CN106084063B

CN106084063B - 一种基因工程重组trail融合蛋白及制备方法和用途

Info

Publication number: CN106084063B
Application number: CN201610356325.2A
Authority: CN
Inventors: 于彬; 于湘晖; 孔维; 闫晶怡; 王真
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2016-05-26
Filing date: 2016-05-26
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2036-05-26
Also published as: CN106084063A

Abstract

本发明公开了一种利用腺病毒纤维蛋白片段作为三聚体模序与TRAIL融合表达，获得稳定性和活性提高的重组蛋白，作为抗肿瘤治疗药物。还提供融合蛋白表达纯化及活性检测的方法。具体为：第一步；设计并构建融合基因，利用大肠杆菌系统低温诱导表达；第二步：采用镍柱亲和层析的方法纯化目的蛋白，利用凝血酶酶切位点切除His标签，获得最终目的蛋白；第三步：体外检测融合蛋白对肿瘤细胞的杀伤活性和对正常细胞的毒性，第四步：不同条件下检测融合蛋白的稳定性，第五步：裸鼠模型上检测融合蛋白的体内抗肿瘤活性。有益效果：发明了2个腺病毒纤维蛋白片段作为三聚体模序的TRAIL融合蛋白。提供了一种简单，快速的获得高稳定性TRAIL蛋白的方法，可应用于TRAIL蛋白的抗肿瘤研究和应用。解决了TRAIL蛋白稳定性差，活性低的弊端。

Description

一种基因工程重组TRAIL融合蛋白及制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白及制备方法和用途，特别涉及一种基因工程重组TRAIL融合蛋白及制备方法和用途。

背景技术

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)是TNF超家族一员，具有广谱抗癌的功能，且其对与正常的组织和细胞几乎是无毒的。有活性的TRAIL是三聚体状态，由三聚体中心的锌离子与各个单体上的半胱氨酸通过螯合作用维持。但TRAIL本身半衰期短、稳定性差、生物活性不强、并且有研究表明引入标签后可溶性TRAIL三聚体结构秩序会改变从而产生肝毒性。

发明内容

本发明的目的是为了解决TRAIL本身半衰期短、稳定性差以及生物活性不强的问题而提供的一种基因工程重组TRAIL融合蛋白及制备方法和用途。

本发明提供的基因工程重组TRAIL融合蛋白包含可溶性TRAIL蛋白片段和腺病毒纤维蛋白片段，其中可溶性TRAIL蛋白片段进一步选自N端截短94个氨基酸的人TRAIL蛋白，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明提供的基因工程重组TRAIL融合蛋白中包含的腺病毒纤维蛋白片段分别是人血清5型腺病毒和禽1型腺病毒纤维蛋白的Tail及Shaft片段，其包含的人血清5型腺病毒纤维蛋白片段的核酸序列如SEQ ID NO:3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，其包含的禽1型腺病毒纤维蛋白片段的核酸序列如SEQ ID NO:5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

本发明提供的基因工程重组TRAIL融合蛋白的制备方法，其方法如下所述：

步骤一、取工程菌接种于LB培养基，37℃摇菌培养至OD600达到0.2-1.2时，加入诱导剂(0.3-1.2mM IPTG)培养4-20h，诱导培养温度为20℃；

步骤二、收集菌体，裂解(用含有蛋白酶抑制剂的PBS重悬菌体沉淀，4℃超声破碎20min)，收集上清，分离纯化，切除标签，分离纯化采用镍柱亲和层析，其中洗涤液是含有50mM咪唑的基础液(NaH₂PO₄ 50mM；NaCl 500mM；pH＝8.0)，洗脱液是含有250mM咪唑的基础液，消化His标签是利用载体上的凝血酶位点，将纯化的蛋白与凝血酶混合1-18小时，混合比例为1mg蛋白使用1-100U凝血酶，混合条件为4℃。

本发明提供的基因工程重组TRAIL融合蛋白稳定性的检测方法:取具有相同杀伤活性融合蛋白，使用蛋白浓度为sTR:100nM,FA1FT:50nM,HA5ST:50nM，包括以下方法：

1)将蛋白样品置于缓冲体系中0h-24h，缓冲体系为4℃的PBS。

2)将蛋白样品置于缓冲体系中0h-24h，缓冲体系为37℃的PBS。

3)将蛋白样品置于血浆中0h-24h，血浆为37℃裸鼠血浆。

4)将蛋白样品反复冻融，冻融方法为循环置于37℃10min与-80℃10min。

本发明提供的基因工程重组TRAIL融合蛋白在肿瘤或癌症治疗中的应用。

本发明的有益效果：

本发明提供的基因工程重组TRAIL融合蛋白不依赖于锌原子的TRAIL三聚体，方法简单，纯度高，无肝肾毒性，具有较好的抗肿瘤或癌细胞活性。

附图说明

图1.基因工程重组TRAIL融合蛋白设计示意图。

图2.表达重组TRAIL融合蛋白的质粒鉴定结果。

图3.TRAIL融合蛋白诱导表达和纯化。

图4.TRAIL融合蛋白切除His标签鉴定图。

图5.切除标签后的TRAIL融合进行非还原性SDS-PAGE。

图6.不同浓度的TRAIL融合蛋白对多种肿瘤细胞的杀伤作用。

图7.不同浓度的TRAIL融合蛋白对正常细胞的杀伤作用。

图8.Annexin V/PI检测细胞凋亡。

图9.TRAIL融合蛋白的稳定性评价。

图10.腹腔注射原位注射TRAIL融合蛋白的抗肿瘤效果比较。

具体实施方式

本说明书和权利要求书所使用的缩写的含义如下所示：

本发明实施例中未说明来源的试剂和仪器均为普通市售品。

下面以具体的实施例，对本发明的技术方案做进一步的技术说明；但本发明并不限于这些实施例。

实施例1腺病毒Fiber-TRAIL融合蛋白原核表达载体的构建

1.目的基因的获得

以实验室保存的带有TRAIL基因的质粒pDC316-TRAIL(人源，aa95-281)为模板进行PCR，反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化PCR产物。用Vector NTI Suited 6软件根据Genebank提供的人TRAIL基因序列TRAIL引物如下：

上游引物序列：5’-GCTAGCATGACCTCTGAGGAAACCATTTCTAC-3’，含Nhe I酶切位点。

下游引物序列：5’-AAGCTTTTAGCCAACTAAAAAGGCCC-3’，含Hind IIl酶切位点。

2.表达载体的构建

以实验室存有的禽类1型腺病毒(Fowl Ad1)骨架质粒和上述获得的TRAIL基因为模板进行overlap-PCR，将Fowl Ad1基因的C端(包括tail基底蛋白和全长的shaft，不包括knob蛋白)与TRAIL的N端连接(如图1，左图)，用pfu高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，为方便将基因克隆入表达载体pET-28a，引物中添加相应的酶切位点。

上游引物：5’-GCTAGCATGGCTGACCAGAAAAGGAAGCTG-3’，含Nhe I酶切位点。

下游引物：5’-AAGCTTTTAGCCAACTAAAAAGGCCC-3’，含Hind III酶切位点。

融合蛋白Fowl Ad1 fiber sTR(FA1FT)的核酸编码序列如SEQ ID NO:9，氨基酸序列如SEQ ID NO:10。

以实验室存有的人类5型腺病毒(Human Ad5)骨架质粒和上述获得的TRAIL基因为模板进行overlap-PCR，将Human Ad5的N端shaft(只包含Shaft的C端一个螺旋，不包含knob)与TRAIL的N端连接(如图1)，用pfu高保真DNA聚合酶进行PCR扩增。

上游引物：5’-GCTAGCATGGGTGCCATTACAGTAGGAAAC-3’，含Nhe I酶切位点。

下游引物：5’-AAGCTTTTAGCCAACTAAAAAGGCCC-3’，含Hind IIl酶切位点。

融合蛋白Human Ad5 fiber sTR(HA5ST)的核算编码序列如SEQ ID NO:7，氨基酸序列如SEQ ID NO:8。

将上述FA1FT和HA5ST的PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定(图1)。PCR产物用琼脂糖胶回收试剂盒(TAKARA)回收，与平末端载体Peasy(北京全式金)连接，经测序正确后，利用Nhe I和Hind III酶切位点，将融合基因进行双酶切，用琼脂糖胶回收试剂盒回收DNA片段，再与经同样双酶切的pET28-a载体相连接，链接产物转化至DH5α感受态细胞，通过卡纳抗性筛选和质粒双酶切鉴定(图2)，阳性克隆进一步通过DNA序列分析进行验证，坚定正确的质粒分别命名为pET-28a-sTR、pET-28a-FA1FT、pET-28a-HA5ST。

实施例2腺病毒Fiber-TRAIL融合蛋白原核表达载体的构建

1.原核表达

将上述3个原核表达质粒分别转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(大连宝生物)，涂于含有卡纳青霉素(100ug/ml)的LB固体培养基上，置于37℃恒温箱中过夜培养。在上述平板中挑取单菌落，接于10mL LB液体培养基中过夜培养。将得到的菌液接种于1L LB液体培养基中，37℃振荡大量培养。菌体的OD600值达到0.8时，加入终浓度1mmol/L的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，北京鼎国)，20℃诱导表达16小时。诱导前和诱导后的菌体留样进行SDS-PAGE电泳，如图3。

2.蛋白纯化

将大量诱导后菌体在4℃下，以4000rpm离心30min收菌，超声破碎20min，在4℃下，以12000rpm离心30min得上清、沉淀，分别取样电泳。上清经0.22μm滤膜过滤后，进行镍离子亲和柱(美国Invitrogen)纯化。先以基础液(NaH₂PO₄ 50mM；NaCl 500mM；pH＝8.0)平衡镍离子亲和柱，再将滤后上清液挂柱。然后用基础液、含50mM咪唑的基础液、含250mM咪唑的基础液、含300mM咪唑的基础液依次进行洗脱2个柱体积。每个梯度用1.5mL Ep管接样10个EP管(每管1mL)。再用基础液和双蒸水分别洗2个柱体积，然后以20％乙醇洗一个柱体积，20％乙醇封柱，4℃保存，取0.5mg/ml的纯化后样品进行SDS-PAGE电泳，鉴定浓缩后蛋白纯度较高(图3)还原性SDS-PAGE电泳：向30μL收获的蛋白样品中加入10μL 4×上样缓冲液(0.35MTris-HCl(PH＝6.8)，30％甘油，10％SDS，0.012％溴酚蓝，6％β-巯基乙醇)，充分混匀，100℃煮沸20min后，4℃12000×g，离心10min，取20μL离心上清加载至13.5％SDS-PAGE凝胶中，120V电泳1.5h。

表1.重组TRAIL蛋白单体分子质量的理论值与电泳结果比较

重组TRAIL蛋白	分子量理论值	电泳结果
			FA1FT	43.48kDa	～44kDa
HA5ST	23.04kDa	～23kDa

切除His标签：将纯化后的蛋白浓缩除去咪唑，然后按照酶：蛋白＝10U：1mg的比例加入凝血酶(经科化学)，4℃搅拌12h。再利用镍柱与His标签的亲和性除去切下来的片段。切除标签后的蛋白进行western blot，分别使用TRAIL抗体和His标签抗体鉴定，anti-TRAIL的结果显示，切除标签的重组TRAIL蛋白分子量略有减小，蛋白有约20％的损失。antiHis的结果显示，凝血酶处理后的蛋白不能被染出条带，证明成功去除标签，结果如图4。为了更好的保护未经修饰重组TRAIL蛋白，即sTR的稳定性及活性，在最终得到的sTR蛋白样品中，加入ZnCl₂加入比例为0.46mol锌/mol蛋白，同时为了避免蛋白发生高聚，每组蛋白样品中加入1mM DTT。

除标签后的融合蛋白进行非还原性GDS-PAGE电泳鉴定Fiber-TRAIL融合蛋白在溶液中呈三聚体状态(图5)。非还原性SDS-PAGE电泳：向30μL收获的蛋白样品中加入10μL 4×非还原性上样缓冲液(0.35M Tris-HCl(PH＝6.8)，30％甘油，10％SDS，0.012％溴酚蓝)，充分混匀，4℃，12000×g，离心10min，取20μL离心上清加载至13.5％SDS-PAGE凝胶中，120V电泳1.5h。

实施例3 Fiber-TRAIL融合蛋白对肿瘤细胞杀伤作用的检测

肿瘤细胞株：

乳腺癌细胞：ZR-75-30，MCF7；肺癌细胞：A549；肝癌细胞：SMMC-7721；结肠癌细胞：SW480；宫颈癌细胞：Hela；乳腺正常细胞：MCF-10A；肝正常细胞：Chang Liver。

1)FA1FT和HA5ST对肿瘤细胞的杀伤作用

实验方法：细胞培养在含10％小牛血清的，100μg/ml链霉素和100U/ml青霉素的培养基中，37℃，5％CO₂条件下培养。将1×10⁴个细胞接种于96孔板中，贴壁过夜，然后将培养基换为含2％小牛血清的培养基，加入不同浓度梯度(0.01，0.1，1，10和100nM)的实例2中获得的融合蛋白。作用过夜后，加入20μl的MTT溶液，反应4小时后，弃去上清液，加入150μl的DMSO溶解沉淀，然后用酶标仪测定490nm吸光值。以未经过蛋白处理的细胞存活率为100％来计算蛋白处理的细胞存活率。

实验结果：如图6所示，随着蛋白浓度提高，FA1FT和HA5ST对肿瘤细胞的杀伤能力逐渐增强，细胞存活率降低。ZR-75-30，SMMC-7721，Hela三种细胞对融合TRAIL蛋白均较敏感，当蛋白浓度为1～10nM时，细胞存活率在50％左右。MCF-7，A549，SW480，对FA1FT和HA5ST的敏感性稍弱，当蛋白浓度为10～100nM时，细胞存活率在50％左右。正常肝细胞，乳腺细胞对蛋白不敏感，即使蛋白浓度达到100nM时，细胞存活率仍然在90％以上。

这些结果表明，FA1FT和HA5ST可以选择性的杀伤肿瘤细胞，如乳腺癌，肺癌，肝癌细胞，结肠癌，宫颈癌，而对正常细胞无毒性(图7)。

2)FA1FT和HA5ST对肿瘤细胞的杀伤途径的检测

实验方法：取对数生长期的ZR-75-30细胞，调整细胞悬液浓度为5×10⁵/ml，以每孔2ml铺6孔板，过夜培养。调整蛋白样品终浓度为10nM，37℃，5％CO₂培养4h；胰酶消化细胞。用1ml预冷的PBS重悬细胞。用100～500μl的Annexin-V(FITC)/PI试剂盒中的1×Bidingbuffer重悬，300目纱网过滤后上机检测。

实验结果：如图8所示，10nM的FA1FT组中，有61.3％的细胞进入凋亡状态，HA5ST组中有66.8％的细胞进入凋亡状态，是sTR组(34.1％)的2倍。

综上，本发明通过对肿瘤细胞和正常细胞的存活率检测，FA1FT和HA5ST对肿瘤细胞的杀伤活性是在凋亡水平实现的，并未导致细胞坏死。

实施例4 Fiber-TRAIL融合蛋白体外稳定性检测

1)FA1FT和HA5ST在PBS中的稳定性

实验方法：取具有相同杀伤能力的各组蛋白作为起始点。即：sTR(100nM)，FA1FT(50nM)，HA5ST(50nM)。将各组蛋白用PBS稀释，放置于4℃或37℃环境中，在不同时间点取样进行MTT实验，检测剩余活性。

实验结果：如图9所示，37℃环境下，未经改造的sTR在2h时已经完全丧失了活性，4℃环境中逐渐丧失活性。而FA1FT和HA5ST对ZR-75-30细胞的杀伤能力在24h内一直维持稳定，几乎没有损失，与sTR相比有显著性差异(*，P<0.1；**，P<0.01；***，P<0.001)。

2)FA1FT和HA5ST在血浆中的稳定性

实验方法：将各组蛋白与裸鼠血浆混合孵育，置于37℃环境中，在不同时间点取样进行剩余活性的检测。

实验结果：如图9所示，在37℃血浆环境中，sTR在0.5h是活性降低一半，1h已经丧失全部杀伤活性。FA1FT和HA5ST的杀伤能力在6h内维持稳定，随后蛋白活性逐渐降低，但在24h时仍具有40％的杀伤力，与sTR相比有显著性差异。

3)FA1FT和HA5ST反复冻融后的稳定性

实验方法：将FA1FT和HA5ST融合蛋白分别置于-80℃和37℃反复冻融，取不同冻融次数的蛋白样品进行剩余活性的检测。

实验结果：如图9所示，sTR在一次冻融后就失去三聚体构象，不能诱导ZR-75-30细胞凋亡。虽然FA1FT和HA5ST随冻融次数的增加逐渐失去杀伤活性，与sTR比较，在稳定性上仍然有显著性差异(*，P<0.1；**，P<0.01；***，P<0.001)。

实施例5Fiber-TRAIL融合蛋白(实施例2制备)体内抗肿瘤检测

1)腹腔注射FA1FT和HA5ST的抗肿瘤效果

实验方法：收集生长状态良好的ZR-75-30细胞，离心除去培养基，无菌PBS洗涤两次，最后用适量的预冷的PBS重悬细胞，使细胞数为1×10⁷个/ml，冰上暂存。选7周龄的BALB/c雌性裸鼠，在背部右后处皮下注入100μl的ZR-75-30细胞，1×10⁶个/ml。约14天，肿瘤体积长到约150mm³时，腹腔给药，0.1nmol/只，连续注射8天。对照组注射相同体积的PBS，每天记录瘤体积。以治疗第1天的初始瘤体积为100％，计算每组每只鼠的相对瘤体积为纵坐标。(每组8只鼠。*,P<0.1；**,P<0.01；***,P<0.001)。

结果如图10，PBS组肿瘤迅速增长，在成瘤后第12天，相对瘤体积已经超过2000，相比于sTR，HA5ST能够有效抑制肿瘤生长，在开始治疗后第24天，sTR组相对瘤体积在1409±200，HA5ST组相对瘤体积在199％±30％，FA1FT组相对瘤体积在第13天时，相对瘤体积达到1586％±300％。

2)原位注射FA1FT和HA5ST的抗肿瘤效果

实验方法：选7周龄的BALB/c雌性裸鼠，在背部右后处皮下注入100μl的ZR-75-30细胞，1×10⁶个/ml。约14天，肿瘤体积长到约400mm³时，原位注射蛋白，注入体积不超过50μl，0.5nmol/只，连续注射8天。对照组注射相同体积的PBS，每天记录瘤体积。以治疗第1天的初始瘤体积为100％，计算每组每只鼠的相对瘤体积为纵坐标。(每组8只鼠。*,P<0.1；**,P<0.01；***,P<0.001)。

结果如图10，PBS组在成瘤后第9天，相对瘤体积超过平均值在405％，治疗结束时sTR组相对瘤体积平均值在200％，FA1FT组相对瘤体积平均值在134％

综上，本发明成功获得了腺病毒fiber-TRAIL融合蛋白，其三聚体构象的维持不依赖于结构中心的锌离子，与天然的可溶性TRAIL蛋白相比，其稳定性显著提升，体内外抗肿瘤活性也显著增强，并且没有对正常组织细胞造成毒性。

SEQUENCE LISTING

<110>吉林大学

<120>一种基因工程重组TRAIL融合蛋白及制备方法和用途

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 564

<212> DNA

<213> TRAIL(95-281)

<400> 1

1 acctctgagg aaaccatttc tacagttcaa gaaaagcaac aaaatatttc tcccctagtg

61 agagaaagag gtcctcagag agtagcagct cacataactg ggaccagagg aagaagcaac

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301 gaaataaaag aaaacacaaa gaacgacaaa caaatggtcc aatatattta caaatacaca

361 agttatcctg accctatatt gttgatgaaa agtgctagaa atagttgttg gtctaaagat

421 gcagaatatg gactctattc catctatcaa gggggaatat ttgagcttaa ggaaaatgac

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<210> 2

<211> 187

<212> PRT

<213> TRAIL(95-281)

<400> 2

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<212> DNA

<213> HA5S

<400> 3

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<210> 4

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<212> PRT

<213> HA5S

<400> 4

MGAITVGNKNNDKLT

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<212> DNA

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<210> 10

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Claims

1.一种基因工程重组TRAIL融合蛋白，其特征在于：人TRAIL可溶性胞外区TRAIL_95-281融合了人血清5型腺病毒(Ad5)纤维蛋白片段序列，该重组TRAIL融合蛋白的氨基酸序列为：SEQ ID NO:8；或人TRAIL可溶性胞外区TRAIL_95-281融合了禽1型腺病毒(FAd1)纤维蛋白片段序列，该重组TRAIL融合蛋白的氨基酸序列为：SEQ ID NO:10。

2.权利要求1所述的基因工程重组TRAIL融合蛋白，其中所述腺病毒纤维蛋白序列分别选自Ad5的C末端最后一个shaft和FAd1完整的tail和shaft。

3.权利要求2所述基因工程重组TRAIL融合蛋白的制备方法，包括原核表达、纯化和切除His标签。

4.权利要求1-2任意一项所述的基因工程重组TRAIL融合蛋白在制备癌症治疗药物中的用途。