂度及插入片段均在可控范围内，适用范围广且数据可靠。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种基于化学酶切法构建DNA二代测序文库试剂盒，所述试剂盒自带的模块包括酶切试剂、加A尾、加接头、PCR扩增、杂交试剂、捕获试剂和PCR富集；自行采购的商业试剂有：纯化磁珠-贝克曼；链霉亲和素磁珠-thermo；RNA探针-安捷伦和乙醇-分析纯。
优选地，所述试剂盒的使用方法，具体步骤为：
S1：进行化学酶切DNA&末端修复DNA；根据FFPE提取DNA的质量进行分级，根据不同质量的DNA匹配相应的酶切时间，活动反应液A；
S2：进行加A尾反应，取用40ul反应液A、8ul加A尾缓冲液和 2ul加A尾酶混合后进行吹打混匀，在65℃反应30分钟后降至4℃保持，获得反应液B；
S3：进行加接头反应，取用60ul反应液B、25ul加接头缓冲液、 5ul加接头酶、5ul接头和5ul水混合后进行吹打混匀，在20℃下反应15分钟后降至4℃保温，活动反应液C；
S4：进行第一步纯化反应，获得反应液D；
S5：进行文库扩增反应，取用15ul反应液D、25ul扩增混合液和10ul通用引物混合后进行吹打混匀，在95℃下反应5分钟后降至 10℃保温，获得反应液E；
S6：进行第二步纯化反应，获得反应液F；
S7：进行杂交反应，获得反应液G；
S8：进行捕获反应，获得反应液H；
S9：进行PCR富集反应，取用20ul反应液H、25ul扩增混合液、 2.5ul的Index 5X和2.5ul的Index 7X混合后进行吹打混匀，在95℃下反应45秒后降至10℃保温，获得反应液J；
S10：进行第三步纯化反应，获得反应液K；
S11：进行质控品数据分析。
优选地，所述不同质量的DNA包括条带完整性好，无明显降解情况的优质DNA、条带完整性中，降解一般/抹带情况的良好DNA和条带完整性差，降解较重/集中在小片段情况的警戒DNA，优质DNA的酶切时间为25-30分钟，良好DNA的酶切时间为15-20分钟，警戒 DNA的酶切时间为5-10分钟。
优选地，所述S4进行第一步纯化反应，获得反应液D的具体步骤为：
S41:纯化磁珠提前在室温孵育30min，使用之前vortex混匀；
S42:取80ul纯化磁珠(样本：磁珠＝1:0.8)加入至加接头的溶液中，vortex 30s，室温孵育10min；
S43:配置新鲜的75％乙醇；
S44:孵育后的混合液放置磁力架上，待上清液澄清后，将上清液倒出；
S45:加300ul 75％乙醇，停留1min，弃去，重复两次；
S46:离心，弃去残液，待磁珠干燥；
S47:加水18ul洗脱磁珠上的DNA，室温孵育5min，放置磁力架上，回收，继续下步操作。
优选地，所述S6进行第二步纯化反应，获得反应液F的具体步骤为：
S61：纯化磁珠提前在室温孵育30min，使用之前vortex混匀；
S62：取50ul纯化磁珠(样本：磁珠＝1:1)加入至扩增文库的溶液中，vortex 30s，室温孵育10min；
S63：配置新鲜的75％乙醇；
S64：孵育后的混合液放置磁力架上，待上清澄清后，弃去；
S65：加300ul 75％乙醇，停留1min，弃去，重复两次；
S66：离心，弃去残液，待磁珠干燥；
S67：加18ul水洗脱磁珠上的DNA，室温孵育5min，放置磁力架上，回收，用于杂交反应。
优选地，所述S7进行杂交反应包括组分A和组分B；组分A包括S6中获得的15ul反应液F和4ul封闭剂，先加热到95℃进行反应混合5分钟，随后降至65度保温；组分B包括10ul杂交缓冲液、 1ul的RNA抑制剂和5ul的RNA探针-全外，先预热到65℃保温5分钟后，加入到组分A中进行65℃保温反应24小时。
优选地，所述S8进行捕获反应，获得反应液H的具体步骤为
S81：准备链霉亲和素磁珠，提前室温孵育30min，用前混匀；
S82：每个样本用50ul链霉亲和素磁珠，弃去上清；
S83：加入200ul结合液至链霉亲和素磁珠，vortex混匀，然后放置磁力架上弃去；重复该步骤三次；
S84：加入200ul结合液至链霉亲和素磁珠，吹打混匀，重悬链霉亲和素磁珠；
S85：将杂交组分A+B的混合液加入至重悬的链霉亲和素磁珠中，室温孵育30min，磁力架上去上清；
S86：加200ul洗脱液1至S85中的链霉亲和素磁珠中，室温孵育15min，磁力架上去上清；
S87：加200ul洗脱液2至S86中的链霉亲和素磁珠中，65℃10 min，磁力架上去上清，重复四次；
S88：加入20ul水至S87中，重悬链霉亲和素磁珠，作为扩增的样品。
优选地，所述S10进行第三步纯化反应，获得反应液K的具体步骤为：
S101：纯化磁珠提前在室温孵育30min，使用之前vortex混匀；
S102：取50ul纯化磁珠(样本：磁珠＝1:1)加入至扩增文库的溶液中，vortex 30s，室温孵育10min；
S103：配置新鲜的75％乙醇；
S104：孵育后的混合液放置磁力架上，待上清澄清后，弃去；
S105：加300ul 75％乙醇，停留1min，弃去，重复两次；
S106：离心，弃去残液，待磁珠干燥
S107：加18ul水洗脱磁珠上的DNA，室温孵育5min，放置磁力架上，回收，上机。
优选地，所述S11质控品数据分析的具体步骤为：
S111：取1ul文库，采用qubit或者qpcr进行定量；
S112：取1ul文库，采用片段仪器等进行片段评估；
S113：选取三种DNA等级的样本进行测试，分别比对物理打断法和化学酶切法对样本最终数据的影响。
本发明有益效果：
1.成本大幅降低。无需额外采购使用物理打断法而所需的打断仪器及相关配套耗材，大幅度的降低了成本。实验操作过程中有效的减少了转管操作，有利于降低样本在转管所产生的错误率。
2.样本投入量低。酶切样本在不同质量下，可使用50-200ng 作为起始投入量，其产量和复杂度等指标，均要优于同等条件下物理打断法所产出的数据。因此，酶切法满足了市场对低投入量的要求，更贴合市场的需求。
3.样本质量可控。酶切方法针对不同质量下的FFPE样本，均给出了合理的酶切时间。基于该限制要求操作下，其数据质量产出均优于物理打断法。因此，一个定性化的操作要求，有益于产出稳定且优质的数据质量。
4.样本通量提高。不同于物理打断样本逐一依次打断，化学酶切可实现大规模的操作1-96个，不仅通量大，而且通量灵活。
5.实验操作简便。该试剂盒实现了酶切后无需纯化而可直接进行后端步骤的操作，因此，降低了操作的复杂程度，也减少因纯化而造成的样本损耗，也为优质的数据产出做了良好的开端。
6.样本转化率高。在样本即低质量又低投入量的投入下，样本所产出的总量及复杂度等指标，均符合各项质量要求，说明样本转化率高。且数据质量要优于同等条件下的物理打断法，尤其是样本质量越差的情况下，对比愈加显著。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行说明。
本发明所述的一种基于化学酶切法构建DNA二代测序文库试剂盒，所述试剂盒自带的模块包括酶切试剂、加A尾、加接头、PCR扩增、杂交试剂、捕获试剂和PCR富集；自行采购的商业试剂有：纯化磁珠-贝克曼；链霉亲和素磁珠-thermo；RNA探针-安捷伦和乙醇-分析纯。
具体的，所述试剂盒的使用方法，具体步骤为：
S1：进行化学酶切DNA&末端修复DNA；根据FFPE提取DNA的质量进行分级，根据不同质量的DNA匹配相应的酶切时间，活动反应液A；
S2：进行加A尾反应，取用40ul反应液A、8ul加A尾缓冲液和 2ul加A尾酶混合后进行吹打混匀，在65℃反应30分钟后降至4℃保持，获得反应液B；
S3：进行加接头反应，取用60ul反应液B、25ul加接头缓冲液、5ul加接头酶、5ul接头和5ul水混合后进行吹打混匀，在20℃下反应15分钟后降至4℃保温，活动反应液C；
S4：进行第一步纯化反应，获得反应液D；
S5：进行文库扩增反应，取用15ul反应液D、25ul扩增混合液和10ul通用引物混合后进行吹打混匀，在95℃下反应5分钟后降至 10℃保温，获得反应液E；
S6：进行第二步纯化反应，获得反应液F；
S7：进行杂交反应，获得反应液G；
S8：进行捕获反应，获得反应液H；
S9：进行PCR富集反应，取用20ul反应液H、25ul扩增混合液、 2.5ul的Index 5X和2.5ul的Index 7X混合后进行吹打混匀，在95℃下反应45秒后降至10℃保温，获得反应液J；
S10：进行第三步纯化反应，获得反应液K；
S11：进行质控品数据分析。
具体的，所述不同质量的DNA包括条带完整性好，无明显降解情况的优质DNA、条带完整性中，降解一般/抹带情况的良好DNA和条带完整性差，降解较重/集中在小片段情况的警戒DNA，优质DNA的酶切时间为25-30分钟，良好DNA的酶切时间为15-20分钟，警戒 DNA的酶切时间为5-10分钟。
具体的，所述S4进行第一步纯化反应，获得反应液D的具体步骤为：
S41:纯化磁珠提前在室温孵育30min，使用之前vortex混匀；
S42:取80ul纯化磁珠(样本：磁珠＝1:0.8)加入至加接头的溶液中，vortex 30s，室温孵育10min；
S43:配置新鲜的75％乙醇；
S44:孵育后的混合液放置磁力架上，待上清液澄清后，将上清液倒出；
S45:加300ul 75％乙醇，停留1min，弃去，重复两次；
S46:离心，弃去残液，待磁珠干燥；
S47:加水18ul洗脱磁珠上的DNA，室温孵育5min，放置磁力架上，回收，继续下步操作。
具体的，所述S6进行第二步纯化反应，获得反应液F的具体步骤为：
S61：纯化磁珠提前在室温孵育30min，使用之前vortex混匀；
S62：取50ul纯化磁珠(样本：磁珠＝1:1)加入至扩增文库的溶液中，vortex 30s，室温孵育10min；
S63：配置新鲜的75％乙醇；
S64：孵育后的混合液放置磁力架上，待上清澄清后，弃去；
S65：加300ul 75％乙醇，停留1min，弃去，重复两次；
S66：离心，弃去残液，待磁珠干燥；
S67：加18ul水洗脱磁珠上的DNA，室温孵育5min，放置磁力架上，回收，用于杂交反应。
具体的，所述S7进行杂交反应包括组分A和组分B；组分A包括S6中获得的15ul反应液F和4ul封闭剂，先加热到95℃进行反应混合5分钟，随后降至65度保温；组分B包括10ul杂交缓冲液、 1ul的RNA抑制剂和5ul的RNA探针-全外，先预热到65℃保温5分钟后，加入到组分A中进行65℃保温反应24小时。
具体的，所述S8进行捕获反应，获得反应液H的具体步骤为
S81：准备链霉亲和素磁珠，提前室温孵育30min，用前混匀；
S82：每个样本用50ul链霉亲和素磁珠，弃去上清；
S83：加入200ul结合液至链霉亲和素磁珠，vortex混匀，然后放置磁力架上弃去；重复该步骤三次；
S84：加入200ul结合液至链霉亲和素磁珠，吹打混匀，重悬链霉亲和素磁珠；
S85：将杂交组分A+B的混合液加入至重悬的链霉亲和素磁珠中，室温孵育30min，磁力架上去上清；
S86：加200ul洗脱液1至S85中的链霉亲和素磁珠中，室温孵育15min，磁力架上去上清；
S87：加200ul洗脱液2至S86中的链霉亲和素磁珠中，65℃10 min，磁力架上去上清，重复四次；
S88：加入20ul水至S87中，重悬链霉亲和素磁珠，作为扩增的样品。
具体的，所述S10进行第三步纯化反应，获得反应液K的具体步骤为：
S101：纯化磁珠提前在室温孵育30min，使用之前vortex混匀；
S102：取50ul纯化磁珠(样本：磁珠＝1:1)加入至扩增文库的溶液中，vortex 30s，室温孵育10min；
S103：配置新鲜的75％乙醇；
S104：孵育后的混合液放置磁力架上，待上清澄清后，弃去；
S105：加300ul 75％乙醇，停留1min，弃去，重复两次；
S106：离心，弃去残液，待磁珠干燥
S107：加18ul水洗脱磁珠上的DNA，室温孵育5min，放置磁力架上，回收，上机。
具体的，所述S11质控品数据分析的具体步骤为：
S111：取1ul文库，采用qubit或者qpcr进行定量；
S112：取1ul文库，采用片段仪器等进行片段评估；
S113：选取三种DNA等级的样本进行测试，分别比对物理打断法和化学酶切法对样本最终数据的影响。
实验端数据比较
比较说明：
在相同质量下和相同投入量下的FFPE样本，酶切相比物理打断所得产物总量更多，尤其是在低质量和低投入量DNA优势更为明显。
酶切适用于各种样本质量的FFPE样本，在低起始投入量下，其总量产出要明显优于物理打断法的产量。
因此，酶切适用于低起始量、低质量的FFPE样本。操作成本低，操作也简便。
生信端数据比较
数据比较说明：
相同质量下的FFPE样本，酶切法相比物理法其所得产物的复杂度更高，说明样本损耗低，尤其是在低质量低投入量的对比下这一优势更为明显。
因此，酶切适用于低起始量、低质量的FFPE样本。操作成本低，操作也简便。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“左”、“右”等指示方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以及特定的方位构造和操作，因此，不能理解为对本发明的限制。此外，“第一”、“第二”仅由于描述目的，且不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。因此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者多个该特征。本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”“相连”“连接”等应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接连接，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
Claims (9)
1.一种基于化学酶切法构建DNA二代测序文库试剂盒，其特征在于：所述试剂盒自带的模块包括酶切试剂、加A尾、加接头、PCR扩增、杂交试剂、捕获试剂和PCR富集；自行采购的商业试剂有：纯化磁珠-贝克曼；链霉亲和素磁珠-thermo；RNA探针-安捷伦和乙醇-分析纯。
2.根据权利要求1所述的一种基于化学酶切法构建DNA二代测序文库试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的使用方法，具体步骤为：
S1：进行化学酶切DNA & 末端修复DNA；根据FFPE提取DNA的质量进行分级，根据不同质量的DNA匹配相应的酶切时间，活动反应液A；
S2：进行加A尾反应，取用40ul反应液A、8ul加A尾缓冲液和2ul加A尾酶混合后进行吹打混匀，在65℃反应30分钟后降至4℃保持，获得反应液B；
S3：进行加接头反应，取用60ul反应液B、25ul加接头缓冲液、5ul加接头酶、5ul接头和5ul水混合后进行吹打混匀，在20℃下反应15分钟后降至4℃保温，活动反应液C；
S4：进行第一步纯化反应，获得反应液D；
S5：进行文库扩增反应，取用15ul反应液D、25ul扩增混合液和10ul通用引物混合后进行吹打混匀，在95℃下反应5分钟后降至10℃保温，获得反应液E；
S6：进行第二步纯化反应，获得反应液F；
S7：进行杂交反应，获得反应液G；
S8：进行捕获反应，获得反应液H；
S9：进行PCR富集反应，取用20ul反应液H、25ul扩增混合液、2.5ul的Index 5X和2.5ul的Index 7X混合后进行吹打混匀，在95℃下反应45秒后降至10℃保温，获得反应液J；
S10：进行第三步纯化反应，获得反应液K；
S11：进行质控品数据分析。
3.根据权利要求2所述的一种基于化学酶切法构建DNA二代测序文库试剂盒，其特征在于：所述不同质量的DNA包括条带完整性好，无明显降解情况的优质DNA、条带完整性中，降解一般/抹带情况的良好DNA和条带完整性差，降解较重/集中在小片段情况的警戒DNA，优质DNA的酶切时间为25-30分钟，良好DNA的酶切时间为15-20分钟，警戒DNA的酶切时间为5-10分钟。
4.根据权利要求2所述的一种基于化学酶切法构建DNA二代测序文库试剂盒，其特征在于：所述S4进行第一步纯化反应，获得反应液D的具体步骤为：
S41:纯化磁珠提前在室温孵育30 min，使用之前vortex混匀;
S42:取80 ul纯化磁珠（样本：磁珠=1:0.8）加入至加接头的溶液中，vortex 30s，室温孵育10min;
S43:配置新鲜的75%乙醇;
S44:孵育后的混合液放置磁力架上，待上清液澄清后，将上清液倒出；
S45:加300 ul 75%乙醇，停留1 min，弃去，重复两次；
S46:离心，弃去残液，待磁珠干燥；
S47:加水18 ul洗脱磁珠上的DNA，室温孵育5 min，放置磁力架上，回收，继续下步操作。
5.根据权利要求2所述的一种基于化学酶切法构建DNA二代测序文库试剂盒，其特征在于：所述S6进行第二步纯化反应，获得反应液F的具体步骤为：
S61：纯化磁珠提前在室温孵育30 min，使用之前vortex混匀；
S62：取50 ul纯化磁珠（样本：磁珠=1:1）加入至扩增文库的溶液中，vortex 30 s，室温孵育10 min；
S63：配置新鲜的75%乙醇；
S64：孵育后的混合液放置磁力架上，待上清澄清后，弃去；
S65：加300 ul 75%乙醇，停留1 min，弃去，重复两次；
S66：离心，弃去残液，待磁珠干燥；
S67：加18 ul水洗脱磁珠上的DNA，室温孵育5 min，放置磁力架上，回收，用于杂交反应。
6.根据权利要求2所述的一种基于化学酶切法构建DNA二代测序文库试剂盒，其特征在于：所述S7进行杂交反应包括组分A和组分B；组分A包括S6中获得的15ul反应液F和4ul封闭剂，先加热到95℃进行反应混合5分钟，随后降至65度保温；组分B包括10ul杂交缓冲液、1ul的RNA抑制剂和5ul的RNA探针-全外，先预热到65℃保温5分钟后，加入到组分A中进行65℃保温反应24小时。
7.根据权利要求2所述的一种基于化学酶切法构建DNA二代测序文库试剂盒，其特征在于：所述S8进行捕获反应，获得反应液H的具体步骤为
S81：准备链霉亲和素磁珠，提前室温孵育30 min，用前混匀；
S82：每个样本用50 ul链霉亲和素磁珠，弃去上清；
S83：加入200 ul结合液至链霉亲和素磁珠，vortex混匀，然后放置磁力架上弃去；重复该步骤三次；
S84：加入200 ul 结合液至链霉亲和素磁珠，吹打混匀，重悬链霉亲和素磁珠；
S85：将杂交组分A+B的混合液加入至重悬的链霉亲和素磁珠中，室温孵育30 min，磁力架上去上清；
S86：加200 ul洗脱液1至S85中的链霉亲和素磁珠中，室温孵育15 min，磁力架上去上清；
S87：加200 ul洗脱液2至S86中的链霉亲和素磁珠中，65 ℃ 10 min，磁力架上去上清，重复四次；
S88：加入20 ul水至S87中，重悬链霉亲和素磁珠，作为扩增的样品。
8.根据权利要求2所述的一种基于化学酶切法构建DNA二代测序文库试剂盒，其特征在于：所述S10进行第三步纯化反应，获得反应液K的具体步骤为：
S101：纯化磁珠提前在室温孵育30 min，使用之前vortex混匀；
S102：取50 ul纯化磁珠（样本：磁珠=1:1）加入至扩增文库的溶液中，vortex 30 s，室温孵育10 min；
S103：配置新鲜的75%乙醇；
S104：孵育后的混合液放置磁力架上，待上清澄清后，弃去；
S105：加300 ul 75%乙醇，停留1 min，弃去，重复两次；
S106：离心，弃去残液，待磁珠干燥
S107：加18 ul水洗脱磁珠上的DNA，室温孵育5 min，放置磁力架上，回收，上机。
9.根据权利要求2所述的一种基于化学酶切法构建DNA二代测序文库试剂盒，其特征在于：所述S11质控品数据分析的具体步骤为：
S111：取1 ul文库，采用qubit或者qpcr进行定量；
S112：取1 ul文库，采用片段仪器等进行片段评估；
S113：选取三种DNA等级的样本进行测试，分别比对物理打断法和化学酶切法对样本最终数据的影响。
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