CN116355987A - 制备基因突变参考品的方法、基因突变参考品及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种制备基因突变参考品的方法。所述方法包括：1)确定预定野生型基因样本和预定突变型基因样本中DNA的完整性；2)基于所述DNA的完整性，确定是否将预定野生型基因样本和预定突变型基因样本进行片段化处理；3)基于预定突变型基因样本中的预定基因的突变频率和基因突变参考品的预设基因突变频率，确定预定野生型基因样本和预定突变型基因样本的混合比例；4)基于混合比例，将预定野生型基因样本和预定突变型基因样本进行混合处理，获得基因突变参考品。该方法制备的参考品的偏差小，后续无需多次进行验证和调试，可减少验证周期和降低成本，具有制备方法简单和制备的参考品突变频率准确性高等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及一种制备基因突变参考品的方法、基因突变参考品及其用途。
背景技术
近年来，基因突变检测发展迅速，在肿瘤早期筛查、精准靶向用药和疾病监测等方面有重要的临床意义。国家药品监督管理局批准上市的靶向治疗药物有EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)如吉非替尼、阿法替尼、奥希替尼；ALK和ROS1抑制剂如克唑替尼；BRAF抑制剂达拉菲尼；MET抑制剂克唑替尼；HER2抑制剂曲妥珠单抗；RET抑制剂普拉替尼；PD-1抑制剂帕博利珠单抗等。还有多种肿瘤靶向治疗药物在开发中。与此同时，伴随诊断试剂盒的研发注册成为IVD领域的热门，目前基于高通量测序已获批了多种基因突变检测试剂盒。
在基因突变检测试剂盒研发中，需要配制各种基因突变类型和突变频率的参考品，用于验证试剂盒的准确性、最低检测限、精密度等性能。目前制备参考品的方法为选择基因突变频率较高的临床样本或者细胞系DNA与野生型基因组DNA按一定比例混合配制相应突变频率的参考品，但该参考品存在基因突变偏差大等问题，因此，亟需开发一种快速、准确的参考品制备方法。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种制备基因突变参考品的方法，该方法制备的基因突变参考品的突变频率与预设基因突变频率的偏差较小，具有准确度高等优点。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
目前普遍制备参考品的方法为选择基因突变频率较高的临床样本或者细胞系DNA与野生型基因组DNA按一定比例混合配制相应突变频率的参考品，如专利《一种制备基因突变参考品的方法》(申请号201910431817.7)。但是，这种参考品制备方法存在实际突变频率与预期偏差较大，需要多次采用二代测序或者数字PCR等方法对配制的参考品的突变频率进行验证和调试，增加了参考品制备的周期和费用。
并且，发明人在试验过程中意外发现，由于各样本中DNA的质量不同，野生型基因样本与突变型基因样本按比例混合制备的参考品，在高通量测序文库构建(后续实验的一个必要环节)过程中，不同质量的野生型基因样本与突变型基因样本中的DNA对片段化酶或者超声打断(后续高通量测序文库构建时所必须的步骤)的敏感性不同，导致两个样本中的DNA被片段化后的长度差异较大，在文库构建过程中不同长度的片段由于回收效率和酶反应率的差异，最终导致参考品的预定基因的实际检出突变频率与预设基因突变频率的偏差较大。
基于此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种制备基因突变参考品的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：1)确定预定野生型基因样本和预定突变型基因样本中DNA的完整性；2)基于所述预定野生型基因样本和预定突变型基因样本中DNA的完整性，确定是否将所述预定野生型基因样本和预定突变型基因样本进行片段化处理；3)基于所述预定突变型基因样本中的预定基因的突变频率和所述基因突变参考品的预设基因突变频率，确定所述预定野生型基因样本和预定突变型基因样本的混合比例；4)基于所述混合比例，将所述预定野生型基因样本和预定突变型基因样本进行混合处理，以便获得所述基因突变参考品。根据本发明实施例的方法制备的参考品的实际检出突变频率与预设基因突变频率偏差小，后续无需多次采用二代测序或者数字PCR等方法对配制的参考品的突变频率进行验证和调试，可减少验证周期和降低成本，且具有制备方法简单和制备的参考品突变频率准确性高等优点。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种基因突变参考品。根据本发明的实施例，所述基因突变参考品的预定基因的突变频率与预设基因突变频率的偏差不超过30％。本发明的基因突变参考品的偏差较少。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种前述的基因突变参考品在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测基因突变频率。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种检测基因突变的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：采用依据前述的方法制备的基因突变参考品或前述的基因突变参考品作为参考品对待测样品进行检测。由前所述，前述的制备基因突变参考品的方法制备的参考品具有偏差小和准确性高等优点，由此，采用该参考品检测待测样品的基因突变具有检测准确性高的优点。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为本发明实施例1中临床样本A的DNA浓度和片段大小；
图2为本发明实施例1中临床样本B的DNA浓度和片段大小。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
本发明提出了一种制备基因突变参考品的方法、基因突变参考品及其用途，下面将分别对其进行详细描述。
制备基因突变参考品的方法
在本发明的一个方面，本发明提出了一种制备基因突变参考品的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：1)确定预定野生型基因样本和预定突变型基因样本中DNA的完整性；2)基于所述预定野生型基因样本和预定突变型基因样本中DNA的完整性，确定是否将所述预定野生型基因样本和预定突变型基因样本进行片段化处理；3)基于所述预定突变型基因样本中的预定基因的突变频率和所述基因突变参考品的预设基因突变频率，确定所述预定野生型基因样本和预定突变型基因样本的混合比例；4)基于所述混合比例，将所述预定野生型基因样本和预定突变型基因样本进行混合处理，以便获得所述基因突变参考品。
发明人在制备基因突变参考品时，首次发现野生型基因样本和预定突变型基因样本中DNA的质量对制备的基因突变参考品(简称参考品)的实际检出突变频率与预设基因突变频率偏差(简称偏差)的影响。因此，根据本发明实施例的方法制备的参考品的实际检出突变频率与预设基因突变频率偏差小，后续无需多次采用二代测序或者数字PCR等方法对配制的参考品的突变频率进行验证和调试，可减少验证周期和降低成本，且具有制备方法简单和制备的参考品突变频率准确性高等优点。
根据本发明的实施例，所述野生型基因样本和预定突变型基因样本为基因组DNA。
根据本发明的实施例，在所述混合处理之前，将所述预定野生型基因样本和预定突变型基因样本进行片段化处理。
需要说明的是，所述预定野生型基因样本和预定突变型基因样本中DNA的完整性相差不高于1，优选相同，也可进行片段化处理，其也在本发明的保护范围内。
在本发明的一个优选实施例中，所述预定野生型基因样本和预定突变型基因样本中DNA的完整性相差高于1，在所述混合处理之前，将所述预定野生型基因样本和预定突变型基因样本进行片段化处理。本发明的方法通过先对DNA的完整性不一致的预定野生型基因样本和预定突变型基因样本分别进行片段化，再将预定野生型基因样本和预定突变型基因样本按比例混合，由此可减少参考品的突变频率偏差。
根据本发明的实施例，所述片段化处理是采用DNA片段化酶消化或超声打断法进行的。
需要说明的是，“DNA片段化酶”是指可对DNA进行片段化的酶，只要能够实现对DNA的片段化即可，具体不受限制。示例性地，可为VAHTS Universal Plus DNA Fragmentase。
根据本发明的实施例，所述混合处理之前进一步包括：将片段化处理产物进行筛选处理，以便得到包含预定长度片段的所述预定野生型基因样本和预定突变型基因样本。
根据本发明的实施例，所述筛选处理是采用磁珠筛选进行的。所述磁珠的类型具体不受限制，只要能够筛选出预定长度片段即可。
示例性地，所述“磁珠”可为NadPrep SP Beads磁珠。
需要说明的是，预定长度片段可根据发明人或使用者的需求进行调整，具体不受限制。示例性地，预定长度片段可为150-250bp的片段。
根据本发明的实施例，所述混合处理之前进一步包括：测定筛选处理产物的DNA浓度和DNA片段的大小。由此，可筛选出预定长度片段。
需要说明的是，测定筛选处理产物的DNA浓度和DNA片段的大小的方法可采用本领域常规方法，具体不受限制。例如，采用Qubit荧光计和Agilent 4200TapeStation分别测定筛选处理产物的DNA浓度和DNA片段的大小。
根据本发明的实施例，所述预定野生型基因样本和预定突变型基因样本中DNA的完整性相差不高于1，优选相同，确定所述DNA的完整性之后直接进行所述基于所述混合比例，将所述预定野生型基因样本和预定突变型基因样本进行混合处理。
根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：检测混合处理产物中的预定基因的突变频率。
根据本发明的实施例，基于所述混合处理产物中的预定基因的突变频率和所述基因突变参考品的预设基因突变频率的偏差，确定所述基因突变参考品。
根据本发明的实施例，所述混合处理产物中的预定基因的突变频率和所述基因突变参考品的预设基因突变频率的偏差不超过30％，是所述基因突变参考品为目标基因突变参考品的指示。
在本文中，术语“预定基因”是指待检测的目标突变基因。示例性地，预定基因为EGFR。
在本文中，术语“预设基因突变频率”、“预期基因突变频率”或“预期突变频率”是指参考品所需的预定基因的突变频率。示例性地，预设基因突变频率为5％、2.5％或1％。
根据本发明的实施例，所述偏差不超过20％。
根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：在确定所述混合比例之前，预先确定所述预定野生型基因样本的预定基因的突变频率。由此，以确保预定野生型基因样本的预定基因的突变频率为0。
根据本发明的实施例，所述预定突变型基因样本和预定野生型基因样本中的预定基因的突变频率是采用高通量测序法或数字PCR法进行确定的。
根据本发明的实施例，所述野生型基因样本和预定突变型基因样本来源于临床样本或者细胞系。
基因突变参考品
在本发明的另一方面，本发明提出了一种基因突变参考品。根据本发明的实施例，所述基因突变参考品的预定基因的突变频率与预设基因突变频率的偏差不超过30％。本发明的基因突变参考品的偏差较少。
根据本发明的实施例，所述偏差不超过20％。
根据本发明的实施例，所述基因突变参考品是依据前述的方法制备的。
制备试剂盒的用途
在本发明的又一方面，本发明提出了一种前述的基因突变参考品在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测基因突变频率。
检测基因突变的方法
在本发明的又一方面，本发明提出了一种检测基因突变的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：采用依据前述的方法制备的基因突变参考品或前述的基因突变参考品作为参考品对待测样品进行检测。由前所述，前述的制备基因突变参考品的方法制备的参考品具有偏差小和准确性高等优点，由此，采用该参考品检测待测样品的基因突变具有检测准确性高的优点。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：参考品的制备和验证
选取临床样本A和临床样本B，采用本发明的方法将临床样本A和临床样本B制备成EGFR突变频率为1％、2.5％和5％的多个参考品，具体制备方法如下所示：
1)采用常规方法分别提取临床样本A和临床样本B的DNA，分别获得突变型DNA和野生型DNA，用Qubit荧光计和Agilent 4200TapeStation分别对突变型DNA和野生型DNA的浓度和完整性进行检测，具体检测结果参见表1。
表1：突变型DNA和野生型DNA的浓度和完整性的检测结果
| 样本 | 浓度ng/μL | 完整性DIN |
| 临床样本A | 45.8 | 5.3 |
| 临床样本B | 62.2 | 6.7 |
2)采用NGS法确认突变型DNA和野生型DNA的突变类型和突变频率，具体检测结果参见表2。
表2：突变型DNA和野生型DNA的突变类型和突变频率的检测结果
| 样本 | 基因 | 突变类型 | 突变频率 |
| 临床样本A | EGFR | L858R | 38.4％ |
| 临床样本B | 野生型 | / | / |
3)用VAHTS Universal Plus DNA Fragmentase将突变型DNA和野生型DNA分别进行片段化处理，然后用NadPrep SP Beads磁珠筛选回收150-250bp范围内的片段。并用Qubit荧光计和Agilent 4200TapeStation测定回收后的DNA浓度和片段大小，具体的测定结果参见图1～2和表3。
表3：突变型DNA和野生型DNA的浓度和片段大小的检测结果
| 样本 | 浓度ng/μL | 片段大小bp |
| 临床样本A | 17.1 | 192 |
| 临床样本B | 13.5 | 205 |
4)分别将临床样本A的突变型DNA和临床样本B的野生型DNA稀释至10ng/μL，并按照表4的比例混合配制目标突变频率的参考品。
表4：不同参考品中临床样本A和临床样本B的配制比例
| 参考品 | 预期突变频率 | 临床样本A体积μL | 临床样本B体积μL | 总体积μL |
| 参考品1 | 5％ | 10 | 66.8 | 76.8 |
| 参考品2 | 2.5％ | 5 | 71.8 | 76.8 |
| 参考品3 | 1％ | 2 | 74.8 | 76.8 |
5)采用高通量测序法分别检测3例参考品的实际突变频率，并计算实际突变频率和预期突变频率的偏差，具体结果参见表5。
表5：不同参考品中的实际突变频率和偏差
| 参考品 | 预期突变频率 | 实际突变频率 | 绝对偏差 | 相对偏差 |
| 参考品1 | 5％ | 4.68％ | -0.32％ | 6.4％ |
| 参考品2 | 2.5％ | 2.7％ | 0.2％ | 8％ |
| 参考品3 | 1％ | 0.81％ | -0.19％ | 19％ |
此外，发明人采用本申请的方法，分别将多组(不少于10组)含有突变型DNA的临床样本和含有野生型DNA的临床样本进行实验制备成不同EGFR突变频率(1％、2.5％和5％)的参考品，得到的相对偏差均在20％以内。
实施例2：参考品的制备
选取临床样本E和临床样本F，采用本发明的方法将临床样本E和临床样本F制备成EGFR突变频率为1％、2.5％和5％的多个参考品，具体制备方法如下所示：
1)采用常规方法分别提取临床样本E和临床样本F的DNA，分别获得突变型DNA和野生型DNA，用Qubit荧光计和Agilent 4200 TapeStation分别对突变型DNA和野生型DNA的浓度和完整性进行检测，具体检测结果参见表6。
表6：突变型DNA和野生型DNA的浓度和完整性的检测结果
| 样本 | 浓度ng/μL | 完整性DIN |
| 临床样本E | 36.7 | 7.2 |
| 临床样本F | 49.1 | 7.8 |
2)采用NGS法确认突变型DNA和野生型DNA的突变类型和突变频率，具体检测结果参见表7。
表7：突变型DNA和野生型DNA的突变类型和突变频率的检测结果
| 样本 | 基因 | 突变类型 | 突变频率 |
| 临床样本E | EGFR | L858R | 24.5％ |
| 临床样本F | 野生型 | / | / |
3)分别将临床样本E的突变型DNA和临床样本F的野生型DNA稀释至10ng/μL，并按照表8的比例混合配制目标突变频率的参考品。
表8：不同参考品中临床样本E和临床样本F的配制比例
| 参考品 | 预期突变频率 | 临床样本E体积μL | 临床样本F体积μL | 总体积μL |
| 参考品1 | 5％ | 10 | 39 | 49 |
| 参考品2 | 2.5％ | 5 | 44 | 49 |
| 参考品3 | 1％ | 2 | 47 | 49 |
5)采用高通量测序法分别检测3例参考品的实际突变频率，并计算实际突变频率和预期突变频率的偏差，具体结果参见表9。
表9：不同参考品中的实际突变频率和偏差
| 参考品 | 预期突变频率 | 实际突变频率 | 绝对偏差 | 相对偏差 |
| 参考品1 | 5％ | 5.35％ | 0.35％ | 7％ |
| 参考品2 | 2.5％ | 2.63％ | 0.13％ | 5.2％ |
| 参考品3 | 1％ | 0.76％ | -0.24％ | 24％ |
此外，发明人采用本申请的方法，分别将多组(不少于10组)含有突变型DNA的临床样本和含有野生型DNA的临床样本进行实验制备成不同EGFR突变频率(1％、2.5％和5％)的参考品，得到的相对偏差均在25％以内。
对比例1：参考品的制备
采用常规方法将临床样本C和临床样本D制备成EGFR突变频率为1％、2.5％和5％的多个参考品，具体制备方法如下所示：
1)采用常规方法分别提取临床样本C和临床样本D的DNA，分别获得突变型DNA和野生型DNA，用Qubit荧光计和Agilent 4200TapeStation分别对突变型DNA和野生型DNA的浓度和完整性进行检测，具体检测结果参见表10。
表10：突变型DNA和野生型DNA的浓度和完整性的检测结果
| 样本 | 浓度ng/μL | 完整性DIN |
| 临床样本C | 45.8 | 4.7 |
| 临床样本D | 62.2 | 8.4 |
2)采用数字PCR法确认突变型DNA和野生型DNA的突变类型和突变频率，具体检测结果参见表11。
表11：突变型DNA和野生型DNA的突变类型和突变频率的检测结果
| 样本 | 基因 | 突变类型 | 突变频率 |
| 临床样本C | EGFR | L858R | 38.4 |
| 临床样本D | 野生型 | / | / |
3)分别将临床样本A的突变型DNA和临床样本D的野生型DNA稀释至10ng/μL，并按照表12的比例混合配制目标突变频率的参考品。
表12：不同参考品中临床样本C和临床样本D的配制比例
| 参考品 | 预期突变频率 | 临床样本C体积μL | 临床样本D体积μL | 总体积μL |
| 参考品1 | 5％ | 10 | 66.8 | 76.8 |
| 参考品2 | 2.5％ | 5 | 71.8 | 76.8 |
| 参考品3 | 1％ | 2 | 74.8 | 76.8 |
4)采用高通量测序法分别检测3例参考品的实际突变频率，并计算实际突变频率和预期突变频率的偏差，具体结果参见表13。
表13：不同参考品中的实际突变频率和偏差
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种制备基因突变参考品的方法，其特征在于，包括：
1)确定预定野生型基因样本和预定突变型基因样本中DNA的完整性；
2)基于所述预定野生型基因样本和预定突变型基因样本中DNA的完整性，确定是否将所述预定野生型基因样本和预定突变型基因样本进行片段化处理；
3)基于所述预定突变型基因样本中的预定基因的突变频率和所述基因突变参考品的预设基因突变频率，确定所述预定野生型基因样本和预定突变型基因样本的混合比例；
4)基于所述混合比例，将所述预定野生型基因样本和预定突变型基因样本进行混合处理，以便获得所述基因突变参考品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预定野生型基因样本和预定突变型基因样本中DNA的完整性相差高于1，在所述混合处理之前，将所述预定野生型基因样本和预定突变型基因样本进行片段化处理；
任选地，所述片段化处理是采用DNA片段化酶消化或超声打断法进行的。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述混合处理之前进一步包括：
将片段化处理产物进行筛选处理，以便得到包含预定长度片段的所述预定野生型基因样本和预定突变型基因样本；
任选地，所述筛选处理是采用磁珠筛选进行的；
任选地，所述混合处理之前进一步包括：
测定筛选处理产物的DNA浓度和DNA片段的大小。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预定野生型基因样本和预定突变型基因样本中DNA的完整性相差不高于1，优选相同，确定所述DNA的完整性之后直接进行所述基于所述混合比例，将所述预定野生型基因样本和预定突变型基因样本进行混合处理。
5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，进一步包括：
检测混合处理产物中的预定基因的突变频率；
任选地，基于所述混合处理产物中的预定基因的突变频率和所述基因突变参考品的预设基因突变频率的偏差，确定所述基因突变参考品；
任选地，所述混合处理产物中的预定基因的突变频率和所述基因突变参考品的预设基因突变频率的偏差不超过30％，是所述基因突变参考品为目标基因突变参考品的指示。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述偏差不超过20％。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述野生型基因样本和预定突变型基因样本为基因组DNA。
8.一种基因突变参考品，其特征在于，所述基因突变参考品的预定基因的突变频率与预设基因突变频率的偏差不超过30％，优选不超过20％；
任选地，所述基因突变参考品是依据权利要求1～7任一项所述的方法制备的。
9.权利要求8所述的基因突变参考品在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测基因突变频率。
10.一种检测基因突变的方法，其特征在于，包括：
采用依据权利要求1～7任一项所述的方法制备的基因突变参考品或权利要求8所述的基因突变参考品作为参考品对待测样品进行检测。
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