CN101671690B - 含日本血吸虫基因的重组表达载体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种含日本血吸虫基因的重组表达载体，所述基因是日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II基因。本发明还公开了日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II的制备方法及上述重组表达载体的应用。本发明的含日本血吸虫基因的重组表达载体，能够高表达日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II，该高表达的重组日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II能诱导小鼠产生一定水平的抗日本血吸虫感染的保护作用。

Description

含日本血吸虫基因的重组表达载体及应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种含日本血吸虫基因的重组表达载体及应用。

背景技术

血吸虫病是一种广泛流行于热带与亚热带地区的人兽共患寄生虫病，所引发的病原体是血吸虫，我国主要受日本血吸虫的危害。日本血吸虫的生活周期复杂，包括在终末宿主体内的有性世代和在中间宿主体内的无性世代的交替。其终末宿主主要包括人、牛、羊、猪、兔等多种哺乳动物，虫体即吸附在其门静脉和肠系膜静脉的内壁上。宿主的血液处于一种有氧呼吸的环境，而虫体要实现其长期寄生，必然有一套克服氧自由基所带来的损害的机制，其中抗氧化酶的作用至关重要，硫氧还蛋白过氧化物酶家族(thioredoxin peroxindasesfamily)即是其中的一类。

硫氧还蛋白过氧化物酶家族在多种细胞功能中发挥重要作用，如抗氧化损伤保护蛋白和脂质，细胞增殖、分化，调节凋亡过程中细胞内信号传导等。增加细胞内抗氧化酶水平可抑制凋亡。硫氧还蛋白过氧化物酶家族是红细胞中主要的抗氧化剂，并且介导早期红细胞系的分化。该家族所包含的一类过氧化物酶，能够利用其活性半胱氨酸残基清除过氧化物及羟基。根据氨基酸序列的差异，硫氧还蛋白过氧化物酶家族有六个亚型，并被分为两大亚家族。亚家族一含有两个保守性半胱氨酸残基，包括I、II、III、IV四个亚型，亚家族二拥有一个保守性半胱氨酸残基，包括V和VI两个亚型。目前研究表明，硫氧还蛋白过氧化物酶II(tpII)具有硫氧还蛋白依赖的过氧化物酶活性，能够抑制细胞凋亡，与细胞膜结合，与红细胞中钙离子激活的钾离子转运相关。

另有研究表明，硫氧还蛋白过氧化物酶II富集于日本血吸虫的皮质层，而皮质层是虫体与宿主环境直接发生相互作用的表面结构，推测该酶在维系皮质层膜结构的稳定以及拮抗药物作用方面起重要作用。

疫苗是控制传染性疾病的有效手段，也是血吸虫病综合防治的重要措施之一，世界卫生组织专家认为，短效的化疗手段必须与长效的疫苗措施相结合。尽管目前所有实验性血吸虫病疫苗在免疫后均只能诱导出对血吸虫感染部分抵抗力，但由于血吸虫在其终宿主体内不繁殖，故对控制血吸虫病仍有重要的生物学与临床意义。寻找新的疫苗候选抗原仍是当今血吸虫疫苗研究的重点之一。

到目前为止，还没有出现关于本发明日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II作为疫苗应用的研究报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种含日本血吸虫基因的重组表达载体，该重组载体表达的日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II可作为抗血吸虫的疫苗候选抗原。

此外，还需要提供一种含日本血吸虫基因的重组表达载体在制备预防或治疗血吸虫病的疫苗中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

在本发明的一个方面，提供了一种含日本血吸虫基因的重组表达载体，所述基因是日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II基因。

优选的，所述日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II基因序列是编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的核苷酸序列；更优选的，该日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II基因序列为SEQ IDNO：2所示核苷酸序列。

优选的，所述表达载体为原核表达载体；更优选的，所述表达载体为原核表达载体pET28a(+)。

在本发明的另一方面，提供了一种包含上述重组表达载体的大肠杆菌宿主细胞。

在本发明的另一方面，还提供了一种日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II的制备方法，包括以下步骤：

构建含日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II基因的重组表达载体；

将所述重组表达载体转化入大肠杆菌宿主细胞；

培养包含重组表达载体的大肠杆菌宿主细胞，并在合适条件下，诱导该重组表达载体表达日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II；

纯化诱导表达的日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II。

优选的，所述诱导表达的日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II还连接有包含6个组氨酸的标签序列。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述重组表达载体在制备预防或治疗血吸虫病的疫苗中的应用。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述重组表达载体在制备诊断血吸虫病的产品中的应用。

本发明重组载体表达的日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II可以作为诊断抗原对血吸虫病畜进行诊断。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述制备方法生产的日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II作为预防或治疗血吸虫病疫苗的用途。

本发明含日本血吸虫基因的重组表达载体，能够高表达日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II，该高表达的重组日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II在小鼠免疫性保护实验中，使免疫组小鼠的减虫率与肝组织减卵率分别达到29.37％和25.54％，表明本发明重组日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II能诱导小鼠产生一定水平的抗日本血吸虫感染保护作用。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例1重组质粒的酶切与PCR鉴定图；

图2是本发明实施例2重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)后经IPTG诱导表达结果图；

图3是本发明实施例3重组日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II表达形式的鉴定与纯化图。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明利用重组DNA技术将日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II(tpII)基因的编码序列克隆至原核表达载体，并使其在大肠杆菌中大量表达，且纯化得到其表达产物。纯化产物可应用于小鼠免疫保护实验，以评估其抗血吸虫的保护效果，为抗血吸虫病疫苗分子的筛选提供重要的参考价值。

实施例1日本血吸虫tpII基因编码序列原核表达载体的构建

查找日本血吸虫tpII基因在Genebank中的序列设计引物，用DNAstar分析其序列特征，并找到其最大的开放阅读框(SEQ ID NO：2)，即其编码蛋白质的序列部分，根据这一部分序列设计引物如下：

Sense：5’-GGCGGATCCATGAAGTGTTTAAATTCG-3’(SEQ ID NO：3)，

Anti-sense：5’-GGCCTCGAGGTTTACAGAGGAAAAGTACG-3’(SEQ ID NO：4)，

分别引入限制性内切酶BamH I和Xho I酶切位点(下划线部分)。TpII开放阅读框的扩增以日本血吸虫雌虫cDNA文库为模板进行PCR。采用的原核表达载体pET28a(+)为表达6×His标签的高效表达载体，该载体设计有多克隆酶切位点，可以插入外源基因片段tpII基因编码序列。将扩增tpII基因编码序列的PCR产物经胶回收、双酶切后，与同样双酶切的质粒pET28a(+)于16℃连接过夜，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，均匀涂布于含有卡那霉素(100ug/ml)的LB平板上。挑取单一菌落扩大培养，提取质粒，进行PCR及单、双酶切鉴定，将初步鉴定正确的阳性克隆菌液进行测序。

图1为重组质粒SjtpII-pET28a(+)的酶切与PCR鉴定图，图1中，M1：DNA标志物(DL15000)；1：重组质粒BamH I单酶切鉴定；2：重组质粒BamH I、Xhol I双酶切鉴定；3：重组质粒PCR鉴定；M2：DNA标志物(DL2000)。从图1可以看出，在“2”、“3”泳道都有明显的681bp大小的tpII条带，表明经PCR扩增出的tpII基因片段，成功地插入了原核表达载体pET28a(+)的多克隆酶切位点。

重组质粒DNA经测序得知，重组质粒中插入片段的序列与Genebank中公布的日本血吸虫SJCHGC00794蛋白mRNA完整编码区完全一致，达到100％的吻合度，且与曼氏血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II的mRNA也有94％的吻合度，可以证明本发明成功地将日本血吸虫tpII的编码序列插入了原核表达载体，且插入方向正确。

实施例2日本血吸虫tpII基因原核表达载体的诱导表达

将测序正确的阳性克隆的质粒SjtpII-pET28a(+)转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含有卡那霉素的LB平板上，挑取单一菌落，鉴定正确后接种于液体LB培养基中，待达到对数生长期后，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，终浓度为1mM/L)进行诱导表达，分别收集诱导前及诱导后1h、2h、4h、6h及8h的菌液，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE电泳，5％浓缩胶80V电压，12％分离胶120V电压)分析验证。

结果如图2所示，在图2中，M：蛋白质标志物；1：未诱导的菌液；2：诱导后1h；3：诱导后2h；4：诱导后4h；5：诱导后6h；6：诱导后8h。从图2可以看出，诱导前及诱导后各时相，经过SDS-PAGE，其中1条带随着诱导时间的延长而增宽，8h达最大，该条带与目的蛋白大小Mr30000Da相近(日本血吸虫tpII基因所编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：1所示，其相对分子质量约为25000Da，表达出的产物为包含有部分载体序列的6个组氨酸标签和插入片段SjtpII基因所编码的蛋白质的融合体rSjtpII，该融合体蛋白的相对分子质量约为30000Da)。可以证实，重组质粒在大肠杆菌当中获得了高水平的表达。

实施例3原核表达载体表达产物的纯化

小量诱导重组菌(100ml)，4℃，4000rpm离心15min，收集菌体沉淀，用PBS洗涤后，加入1×结合缓冲液(binding buffer)重悬菌体，反复冻融3次后，超声破碎细胞。将超声后的悬液于4℃，12000rpm，离心30min，分别收集上清和沉淀鉴定其表达形式。由图3可知，重组质粒的表达产物出现在超声后的沉淀中，说明其表达形式为包涵体。在图3中，1：超声后的上清；2：超声后的沉淀；3：纯化后的蛋白。

利用重组表达的融合体蛋白中的组氨酸和镍离子的亲和性可将该融合体蛋白加以纯化，纯化步骤按照Novagen His-tag纯化手册进行。

将沉淀用含6M尿素的1×结合缓冲液溶解，4℃，12000rpm，离心30min，收集上清。用His·Bind树脂纯化表达产物。具体操作如下：

(1)将400μL树脂悬液加入到1.5mL离心管中，低速离心后除去上清。

(2)按以下顺序和次数进行树脂的离子化和平衡。

a.2倍体积灭菌去离子水，2次

b.2倍体积1×离子化缓冲液(charge buffer)，3次

c.2倍体积1×结合缓冲液，2次

(3)加入前述用尿素溶解后的上清，轻柔混匀，孵育5min，2000rpm，离心5min，弃上清。

(4)3倍体积1×结合缓冲液清洗树脂3次。

(5)3倍体积1×冲洗缓冲液(washing buffer)清洗树脂3次。

(6)1倍体积1×洗脱缓冲液(stripping buffer)将目的蛋白从树脂上剥离下来。

由图3可知，表达产物rSjtpII得到了纯化(见图3第“3”泳道箭头所指的条带)，且纯度较高。

实施例4纯化后表达产物对小鼠的免疫

将6周龄雄性BALB/c小鼠分为两组(实验组和对照组)，每组10只。首次免疫按每只小鼠100μg纯化后的日本血吸虫tpII(rSjtpII)与206佐剂混合的乳剂，皮下注射。每隔14天同样剂量进行第二次和第三次免疫。用PBS与206佐剂的混合乳剂以同样方法处理对照组小鼠。

第三次免疫一周后，每只小鼠攻击日本血吸虫尾蚴40条。

感染后42天将两组小鼠剖杀，肝门静脉冲虫，计算减虫率。同时每只小鼠取0.5g肝脏，匀浆后，经氢氧化钾消化后进行肝组织虫卵计数，计算减卵率。通过对减虫率与减卵率的分析，评估本发明重组日本血吸虫tpII蛋白作为抗原的免疫保护效果。

减虫率＝(1-免疫组平均虫荷数/对照组平均虫荷数)×100％

减卵率＝(1-免疫组平均卵荷数/对照组平均卵荷数)×100％

结果如下表1所示，rSjtpII实验组的减虫率与减卵率分别为29.37％和25.54％，表明rSjtpII能诱导小鼠产生一定水平的抗日本血吸虫感染保护作用，本发明重组抗原rSjtpII具有一定的免疫保护效果。

表1 rSjtpII免疫小鼠的减虫率和减卵率

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>中国农业科学院上海兽医研究所

<120>含日本血吸虫基因的重组表达载体及应用

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>226

<212>PRT

<213>Schistosoma japonicum

<400>1

Met Lys Cys Leu Asn Ser Glu Pro Phe Phe Ile Val Ser Leu Leu Ser

1               5                   10                  15

Ile Ile Ser Ser Ile Ser Ser Gln Ser Glu Ser Val Asn Arg Thr Asn

            20                  25                  30

Met Leu Leu Pro Asn Gln Pro Ala Pro Asp Phe Glu Gly Thr Ala Val

        35                  40                  45

Ile Gly Thr Glu Phe His Pro Ile Thr Leu Arg Gln Phe Arg Gly Ser

    50                  55                  60

Tyr Val Leu Leu Val Phe Tyr Pro Leu Asp Phe Thr Phe Val Cys Pro

65                  70                  75                  80

Thr Glu Leu Ile Ala Phe Ser Glu Arg Ala Ala Glu Phe Lys Ser Arg

                85                  90                  95

Gly Cys Gln Val Ile Ala Cys Ser Thr Asp Ser Ile Tyr Ser His Leu

            100                 105                 110

Ala Trp Thr Lys Leu Asp Arg Lys Ala Gly Gly Leu Gly Gln Met Asn

        115                 120                 125

Ile Pro Leu Leu Ser Asp Lys Asn Leu Lys Ile Ser Arg Ala Tyr Gly

    130                 135                 140

Val Leu Asp Glu Glu Glu Gly His Ala Phe Arg Gly Met Phe Leu Ile

145                 150                 155                 160

Asp Pro Asn Gly Val Leu Arg Gln Ile Thr Val Asn Asp Arg Pro Val

                165                 170                 175

Gly Arg Ser Val Asp Glu Ala Ile Arg Leu Leu Asp Ala Phe Ile Phe

            180                 185                 190

Phe Glu Lys Asn Gly Glu Val Cys Pro Ala Asn Trp Lys Pro Lys Ser

        195                 200                 205

Ala Thr Ile Lys Pro Asp Pro Thr Ala Ala Leu Ser Tyr Phe Ser Ser

    210                 215                 220

Val Asn

225

<210>2

<211>681

<212>DNA

<213>Schistosoma japonicum

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(681)

<400>2

atg aag tgt tta aat tcg gag cca ttt ttc atc gtc tca ttg ttg tca    48

Met Lys Cys Leu Asn Ser Glu Pro Phe Phe Ile Val Ser Leu Leu Ser

1               5                   10                  15

ata att tcc tcg att tca agt cag tca gag tca gtt aat cgg aca aat    96

Ile Ile Ser Ser Ile Ser Ser Gln Ser Glu Ser Val Asn Arg Thr Asn

            20                  25                  30

atg ttg ttg cca aat caa cct gct ccc gat ttt gaa ggt aca gct gtt    144

Met Leu Leu Pro Asn Gln Pro Ala Pro Asp Phe Glu Gly Thr Ala Val

        35                  40                  45

att gga aca gaa ttc cat cca att acc ttg cgt cag ttt cgc ggg agt    192

Ile Gly Thr Glu Phe His Pro Ile Thr Leu Arg Gln Phe Arg Gly Ser

    50                  55                  60

tat gtg tta ttg gta ttt tat cca ctt gac ttc acg ttt gtt tgc cca    240

Tyr Val Leu Leu Val Phe Tyr Pro Leu Asp Phe Thr Phe Val Cys Pro

65                  70                  75                  80

act gag ctg att gcg ttt agt gaa aga gct gcg gaa ttc aag tcc aga    288

Thr Glu Leu Ile Ala Phe Ser Glu Arg Ala Ala Glu Phe Lys Ser Arg

                85                  90                  95

ggt tgt caa gtg att gca tgc tca act gat tcg att tat tca cat ctg    336

Gly Cys Gln Val Ile Ala Cys Ser Thr Asp Ser Ile Tyr Ser His Leu

            100                 105                 110

gca tgg aca aaa tta gat cga aaa gct ggt gga tta gga caa atg aat    384

Ala Trp Thr Lys Leu Asp Arg Lys Ala Gly Gly Leu Gly Gln Met Asn

        115                 120                 125

ata cct ctg ctt tca gac aaa aat ttg aaa ata tca cga gct tac gga    432

Ile Pro Leu Leu Ser Asp Lys Asn Leu Lys Ile Ser Arg Ala Tyr Gly

    130                 135                 140

gtt ctt gat gaa gaa gag ggt cat gca ttc aga ggg atg ttc ctc att    480

Val Leu Asp Glu Glu Glu Gly His Ala Phe Arg Gly Met Phe Leu Ile

145                 150                 155                 160

gat cct aat ggt gtt tta cgt cag att acc gtt aac gat cgc ccc gta    528

Asp Pro Asn Gly Val Leu Arg Gln Ile Thr Val Asn Asp Arg Pro Val

                165                 170                 175

ggg aga tca gtt gat gag gcg att cgt ctt ctg gat gct ttc att ttc    576

Gly Arg Ser Val Asp Glu Ala Ile Arg Leu Leu Asp Ala Phe Ile Phe

            180                 185                 190

ttc gag aaa aac ggt gaa gtt tgt cca gca aat tgg aaa cca aag tcg    624

Phe Glu Lys Asn Gly Glu Val Cys Pro Ala Asn Trp Lys Pro Lys Ser

        195                 200                 205

gca aca ata aaa cct gat cct aca gct gct ctc tcg tac ttt tcc tct    672

Ala Thr Ile Lys Pro Asp Pro Thr Ala Ala Leu Ser Tyr Phe Ser Ser

    210                 215                 220

gta aac tga                                  681

Val Asn

225

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(27)

<223>引物

<220>

<221>misc_signal

<222>(4)..(9)

<223>BamH I酶切位点

<400>3

ggcggatcca tgaagtgttt aaattcg                27

<210>4

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(29)

<223>引物

<220>

<221>misc_signal

<222>(4)..(9)

<223>Xho I酶切位点

<400>4

ggcctcgagg tttacagagg aaaagtacg              29

Claims (8)

1.一种含日本血吸虫基因的重组表达载体，其特征在于，所述基因是日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II基因，其基因序列是编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的核苷酸序列，所述表达载体为原核表达载体pET28a(+)。

2.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II基因序列为SEQ ID NO：2所示核苷酸序列。

3.一种包含权利要求1所述重组表达载体的大肠杆菌宿主细胞。

4.一种日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

构建含日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II基因的重组表达载体，所述日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II基因是编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的核苷酸序列，所述表达载体为原核表达载体pET28a(+)；

将所述重组表达载体转化入大肠杆菌宿主细胞；

培养包含重组表达载体的大肠杆菌宿主细胞，并在合适条件下，诱导该重组表达载体表达日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II；

纯化诱导表达的日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述诱导表达的日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II还连接有包含6个组氨酸的标签序列。

6.权利要求1所述的重组表达载体在制备预防或治疗血吸虫病的疫苗中的应用。

7.权利要求1所述的重组表达载体在制备诊断血吸虫病的产品中的应用。

8.权利要求4所述制备方法生产的日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II在制备预防或治疗血吸虫病疫苗中的应用。

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