CN111926075A - 基于二代测序探针捕获技术肿瘤微卫星不稳定检测试剂盒 - Google Patents
基于二代测序探针捕获技术肿瘤微卫星不稳定检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供基于二代测序探针捕获技术肿瘤微卫星不稳定检测试剂盒，所述检测试剂盒采用二代测序探针捕获技术，所述检测试剂盒的试剂包括质控品、建库试剂和RNA探针；所述质控品包括阴性质控品和阳性质控品；所述阴性质控品为阴性样本溶于TE中，所述阳性质控品为含有MSI位点的质粒溶于TE中；在MSI的实验方法上选用了NGS技术，其优势在于检测位点多——筛选后覆盖多达40个微卫星位点，对微卫星覆盖区域广泛，RNA探针调整后均一性良好，可对患者有较好的用药指导，适用于多肿瘤如结直肠癌、子宫内膜癌、胃肠道肿瘤等。
Description
技术领域
本发明涉及检测试剂盒技术领域，特指基于二代测序探针捕获技术肿瘤微卫星不稳定检测试剂盒。
背景技术
微卫星(Microsatellite)是指通常以1-6bp为一个重复单元，重复次数≤60次的短串联重复序列。微卫星位点散落于各条染色体上，为易发生突变区域，呈现高度多态性，具体表现为不同个体间或正常组织与肿瘤组织之间，微卫星位点重复单元(1-6bp)的重复次数具有波动性。基于微卫星位点的分布广泛性及高度多态性,微卫星常被用于肿瘤发生机制的研究。
微卫星不稳定(Microsatellite Instability,MSI)是指DNA复制过程中的“链滑”错误且未被DNA错配修复系统(MMR)修复，而引起的微卫星区域重复序列插入或缺失现象，也即重复单元重复次数具有差异性。根据差异性的程度，MSI分为MSI-H(MicroSatelliteInstability High), MSI-L(MicroSatellite Instaillity Low)以及MSS(MicroSatellite Stable)。未能被MMR修复的诱因可能是启动子超甲基化或基因突变等，因此，微卫星不稳定的检测对于肿瘤的早期诊断以及预后判断等具有重要的意义。
临床上检测MSI的实验方法通常采用MSI-PCR或MMR-IHC技术。MSI-PCR通过PCR扩增及电泳条带来比较正常和肿瘤组织的微卫星位点之间的差异，鉴定 MSI的状态差异。目前，NCI共识的有5个位点(BAT-25,BAT-26,NR-21,NR-24 和MONO-27)用于检测MSI，2个位点(Penta C和Penta D)用于标识样本。MMR-IHC 通过检测MMR蛋白(MLH1、MSH2、MSH6和PMS2)的表达判断MMR系统的运行正常否，鉴定MSI的状态差异。但MMR-IHC具有局限性，表现在MSI-H中有5％的肿瘤上述四种MMR蛋白均表达。
临床上检测MSI的计算方法通常采用基于一般统计模型的以及基于机器学习模型的技术。一般统计模型的MSI检测方法有：基于Indel的MSI检测方法——识别过滤仅保留位于微卫星区域的Indel，同t检验评估PI(微卫星区域 insertion占所有insertion的比例)/PD(PD表示微卫星区域deletion占所有deletion的比例)的比率；mSINGS——根据MSS样本建立微卫星位点的参考线，若超出参考线则评估为微卫星不稳定；MSIsensor——需基于配对的正常和肿瘤组织样本进行评估；MANTIS——还需定义样本的稳定程度。基于机器学习模型的MSI检测方法有：MSIseq；MOSAIC；MIRMMR。
发明内容
针对以上问题，本发明提供了基于二代测序探针捕获技术肿瘤微卫星不稳定检测试剂盒，在MSI的实验方法上选用了NGS技术，其优势在于检测位点多——筛选后覆盖多达40个微卫星位点，对微卫星覆盖区域广泛，RNA探针调整后均一性良好，可对患者有较好的用药指导，适用于多肿瘤如结直肠癌、子宫内膜癌、胃肠道肿瘤等，在MSI的计算方法基于mSINGS进行了优化和改良，制定出了适宜于自己平台的MSI评估准则，如下：MSI得分即不稳定的微卫星位点占比(MSI score＝Unstable loci/Passing loci)，MSI得分越高，微卫星不稳定可能性越大，免疫治疗有效应答的概率越高。若MSI得分大于0.3则判定为高度微卫星不稳定(MSI-H)，若MSI得分介于0.1至0.3之间则判定为低度微卫星不稳定(MSI-L)，若MSI得分小于0.1则判定为微卫星稳定(MSS)。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
基于二代测序探针捕获技术肿瘤微卫星不稳定检测试剂盒，所述检测试剂盒采用二代测序探针捕获技术，所述检测试剂盒的试剂包括质控品、建库试剂和RNA探针；
所述质控品包括阴性质控品和阳性质控品；所述阴性质控品为阴性样本溶于TE中，所述阳性质控品为含有MSI位点的质粒溶于TE中；
所述建库试剂包括末端修复&加A试剂、加接头试剂、扩增试剂、杂交试剂、捕获试剂和扩增试剂；
所述RNA探针为识别相关MSI位点的RNA单链探针，所述RNA探针的片段长度在90-120nt之间，且修饰有生物素，所述RNA探针与DNA文库片段进行杂交，捕获链霉亲和素特异性的识别生物素、特异性的洗脱和富集程序，得到最终所需的DNA片段。
优选地，所述检测试剂盒的使用方法，具体步骤为：
S1：利用超声波进行物理打断DNA；
S2：进行末端修复和加A654尾反应，取用S1中的反应液50ul与末端修复 &加A尾反应液15ul进行轻微吹打混匀，在20℃进行混匀30分钟后加热到65℃反应30分钟，最后保持10℃进行反应的到反应液A；
S3：进行加接头反应，取用S2中的65ul反应液A、加接头缓冲液25ul、加接头酶5ul和接头5ul进行轻微吹打混匀，在20℃进行混匀15分钟后加热到 70℃反应10分钟，最后保持10℃进行反应的到反应液B；
S4：进行第一步纯化反应，获得反应液C；
S5：进行文库扩增反应；取用S4中的15ul反应液C、扩增混合液25ul和通用引物10ul进行轻微吹打混匀，获得反应液D；
S6：进行第二步纯化反应，获得反应液E；
S7：进行杂交反应，获得反应液F；
S8：进行捕获反应，获得反应液G；
S9：进行PCR富集反应，获得反应液H；
S10：进行第三步纯化反应，获得反应液J；
S11：质控品数据分析。
优选地，所述S1利用超声波进行物理打断DNA具体操作为：检测开始前30 分钟启动Covaris M220仪器，检查Covaris槽装满AFA-grade water(新鲜去离子水)至刚好淹过槽口，且覆盖管的玻璃部分，设置温度在4℃之间，以保证读到的水浴温度为4℃；根据microTUBE类型(50μL和130μL)和目标片段(200～300bp)，预先设置打断程序；将250ng的高质量白细胞gDNA加到 microTUBE管，使用无核酶水稀释至总体积为55μL，盖上管盖使用预设程序进行基因组打断。
优选地，所述S4进行第一步纯化反应，获得反应液C的具体步骤为：
S41:纯化磁珠提前在室温孵育30min，使用之前vortex混匀；
S42:取80ul纯化磁珠(样本：磁珠＝1:0.8)加入至加接头的溶液中，vortex 30s，室温孵育10min；
S43:配置新鲜的75％乙醇；
S44:孵育后的混合液放置磁力架上，待上清液澄清后，将上清液倒出；
S45:加300ul 75％乙醇，停留1min，弃去，重复两次；
S46:离心，弃去残液，待磁珠干燥；
S47:加水18ul洗脱磁珠上的DNA，室温孵育5min，放置磁力架上，回收，继续下步操作。
优选地，所述S6进行第二步纯化反应，获得反应液E的具体步骤为：
S61：纯化磁珠提前在室温孵育30min，使用之前vortex混匀；
S62：取50ul纯化磁珠(样本：磁珠＝1:1)加入至扩增文库的溶液中，vortex 30s，室温孵育10min；
S63：配置新鲜的75％乙醇；
S64：孵育后的混合液放置磁力架上，待上清澄清后，弃去；
S65：加300ul 75％乙醇，停留1min，弃去，重复两次；
S66：离心，弃去残液，待磁珠干燥；
S67：加18ul水洗脱磁珠上的DNA，室温孵育5min，放置磁力架上，回收，用于杂交反应。
优选地，所述S7进行杂交反应包括组分A和组分B；组分A包括S6中获得的15ul反应液E和4ul封闭剂，先加热到95℃进行反应混合5分钟，随后降至 65度保温；组分B包括10ul杂交缓冲液、1ulRNA抑制剂和2ulRNA探针-定制，先预热到65℃保温5分钟后，加入到组分A中进行65℃保温反应24小时。
优选地，所述S8进行捕获反应，获得反应液G的具体步骤为：
S81：准备链霉亲和素磁珠，提前室温孵育30min，用前混匀；
S82：每个样本用50ul链霉亲和素磁珠，弃去上清；
S83：加入200ul结合液至链霉亲和素磁珠，vortex混匀，然后放置磁力架上弃去；重复该步骤三次；
S84：加入200ul结合液至链霉亲和素磁珠，吹打混匀，重悬链霉亲和素磁珠；
S85：将杂交组分A+B的混合液加入至重悬的链霉亲和素磁珠中，室温孵育 30min，磁力架上去上清；
S86：加200ul洗脱液1至S85中的链霉亲和素磁珠中，室温孵育15min，磁力架上去上清；
S87：加200ul洗脱液2至S86中的链霉亲和素磁珠中，65℃10min，磁力架上去上清，重复四次；
S88：加入20ul水至S87中，重悬链霉亲和素磁珠，作为扩增的样品。
优选地，所述S10进行第三步纯化反应，获得反应液J的具体步骤为：
S101：纯化磁珠提前在室温孵育30min，使用之前vortex混匀；
S102：取50ul纯化磁珠(样本：磁珠＝1:1)加入至扩增文库的溶液中， vortex30s，室温孵育10min；
S103：配置新鲜的75％乙醇；
S104：孵育后的混合液放置磁力架上，待上清澄清后，弃去；
S105：加300ul 75％乙醇，停留1min，弃去，重复两次；
S106：离心，弃去残液，待磁珠干燥
S107：加18ul水洗脱磁珠上的DNA，室温孵育5min，放置磁力架上，回收，上机。
优选地，所述S11质控品数据分析的具体步骤为：
S111：取1ul文库，采用qubit或者qpcr进行定量；
S112：取1ul文库，采用片段仪器等进行片段评估；
S113：经过一批批测序数据，优化探针的摩尔比例，调试部分位点的探针摩尔比例，最终呈现出探针覆盖均一性一致。
本发明有益效果：
1.检出位点数多。该panel的RNA探针可高达40个MSI检测位点，是通过大量数据经验及验证确定的位点，使得最终结果解读更为准确。
2.MSI评分机制。根据MSI的得分即不稳定的微卫星位点占比评估免疫治疗有效应答的概率。MSI得分越高，其微卫星不稳定可能性越大，免疫治疗有效应答的概率越高。若MSI得分大于0.3，则判定为高度微卫星不稳定(MSI-H),若 MSI得分介于0.1-0.3之间则判定为低度微卫星不稳定(MSI-L)，若MSI score 小于0.1则判定为微卫星稳定(MSS)。
3.肿瘤范围广泛。该panel的RNA探针适用于是结直肠癌、子宫内膜癌、胃肠道肿瘤等肿瘤。
4.检测灵敏度高。根据梯度测试，该探针配合试剂盒可达到1％的检出率。
5.探针均一性好。根据探针MSI 40个位点的摩尔比例的调试，达到了位点均一性良好的结果。
6.探针特异性好。经过MSI位点的探针长度调试，最终确定在90-140nt。配合杂交捕获程序，使得最终文库结果产出的特异性好，即捕获效率高。
7.检出准确性高。通过二代测序试剂盒配合MSI探针的使用，其检出低频位点通过一定的验证方法，结果准确性一致度高。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行说明。
本发明所述的基于二代测序探针捕获技术肿瘤微卫星不稳定检测试剂盒，所述检测试剂盒采用二代测序探针捕获技术，所述检测试剂盒的试剂包括质控品、建库试剂和RNA探针；
所述质控品包括阴性质控品和阳性质控品；所述阴性质控品为阴性样本溶于TE中，所述阳性质控品为含有MSI位点的质粒溶于TE中；
所述建库试剂包括末端修复&加A试剂、加接头试剂、扩增试剂、杂交试剂、捕获试剂和扩增试剂；
所述RNA探针为识别相关MSI位点的RNA单链探针，所述RNA探针的片段长度在90-120nt之间，且修饰有生物素，所述RNA探针与DNA文库片段进行杂交，捕获链霉亲和素特异性的识别生物素、特异性的洗脱和富集程序，得到最终所需的DNA片段。
具体的，所述检测试剂盒的使用方法，具体步骤为：
S1：利用超声波进行物理打断DNA；
S2：进行末端修复和加A654尾反应，取用S1中的反应液50ul与末端修复 &加A尾反应液15ul进行轻微吹打混匀，在20℃进行混匀30分钟后加热到65℃反应30分钟，最后保持10℃进行反应的到反应液A；
S3：进行加接头反应，取用S2中的65ul反应液A、加接头缓冲液25ul、加接头酶5ul和接头5ul进行轻微吹打混匀，在20℃进行混匀15分钟后加热到 70℃反应10分钟，最后保持10℃进行反应的到反应液B；
S4：进行第一步纯化反应，获得反应液C；
S5：进行文库扩增反应；取用S4中的15ul反应液C、扩增混合液25ul和通用引物10ul进行轻微吹打混匀，获得反应液D；
S6：进行第二步纯化反应，获得反应液E；
S7：进行杂交反应，获得反应液F；
S8：进行捕获反应，获得反应液G；
S9：进行PCR富集反应，获得反应液H；
S10：进行第三步纯化反应，获得反应液J；
S11：质控品数据分析。
具体的，所述S1利用超声波进行物理打断DNA具体操作为：检测开始前30 分钟启动Covaris M220仪器，检查Covaris槽装满AFA-grade water(新鲜去离子水)至刚好淹过槽口，且覆盖管的玻璃部分，设置温度在4℃之间，以保证读到的水浴温度为4℃；根据microTUBE类型(50μL和130μL)和目标片段(200～300bp)，预先设置打断程序(表1)；将250ng的高质量白细胞gDNA 加到microTUBE管，使用无核酶水稀释至总体积为55μL，盖上管盖使用预设程序进行基因组打断；
表1.打断程序参数
具体的，所述S4进行第一步纯化反应，获得反应液C的具体步骤为：
S41:纯化磁珠提前在室温孵育30min，使用之前vortex混匀；
S42:取80ul纯化磁珠(样本：磁珠＝1:0.8)加入至加接头的溶液中，vortex 30s，室温孵育10min；
S43:配置新鲜的75％乙醇；
S44:孵育后的混合液放置磁力架上，待上清液澄清后，将上清液倒出；
S45:加300ul 75％乙醇，停留1min，弃去，重复两次；
S46:离心，弃去残液，待磁珠干燥；
S47:加水18ul洗脱磁珠上的DNA，室温孵育5min，放置磁力架上，回收，继续下步操作。
具体的，所述S6进行第二步纯化反应，获得反应液E的具体步骤为：
S61：纯化磁珠提前在室温孵育30min，使用之前vortex混匀；
S62：取50ul纯化磁珠(样本：磁珠＝1:1)加入至扩增文库的溶液中，vortex 30s，室温孵育10min；
S63：配置新鲜的75％乙醇；
S64：孵育后的混合液放置磁力架上，待上清澄清后，弃去；
S65：加300ul 75％乙醇，停留1min，弃去，重复两次；
S66：离心，弃去残液，待磁珠干燥；
S67：加18ul水洗脱磁珠上的DNA，室温孵育5min，放置磁力架上，回收，用于杂交反应。
具体的，所述S7进行杂交反应包括组分A和组分B；组分A包括S6中获得的15ul反应液E和4ul封闭剂，先加热到95℃进行反应混合5分钟，随后降至 65度保温；组分B包括10ul杂交缓冲液、1ulRNA抑制剂和2ulRNA探针-定制，先预热到65℃保温5分钟后，加入到组分A中进行65℃保温反应24小时。
具体的，所述S8进行捕获反应，获得反应液G的具体步骤为：
S81：准备链霉亲和素磁珠，提前室温孵育30min，用前混匀；
S82：每个样本用50ul链霉亲和素磁珠，弃去上清；
S83：加入200ul结合液至链霉亲和素磁珠，vortex混匀，然后放置磁力架上弃去；重复该步骤三次；
S84：加入200ul结合液至链霉亲和素磁珠，吹打混匀，重悬链霉亲和素磁珠；
S85：将杂交组分A+B的混合液加入至重悬的链霉亲和素磁珠中，室温孵育 30min，磁力架上去上清；
S86：加200ul洗脱液1至S85中的链霉亲和素磁珠中，室温孵育15min，磁力架上去上清；
S87：加200ul洗脱液2至S86中的链霉亲和素磁珠中，65℃10min，磁力架上去上清，重复四次；
S88：加入20ul水至S87中，重悬链霉亲和素磁珠，作为扩增的样品。
具体的，所述S10进行第三步纯化反应，获得反应液J的具体步骤为：
S101：纯化磁珠提前在室温孵育30min，使用之前vortex混匀；
S102：取50ul纯化磁珠(样本：磁珠＝1:1)加入至扩增文库的溶液中， vortex30s，室温孵育10min；
S103：配置新鲜的75％乙醇；
S104：孵育后的混合液放置磁力架上，待上清澄清后，弃去；
S105：加300ul 75％乙醇，停留1min，弃去，重复两次；
S106：离心，弃去残液，待磁珠干燥
S107：加18ul水洗脱磁珠上的DNA，室温孵育5min，放置磁力架上，回收，上机。
具体的，所述S11质控品数据分析的具体步骤为：
S111：取1ul文库，采用qubit或者qpcr进行定量；
S112：取1ul文库，采用片段仪器等进行片段评估；
S113：经过一批批测序数据，优化探针的摩尔比例，调试部分位点的探针摩尔比例，最终呈现出探针覆盖均一性一致。
表2：微卫星的位点信息
表3：微卫星的位点的RNA探针序列信息
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“左”、“右”等指示方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以及特定的方位构造和操作，因此，不能理解为对本发明的限制。此外，“第一”、“第二”仅由于描述目的，且不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。因此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者多个该特征。本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”“相连”“连接”等应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接连接，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
Claims (9)
1.基于二代测序探针捕获技术肿瘤微卫星不稳定检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒采用二代测序探针捕获技术，所述检测试剂盒的试剂包括质控品、建库试剂和RNA探针；
所述质控品包括阴性质控品和阳性质控品；所述阴性质控品为阴性样本溶于TE中，所述阳性质控品为含有MSI位点的质粒溶于TE中；
所述建库试剂包括末端修复&加A 试剂、加接头试剂、扩增试剂、杂交试剂、捕获试剂和扩增试剂；
所述RNA探针为识别相关MSI位点的RNA单链探针，所述RNA探针的片段长度在90-120nt之间，且修饰有生物素，所述RNA探针与DNA文库片段进行杂交，捕获链霉亲和素特异性的识别生物素、特异性的洗脱和富集程序，得到最终所需的DNA片段。
2.根据权利要求1所述的基于二代测序探针捕获技术肿瘤微卫星不稳定检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒的使用方法，具体步骤为：
S1：利用超声波进行物理打断DNA；
S2：进行末端修复和加A654尾反应，取用S1中的反应液50ul与末端修复&加A尾反应液15ul进行轻微吹打混匀，在20℃进行混匀30分钟后加热到65℃反应30分钟，最后保持10℃进行反应的到反应液A；
S3：进行加接头反应，取用S2中的65ul反应液A、加接头缓冲液25ul、加接头酶5ul和接头5ul进行轻微吹打混匀，在20℃进行混匀15分钟后加热到70℃反应10分钟，最后保持10℃进行反应的到反应液B；
S4：进行第一步纯化反应，获得反应液C；
S5：进行文库扩增反应；取用S4中的15ul反应液C、扩增混合液25ul和通用引物10ul进行轻微吹打混匀，获得反应液D；
S6：进行第二步纯化反应，获得反应液E；
S7：进行杂交反应，获得反应液F；
S8：进行捕获反应，获得反应液G；
S9：进行PCR富集反应，获得反应液H；
S10：进行第三步纯化反应，获得反应液J；
S11：质控品数据分析。
3.根据权利要求2所述的基于二代测序探针捕获技术肿瘤微卫星不稳定检测试剂盒，其特征在于：所述S1利用超声波进行物理打断DNA具体操作为：检测开始前30分钟启动Covaris M220仪器，检查Covaris槽装满AFA-grade water（新鲜去离子水）至刚好淹过槽口，且覆盖管的玻璃部分，设置温度在4℃之间，以保证读到的水浴温度为4℃；根据microTUBE类型（50 μL 和130 μL）和目标片段（200~300 bp），预先设置打断程序；将250 ng的高质量白细胞gDNA 加到microTUBE管，使用无核酶水稀释至总体积为55 μL，盖上管盖使用预设程序进行基因组打断。
4.根据权利要求2所述的基于二代测序探针捕获技术肿瘤微卫星不稳定检测试剂盒，其特征在于：所述S4进行第一步纯化反应，获得反应液C的具体步骤为：
S41:纯化磁珠提前在室温孵育30 min，使用之前vortex混匀;
S42:取80 ul纯化磁珠（样本：磁珠=1:0.8）加入至加接头的溶液中，vortex 30s，室温孵育10min;
S43:配置新鲜的75%乙醇;
S44:孵育后的混合液放置磁力架上，待上清液澄清后，将上清液倒出；
S45:加300 ul 75%乙醇，停留1 min，弃去，重复两次；
S46:离心，弃去残液，待磁珠干燥；
S47:加水18 ul洗脱磁珠上的DNA，室温孵育5 min，放置磁力架上，回收，继续下步操作。
5.根据权利要求2所述的基于二代测序探针捕获技术肿瘤微卫星不稳定检测试剂盒，其特征在于：所述S6进行第二步纯化反应，获得反应液E的具体步骤为：
S61：纯化磁珠提前在室温孵育30 min，使用之前vortex混匀；
S62：取50 ul纯化磁珠（样本：磁珠=1:1）加入至扩增文库的溶液中，vortex 30 s，室温孵育10 min；
S63：配置新鲜的75%乙醇；
S64：孵育后的混合液放置磁力架上，待上清澄清后，弃去；
S65：加300 ul 75%乙醇，停留1 min，弃去，重复两次；
S66：离心，弃去残液，待磁珠干燥；
S67：加18 ul水洗脱磁珠上的DNA，室温孵育5 min，放置磁力架上，回收，用于杂交反应。
6.根据权利要求2所述的基于二代测序探针捕获技术肿瘤微卫星不稳定检测试剂盒，其特征在于：所述S7进行杂交反应包括组分A和组分B；组分A包括S6中获得的15ul反应液E和4ul封闭剂，先加热到95℃进行反应混合5分钟，随后降至65度保温；组分B包括10ul杂交缓冲液、1ulRNA抑制剂和2ulRNA探针-定制，先预热到65℃保温5分钟后，加入到组分A中进行65℃保温反应24小时。
7.根据权利要求2所述的基于二代测序探针捕获技术肿瘤微卫星不稳定检测试剂盒，其特征在于：所述S8进行捕获反应，获得反应液G的具体步骤为：
S81：准备链霉亲和素磁珠，提前室温孵育30 min，用前混匀；
S82：每个样本用50 ul链霉亲和素磁珠，弃去上清；
S83：加入200 ul结合液至链霉亲和素磁珠，vortex混匀，然后放置磁力架上弃去；重复该步骤三次；
S84：加入200 ul 结合液至链霉亲和素磁珠，吹打混匀，重悬链霉亲和素磁珠；
S85：将杂交组分A+B的混合液加入至重悬的链霉亲和素磁珠中，室温孵育30 min，磁力架上去上清；
S86：加200 ul洗脱液1至S85中的链霉亲和素磁珠中，室温孵育15 min，磁力架上去上清；
S87：加200 ul洗脱液2至S86中的链霉亲和素磁珠中，65 ℃ 10 min，磁力架上去上清，重复四次；
S88：加入20 ul水至S87中，重悬链霉亲和素磁珠，作为扩增的样品。
8.根据权利要求2所述的基于二代测序探针捕获技术肿瘤微卫星不稳定检测试剂盒，其特征在于：所述S10进行第三步纯化反应，获得反应液J的具体步骤为：
S101：纯化磁珠提前在室温孵育30 min，使用之前vortex混匀；
S102：取50 ul纯化磁珠（样本：磁珠=1:1）加入至扩增文库的溶液中，vortex 30 s，室温孵育10 min；
S103：配置新鲜的75%乙醇；
S104：孵育后的混合液放置磁力架上，待上清澄清后，弃去；
S105：加300 ul 75%乙醇，停留1 min，弃去，重复两次；
S106：离心，弃去残液，待磁珠干燥
S107：加18 ul水洗脱磁珠上的DNA，室温孵育5 min，放置磁力架上，回收，上机。
9.根据权利要求2所述的基于二代测序探针捕获技术肿瘤微卫星不稳定检测试剂盒，其特征在于：所述S11质控品数据分析的具体步骤为：
S111：取1 ul文库，采用qubit或者qpcr进行定量；
S112：取1 ul文库，采用片段仪器等进行片段评估；
S113：经过一批批测序数据，优化探针的摩尔比例，调试部分位点的探针摩尔比例，最终呈现出探针覆盖均一性一致。
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-
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