CN102731659B - 一种6×His-C99重组蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种6×His-C99重组蛋白及其制备方法和应用，根据本发明实施例的6×His-C99重组蛋白，在体外的稳定性强于Aβ42，用于抗体检测的稳定性好，在碱性包被液的条件下，6×His-C99重组蛋白呈现的抗原表位稳定，克服了Aβ42容易聚集，抗原表位具有多变性，导致检测结果不稳定的难题；另外，6×His-C99作为检测抗原，其用量低于Aβ42多肽做检测抗原的情形，6×His-C99的成本低，应用更经济，具有大规模应用的可能。

Description

一种6×His-C99重组蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因重组技术领域，更具体地，本发明涉及一种6×His-C99重组蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）患者脑内产生β淀粉样斑块沉积是此病的典型病变。Aβ寡聚体是重要的AD早期生物标志物之一。不同年龄、不同疾病发展阶段AD患者外周血Aβ寡聚体自身抗体水平与疾病发展和预后密切相关。因此，针对Aβ寡聚体抗体的检测在AD的早期诊断和疾病预后监测中很有意义。

目前已有人开展外周血Aβ自身抗体的检测分析，但是多家报道结果不一致。究其原因，最重要的一点是：检测抗原标准不一致。目前多采用Aβ作为检测抗原，其缺点是Aβ容易聚集，形成单体、寡聚体和纤维混合物。这些成分呈现的抗原表位不一致，因而导致所测抗体水平结果不一致。再者，目前尚无AD患者和正常人外周血Aβ42寡聚体自身抗体水平的检测数据。因此，规范检测抗原的组成和参数，发展新型Aβ42寡聚体特异性抗体的检测方法势在必行。

发明内容

本发明旨在至少解决上述技术问题之一。

为此，本发明的一个目的在于提出一种稳定性好、特异性强的6×His-C99重组蛋白。

根据本发明实施例的6×His-C99重组蛋白，编码该重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

将本发明的6×His-C99重组蛋白和6×His-Aβ42进行稳定性比较，在同样的保存条件下（-80℃，避免反复冻融），6×His-C99重组蛋白比6×His-Aβ42更稳定。6×His-Aβ42几乎聚集成80kD以上的聚集体，而6×His-C99重组蛋白则保持单体和寡聚体成分。

根据本发明实施例的6×His-C99重组蛋白，在体外的稳定性强于Aβ42，用于抗体检测的稳定性好，在碱性包被液的条件下，6×His-C99重组蛋白呈现的抗原表位稳定，克服了Aβ42容易聚集，抗原表位具有多变性，导致检测结果不稳定的难题；另外，6×His-C99作为检测抗原，其用量低于Aβ42多肽做检测抗原的情形，6×His-C99的成本低，应用更经济，具有大规模应用的可能。

本发明的另一个目的在于提出一种6×His-C99重组蛋白的制备方法。

根据本发明实施例的6×His-C99重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：

a）以淀粉样前体蛋白（APP）基因为模板克隆出APP羧基末端水解片段C99；

b）将所述APP羧基末端水解片段C99进行电泳分离，回收纯化后克隆至载体并转化得到第一重组质粒；

c）选择测序正确的第一重组质粒，双酶切测序正确的第一重组质粒和原核表达载体pET30a并将其连接，得到重组质粒pET30a-6×His-C99；

d）将所述重组质粒pET30a-6×His-C99进行表达，得到6×His-C99重组蛋白。

另外，根据本发明上述实施例的一种6×His-C99重组蛋白的制备方法，还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的一个实施例，所述步骤a）中上游引物为5’-AGCGGATCCATGGATGCAGAATTCCGA，下游引物为3’-CGCAAGCTTCTACTAGTTCTGCATCTGCTC。

根据本发明的一个实施例，所述步骤a）具体包括：

a-1）将所述模板和上、下游引物于94℃预变性5min；

a-2）将步骤a-1）所得产物于94℃变性30s；

a-3）将步骤a-2）所得产物于55℃退火30s；

a-4）将步骤a-3）所得产物于72℃扩增30个循环，扩增时间为30s；

a-5）将步骤a-4）所得产物于72℃延伸10min，得到APP羧基末端水解片段C99。

根据本发明的一个实施例，所述步骤b）中采用1.5g/100mL琼脂糖凝胶进行电泳分离，采用DNA胶回收试剂盒进行回收。

根据本发明的一个实施例，所述载体为PMD18-T载体。所述转化载体为大肠杆菌感受态细胞DH5α。

根据本发明的一个实施例，所述双酶切位点分别为BamHⅠ和HindⅢ。

根据本发明实施例的6×His-C99重组蛋白的制备方法，应用PCR技术以APP基因为模板克隆构建了APP羧基末端水解片段C99融合蛋白基因，利用原核表达载体pET30a系统诱导表达，镍亲和层析纯化得到蛋白纯品（6×His-C99）。此表达产物可以同时被鼠抗His单抗和A8单抗所识别。表达产物显示为包括11kD单体和80～100kD聚集体的蛋白组分。

基于上述已经克隆构建并表达纯化的6×His-C99重组蛋白，将其作为替代包被抗原，可以用于单抗筛选和Aβ寡聚体特异性抗体的检测，制备用于抗阿尔茨海默病Aβ42寡聚体单抗筛选的试剂盒及Aβ42寡聚体抗体谱的检测试剂盒，或者将其应用于制备阿尔茨海默病生物标记物的诊断试剂，以用于阿尔茨海默病的诊断和鉴别诊断目的。

本发明还鉴定了6×His-C99重组蛋白作为间接ELISA检测抗原包被酶标板的条件和最适浓度。以碱性溶液包被液溶解6×His-C99重组蛋白，系列稀释，以A8单抗1:2000作为抗原，得到最适包被浓度为10ng/ml（即1ng每孔）。

以所得包被条件和最适浓度为标准，通过间接ELISA检测发现，这种包被抗原可以被寡聚体特异性单抗A8和NU识别，而不能被Aβ纤维特异的单抗NU6所识别。即6×His-C99重组蛋白作为包被抗原用于间接ELISA系统，可以检测Aβ寡聚体特异性抗体水平，反映Aβ寡聚体抗体谱的特征，有较好的应用前景。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是根据本发明所涉及的6×His-C99重组蛋白的制备方法的流程示意图；

图2是根据本发明实施例的双酶切鉴定显示图；

图3是根据本发明实施例的SDS-PAGE条带分析图；

图4是根据本发明实施例的6×His-C99重组蛋白被小鼠抗组氨酸标签单抗示意图；

图5是根据本发明实施例的单抗A8被小鼠抗组氨酸标签单抗示意图；

图6是根据本发明实施例的NU1，NU4，NU6，4G8被小鼠抗组氨酸标签单抗示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下面首先参考图1描述根据本发明所涉及的6×His-C99重组蛋白的制备方法的流程。

具体地，根据本发明所述的6×His-C99重组蛋白的制备方法包括以下步骤：

a）以淀粉样前体蛋白（APP）基因为模板克隆出APP羧基末端水解片段C99；

b）将所述APP羧基末端水解片段C99进行电泳分离，回收纯化后克隆至载体并转化得到第一重组质粒；

c）选择测序正确的第一重组质粒，双酶切测序正确的第一重组质粒和原核表达载体pET30a并将其连接，得到重组质粒pET30a-6×His-C99；

d）将所述重组质粒pET30a-6×His-C99进行表达，得到6×His-C99重组蛋白。

由此，可以制得6×His-C99重组蛋白，所述6×His-C99重组蛋白在体外的稳定性强于Aβ42，用于抗体检测的稳定性好，在碱性包被液的条件下，6×His-C99重组蛋白呈现的抗原表位稳定，克服了Aβ42容易聚集，抗原表位具有多变性，导致检测结果不稳定的难题；另外，6×His-C99作为检测抗原，其用量低于Aβ42多肽做检测抗原的情形，6×His-C99的成本低，应用更经济，具有大规模应用的可能。

关于所述步骤a），需要理解的是，所述步骤a）中上游引物为5’-AGCGGATCCATGGATGCAGAATTCCGA，下游引物为3’-CGCAAGCTTCTACTAGTTCTGCATCTGCTC,其具体操作可以包括：

a-1）将所述模板和上、下游引物于94℃预变性5min；

a-2）将步骤a-1）所得产物于94℃变性30s；

a-3）将步骤a-2）所得产物于55℃退火30s；

a-4）将步骤a-3）所得产物于72℃扩增30个循环，扩增时间为30s；

a-5）将步骤a-4）所得产物于72℃延伸10min，得到APP羧基末端水解片段C99。

由此可以制得APP羧基末端水解片段C99。

根据本发明的一个实施例，所述步骤b）中采用1.5g/100mL琼脂糖凝胶进行电泳分离，采用DNA胶回收试剂盒进行回收。

根据本发明的一个实施例，所述载体为PMD18-T载体。所述转化载体为大肠杆菌感受态细胞DH5α。

根据本发明的一个实施例，所述双酶切位点分别为BamHⅠ和HindⅢ。

根据本发明实施例的6×His-C99重组蛋白的制备方法，应用PCR技术以APP基因为模板克隆构建了APP羧基末端水解片段C99融合蛋白基因，利用原核表达载体pET30a系统诱导表达，镍亲和层析纯化得到蛋白纯品（6×His-C99）。此表达产物可以同时被鼠抗His单抗和A8单抗所识别。表达产物显示为包括11kD单体和80～100kD聚集体的蛋白组分。

基于上述已经克隆构建并表达纯化的6×His-C99重组蛋白，将其作为替代包被抗原，可以用于单抗筛选和Aβ寡聚体特异性抗体的检测，制备用于抗阿尔茨海默病Aβ42寡聚体单抗筛选的试剂盒及Aβ42寡聚体抗体谱的检测试剂盒，或者将其应用于制备阿尔茨海默病生物标记物的诊断试剂，以用于阿尔茨海默病的诊断和鉴别诊断目的。

本发明还鉴定了6×His-C99重组蛋白作为间接ELISA检测抗原包被酶标板的条件和最适浓度。以碱性溶液包被液溶解6×His-C99重组蛋白，系列稀释，以A8单抗1:2000作为抗原，得到最适包被浓度为10ng/ml（即1ng每孔）。

以所得包被条件和最适浓度为标准，通过间接ELISA检测发现，这种包被抗原可以被寡聚体特异性单抗A8和NU识别，而不能被Aβ纤维特异的单抗NU6所识别。即6×His-C99重组蛋白作为包被抗原用于间接ELISA系统，可以检测Aβ寡聚体特异性抗体水平，反映Aβ寡聚体抗体谱的特征，有较好的应用前景。

下面结合实施例具体描述根据本发明的6×His-C99重组蛋白及其制备方法和应用。

实施例16×His-C99重组蛋白的基因克隆以及表达载体的构建

1、引物设计

根据GenBank中APP695的基因序列（GeneID:351）及β分泌酶水解位置得知C99蛋白的基因序列（300bp）设计引物，上、下游引物分别为：

5’-AGCGGATCCATGGATGCAGAATTCCGA，

3’-CGCAAGCTTCTACTAGTTCTGCATCTGCTC（酶切位点分别为BamHⅠ和HindⅢ）。

引物由上海生工生物工程有限公司合成并纯化和测序。

2、目的基因的克隆

利用上述引物进行PCR。以APP序列作为模板，将所述模板和上、下游引物于94℃预变性5min，接着94℃变性30s，然后于55℃退火30s，于72℃扩增30个循环，扩增时间为30s，最后于72℃延伸10min，得到APP羧基末端水解片段C99。

PCR结束后，将APP羧基末端水解片段C99用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA胶回收试剂盒回收纯化后克隆至PMD18-T载体，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，双酶切电泳检测，鉴定正确的质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。

3、表达载体构建

将双酶切测序正确的重组质粒和表达载体pET30a，经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA胶回收试剂盒回收纯化后双酶切的目的片段，与同样用BamHⅠ和HindⅢ双酶切的pET30a载体连接，转化大肠杆菌感受态DH5α、挑单克隆扩大培养，提质粒酶切鉴定，鉴定正确后的重组质粒pET30a-6×His-C99阳性克隆保存质粒和菌种。

4、结果与结论

以APP695为模板，设计引物经PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳显示得到一条300bp左右的条带，此条带与PMD18-T载体连接转化后得到多个阳性克隆，测序结果分析完全正确。重组基因亚克隆至pET30a载体，双酶切鉴定显示一条300bp左右的条带（如图2所示）。

以上结果说明：成功克隆并构建了pET30a-6×His-C99表达载体。

实施例2 6×His-C99表达载体的表达及纯化

1、蛋白表达

将pET30a-6×His-C99表达载体质粒转化E.coliBL21，挑取生长良好的单菌落到7mL具有kana抗性的LB培养液中，于260rpm，37℃过夜培养。从过夜培养的菌液中取2mL到具有kana抗性的500mL LB培养液中，于260rpm，37℃继续培养。培养4h后菌液OD600值达到0.6，此时加入终浓度为1mmol/L的诱导剂—异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)进行诱导，6h后于12000rpm，4℃离心15min收集菌体并称重。按1:5（g:mL）比例加入磷酸盐缓冲液(phosphate buffersolution，PBS)（PH 8.0）洗涤菌体两次，于12000rpm，4℃离心15min收集菌体。加入超声裂解液重悬细菌，充分混和（功率300w，超声10s，间歇15s，超声90min）。于室温15000rpm，离心30min，分别收集上清和沉淀，行SDS-PAGE凝胶电泳，分析目的蛋白的表达形式及表达量。

2、蛋白纯化

用Ni-NTA agarose纯化上清。平衡Ni柱子：每个15mL离心管中取0.6mL Ni－NTAAgarose，分别加入2mL裂解缓冲液，混匀，室温5440g离心1min弃上清，重复3次；将菌液上清30mL于Ni－NTA Agarose混合后，室温200rpm摇动10min；5440g离心1min，上清转入一新的离心管中，标记为FL；每个离心管中的Ni-NTA Agarose用5mL的洗涤缓冲液（washing buffer）洗涤两次，5440g，离心1min，上清转入新的离心管中，标记为W1和W2；每管用2mL的洗脱缓冲液（elution buffer）洗脱三次，5440g，离心1min，上清转入新的离心管中标记为E1,，E2和E3；将上述得到的上清取少量行SDS-PAGE电泳，其余-80℃保存。

3、结果与结论

质粒转化表达菌E.coliBL21，经1mmol/L IPTG诱导6h，超声裂解后对上清和沉淀分别进行SDS-PAGE分析发现此蛋白分泌到上清中，SDS-PAGE于相对分子质量约15KD处可见目的条带，并能形成一定的寡聚体，与预期大小一致（如图3所示）。

用Ni-NTA agarose亲和层析纯化上清，通过平衡、结合、洗涤、洗脱等步骤获得纯化后的上清，经SDS-PAGE检测，表明目的蛋白得到纯化，其中表达的蛋白纯度占总蛋白的90%以上。经过BCA法测得浓度为0.5278mg/mL。

上述结果说明：成功表达并纯化了6×His-C99重组蛋白，其浓度和纯度均满足后续实验。

实施例36×His-C99重组蛋白免疫反应性的鉴定

1、考马斯亮蓝染色检测

将凝胶放入考马斯亮蓝染色液中，在脱色摇床上染色4h左右。染色完毕后，回收染色液，将凝胶放入脱色液中在脱色摇床上脱色至蛋白条带清晰为止，将凝胶放入凝胶成像系统观察照相。

2、Western blot检测

以6×His-C99重组蛋白为抗原，分别以小鼠抗组氨酸标签单抗（Mouse Anti-His TagMonoclonal Antibody）和针对淀粉样蛋白的不同抗体（NU1，NU4，NU6，见文献Lambert MP，et al.J Neurochem，2007，100，23-35；4G8,SIGNET）以及本实验室制备的小鼠抗淀粉样蛋白单抗A8（见文献Zhang Y，et al.J Alzheimer Dis，2011，23(3):551-561）为一抗，辣根酶标记的山羊抗小鼠IgG为二抗，进行Western blot检测。

Western blot检测的方法为常规实验方法，具体如下：

取5～10μg样品，5×样品缓冲液，混匀后上样，先以100V电压使蛋白通过浓缩胶。当样品进入分离胶时，调节电压使其恒定在120V。当溴酚蓝泳动至凝胶底部时，结束电泳，取下凝胶，常规用考马斯亮蓝R-250染色法染色；将凝胶和硝酸纤维素膜分别放入装有印迹缓冲液的容器里平衡10min，依次在放入滤纸、凝胶、NC膜、滤纸，成“三明治”状，倒入转膜缓冲液，胶面朝负极，NC膜面朝向正极，小心避免并赶去气泡。接通电源，使恒流80mA连续转移2h，切断电源。

转膜结束后，用丽春红S染色液(10×丽春红S贮存液配制方法为：称取丽春红S 2g,三氯乙酸30g,璜基水杨酸30g,加水至100ml；用时按照1：10的比例用用去离子水稀释)确定蛋白条带位置，做相应的标记。用封闭液封闭硝酸纤维素膜（称取脱脂奶粉5g，溶于0.1mol/L PBST（NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄.1.44g，KH₂PO₄.0.44g，Tween-200.05ml，补去离子水至1L，pH 7.2～7.4）100ml），4℃封闭过夜。用封闭液液稀释单抗，浓度一般为0.2～1μg/ml,于4℃孵育12～14h，或于20～37℃孵育2h。用0.1mol/LPBST洗涤硝酸纤维素膜4次，每次5～10min。用PBS稀释HRP标记的二抗，稀释度为1:1000，室温孵育1h。用0.1mol/L PBST洗涤硝酸纤维素膜4次，每次5min。按照PIERCE化学发光试剂盒说明，将A液和B液等体积混合，加在硝酸纤维素膜上，2～5min后，用X光片曝光显影，观察结果。

3、结果与结论

试验结果：6×His-C99重组蛋白可以被小鼠抗组氨酸标签单抗（Mouse Anti-His TagMonoclonal Ant ibody），如图4所示。图5为单抗A8被小鼠抗淀粉样蛋白标签。图6为NU1，NU4，NU6，4G8被小鼠抗组氨酸标签单抗示意图。

上述结果说明，6×His-C99重组蛋白具有与淀粉样蛋白相近的免疫反应性。

实施例46×His-C99重组蛋白作为抗原在AD ELISA检测方法中的应用

1、确定最佳抗原包被浓度

纯化后的6×His-C99重组蛋白用包被液做不同浓度的稀释之后，作为包被抗原，用于检测Aβ寡聚体单抗A8，从而确定CTFβ的最佳包被浓度。

其具体操作方法如下：抗原用碱性包被液（pH 9.6，0.05mol/L碳酸盐缓冲液）稀释，蛋白浓度为CTFβ分别为0.5ng/孔，1ng/孔，10ng/孔50ng/孔，100ng/孔，200ng/孔，500ng/孔，800ng/孔，1μg/孔，加入96孔聚苯乙烯酶标板中，100μl/孔，4℃过夜；次日磷酸盐吐温缓冲液（phosphate buffer solution Tween，PBST）洗涤3次；加封闭液200μl/孔,37℃放置1h；PBST洗涤3次；加一抗：Aβ寡聚体单抗A8，100μl/孔；PBST洗涤3次；加二抗：辣根酶标记的山羊抗小鼠IgG的二抗100μl/孔；PBST洗涤3次；TMB显色10min，2M浓硫酸终止反应；检测结果，用TECON全自动酶标仪检测450nm吸光值（OD₄₅₀）；每份样品做2个孔测定，取平均A值。根据P/N值最大处为抗原最佳包被浓度，以样品孔与阴性对照孔OD₄₅₀值之比（P/N）大于2作为阳性结果的判定标准。

2、ELISA检测

确定6×His-C99重组蛋白的包被浓度后，CTFβ 10ng/孔，Aβ1-42500ng/孔，比较6×His-C99和Aβ分别作为抗原与各个抗体（纯化后的A8，NU1，NU4，NU6，4G8等）的结合能力，从而建立ELISA方法应用于AD的检测。

3.结果与结论

通过对数据分析和对最大P/N值的计算得出：最佳抗原包被浓度为1ng/孔，抗体的A8的最佳稀释度是1:1000。

通过数据分析和对最大P/N值的计算，结果显示6×His-C99重组蛋白用作抗原包被可以识别Aβ的各种抗体，用于检测样品中各种Aβ寡聚体抗体的含量，见表1。

上述结果说明，纯化后的6×His-C99重组蛋白在碱性包被液条件下，作为包被抗原，可以满足用于检测Aβ寡聚体的抗体。

表1以6×His-C99包被酶标板检测阿尔茨海默病抗体含量表

根据上述实施例可以看出，根据本发明实施例的6×His-C99重组蛋白，在体外的稳定性强于Aβ42，用于抗体检测的稳定性好，在碱性包被液的条件下，6×His-C99重组蛋白呈现的抗原表位稳定，克服了Aβ42容易聚集，抗原表位具有多变性，导致检测结果不稳定的难题；另外，6×His-C99作为检测抗原，其用量低于Aβ42多肽做检测抗原的情形，6×His-C99的成本低，应用更经济，具有大规模应用的可能。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

序列表

<110>北京交通大学

<120>一种6×His-C99重组蛋白及其制备方法和应用

<130>BioEdit-Lasergene

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>450

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>1

ATGCACCATC ATCATCATCA TTCTTCTGGT CTGGTGCCAC GCGGTTCTGG TATGAAAGAA  60

ACCGCTGCTG CTAAATTCGA ACGCCAGCAC ATGGACAGCC CAGATCTGGG TACCGACGAC  120

GACGACAAGG CCATGGCTGA TATCGGATCC GATGCAGAAT TCCGACATGA CTCAGGATAT  180

GAAGTTCATC ATCAAAAATT GGTGTTCTTT GCAGAAGATG TGGGTTCAAA CAAAGGTGCA  240

ATCATTGGAC TCATGGTGGG CGGTGTTGTC ATAGCGACAG TGATCGTCAT CACCTTGGTG  300

ATGCTGAAGA AGAAACAGTA CACATCCATT CATCATGGTG TGGTGGAGGT TGACGCCGCT  360

GTCACCCCAG AGGAGCGCCA CCTGTCCAAG ATGCAGCAGA ACGGCTACGA AAATCCAACC  420

TACAAGTTCT TTGAGCAGAT GCAGAACTAG                                   450

Claims (7)

1.一种6×His-C99重组蛋白，其特征在于，编码该重组蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。

2.一种根据权利要求1所述的6×His-C99重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a）以淀粉样前体蛋白（APP）基因为模板克隆出APP羧基末端水解片段C99；

b）将所述APP羧基末端水解片段C99进行电泳分离，回收纯化后克隆至载体并转化得到第一重组质粒；

c）选择测序正确的第一重组质粒，双酶切测序正确的第一重组质粒和原核表达载体pET30a并将其连接，得到重组质粒pET30a-6×His-C99；

d）将所述重组质粒pET30a-6×His-C99进行表达，得到6×His-C99重组蛋白，

所述步骤a）中上游引物为5’-AGCGGATCCATGGATGCAGAATTCCGA，下游引物为3’-CGCAAGCTTCTACTAGTTCTGCATCTGCTC。

3.根据权利要求2所述的6×His-C99重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤a）具体包括：

a-1）将所述模板和上、下游引物于94℃预变性5min；

a-2）将步骤a-1）所得产物于94℃变性30s；

a-3）将步骤a-2）所得产物于55℃退火30s；

a-4）将步骤a-3）所得产物于72℃扩增30个循环，扩增时间为30s；

a-5）将步骤a-4）所得产物于72℃延伸10min，得到APP羧基末端水解片段C99。

4.根据权利要求2所述的6×His-C99重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤b）中采用1.5g/100mL琼脂糖凝胶进行电泳分离，采用DNA胶回收试剂盒进行回收。

5.根据权利要求2所述的6×His-C99重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤b）中的载体为PMD18-T载体。

6.一种根据权利要求1所述的6×His-C99重组蛋白在制备阿尔茨海默病生物标记物的诊断试剂中的应用。

7.一种根据权利要求1所述的6×His-C99重组蛋白在制备用于抗阿尔茨海默病Aβ42寡聚体单抗筛选的试剂盒及Aβ42寡聚体抗体谱的检测试剂盒中的应用。

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