BRPI0417744B1

BRPI0417744B1 - método para produzir um conjugado imunogênico, e,conjugado imunogênico

Info

Publication number: BRPI0417744B1
Application number: BRPI0417744-4A
Authority: BR
Inventors: Rasappa G. Arumugham; A. Krishna Prasad
Original assignee: Wyeth Llc
Priority date: 2003-12-17
Filing date: 2004-12-17
Publication date: 2020-11-03
Also published as: AU2004299501A1; HUE026000T2; EP1701968B1; PL1701968T3; NO20062687L; CA2549132C; BRPI0417744A8; JP2008505052A; WO2005058940A2; DK1701968T3; EA200800300A1; WO2005058940A3; CN1984676A; PT1701968E; ECSP066655A; JP4764830B2; UA93854C2; ES2546175T3; SI1701968T1; US20070134762A1

Abstract

“MÉTODO PARA PRODUZIR UM CONJUGADO IMUNOGÊNICO, E, CONJUGADO IMUNOGÊNICO” A presente invenção é dirigida a métodos de produzir conjugados de imunógenos de peptídeo com moléculas carreadoras de proteína/polipeptídeo, que são úteis como imunógenos, em que os imunógenos de peptídeo são conjugados com carreadores de proteína via grupos funcionais ativados de resíduos de aminoácido do carreador ou da molécula ligante opcionalmente fixada e em que quaisquer grupos funcionais reativos não-conjugados nos resíduos de aminoácido são inativados via capeamento, assim retendo a funcionalidade imunológica da molécula carreadora, porém reduzindo a propensão para reações indesejáveis, que poderiam tornar o conjugado menos seguro ou eficaz. Além disso, a invenção também refere-se a tais produtos imunogênicos e composições imunogênicas contendo tais produtos imunogênicos, produzidos por tais métodos.

Description

REFERÊNCIA A PEDIDOS REEACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício sob 35 U.S.C. § 119(e) do Pedido de Patente Provisório U.S. No. de Série 60/530.480, depositado em 17 de dezembro de 2003, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade, para todas as finalidades.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0002] A essência da imunidade adaptativa é a capacidade de um organismo reagir à presença de substâncias estranhas e produzir componentes (anticorpos e células) capazes de especificamente interagir com o hospedeiro e protegê-lo de sua invasão. Um “antígeno” ou “imunógeno” é uma substância que é capaz de eliciar este tipo de resposta imune e também é capaz de interagir com as células sensibilizadas, que são manufaturadas contra ela.

[0003] Os antígenos ou imunógenos são usualmente macromoléculas que contêm sítios antigênicos distintos ou “epítopos”, que são reconhecidos e interagem com os vários componentes do sistema imune. Eles podem existir como moléculas individuais, compostas de químicos, proteínas, lipoproteínas, glicoproteínas, RNA, DNA ou polissacarídeos orgânicos sintéticos, ou eles podem ser partes de estruturas celulares (bactérias ou fungos) ou vírus (Harlow and Lane 1988a, b, c; Male et al., 1987).

[0004] As moléculas pequenas, como os peptídeos curtos, embora normalmente capazes de interagirem com os produtos de uma resposta imune, com freqüência não podem causar uma resposta sozinhos. Estes imunógenos de peptídeo ou “haptenos”, como eles são também chamados, são realmente antígenos incompletos e, embora não capazes sozinhos de provocar imunogenicidade ou eliciar produção de anticorpos, podem ser tornados imunogênicos por seu acoplamento a um carreador adequado. Os carreadores tipicamente são antígenos de proteína de mais elevado peso molecular, que são capazes de causarem uma resposta imunológica quando administrados in vivo.

[0005] Em uma resposta imune, os anticorpos são produzidos e secretados pelos linfócitos-B, em conjunto com as células auxiliares-T (TH). Na maior parte dos sistemas de hapteno-carreador, as células B produzem anticorpos que são específicos tanto para o hapteno como para o carreador. Nestes casos, os linfócitos-T terão domínios de ligação específicos no carreador, porém não reconhecerão o hapteno sozinho. Em uma espécie de sinergismo, as células B e T cooperam para induzir uma resposta anticorpo específica de hapteno. Após tal resposta imune ter ocorrido, se o hospedeiro for subsequentemente provocado com somente o hapteno, usualmente ele responderá produzindo anticorpos específicos de hapteno pelas células de memória formadas após a imunização inicial.

[0006] Os haptenos sintéticos, imitando algumas estruturas epitópicas críticas em macromoléculas maiores, são com frequência conjugados com carreadores, para criar uma resposta imune para a molécula “precursora” maior. Por exemplo, os segmentos de peptídeos curtos podem ser sintetizados da sequência conhecida de uma proteína e acoplados a um carreador, para induzir imunogenicidade em relação à proteína nativa. Este tipo de abordagem sintética para a produção de imunógenos tornou-se a base de muito da pesquisa atual para a criação de vacinas. Entretanto, em muitos exemplos, meramente criando-se uma resposta de célula-B, utilizando-se conjugados sintéticos de peptídeo-carreador, embora bem projetados, nem sempre garantirá completa imunidade protetora com respeito a um antígeno intacto. A resposta imune, gerada por um epítopo de peptídeo curto de uma maior partícula viral ou célula bacteriana, pode somente ser suficiente para gerar memória no nível da célula B. Nestes casos é geralmente agora aceito que uma resposta a célula-T citotóxica é um indicador mais importante da imunidade protetora. A projeção de imunógenos de peptídeo, com os apropriados sítios de ligação epitópicos, para o reconhecimento tanto das células-B como das células-T, é uma das áreas de pesquisa mais desafiadoras da imunologia hoje em dia.

[0007] A abordagem de aumentar a imunogenicidade de moléculas pequenas ou fracamente imunogênicas, conjugando-se estas moléculas com moléculas grandes “carreadoras”, tem sido utilizada com sucesso por décadas (vide, por exemplo, Goebel et al. (1939) J. Exp. Med. 69: 53). Por exemplo, muitas composições imunogênicas têm sido descritas, em que polímeros capsulares purificados têm sido conjugados a proteínas carreadoras, para criar composições imunogênicas mais eficazes, pela exploração deste “efeito carreador”. Schneerson et al. (1984) Infect. Immun. 45: 582 - 591). A conjugação tem também mostrado desviar-se da fraca resposta anticorpo, usualmente observada em crianças, quando imunizadas com um polissacarídeo livre (Anderson et al. (1985) J. Pediatr. 346; Insel et al. (1986) J. Exp. Med. 158: 294).

[0008] Os conjugados carreadores de hapteno têm sido gerados com sucesso, empregando-se vários reagentes de reticulação/acoplamento, tais como homobifuncional, heterobifuncional ou reticuladores de comprimento zero. Muitos de tais métodos são atualmente disponíveis para acoplamento de sacarídeos, proteínas e peptídeos a carreadores de peptídeos. A maioria dos métodos criam ligações amina, amida, uretano, isotiouréia ou dissulfeto, ou em alguns casos tioéteres. Uma desvantagem do uso de reagentes de acoplamento, que introduzem sítios reativos nas cadeias laterais das moléculas de aminoácido reativas das moléculas de carteador e/ou hapteno, é que os sítios reativos, se não neutralizados, são livres para reagir com qualquer molécula indesejada in vitro (assim adversamente afetando a funcionalidade ou estabilidade do(s) conjugado(s)) ou in vivo (assim apresentando um risco potencial de eventos adversos em pessoas ou animais imunizados com as preparações). Tais sítios reativos em excesso podem ser reagidos ou “capeados”, de modo a inativar estes sítios, utilizando-se várias reações químicas, porém estas reações podem ser, por outro lado, rompedoras da funcionalidade dos conjugados. Isto pode ser particularmente problemático quando tentando-se criar um conjugado pela introdução dos sítios reativos dentro da molécula carreadora, visto que seu tamanho maior e estrutura mais complexa (em relação ao hapteno) podem torná-lo mais vulnerável aos efeitos rompedores do tratamento químico. De fato, não são conhecidos exemplos de métodos por meio dos quais um conjugado seja produzido ativando-se primeiro o carreador, em seguida reagindo-se com o hapteno em uma reação de conjugação e, finalmente, “cobrindo-se” os restantes sítios reativos, enquanto preservando-se a capacidade do conjugado resultante funcionar como uma composição imunogênica, tendo as desejadas propriedades de “efeito carreador”.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0009] A presente invenção é dirigida a métodos de produzir um conjugado imunogênico de um imunógeno de peptídeo com um carreador de proteína/polipeptídeo, em que o imunógeno de peptídeo é conjugado com o carreador, via grupos funcionais derivados de resíduos de aminoácido do carreador, tais como resíduos de lisina, e em que quaisquer grupos funcionais derivados não-conjugados dos resíduos de aminoácido são inativados via capeamento, para bloquear sua reação com outras moléculas, incluindo proteínas/polipeptídeos, desse modo preservando a funcionalidade do carreador, de modo ele retenha sua capacidade de eliciar as desejadas respostas imunes contra o imunógeno de peptídeo que, de outro modo, não ocorreria sem um carreador. Além disso, a invenção também refere-se a conjugados produzidos pelos métodos acima e a composições imunogênicas contendo tais conjugados.

[0010] Em uma formas de realização, a invenção é dirigida a um primeiro método para conjugar um imunógeno de peptídeo, via um grupo reativo de um resíduo de aminoácido do imunógeno de peptídeo, com um carreador de proteína/polipeptídeo, tendo um ou mais grupos funcionais, o método compreendendo as etapas de: (a) derivar um ou mais grupos funcionais do carreador de proteína/polipeptídeo, para gerar uma molécula derivada com sítios reativos; (b) reagir o carreador de proteína/polipeptídeo derivado da etapa (a) com um grupo reativo de um resíduo de aminoácido do imunógeno de peptídeo, sob condições de reação, de modo que o imunógeno de peptídeo seja conjugado com o carreador de proteína/polipeptídeo derivado, via os grupos funcionais; e (c) reagir ainda o conjugado com um reagente de capeamento, para inativar os grupos funcionais reativos livres do carreador de proteína/polipeptídeo ativado, desse modo preservando a funcionalidade do carreador em relação ao imunógeno de peptídeo, o que, de outro modo, não ocorreria sem um carreador.

[0011] Em uma formas de realização, o carreador de proteína/polipeptídeo é selecionado do grupo consistindo de albumina de soro humano, hemocianina de lapa buraco de fechadura, moléculas de imunoglobulina, tiroglobulina, ovalbumina, hemaglutinina da influenza, peptídeo de ligação PAN-DR (polipeptídeo PADRE), proteína da circunsporozita (CS) da malária, antígeno de superfície da hepatite B (HBsAgi9-2s), Proteína de Choque Térmico (HSP) 65, Bacilo Calmette-Guerin (BCG), toxina da cólera, mutantes da toxina da cólera com toxicidade reduzida, toxina da difteria, proteína CRMI97 que tem reação cruzada com a toxina da difteria, Streptococal C5a peptidase recombinante, Streptococcus pyogenesORF1224, Streptococcus pyogenes ORF1664, Streptococcus pyogenes ORF 2452, Chlamydia pneumoniae ORF T367, Chlamydia pneumoniae ORF T858, toxóide do Tétano, HIV gpl20 Tl, componentes de superfície microbianos, reconhecendo moléculas de matriz adesivas (MSCRAMMS), fator de crescimento / hormônio, citocinas e quimiocinas.

[0012] Em outra formas de realização, o carreador de proteína/polipeptídeo contém um epítopo de célula-T.

[0013] Em ainda outra formas de realização, o carreador de proteína/polipeptídeo é um toxóide bacteriano, tal como um toxóide do tétano, toxina da cólera ou mutante de toxina da cólera, como descrito acima. Em uma formas de realização, o carreador de proteína/polipeptídeo é CRM197.

[0014] Em ainda outra formas de realização, o carreador de proteína/polipeptídeo pode ser uma hemaglutinina da influenza, um polipeptídeo PADRE, uma proteína CS da malária, um antígeno de superfície da Hepatite B (HSBAgi^s), uma proteína de choque térmico 65 (HSP 65), ou um polipeptídeo de Mycobacterium tuberculosis(BCG).

[0015] Em uma formas de realização preferida, o carreador de proteína/polipeptídeo é selecionado de Streptococcal rC5a peptidase, Streptococcus pyogenesORF1224, Streptococcus pyogenes ORF1664 ou Streptococcus pyogenes ORF2452, Chlamydia pneumoniae ORF T367, e Chlamydia pneumoniae ORF T858.

[0016] Em uma forma de realização, o carreador de proteína/polipeptídeo é um fator ou hormônio do crescimento, que estimula ou aumenta a resposta imune e é selecionado do grupo consistindo de IL-1, IL-2, y-interferon, IL-10, GM-CSF, MIP-loc, MIP-lβ e RANTES.

[0017] Em uma formas de realização, o imunógeno de peptídeo é selecionado de uma proteína bacteriana, uma proteína virai e uma proteína eucariótica.

[0018] Em outra forma de realização, o imunógeno de peptídeo é selecionado de uma proteína bacteriana, uma proteína virai e uma proteína eucariótica.

[0019] Em outra forma de realização, o imunógeno de peptídeo é derivado de um antígeno de proteína bacteriana de Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhea, Haemophilus influenzae, Esherichia coli, Klebsiella enterobacter, Listeria monocitogenes, Vibrio cholerae, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Pseudomonas species, Salmonella typhimurium, Borrelia burgdorferi, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella dysentriae, Alloiococcus otitidis e estreptococos do Grupo B.

[0020] Em outra forma de realização, o imunógeno de peptídeo é derivado de um antígeno de proteína de um vírus selecionado do grupo consistindo de vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus do herpes simples (HSV), vírus do papiloma humano (HPV), vírus da parainfluenza (PIV), vírus da estomatite vesicular (VSV), vírus sincicial respiratório (RSV), vírus Epstein-Barr (EBV), coronavirus, vírus da vacínia, rotavirus, vírus da raiva, vírus da hepatite C (HCV) e vírus da hepatite B (HBV).

[0021] Em ainda outra forma de realização, o imunógeno de peptídeo é derivado de um antígeno de proteína de um fungo selecionado da espécie Candida,espécie Cryptococcus, espécie Coccidioides, espécie Histoplasma e espécie Aspergillus.

[0022] Em outra forma de realização, o imunógeno de peptídeo é derivado de um antígeno de proteína de um parasita selecionado de um Plasmodium,um Trypanosome,um Schistosome c um Leishmania.

[0023] Em outra forma de realização, o imunógeno de peptídeo é derivado de um antígeno de proteína de um eucarioto. Em uma forma de realização, o eucarioto é um humano.

|0024] Em ainda outra forma de realização preferida, o imunógeno de peptídeo do humano é derivado de um tumor maligno. Em uma forma de realização preferida, o imunógeno de peptídeo é de um antígeno de tumor de um carcinoma de célula renal, um carcinoma da mama, um melanoma e um carcinoma da próstata. Em outra forma de realização preferida, o antígeno de peptídeo é derivado do antígeno de tumor, antígeno carcinoembriônico (CEA).

|0025] Em um aspecto, a invenção provê um imunógeno de peptídeo compreendendo peptídeo Aβ ou fragmentos de Aβ ou seus análogos eliciando uma resposta imunogênica contra certos epítopos dentro de Aβ. Os peptídeos imunogênicos da invenção incluem peptídeos heterólogos imunogênicos. Em alguns peptídeos imunogênicos, um fragmento Aβ é ligado a um carreador para formar um peptídeo heterólogo imunogênico e então este peptídeo heterólogo é ligado a um carreador empregando-se um método da presente invenção, para formar um conjugado.

[0026] Em outro aspecto da invenção, o imunógeno de peptídeo é um polipeptídeo compreendendo um segmento de terminal-N de pelo menos os resíduos 1-5 de Aβ, o primeiro resíduo de Aβ sendo o resíduo de terminal-N do polipeptídeo, em que o polipeptídeo é livre de um segmento de terminal-C de Aβ. Em ainda outro aspecto da invenção, o imunógeno de peptídeo é um polipeptídeo compreendendo um segmento de terminal-N de Aβ, o segmento começando no resíduo 1-3 de Aβ e terminando nos resíduos 7-11 de Aβ. Em alguns aspectos da invenção, o imunógeno de peptídeo é um agente que inclui uma resposta imunogênica contra um segmento de terminal- N de Aβ, o segmento começando no resíduo 1-3 de Aβ e terminando nos resíduos 7-11 de Aβ, sem induzir uma resposta imunogênica contra um epítopo dentro dos resíduos 12-43 de Aβ43. Em outro aspecto da invenção, o imunógeno de peptídeo é um polipeptídeo heterólogo, compreendendo um segmento de Aβ ligado a uma sequência amino ácida heteróloga que induz uma resposta de célula auxiliar-T contra a sequência amino ácida heteróloga e, desse modo, uma resposta de célula-B contra o segmento de terminal-N.

[0027] Em alguns imunógenos de peptídeo, o segmento de terminal-N de Aβ é ligado em seu terminal-C a um polipeptídeo heterólogo. Em alguns imunógenos de peptídeo, o segmento de terminal-N de Aβ é ligado em seu terminal-N a um polipeptídeo heterólogo. Em alguns imunógenos de peptídeo, o segmento de terminal-N de Aβ é ligado em seus términos N e C aos primeiro e segundo polipeptídeo heterólogos. Em alguns imunógenos de peptídeo, o segmento de terminal-N de Aβ em seu terminal-N a um polipeptídeo heterólogo e em seu terminal-C a pelo menos uma cópia adicional do segmento de terminal-N. Em alguns imunógenos de peptídeo, o polipeptídeo compreende do terminal-N ao terminal-C, o segmento de terminal-N de Aβ, uma pluralidade de cópias adicionais do segmento de terminal-N e o segmento aminoácido heterólogo.

[0028] Em alguns dos imunógenos de peptídeo acima, o polipeptídeo compreende ainda pelo menos uma cópia adicional do segmento de terminal-N. Em alguns dos imunógenos de peptídeo acima, o fragmento é livre de pelo menos os 5 aminoácidos de terminal-C de Aβ43.

[0029] Em alguns aspectos dos imunógenos de peptídeo acima, o fragmento compreende até 10 aminoácidos contíguos de Aβ.

[0030] Em outro aspecto, a invenção provê um imunógeno de peptídeo, compreendendo peptídeo Aβ ou fragmentos de Aβ ou seus análogos, eliciando uma resposta imunogênica contra certos epítopos dentro de Aβ, que pode ser em uma configuração referida como uma configuração de múltiplos peptídeos antigênicos (MAP).

[0031] Em alguns dos aspectos da invenção acima, o imunógeno de peptídeo da metade de terminal-N de Aβ. Em alguns aspectos da invenção, o imunógeno de peptídeo é um fragmento de Aβ selecionado do grupo consistindo de Aβl-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-10, 1-11, 1-12, 1-16, 3-6 e 3-7. Em alguns dos aspectos acima da invenção, o imunógeno de peptídeo é da região interna de Aβ. Em alguns aspectos da invenção, o imunógeno de peptídeo é um fragmento de Aβ selecionado do grupo consistindo de Aβl3- 28, 15-24, 17-28 e 25-35. Em alguns dos aspectos acima da invenção, o imunógeno de peptídeo da extremidade do terminal-C de Aβ. Em alguns aspectos da invenção, o imunógeno de peptídeo é um fragmento de Aβ selecionado do grupo consistindo de Aβ-33-42, 35-40 e 35-42. Em alguns aspectos da invenção, o imunógeno de peptídeo é um fragmento de Aβ selecionado do grupo consistindo de Aβl-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-10, 1-11, 1- 12, 1-16, 1-28, 3-6, 3-7, 13-28, 15-24, 17-28, 25-35, 33-42, 35-40 e 35-42. Em alguns aspectos da invenção, o imunógeno de peptídeo é um fragmento de Aβ selecionado do grupo consistindo de Aβl-5, Aβl-7, Aβl-9 e Aβl-12. Em alguns aspectos da invenção, o imunógeno de peptídeo é um fragmento de Aβ selecionado do grupo consistindo de Aβl-5-L, Aβl-7-L, Aβl-9-L e Aβl-12- L, em que L é um ligante. Em alguns aspectos da invenção, o imunógeno de peptídeo é um fragmento de Aβ selecionado do grupo consistindo de Aβl-5- L-C, Aβl-7-L-C, Aβl-9-L-C e Aβl-12-L-C, onde C é um resíduo de aminoácido de cisteína.

[0032] Em alguns aspectos da invenção, o imunógeno de peptídeo é um fragmento de Aβ selecionado do grupo consistindo de Aβl6- 22, Aβl6-23, Aβ-17-23, Aβl7-24, Aβl8-24 e Aβl8-25. Em alguns aspectos da invenção, imunógeno de peptídeo é um fragmento de Aβ selecionado do grupo consistindo de Aβl6-22-C, Aβl6-23-C, Aβl7-23-C, Aβl7-24-C, Aβl8-24-C e Aβl8-25-C, onde C é um resíduo de aminoácido de cisteína. Em outros aspectos da invenção, o imunógeno de peptídeo é um fragmento de Aβ selecionado do grupo consistindo de C-Aβ 16-22, C-Aβ 16-23, C-Aβ 17- 23, C-Aβl7-24, C-Aβl8-24 e C-Aβl8-25, em que C é um resíduo de aminoácido de cisteina.

[0033] Em alguns dos imunógenos de peptídeo acima, o polipeptídeo heterólogo é selecionado do grupo consistindo de peptídeos tendo um epítopo de célula-T, um epítopo de célula B e suas combinações.

[0034] Em uma forma de realização, o grupo funcional de uma ou mais moléculas de aminoácido do carreador de proteína/polipeptídeo ou do ligante de polipeptídeo opcionalmente ligado é derivado empregando-se um reagente de reticulação. Em outra forma de realização, o reagente de derivação é um reagente de reticulação de comprimento-zero. Em outra forma de realização, o reagente de derivação é um reagente de reticulação homobifuncional. Em ainda outra forma de realização, o reagente de derivação é um reagente de reticulação heterobifuncional.

[0035] Em uma forma de realização preferida, o reagente heterobifuncional é um reagente que reage com um grupo funcional primário ou de ε-amina de uma ou mais moléculas de aminoácido do carreador de proteína/polipeptídeo e um grupo tiol pendente de uma ou mais moléculas de aminoácido do imunógeno de peptídeo. Em uma forma de realização, o reagente heterobifuncional é bromoacetato de N-succinimidila.

[0036] Em outra forma de realização, o grupo funcional primário ou ε-amina é lisina. Em ainda outra forma de realização, a derivação do grupo funcional primário ou ε-amina da lisina do carreador de proteína/polipeptídeo com bromoacetato de N-succinimidila resulta na bromoacetilação dos resíduos primários ou de ε-amina nas moléculas de lisina do carreador de proteína/polipeptídeo. Em uma mais preferida forma de realização, o grupo tiol pendente é um resíduo de cisteina do imunógeno de peptídeo, que pode ser localizado no término amino do imunógeno de peptídeo, no termino carbóxi do imunógeno de peptídeo ou internamente no imunógeno de peptídeo.

[0037] Em outra forma de realização, o grupo tiol pendente é gerado por um reagente tiolante, tal como N-acetil homocisteinetio lactona, reagente de Traut (2-iminotilano) SATA (N-succinimidil S-acetiltioacetato), SMPT (4-succinimidiloxicarbonil-metil-12-piridilditio tolueno), SulfoLC SPDP (Sulfo Succinimidil piridil ditio propionamido hexanoato), SPDP (Succinimidil piridil ditio propionato). Em uma forma de realização preferida, o reagente de capeamento, que é usado para inativar o reativo livre, grupos funcionais do carreador de proteína/polipeptídeo ativado, é selecionado do grupo reagente consistindo de cisteamina, A-acetilcisteamina e etanolamina.

[0038] Em uma forma de realização particularmente preferida, o reagente de capeamento, que é usado para inativar os grupos funcionais reativos do carreador de proteína/polipeptídeo ativado, é selecionado do grupo reagente consistindo de hidróxido de sódio, carbonato de sódio, bicarbonato de amónio e amónia.

[0039] Em uma forma de realização, o grupo reativo do resíduo de aminoácido do imunógeno de peptídeo é um grupo sulfidrila livre.

[0040] Em outra forma de realização, um ou mais dos grupos funcionais estão em um ligante, que é opcionalmente ligado ao carreador de proteína/polipeptídeo. Em uma forma de realização preferida, o ligante é um ligante de peptídeo. Em uma forma de realização mais preferida, o ligante de peptídeo é polilisina.

[0041] Em outra forma de realização, a invenção é dirigida a um segundo método para conjugar um imunógeno de peptídeo de uma proteína/polipeptídeo com um carreador de proteína/polipeptídeo tendo a estrutura:

em que, C é um carreador de proteína/polipeptídeo e X é um grupo funcional derivável de um resíduo de aminoácido do carreador de proteína/polipeptídeo ou, opcionalmente, de um resíduo de aminoácido de um ligante de peptídeo covalentemente ligado ao carreador de proteína/polipeptídeo e em que m é um inteiro maior do que 0, porém menor do que ou igual a 85, o método compreendendo as etapas de: (a) derivar um ou mais dos grupos funcionais do carreador de proteína/polipeptídeo ou da molécula ligante opcionalmente ligada, para gerar uma molécula derivada com sítios reativos; (b) reagir o carreador de proteína/polipeptídeo derivado da etapa (a) com um grupo reativo de um resíduo de aminoácido do imunógeno de peptídeo, para formar um conjugado de imunógeno de peptídeo-carreador de proteína/polipeptídeo covalentemente acoplado; e (c) reagir ainda o dito conjugado com um reagente de capeamento, para inativar os grupos funcionais reativos livres do carreador de proteína/polipeptídeo, de modo que os grupos capeados não fiquem livres para reagir com outras moléculas, incluindo proteínas/polipeptídeos, desse modo preservando a funcionalidade do carreador, de modo que retenha sua capacidade de eliciar as desejadas respostas imunes contra o imunógeno de peptídeo, quede outro modo não ocorreria sem um carreador para gerar um conjugado de imunógeno de peptídeo/carreador de proteína/polipeptídeo capeado, tendo a fórmula:

em que, C é o carreador de proteína/polipeptídeo e Xdé um grupo funcional derivado de um resíduo de aminoácido do carreador de proteína/polipeptídeo ou, opcionalmente, de um resíduo de aminoácido de um ligante de peptídeo covalentemente ligado ao carreador de proteína/polipeptídeo e em que P é a molécula de imunógeno de peptídeo covalentemente ligada ao grupo funcional derivado do resíduo de aminoácido do carreador de proteína ou, opcional mente, de um resíduo de aminoácido de um ligante de peptídeo covalentemente ligado a um carreador de proteína/polipeptídeo, R é uma molécula de capeamento covalentemente ligada ao grupo funcional derivado de um resíduo de aminoácido do carreador de proteína/polipeptídeo ou, opcionalmentc, dc um resíduo de aminoácido de um ligante de peptídeo covalentemente ligado a um carreador de proteína/polipeptídeo, n é um inteiro maior do que 0, porém menor do que ou igual a 85 e p é um inteiro maior do que 0, porém menor do que 85.

[0042] As formas de realização detalhadas para o primeiro método descrito acima são também aplicáveis aos conjugados há pouco descritos, preparados pelo segundo método.

[0043] Em uma forma de realização, a invenção é dirigida a conjugados de imunógeno de peptídeo-carreador de proteína/polipeptídeo, em que o carreador de proteína/polipeptídeo tem a fórmula:

em que C é um carreador de proteína/polipeptídeo e X é um grupo funcional derivável de um resíduo de aminoácido do carreador de proteína/polipeptídeo ou, opcionalmente, de um resíduo de aminoácido de um ligante de peptídeo covalentemente ligado ao carreador de proteína/polipeptídeo e em que m é um inteiro maior do que 0, porém menor do que ou igual a 85 e em que o conjugado imunógeno de peptídeo-carreador de proteína/polipeptídeo capeado tem a fórmula:

em que, C é o carreador de proteína/polipeptídeo e Xd é um grupo funcional derivável de um resíduo de aminoácido do carreador de proteína/polipeptídeo ou, opcionalmente, de um resíduo de aminoácido de um ligante de peptídeo covalentemente ligado ao carreador de proteína/polipeptídeo e cm que P é a molécula de imunógeno de peptídeo, covalentemente ligada ao grupo funcional derivado do resíduo de aminoácido do carreador de proteína ou, opcionalmente, de um resíduo de aminoácido de um ligante de peptídeo covalentemente ligado a um carreador de proteína/polipeptídeo, R é uma molécula de capeamento, covalentemente ligada ao grupo funcional derivado de um resíduo de aminoácido do carreador de proteína/polipeptídeo ou, opcionalmente, de um resíduo de aminoácido de um ligante de peptídeo covalentemente ligado a um carreador de proteína/polipeptídeo, desse modo preservando a funcionalidade do carreador, de modo a reter sua capacidade para eliciar as desejadas respostas imunes contra o imunógeno de peptídeo, o que de outro modo não ocorreria sem um carreador, n é um inteiro maior do que 0, porém menor do que ou igual a 85 e p é um inteiro maior do que 0, porém menor do que 85.

[0044] As formas de realização detalhadas para os primeiro e segundo métodos descritos acima são também aplicáveis aos conjugados há pouco descritos.

[0045] Em outra forma de realização, a invenção é dirigida a conjugados de imunógeno de peptídeo-carreador de proteína/polipeptídeo gerados de acordo com o segundo método da invenção, tendo a fórmula:

em que C é o carreador de proteína/polipeptídeo e Xa é um grupo funcional derivado de um resíduo de aminoácido do carreador de proteína/polipeptídeo ou, opcional mente, de um resíduo de aminoácido de um ligante de peptídeo, covalentemente ligado ao carreador de proteína/polipeptídeo, e em que P c a molécula de imunógeno de peptídeo, covalentemente ligada o grupo funcional derivado do resíduo de aminoácido do carreador de proteína ou, opcionalmente, de um resíduo de aminoácido de um ligante de peptídeo, covalentemente ligado a um carreador de proteína/polipeptídeo, R é uma molécula de capeamento covalentemente ligada ao grupo funcional derivado de um resíduo de aminoácido do carreador de proteína/polipeptídeo ou, opcionalmente, de um resíduo de aminoácido de um ligante de peptídeo, covalentemente ligado a um carreador de proteína/polipeptídeo, desse modo preservando a funcionalidade do carreador, de modo a reter sua capacidade para eliciar as respostas imunes desejadas contra o imunógeno de peptídeo, o que, de outro modo, não ocorreria sem um carreador, n é um inteiro maior do que 0, porém menor do que ou igual a 85 e p é um inteiro maior do que 0, porém menor do que 85.

[0046] As formas de realização detalhadas para o segundo método descrito acima são também aplicáveis aos conjugados gerados pelo segundo método, como há pouco descrito.

[0047] Em outra forma de realização, a invenção é dirigida a composições imunogênicas compreendendo um conjugado de um imunógeno de peptídeo com um carreador de proteína/polipeptídeo gerado pelo segundo método da invenção, junto com um ou mais excipientes, diluentes ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.

[0048] As formas de realização detalhadas para o segundo método e os conjugados gerados, assim, descritos acima, são também aplicáveis a composições imunogênicas contendo aqueles conjugados há pouco descritos.

[0049] Em outra forma de realização, a invenção é dirigida a um método para induzir uma resposta imune em um indivíduo mamífero, que compreende administrar uma quantidade eficaz de uma composição imunogênica da presente invenção ao indivíduo.

[0050] As formas de realização detalhadas, aplicáveis à composição imunogênica contendo os conjugados da presente invenção, são também aplicáveis à forma de realização da invenção dirigida ao método de uso destas composições imunogênicas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0051] Figura 1: Fluxograma representando a química de processamento usada para conjugação de fragmentos de peptídeo Aβ ao carreador de proteína/polipeptídeo CRM197, para formar o conjugado Aβ/CRMi97.

[0052] Figura 2: Fluxograma representando a química de hidrólise ácida usada para determinação quantitativa de S- carboximetilcisteína e S-carboximetilcisteamina, como avaliação do grau de conjugação dos conjugados de imunógeno de peptídeo-carreador de proteína/polipeptídeo, tais como o conjugado Aβ/CRMi97.

[0053] Figura 3: Esta figura representa a dependência de H da reação da conjugação de peptídeo Aβ/CRM.

[0054] Figura 4: Esta figura representa a dependência da conjugação de peptídeo Aβ/CRM da relação peptídeo: CRM.

[0055] Figura 5: Verificação do processo de capeamento para conjugação Aβl-7/CRM. O pH da reação foi de 9.15. O tempo de reação com o peptídeo foi de 16 h, o capeamento com N-acetilcisteamina foi de 8 h.

[0056] Figura 6: Conjugação e capeamento com várias relações de peptídeo: CRM com peptídeo. O pH da reação foi de 9,0. O tempo de reação com o peptídeo foi de 16 h, o capeamento com a N-acetilcisteamina foi de 8 h.

[0057] Figura 7: Titulações do dia 36 de soros de primatas, em seguida à imunização dos primatas com conjugados de peptídeo Aβ com vários adjuvantes.

[0058] Figura 8: Titulações do dia 64 de soros de primata, em seguida à imunização de primatas com conjugados de peptídeo Aβ com vários adjuvantes.

[0059] Figura 9: Titulações de primatas por dia e grupo de tratamento. Os primatas foram imunizados com conjugados Aβ 1-7 ou Aβ 1-5 CRM197 com alume ou 529 como adjuvantes e os títulos de anticorpos anti- Aβ foram medidos nos dias 29, 36, 57 e 54.

[0060] Figura 10: Conjugados de peptídeo-proteína foram caracterizados empregando-se análise SDS-PAGE Western blot com um gel pré-moldado de tris-tricina. As faixas são: marcador (faixa 1); E-28375 24/01 (faixa 2); E-28375 24/02 (faixa 3); E-28375 24/03 (faixa 4); L28375 24/04 (faixa 5); L-28375 24/05 (faixa 6); L-28375 24/06 (faixa 7) L-28375 24/07 (faixa 8); L-28375 24/08 (faixa 9); L-28375 24/09 (simulado) (faixa 10); e BrAcCRMi97 (faixa 11). BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQÜÊNCIAS

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0061] A presente invenção é dirigida a métodos de gerar conjugados de imunógeno de peptídeo-proteína, em que os grupos funcionais ativos não reagidos do carreador, que são gerados durante a ativação, são inativados utilizando-se reagentes de capeamento, tais como N- acetilcisteamina, a fim de evitar que reajam mais. A presente invenção é também dirigida a conjugados de carreador-imunógeno de peptídeo capeados, gerados por aqueles métodos, e a composições imunogênicas compreendendo ditos conjugados.

[0062] A abordagem de aumentar a imunogenicidade de moléculas pequenas ou fracamente imunogênicas, tais como sacarídeos, através da conjugação, tem sido utilizada com sucesso por décadas (vide, por exemplo, Goebel et al. (1939) J. Exp. Med. 69: 53) e muitas composições imunogênicas foram descritas em que polímeros capsulares purificados foram conjugados com proteínas carreadoras, para criar composições imunogênicas mais eficazes, pela exploração deste “efeito carreador”. Por exemplo, Schneerson et al. (J. Exp. Med. 152: 361 - 3786, 1980) descrevem conjugados de Haemophilus influenzae b proteína polissacarídeo que conferem imunidade a doenças invasivas causadas por aquele microorganismo. Os conjugados de PRP (poliribosilribitol fosfato, um polímero capsular de H. influenzaeb) mostraram ser mais eficazes do que as composições imunogênicas baseadas apenas no polissacarídeo (Chu et al. (1983) Infect. Immun. 40: 245; Schneerson et al. (1984), Infect. Immun. 45: 582-591). A conjugação também mostrou desviar-se da fraca resposta anticorpo, usualmente observada em crianças, quando imunizadas com um polissacarídeo livre (Anderson et al. (1985) J. Pediatr. 107: 346; Insel et al. (1986) J. Exp. Med. 158:294.

[0063] Uma outra vantagem de utilizar-se como o carreador de proteína uma toxina ou toxóide bacteriano, contra o qual a imunização de rotina de humanos (por exemplo, tétano ou difteria) é uma prática padrão, é que uma imunidade desejada para a toxina ou toxóide é induzida juntamente com a imunidade contra os patógenos associados com o polímero capsular.

[0064] Os conjugados de determinante antigênico/carreador-hapteno estão também sendo usados para produzir anticorpos monoclonais altamente específicos, que podem reconhecer epítopos químicos distintos no hapteno acoplado. Os monoclonais resultantes com frequência são usados para investigar a estrutura epitópica e as interações entre as proteínas nativas. Em muitos casos, os determinantes antigênicos/haptenos usados para gerar estes monoclonais são pequenos segmentos de peptídeo, representando sítios antigênicos cruciais da superfície de proteínas maiores. Os critérios para um carreador bem sucedido, a serem usados na geração de um conjugado de determinante antigênico/carreador- hapteno, são o potencial para imunogenic idade, a presença de grupos funcionais adequados para a conjugação com um determinante antigênico/hapteno, propriedades de solubilidade razoáveis, mesmo após derivação, e falta de toxicidade in vivo.

[0065] Estes critérios são satisfeitos pelos conjugados gerados pelos métodos da presente invenção. Os conjugados podem ser quaisquer conjugados de imunógeno de peptídeo-carreador, gerados utilizando-se o processo de conjugação aqui descrito. Os conjugados são gerados utilizando-se um processo da presente invenção, em que um carreador de proteína/polipeptídeo, tendo a seguinte estrutura:

é covalentemente ligado a um carreador de proteína/polipeptídeo, em que, C é um carreador de proteina/polipeptídeo e X é um grupo funcional derivável de um resíduo de aminoácido do carreador de proteína/polipeptídeo ou, opcionalmente, de um resíduo de aminoácido de um ligante de peptídeo, covalentemente ligado ao carreador de proteína/polipeptídeo e em que m é um inteiro maior do que 0, porém menor do que ou igual a 85, é covalentemente ligado a um imunógeno de peptídeo e em que o conjugado de imunógeno de peptídeo-carreador de proteína/polipeptídeo tem a seguinte fórmula, é representado ela seguinte fórmula:

em que C é o carreador de proteína/polipeptídeo e X'1 é um grupo funcional derivado de um resíduo de aminoácido do carreador de proteína/polipeptídeo ou, opcionalmente, de um resíduo de aminoácido de um ligante de peptídeo, covalentemente ligado ao carreador de proteína/polipeptídeo, P é um imunógeno de peptídeo covalentemente ligado ao grupo funcional derivado do resíduo de aminoácido do carreador de proteína/polipeptídeo ou, opcionalmente, de um resíduo de aminoácido de um ligante de peptídeo, covalentemente ligado a um carreador de proteína/polipeptídeo, R é uma molécula de capeamento, covalentemente ligada ao grupo funcional derivado de um resíduo de aminoácido do carreador de proteína/polipeptídeo ou, opcionalmente, de um resíduo de aminoácido de um ligante de peptídeo, covalentemente ligado a um carreador de proteína/polipeptídeo, desse modo preservando a funcionalidade do carreador, de modo a reter sua capacidade de eliciar as desejadas respostas imunes contra o imunógeno de peptídeo que, de outro modo, não ocorreria sem um carreador, n é um inteiro maior do que 0, porém menor do que ou igual a 85 e p é um inteiro maior do que 0, porém menor do que 85.

Seleção de Carreadores

[0066] Alguns imunógenos de peptídeo contêm o apropriado cpítopo para induzir uma resposta imune, porém são demasiados pequenos para serem imunogênicos. Nesta situação, os imunógenos de peptídeo são ligados a um carreador adequado, para ajudar a eliciar uma resposta imune. Na representação esquemática acima do conjugado de imunógenos de peptídeo-carreador, gerado por um processo da presente invenção, C é um carreador de proteína/polipeptídeo com que os imunógenos de peptídeo são conjugados diretamente via grupos funcionais derivados dos próprios resíduos de aminoácido do carreador ou indiretamente via grupos funcionais derivados dos ligantes de peptídeo, covalentemente ligados aos carreadores. Carreadores de proteína/polipeptídeo adequados incluem mas não são limitados a albumina (incluindo albumina de soro humano), hemocianina de lapa buraco de fechadura, moléculas de imunoglobulina, tiroglobulina, ovalbumina, toxóide de tétano ou um toxóide de outras bactérias patogênicas, tendo reduzida toxicidade, incluindo mutantes, tais como difteria, E. coli, cólera ou H. pyloriou um derivado de toxina atenuado. Um tal carreador é a proteína CRM197 (SEQ. ID NO: 40), que tem reação cruzada com a toxina da difteria.

[0067] Outros carreadores incluem epítopos de célula-T, que se ligam a múltiplos alelos de MHC, por exemplo, pelo menos 75% de todos os alelos MHC humanos. Tais carreadores são às vezes conhecidos na técnica como “epítopos de célula-T universais”. Carreadores exemplificativos, com epítopos de célula-T universais, incluem: Hemaglutinina da Influenza: HA307-319 PKYVKQNTLKLAT (SEQ. ID NO: 11) Peptídeo PAN-DR (peptídeo PADRE) AKXVAAWTLKAAA (SEQ. ID NO: 12) CS da Malária: epítopo T3 EKKIAKMEK AS S VFN V (SEQ. ID NO: 13) Antígeno superfície Hepatite B: HBgAg19-28 FELLTRILTI (SEQ. ID NO: 14) Proteína Choque Térm. 65:hsp65153-171 QSIGDLIAEAMDKVGNEG (SEQ. ID NO: 15) Bacilo Calmette-Guerin (BCG) QVHFQPLPPAVVKL (SEQ. ID NO: 16) Toxóide do Tétano: TT830-844 QYIKANSKFIGITEL (SEQ. ID NO: 17) Toxóide do Tétano: TT947-967 NNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ. ID NO: 18) HIV gp120 T1: KQIINMWQEVGKAMY (SEQ. ID NO: 19) CRM197 Vide a Breve Descrição das Sequências (SEQ. ID NO: 40) Fragmentos de Albumina ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ. ID NO: 41)

[0068] Outros carreadores para estimular ou aumentar uma resposta imune e com que um imunógeno de peptídeo ou um hapteno pode ser conjugado, incluem citocinas tais como IL-1, IL-1 oc e peptídeos β, IL-2, ylNF, IL-10, GM-CSF e quimiocinas, tais como MIP lot e β e RANTES. Os peptídeos imunogênicos podem também ser ligados a carreador de proteína/peplídeo, que aumentam o transporte através dos tecidos, como descrito em O’Mahony, WO 97/17163 e WO 97/17614, que são por este meio incorporados por referência em sua totalidade, para todas as finalidades.

[0069] Ainda outros carreadores incluem Streptococcal C5a peptidase recombinante, Streptococcus pyogenes ORFs 1224, 1664 e 2452, Chlamydia pneumoniae ORFs T367 e T858, fatores de crescimento e hormônios.

[0070] Em uma forma de realização preferida da presente invenção, a proteína carreadora é CRMI97,um mutante não-tóxico da toxina da difteria com uma mudança amino ácida em sua sequência primária. A glicina presente na posição amino ácida 52 da molécula é substituída por um ácido glutâmico, devido a uma única mudança do códon do ácido nucléico. Devido a esta mudança, a proteína não tem atividade de transferase de ribosil- ADP e torna-se não-tóxica. Ela tem um peso molecular de 58.408 Da. A CRM197 é produzida em grandes quantidades por expressão recombinante de acordo com a Patente U.S. 5.614.382, que é por este meio incorporada por referência. As conjugações dos sacarídeos bem como dos peptídeos com CRM 197 são realizadas por ligação através dos grupos amino-e dos resíduos de lisina. Foi bem estabelecido, através de diversos produtos comerciais, que CRM197 é um excelente e seguro carreador para os epítopos de célula-B.

Peptídeos imunogênicos

[0071] Como aqui usada, a expressão “imunógeno de peptídeo” ou “hapteno” é qualquer proteína ou estrutura/fragmento/análogo subunitário derivado dela, que pode eliciar, facilitar ou ser induzido para produzir uma resposta imune na administração a um mamífero. Em particular, a expressão é usada para referir-se a um determinante antigênico de polipeptídeo de qualquer fonte (bactérias, vírus ou eucarioto), que pode ser acoplado a um carreador empregando-se um método aqui descrito. Tais imunógeno de polipeptídeo/determinantes antigênicos podem ser de origem celular virai, bacteriana ou eucariótica.

[0072] Imunógenos de peptídeo de uma célula bacteriana incluem aqueles derivados de superfície de célula bacteriana ou proteínas secretadas, que podem ser usadas nas composições imunogênicas baseadas em proteína. Cepas bacterianas exemplitlcativas incluem Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenza, Klebsiella spp., Pseudomonas spp., Salmonella spp., Shigella spp., Alloiococciis odditis e streptococciGrupo B.

[0073] Imunógenos de peptídeo exempliticativos de virus incluem aqueles derivados do vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus do herpes simples (HSV), virus do papiloma humano (HPV), virus da parainfluenza (PIV), virus da estomatite vesicular (VSV), virus sincial respiratório (RSV), virus Epstein-Barr (EBV), coronavirus, virus da vacinia, rotavirus, virus da raiva, virus da hepatite C (HCV) e virus da hepatite B (HBV), para citar alguns.

[0074] Imunógenos de peptídeo fúngico exemplificativos incluem aqueles derivados de Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Coccidoides spp., Histoplasma spp. e Aspergillus spp. Antígenos parasíticos incluem aqueles derivados de Plasmodium spp., Trypanosoma spp., Schistosoma spp., Leishmania spp. e similares.

[0075] Imunógenos de peptídeo eucarióticos exemplificativos, que podem ser conjugados com um carreador para uso como um imunoterapêutico na prevenção, tratamento, profilaxia ou melhoria de várias doenças humanas, incluem aqueles associados com células tumorais, aqueles derivados de Aβ, um peptídeo de 39-43 aminoácidos, preferivelmente 42 aminoácidos, que são o componente principal das placas características da doença de Alzheimer (AD) (vide US 4.666.829; Glenner & Wong (1984) Biochem. Biophy. Rs. Commun. 120: 1131, Hardy (1984) TINS20: 1131; Hardy (1977) TINS 20: 154), aqueles derivados de peptídeos amilóides da amilina, um material de polipeptídeo produzido pelas células ilhotas pancreáticas, que tem estado implicado no diabetes tipo II, peptídeos derivados dos produtos genéticos da lipoproteína de baixa densidade, que têm estado implicados na aterosclerose e peptídeos antigênicos derivados de citocinas inflamatórias e fatores de crescimento, tais como interleucina 6 (IL- 6), fator de necrose tumoral oc (TNF-oc) e GDF-8. Tais imunógenos de peptídeo eucarióticos podem incluir epítopo de célula-T (CTL) ou célula-B.

[0076] Um “epítopo CTL” é um derivado das regiões epitópicas selecionadas de antígenos alvo potenciais, tais como antígenos associados a tumor, incluindo mas não limitado a carcinoma de célula renal, câncer de mama, antígenos carcinoembriônicos, antígenos de melanoma (MAGE) e antígenos específicos de câncer da próstata, tais como antígeno de membrana específico de próstata (PSMA) e antígeno de célula tronco da próstata (PSCA), antígenos da hepatite C.

[0077] Aβ, também conhecido como peptídeo amiloide-β ou peptídeo A4 (vide US 4.666.829; Glenner & Wong, Biochem. Biophys. Res. Commun., 120, 1131 (1984)), é um peptídeo de 39 - 43 aminoácidos, que é o principal componente das placas características da doença de Alzheimer. Aβ é gerado pelo processamento de uma proteína APP maior por duas enzimas, denominadas secretases β e y (vide Hardy, TINS 20, 154 (1997)). As mutações conhecidas de APP, associadas com a doença de Alzheimer, ocorrem próximo ao sítio da secretase β ou y, ou dentro de Aβ. Por exemplo, a posição 717 é próxima ao sítio de clivagem da secretase-y de APP em seu processamento para Aβ e as posições 670/671 são próximas ao sítio de clivagem da secretase-β. Acredita-se que as mutações causem AD pela interação com as reações de clivagem pelas quais Aβ é formada, a fim de aumentar a quantidade da forma de aminoácidos 42/43 de Aβ gerado.

[0078] Aβ tem a propriedade incomum de que pode fixar e ativar cascatas complementares clássicas e alternativas. Em particular, ele liga-se a Clq e, finalmente, a C3bi. Esta associação facilita a ligação em macrófagos, resultando na ativação das células-B. Além disso, C3bi decompõe-se mais e então liga-se a CR2 das células B em uma maneira dependente de célula T, resultando em um aumento 10.000 vezes de ativação destas células. Este mecanismo faz com que Aβ gere uma resposta imune excedente àquela de outros antígenos.

[0079] Aβ tem diversas formas naturalmente ocorrentes. As formas humanas de Aβ são referidas como Aβ39, Aβ40, Aβ41, Aβ42 e Aβ43. As sequências destes peptídeos e sua relação com o precursor APP são ilustradas pela Figura 1 de Hardy et al., TINS 20, 155-158 (1997). Por exemplo, Aβ42 tem a sequência: H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val- His- His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly- Ser-Asn- Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val- Val-IIe- Ala-OH (SEQ. ID NO: 21).

[0080] Aβ41, Aβ40 e Aβ39 diferem de Aβ42 pela omissão de Ala, Ala-Ile e Ala-Ile-Val, respectivamente da extremidade do terminal-C. Aβ difere de Aβ42 pela presença de um resíduo de treonina no terminal-C.

[0081] Os imunógenos de peptídeo, que são fragmentos de Aβ, são vantajosos em relação à molécula intacta para uso nos presentes métodos por diversas razões. Primeira, em razão de somente certos epítopos dentro de Aβ induzirem uma resposta imunogênica útil, para tratamento da doença de Alzheimer, uma dosagem igual de massa de um fragmento contendo tais epítopos provê uma maior concentração molar dos epítopos imunogênicos úteis do que uma dosagem de Aβ intacto. Segunda, certos imunógenos de peptídeo de Aβ geram uma resposta imunogênica contra depósitos amilóides, sem gerar uma significativa resposta imunogênica contra a proteína APP de que Aβ deriva-se. Terceira, os imunógenos de peptídeo de Aβ são de manufatura mais simples do que Aβ intacto, devido a seu mais curto tamanho. Quarta, os imunógenos de peptídeo de Aβ não se agregam da mesma maneira que o Aβ intacto, simplificando a preparação dos conjugados com carreadores.

[0082] Alguns dos imunógenos de peptídeo de Aβ têm uma sequência de pelo menos 2, 3, 5, 6, 10 ou 20 aminoácidos contíguos de um peptídeo natural. Alguns imunógenos de peptídeo não têm mais do que 10, 9, 8, 7, 5 ou 3 resíduos contíguos de Aβ. Em uma forma de realização preferida, os imunógenos de peptídeo da metade de terminal-N de Aβ são usados para preparar conjugados. Os imunógenos de peptídeo preferidos incluem Aβl-5, 1-6, 1-7, 1-10, 1-11, 3-7, 1-3 e 1-4. A designação Aβl-5, por exemplo, indica um fragmento de terminal-N incluindo os resíduos 1-5 de Aβ. Os fragmentos de Aβ começando no terminal-N e terminando em um resíduo dentro dos resíduos 7-11 de Aβ, são particularmente preferidos. O fragmento Aβl-12 pode também ser usado, porém é menos preferido. Em alguns métodos, o fragmento é um fragmento de terminal-N que não Aβl-10. Outros fragmentos preferidos incluem Aβl3-28, 15-24, 1-28, 25-35, 35-40, 35-42 e outros fragmentos internos e fragmentos de terminal-C.

[0083] Alguns peptídeos Aβ da invenção são peptídeos imunogênicos que, na administração a um paciente humano ou animal, geral anticorpos que especificamente ligam-se a um ou mais epítopos entre os resíduos 16 e 25 de Aβ. Fragmentos preferidos incluem Aβl6-22, 16-23, 17- 23, 17-24, 18-24 e 18-25. Os anticorpos especificamente ligam-se a epítopos entre os resíduos 16 e 25, especificamente ligam-se a Aβ solúvel, sem se ligarem às placas de Aβ. Estes tipos de anticorpo podem especificamente ligar-se a Aβ solúvel na circulação de um paciente ou modelo animal, sem especificamente ligarem-se a placas de depósitos de Aβ do cérebro do paciente ou modelo. A ligação específica dos anticorpos em Aβ solúvel inibe a Aβ de ser incorporado dentro das placas, assim inibindo o desenvolvimento das placas de um paciente ou inibindo um outro aumento do tamanho ou frequência de placas, se tais placas já tiverem se desenvolvido antes do tratamento ser administrado.

[0084] Preferivelmente, o fragmento de Aβ administrado não tem um epítopo que geraria uma resposta de célula T ao fragmento. Geralmente, os epítopos de célula-T são maiores do que 10 aminoácidos contíguos. Portanto, fragmentos preferidos de Aβ são de tamanho 5-10 ou, preferivelmente, 7-10 aminoácidos contíguos ou, muitíssimo preferivelmente, 7 aminoácidos contíguos; isto é, suficiente comprimento para gerar uma resposta anticorpo, sem gerar uma resposta de célula T. A ausência de epítopos de célula-T é preferida porque estes epítopos não são necessários para atividade imunogênica de fragmentos e podem provocar uma indesejada resposta inflamatória em um subconjunto de pacientes (Anderson et al., (2002) J. Immunol. 168, 3697-3701; Senior (2002) Lancet Neurol. 1, 3).

[0085] O fragmento de Aβl5-25 e subfragmentos de 7-8 aminoácidos contíguos dele são preferidos porque estes peptídeos geram consistentemente uma alta resposta imunogênica ao peptídeo Aβ. Estes fragmentos incluem Aβl6-22, Aβl6-23, Aβl6-24, Aβl7-23, Aβl7-24, Aβl8- 24 e Aβl8-25. Subfragmentos Aβl5-25 particularmente preferidos são 7 aminoácidos contíguos de comprimento. A designação Aβl5-21, por exemplo, indica um fragmento incluindo os resíduos 15-21 de Aβ e não tendo outros resíduos de Aβ e, preferivelmente, 7-10 aminoácidos contíguos. Estes fragmentos podem gerar uma resposta anticorpo que inclui anticorpos específicos de extremidade.

[0086] Os imunógenos de peptídeo de Aβs requerem avaliação quanto à atividade de remover ou evitar depósitos amilóides (vide WO 00/72880, que é incorporado aqui em sua totalidade para todas as finalidades). A administração de fragmentos de terminal-N de Aβ induz a produção de anticorpos que reconhecem os depósitos Aβ in vivo e in vitro. Os fragmentos não tendo pelo menos um e às vezes pelo menos 5 ou 10 aminoácidos de terminal-C presentes, em formas naturalmente ocorrentes de Aβ, são usados em alguns métodos. Por exemplo, um fragmento não tendo 5 aminoácidos da extremidade de terminal-C de Aβ43 inclui os primeiros 38 aminoácidos da extremidade de terminal-C de Aβ.

[0087] A menos que de outro modo indicado, referência a Aβ inclui as sequências amino ácidas humanas naturais indicadas acima, bem como análogos incluindo alélicos, espécies e variantes induzidas. Os análogos tipicamente diferem dos peptídeos naturalmente ocorrentes em uma, duas ou algumas posições, com frequência em virtude de substituições conservativas. Os análogos tipicamente exibem pelo menos 80 ou 90% de identidade de sequência com peptídeos naturais. Alguns análogos também incluem aminoácidos não naturais ou modificações de aminoácidos de terminal-N ou C em uma, duas ou algumas posições. Por exemplo, o resíduo ácido aspártico natural da posição 1 e/ou 7 de Aβ pode ser substituído por ácido iso-aspártico.

[0088] Exemplos de aminoácidos não naturais são D, alfa, aminoácidos D, alfa, alfa-dissubstituídos, aminoácidos de N-alquila, ácido lático, 4-hidroxiprolina, gama-carboxiglutamato, épsilon-N,N,N-trimetilisina, épsilon-N-acetilisina, O-fosfosserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3- metilistidina, 5-hidroxilisina, ômega-N- metilarginina, β-alanina, ornitinina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, tiroxina, ácido gama-amino butírico, homosserina, citrulina e ácido isoaspártico. Os peptídeos imunogênicos também incluem análogos de Aβ e seus fragmentos. Alguns agentes terapêuticos da invenção são todos peptídeos-D, por exemplo, todos D Aβ, todos fragmento D Aβ ou análogos de todos D Aβ ou todos fragmento de D Aβ. Os fragmentos e análogos podem ser avaliados quanto à eficácia profilática ou terapêutica em modelos de animais transgênicos, em comparação com controles não-tratados ou placebo, como descrito em WO 00/72880.

[0089] Os imunógenos de peptídeo também incluem polipeptídeos mais longos, que incluem, por exemplo, um imunógeno de peptídeo Aβ, junto com outros aminoácidos. Por exemplo, peptídeos imunogênicos preferidos incluem proteínas de fusão compreendendo um segmento de Aβ ligado a uma sequência amino ácida heteróloga, que induz uma resposta de célula T auxiliar contra a sequência amino ácida heteróloga e, desse modo, uma resposta de célula-B contra o seguimento Aβ. Tais polipeptídeos podem ser avaliados quanto à eficácia profilática ou terapêutica em modelos animais, em comparação com controles não-tratados ou placebo, como descrito no WO 00/72880.

[0090] O peptídeo Aβ, análogo, fragmento imunogênico ou outro polipeptídeo pode ser administrado em forma desagregada ou agregada. Aβ desagregado ou seus fragmentos significa unidades de peptídeo monoméricas. Aβ desagregado ou seus fragmentos são geralmente solúveis e são capazes de auto-agregarem para formar oligômeros solúveis, protofibrilas e ADDLs. Os oligômeros de Aβ e seus fragmentos são usualmente solúveis e existem predominantemente como hélices-alfa ou espirais aleatórias. Aβ agregado ou seus fragmentos significa oligômeros de Aβ ou seus fragmentos, que se associaram em conjuntos de folha-beta insolúveis. Aβ agregado ou seus fragmentos também significa polímeros fibrilares. As fibrilas são usualmente insolúveis. Alguns anticorpos ligam-se a Aβ solúvel ou seus fragmentos ou Aβ agregado ou seus fragmentos. Alguns anticorpos ligam-se tanto a Aβ solúvel ou seus fragmentos e Aβ agregado ou seus fragmentos.

[0091] Os peptídeos imunogênicos também incluem multímeros de peptídeos imunogênicos monoméricos. Os peptídeos imunogênicos que não peptídeos Aβ devem induzir uma resposta imunogênica contra um ou mais dos fragmentos preferidos de Aβ listados acima (por exemplo, Aβl-3, 1-7, 1-10 e 3-7).

[0092] Os peptídeos imunogênicos da presente invenção são ligados a um carreador empregando-se um método da presente invenção, para formar um conjugado. O peptídeo imunogênico pode ser ligado em seu término amino, seu término carboxila, ou ambos, a um carreador, para formar um conjugado. Opcionalmente, múltiplas repetições do peptídeo imunogênico podem estar presentes no conjugado.

[0093] Um fragmento de terminal-N de Aβ pode ser ligado em seu termino-C a um peptídeo carreador, para formar um conjugado. Em tais conjugados, o resíduo de terminal-N do fragmento de Aβ constitui o resíduo de terminal-N do conjugado. Portanto, tais conjugados são eficazes na indução de anticorpos que se ligam a um epítopo que requer o resíduo de terminal-N de Aβ para ficar em forma livre. Alguns peptídeos imunogênicos da invenção compreendem uma pluralidade de repetições de um segmento de terminal-N de Aβ ligado no terminal-C a uma ou mais cópias de um peptídeo carreador, para formar um conjugado. O fragmento de terminal-N de Aβ, incorporado dentro de tais conjugados, às vezes começa em Aβl-3 e termina em Aβ7-ll. Aβl-7, 1-3, 1-4, 1-5 e 3-7 são fragmentos de terminal-N de Aβ. Alguns conjugados compreendem diferentes segmentos de terminal-N de Aβ em tandem. Por exemplo, um conjugado pode compreender Aβl-7, seguido por Aβl-3 ligado a um carreador.

[0094] Em alguns conjugados, um segmento de terminal-N de Aβ é ligado em sua extremidade de terminal-N a um peptídeo carreador. A mesma variedade de segmentos de terminal-N de Aβ pode ser usada como com a ligação de terminal-C. Alguns conjugados compreendem um peptídeo carreador, ligado ao terminal-N de um segmento de terminal-N de Aβ, que é, por sua vez, ligado a um ou mais segmentos de terminal-N de Aβ em tandem. Preferivelmente, tais fragmentos de Aβ imunogênico, uma vez conjugados a um carreador apropriado, induz uma resposta imunogênica, que é especificamente dirigida ao fragmento Aβ, sem ser dirigida a outros fragmentos de Aβ.

[0095] Os peptídeos imunogênicos da invenção incluem peptídeos heterólogos imunogênicos. Em alguns peptídeos imunogênicos, um fragmento Aβ é ligado a um carreador para formar um peptídeo heterólogo imunogênico. Este peptídeo heterólogo é ligado a um carreador empregando- se um método da presente invenção, para formar um conjugado. Alguns destes peptídeos heterólogos imunogênicos compreendem fragmentos de Aβ ligados aos epítopos de toxóide de tétano, tal como descrito em US 5.196.512, EP 378.881 e EP 427.347. Opcionalmente, um peptídeo imunogênico pode ser ligado a uma ou múltiplas cópias de um carreador, por exemplo, em ambos os términos N e C do carreador, para formar um peptídeo heterólogo imunogênico. Outros destes peptídeos heterólogos imunogênicos compreendem fragmentos de Aβ ligados a peptídeos carreadores descritos em US 5.736.142. Por exemplo, um peptídeo heterólogo imunogênico pode compreender Aβl-7, seguido por Aβl-3, seguido por um carreador. Exemplos de tais peptídeos heterólogos imunogênicos incluem:

[0096] Aβ 1-7/toxóide do Tétano 830-844 + 947-767 em uma configuração linear DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELFNNFT VSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO.: 24)

[0097] Os peptídeos descritos no US 5.736.142 (todos em configurações lineares): PADRE/Aβ 1-7: AKXVAAWTLKAAA-DAEFRHD (SEQ ID NO.: 26) Aβl-7 x 3/PADRE: DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO.: 27) PADRE/Aβl-7 x 3: AKXVAAWTLKAAA-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD (SEQ ID NO.: 28) Aβl-7/PADRE: DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO.: 29) Aβl-7/fragmento de albumina: DAEFRHD-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO.: 30) Aβ4-10/fragmento de albumina: FRHDSGY-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO.:31) Aβ3-9/fragmento de albumina: EFRHDSG-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO.: 32) HA307-3i9/Aβi-7 x 3: PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD (SEQ ID NO.: 33) Aβ 1-7/HA307-319/Aβ 1-7: DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD (SEQ ID NO.: 34) Aβ I-7X3/H A307-319: DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO.: 35) Aβ-1-7X 2/HA307-319: DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO.: 36) Aβl-7/HA307-319/CS Malária CS/TT830-844/TT947.967/Aβi-7 DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-EKKIAKMEKASSVFNV- QYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE- DAEFRHD (SEQ ID NO.: 37) Aβi-7X 3/TT830-844/C/TT947-967 DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL- C- FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO.: 38) Aβi-7/TT830-844/C/TT947-967 DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELCFN NFTVSF WLR VPKVSASHLE (SEQ ID NO.: 39) Aβ I-7/TT83O-844/C/TT947-967/ Aβ 1-7 DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL-C-FNNFTVSFWLRV PKVSASHLE-DAEFRHD (SEQ ID NO.: 20)

[0098] Alguns peptídeos heterólogos imunogênicos compreendem um multímero de peptídeos imunogênicos, representados pela fórmula 2X, em que x é um inteiro de 1 - 5. Preferivelmente, x é 1, 2 ou 3, com 2 sendo muitíssimo preferido. Quando x é dois, tal multímero tem quatro peptídeos imunogênicos ligados em uma configuração preferida, referida como MAP4 (vide US 5.229.490). Tais peptídeos imunogênicos são então ligados a um carreador utilizando-se um método da presente invenção para formar um conjugado.

[0099] A configuração MAP4 é mostrada abaixo, onde estruturas ramificadas são produzidas iniciando-se a síntese do peptídeo tanto no terminal-N como nas aminas de lisina de cadeia lateral. Dependendo do número de vezes que a lisina é incorporada dentro da seqüência e permitida ramificar, a estrutura resultante apresentará múltiplos terminais-N. Neste exemplo, quatro terminais-N idênticos foram produzidos no núcleo contendo lisina ramificado. Tal multiplicidade aumenta grandemente a responsividade das células B cognatas.

[00100] Exemplos de tais peptídeos heterólogos imunogênicos incluem: Aβ 1-7/Toxóide do Tétano 830-844 em uma configuração MAP4: DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL (SEQ. ID NO: 22) Aβ 1-7/Toxóidc do Tétano 947-967 em uma configuração MAP4: DAEFRHD-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ. ID NO: 23) Aβ 3-9/Toxóide do Tétano 830-844 em uma configuração MAP4: EFRHDSG-QYIKANSKFIGITEL (SEQ. ID NO: 25) DAEFRHD-QYIKANSKFGITEL de uma resina 2 ramificada

[00101] O peptídeo Aβ, análogo, fragmento ativo ou outro polipeptídeo pode ser administrado em forma associada ou multimérica ou em forma dissociada. Os agentes terapêuticos também incluem multímeros de agentes imunogênicos monoméricos. Agentes que não peptídeos Aβ devem induzir uma resposta imunogênica contra um ou mais fragmentos preferidos de Aβ listados acima (por exemplo, 1-10, 1-7, 1-3 e 3-7) e podem também ser conjugados a um carreador empregando-se um método da presente invenção. Preferivelmente, tais agentes, uma vez conjugados com um apropriado carreador, induzem uma resposta imunogênica, que é especificamente dirigida a um destes fragmentos, sem ser dirigida a outros fragmentos de Aβ. Para facilitar a conjugação de um imunógeno de peptídeo com um carreador, aminoácidos adicionais podem ser adicionados aos términos dos determinantes antigênicos. Os resíduos adicionais podem também ser usados para modificar as propriedades físicas ou químicas do imunógeno de peptídeo. Aminoácidos tais como tirosina, cisteina, lisina, ácido glutâmico ou ácido aspártico, ou similares, podem ser introduzidos no terminal-C ou terminal-N do imunógeno de peptídeo. Adicionalmente, ligantes de peptídeo contendo aminoácidos tais como glicina e alanina podem também ser introduzidos. Além disso, os determinantes antigênicos podem diferir da sequência natural ao ser modificado pela acilação de grupo NIL terminal, por exemplo, alcanoíla (C1-C20) ou acetilação de tioglicolila, amidação de carbóxi-terminal, por exemplo, amónia, metilamina etc. Em alguns exemplos, estas modificações podem prover sítios para ligação a um suporte ou outra molécula.

[00102] Os imunógenos de peptídeo usados para gerar conjugados da presente invenção, empregando-se um processo descrito aqui, podem ser combinados via ligação, para formar polímeros (multímeros) ou podem ser formulados em uma composição sem ligação, como uma mistura. Onde um peptídeo é ligado a um peptídeo idêntico, desse modo formando um homopolímero, uma pluralidade de unidades epitópicas repetidoras são apresentadas. Por exemplo, a tecnologia de múltiplos peptídeos antígenos (MAP) é usada para construir polímeros contendo tanto CTL e/ou peptídeos anticorpo e peptídeos. Quando os peptídeos diferem, por exemplo, de um coquetel representando diferentes subtipos virais, diferentes epítopos dentro de um subtipo, diferentes especificidades de restrição HLA, ou peptídeos que contêm epítopos auxiliares-T, heteropolímeros com unidades repetidoras são providos. Além de ligações covalentes, ligações não-covalentes, capazes de formar ligações intermoleculares e intraestruturais são também contempladas.

[00103] Tais imunógenos de peptídeo e seus análogos são sintetizados por síntese de peptídeo de fase sólida ou expressão recombinante, ou são obtidos de fontes naturais. Sintetizadores de peptídeo automáticos são comercialmente disponíveis em numerosos fornecedores, tais como Applied Biosystems, Foster City California.

[00104] A expressão recombinante pode ser em bactérias, tais como E. coli), levedura, células de insetos ou células mamíferas. Os procedimentos para expressão recombinante são descritos por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press, NY, 2a. ed., 1989). Alguns peptídeos imunogênicos são também comercialmente disponíveis (por exemplo, American Peptides Company, Inc., Sunnyvale, CA e California Peptide Research, Inc. Napa, (CA).

[00105] Bibliotecas aleatórias de peptídeos ou outros compostos podem também ser avaliadas quanto à adequabilidade como um imunógeno de peptídeo. As bibliotecas combinatoriais podem ser produzidas para muitos tipos de compostos que podem ser sintetizados em um modo de etapa-por-etapa. Tais compostos incluem polipeptídeos miméticos de rotação beta, hormônios, glicinas N-substituídas oligoméricas e oligocarbamatos e similares. Grandes bibliotecas combinatoriais dos compostos podem ser construídas pelo método das bibliotecas sintéticas codificadas (ESL),descrito no WO 95/12608, WO 93/06121, WO 94/08051, WO 95/35503 e WO 95/30642 (cada um dos quais é incorporado por referência para todas as finalidades). As bibliotecas de peptídeos podem também ser geradas por métodos de exibição de fago (vide, por exemplo, Devlin, WO 91/18980).

Derivação e Conjugação de um Peptídeo Imunogênico com um Carreador de Proteína

[00106] O sítio de ligação de um imunógeno de peptídeo com um carreador de proteína/polipeptídeo e a natureza do agente de reticulação que é usado para ligar um imunógeno de peptídeo ao carreador são ambos importantes para a especificidade do anticorpo resultante gerado contra ele. Para o adequado reconhecimento, o imunógeno de peptídeo deve ser acoplado ao carreador com a apropriada orientação. Para um anticorpo reconhecer subsequentemente os imunógenos de peptídeo livres sem carreador, o conjugado de imunógeno de peptídeo-carreador de proteína/polipeptídeo deve apresentar os imunógenos de peptídeo em uma forma exposta e acessível. Orientação ótima é com freqüência conseguida dirigindo-se a reação de reticulação para sítios específicos dos imunógenos de peptídeo. Uma maneira para se conseguir isto com um imunógeno de peptídeo é ligando-se um resíduo de cisteína terminal durante a síntese do peptídeo. Isto fornece um grupo sulfidrila em uma extremidade do peptídeo, para conjugação com o carreador. A reticulação através deste grupo provê ligação do imunógeno de peptídeo somente em uma extremidade, desse modo assegurando consistente orientação.

[00107] Na conjugação de imunógeno de peptídeo- carreador, o objetivo é não manter o estado nativo ou estabilidade do carreador, mas apresentar o hapteno do melhor modo possível ao sistema imune. Ao alcançar este objetivo, a escolha da química de conjugação pode controlar o título resultante, afinidade e especificidade dos anticorpos gerados contra o hapteno. Pode ser importante em alguns casos escolher um agente de reticulação contendo um braço espaçador bastante longo para apresentar o antígeno em um modo não-restrito. Pode também ser importante controlar a densidade do imunógeno de peptídeo na superfície do carreador. Demasiado pouca substituição do imunógeno de peptídeo pode resultar em pouca ou nenhuma resposta. Uma densidade de imunógeno de peptídeo demasiado elevada realmente pode causar supressão imunológica e diminuir a resposta. Além disso, o próprio reticulador pode gerar uma indesejada resposta imune. Estes problemas precisam ser considerados na seleção não somente dos apropriados reagentes de reticulação, mas também das apropriadas relações de carreador de proteína/polipeptídeo e imunógeno de peptídeo.

[00108] Uma variedade de meios de fixar os carreadores de proteína/peptídeo aos imunógenos de peptídeo é possível. Interações iônicas são possíveis através dos terminais ou através do grupo ε-amino da lisina. A ligação de hidrogênio entre os grupos laterais dos resíduos e do imunógeno de peptídeo são também possíveis. Finalmente, interações de conformação entre os carreadores de proteína/peptídeo e o presente invenção podem dar origem a uma fixação estável.

[00109] Os conjugados de imunógenos de peptídeo- carreador foram gerados com sucesso empregando-se vários reagentes de reticulação, tais como reticulares de comprimento-zero, homobifuncionais ou heterobifuncionais. Os menores sistemas de reagente disponíveis para bioconjugação são os chamados reticuladores de comprimento-zero. Estes compostos mediam a conjugação de duas moléculas pela formação de uma ligação não contendo átomos adicionais. Assim, um átomo de uma molécula é espaçador. Em muitos esquemas de conjugação, o complexo final é ligado junto em virtude de componentes químicos que adicionam estruturas estranhas às substâncias sendo reticuladas. Em algumas aplicações, a presença destes ligantes intervenientes pode ser nociva ao uso pretendido. Por exemplo, na preparação de conjugados de imunógeno de peptídeo-carreador o complexo é formado com a intenção de gerar uma resposta imune para o hapteno fixado. Ocasionalmente, uma parte dos anticorpos produzidos por esta resposta terá especificidade para o agente de reticulação usado no procedimento de conjugação. Os agentes de reticulação de comprimento zero eliminam o potencial para este tipo de reatividade cruzada, pela mediação de uma ligação direta entre duas substâncias.

[00110] Os reagentes homobifuncionais, que foram os primeiros reagentes de reticulação usados para modificação e conjugação de macro moléculas, consistiram de compostos biorreativos, contendo o mesmo grupo funcional em ambas as extremidades (Hartman e Wold, 1966). Estes reagentes poderiam amarrar uma proteína em outra reagindo covalentemente com os mesmos grupos comuns de ambas as moléculas. Assim, as e-aminas de lisina ou aminas de terminal-N de uma proteína poderiam ser ligados transversalmente nos mesmos grupos funcionais de uma segunda proteína simplesmente misturando-se os dois entre si na presença do reagente homobifuncional.

[00111] Os reagentes de conjugação heterobifuncionais contêm dois diferentes grupos reativos, que podem acoplar-se a dois diferentes alvos funcionais das proteínas e outras macromoléculas. Por exemplo, uma parte de um reticulador pode conter um grupo reativo amina, enquanto outra parte pode consistir de um grupo reativo sulfidrila. O resultado é a capacidade de dirigir a reação de reticulação para partes selecionadas de moléculas alvo, assim obtendo melhor controle sobre o processo de conjugação.

[00112] Os reagentes heterobifuncionais são usados para reticular proteínas e outras moléculas em um processo de duas ou três etapas, que limita o grau de polimerização, com freqüência obtido usando-se reticuladores homobifuncionais.

[00113] Muitos métodos são atualmente disponíveis para acoplamento de imunógenos de peptídeo a carreadores de proteína/peptídeo, empregando-se reticuladores homobifuncionais ou heterobifuncionais de comprimento zero. A maioria dos métodos criam ligações amina, amida, uretano, isotiouréia ou dissulfeto ou, em alguns casos, tioéteres. O método mais geral de acoplar proteínas ou peptídeos a peptídeos utiliza reagentes de reticulação bifuncionais. Estes são pequenas moléculas espaçadoras, tendo grupos ativos em cada extremidade. As moléculas espaçadoras podem ter grupos ativos idênticos ou diferentes em cada extremidade. As funcionalidades, grupos de acoplamento e ligações ativas mais comuns formados são: 1. Aldeído - amino -> amina secundária 2. Maleimido - sulfidrila -> tioéter 3. Succinimido - amino -> amida 4. Ésteres de imidato - amino -> amida 5. Fenil azidas - amino -> fenil amida 6. Haleto de acila - sulfidrila -> tioéter 7. Piridildissulfetos - sulfidrila -> dissulfeto 8. Isotiocianato - amino isotiouréia

[00114] A reatividade de uma dada proteína carreadora, em termos de sua capacidade de ser modificada por um agente reticulante, de modo que possa ser conjugada com um imunógeno de peptídeo, é determinada por sua composição amino ácida e a localização da sequência dos aminoácidos individuais da estrutura tridimensional da molécula, bem como pela composição amino ácida do imunógeno de peptídeo.

[00115] No caso de ligantes (“L”) entre os carreadores de proteína/polipeptídeo e outros peptídeos (por exemplo, um carreador de proteína/polipeptídeo e um imunógeno de peptídeo), os espaçadores são tipicamente selecionados de Ala, Gly ou outros espaçadores neutros de aminoácidos não-polares ou aminoácidos polares neutros. Em certas formas de realização, o espaçador neutro é Ala. Deve ser entendido que opcionalmente o presente espaçador não precisa consistir dos mesmos resíduos e, assim, pode ser um hetero ou homo-oligômero. Espaçadores exemplificativos incluem homo-oligômeros de Ala. Quando presente, o espaçador usualmente será pelo menos um ou dois resíduos, mais usualmente três a seis resíduos. Em outras formas de realização, o carreador de proteína/polipeptídeo é conjugado com um imunógeno de peptídeo, preferivelmente com o carreador de proteína/polipeptídeo posicionado no término amino. O peptídeo pode ser unido por um ligante neutro, tal como Ala-Ala-Ala ou similar e, preferivelmente, conter ainda um resíduo lipídico, tal como ácido palmítico ou similar, que seja fixado aos grupos alfa e épsilon amino de um resíduo Lys ((PAM)2Lys), que é fixado ao término amino do conjugado de peptídeo, tipicamente via ligação Ser-Ser ou similar.

[00116] Em alguns aspectos da invenção, o imunógeno de peptídeo é um fragmento de Aβ selecionado do grupo consistindo de Aβl-5- L, Aβl-7-L, Aβl-9-L e Aβ-l-12-L. Em alguns aspectos da invenção, o ligante é GAGA (SEQ. ID NO: 10).

[00117] Para facilitar a conjugação de um imunógeno de peptídeo com um carreador, aminoácidos adicionais podem ser adicionados aos términos dos determinantes antigênicos. Os resíduos adicionais podem também ser usados para modificar as propriedades físicas ou químicas do imunógeno de peptídeo. Aminoácidos tais como tirosina, cisteína, lisina, ácido glutâmico ou aspártico ou similares, podem ser introduzidos no terminal-C ou N do imunógeno de peptídeo. Adicionalmente, os ligantes de peptídeo contendo aminoácidos, tais como glicina e alanina, podem também ser introduzidos. Além disso, os determinantes antigênicos podem diferir da sequência natural ao serem modificados pela acilação do grupo-NH2 terminal, por exemplo, por acetilação de alcanoíla (C1-C20) ou tioglicolila, amidação de carbóxi-terminal, por exemplo, amónia, metilamina etc. Em alguns exemplos, estas modificações podem prover sítios para ligação a um suporte ou outra molécula.

[00118] Em alguns aspectos da invenção, o imunógeno de peptídeo é um fragmento de Aβ selecionado do grupo consistindo de Aβl-5- C, Aβl-7-C, Aβl-9-C e Aβl-12-C, em que C é um resíduo de aminoácido de cisteina. Em alguns aspectos da invenção, o imunógeno de peptídeo é um fragmento de Aβ selecionado do grupo consistindo de Aβl-5-L-C, Aβl-7-L- C, Aβl-9-L-C e Aβl-12-L-C.

[00119] O imunógeno de peptídeo é ligado ao carreador de proteína/polipeptídeo diretamente ou via um ligante no término amino ou carbóxi do imunógeno de peptídeo. O término amino do imunógeno de peptídeo ou carreador de proteína/polipeptídeo pode ser acilado. Além disso, o conjugado de imunógeno de peptídeo-carreador de proteína/peptídeo pode ser acilado. Além disso, o conjugado de imunógeno de peptídeo-carreador de proteína/peptídeo pode ser ligado a certos lipídeos de alcanoíla (C1-C20), via um ou mais resíduos de ligação, tais como Gly, Gly-Gly, Ser, Ser-Ser, como descrito abaixo. Outros componentes de lipídeo úteis incluem colesterol, ácidos graxos e similares.

[00120] Os imunógenos de peptídeo podem ser ligados a um carreador por reticulação química. Técnicas para ligar um imunógeno a um carreador incluem a formação de ligações dissulfeto, empregando-se N- succinimidil-3-(2-piridil-tio) propionato (SPDP) (Carlsson, J. et al. (1978) Biochem. J, 173: 723) e duccinimidil 4-(N-maleimidometil) cicloexano-1- carboxilato (SMCC) (se o peptídeo não tiver um grupo sulfidrila, este pode ser provido pela adição de um resíduo de cisteina ao hapteno). Estes reagentes criam uma ligação dissulfeto entre eles próprios e resíduos de cisteina de peptídeo em uma proteína e uma ligação amida através de e-amino de uma lisina, ou outro grupo amino livre de outros aminoácidos. Uma variedade de tais agentes formadores de dissulfeto/amida são descritos em Immune. Rev. 62: 85 (1982). Outros agentes de acoplamento bifuncionais forma uma ligação tioéter em vez de uma dissulfeto. Os agentes formadores de tioéter incluem éster reativo de ácido 6-maleimidocapróico, ácido 2-bromoacético e ácido 2-iodoacético, ácido 4-(N-maleimido-metil) cicloexanol-carboxílico. Os grupos carboxila podem ser ativados combinando-os com succinimida ou ácido l-hidroxil-2-nitro-4-sulfônico, sal de sódio.

[00121] Mais frequentemente, os resíduos de lisina são os resíduos de aminoácido mais abundantes encontrados nas proteínas carreadoras e estes resíduos são modificados utilizando-se reagentes reticulantes para gerar sítios nucleofílicos, que são então acoplados a um hapteno. Este acoplamento é conseguido via qualquer uma das cadeias laterais hidrofílicas das moléculas de hapteno que são quimicamente ativas. Estas incluem o grupo guanidila de arginina, os grupos carboxila de glutamato e ácido aspártico, o grupo sulfidrila de cisteína e o grupo e-amino de lisina, para citar alguns. A modificação das proteínas, de modo que elas possam agora ser acopladas a outros componentes, é conseguida utilizando-se reagentes reticulantes, que reagem com qualquer uma das cadeias laterais do carreador de proteína ou moléculas de hapteno.

[00122] Em um aspecto da presente invenção, a proteína carreadora, com ou sem uma molécula ligante, é funcionalizada (derivada) com um reagente que introduz sítios reativos dentro da molécula de proteína carreadora, que são receptivos a mais modificação para introduzir grupos nucleofílicos. Em uma forma de realização, o carreador é reagido com um reagente haloacetilante, que preferivelmente reage com numerosos grupos funcionais dos resíduos de aminoácido de proteínas, tais como o grupo sulfidrila de cisteína, o grupo ε-amina primário do resíduo de lisina, o terminal-oc de oc-aminas, o tioéter da metionina e ambos os nitrogénios de histidina da cadeia lateral de imidazoíla (Gurd, 1967). Em uma forma de realização preferida, os grupos ε-amina primários dos resíduos de lisina da proteína carreadora são derivados com N-hidroxissuccinimidil bromoacetato, para gerar um carreador bromoacetilado. A conjugação do imunógeno de peptídeo e do carreador de proteína ativado foi realizada adicionando-se lentamente o carreador ativado à solução contendo o imunógeno de peptídeo.

[00123] Utilizando-se o processo desta invenção, os imunógenos de peptídeo examinado na seção B, acima, pode ser conjugado com qualquer um dos carreadores examinados na seção A, acima. Os conjugados resultantes do processo desta invenção são usados como imunógenos para a geração de anticorpos contra Aβ, para uso em imunoterapia passiva/ativa. Além disso, Aβ ou um fragmento de Aβ ligado a um carreador pode ser administrado a um animal de laboratório, para produção de anticorpos monoclonais para Aβ.

[00124] Em um aspecto da invenção, o conjugado é um conjugado selecionado do grupo consistindo de Aβl-7-CRMi97, (Aβl-7 x 3)- CRM 197 e (Aβl-7 x 5)-CRMi97. Em um aspecto da invenção, o conjugado é um conjugado selecionado do grupo consistindo de CRMi97-Aβl-5, CRM197- Aβl-7, CRMi97-Aβl-9 e CRMi97-Aβl-12. Em outro aspecto da invenção, o conjugado é um conjugado selecionado do grupo consistindo de Aβl-5-C- CRM197, Aβl-7-C-CRMi97, Aβl-9-C-CRMi97E Aβl-12-C-CRMi97, Aβl6- 23-C-CRM197, Aβl7-24-C-CRMi97, Aβl8-25-C-CRM197, CRMi97-C-Aβl6- 23, CRNWC-Aβ 17-24, CRNWC-Aβ 1-18-25, Aβl6-22-C-CRMi97, Aβl7- 23-C-CRM197, Aβl8-24-C-CRMi97, CRNWC-Aβ 16-22, C5MlC-Aβ7-23 E CRMi97-C-Aβ 18-24. Em ainda outro aspecto da invenção, o conjugado é um conjugado selecionado do grupo consistindo de Aβl-5-L-CRMi97, Aβl-7-L- C-CRM197, Aβl-9-L-C-CRMi97 e Aβl-12-L-C-CRMi97.

Capeamento

[00125] Uma desvantagem do uso de reagentes de acoplamento, que introduz sítios reativos dentro das cadeias laterais das moléculas de aminoácidos do carreador e/ou moléculas de hapteno, é que os sítios reativos, se não neutralizados, são livres para reagir com qualquer molécula indesejada, in vitro ou in vivo. No processo da presente invenção, o capeamento dos grupos funcionais não-reagidos é realizada pela reação dos conjugados com grupos reativos pendentes com reagentes que inativam/cobrem os grupos reativos. Reagentes inativantes/de capeamento, para uso com o processo de conjugação da presente invenção, incluem cisteamina, N-acetilcisteamina e etanolamina. Alternativamente, o capeamento é realizado pela reação com amónia ou bicarbonato de amónio, um ou outro dos quais converte os grupos haloacetila em grupos aminoacetila. O capeamento é também realizado a pH alcalino (9,0 - 9,8), utilizando-se hidróxido de sódio ou carbonato de sódio, que converte os grupos haloacetila em grupos hidroxiacetila. Uma vantagem potencial de converter os grupos haloacetila em grupos aminoacetila ou hidroxiacetila, o oposto à reação com derivados de cisteamina, etanolamina etc., é a introdução de funcionalidades químicas, de tamanho relativamente menor, por reação com carbonato de amónia ou hidróxido. Os resultantes grupos funcionais capeados, por exemplo, aminoacetila ou hidroxiacetila, fornecem perturbação relativamente menor na parte de proteína carreadora do conjugado. O imunógeno de peptídeo-proteína carreadora capeado é purificado quando necessário utilizando-se métodos conhecidos, tais como cromatografia (filtragem gel, troca de íons, interação hidrofóbica ou afinidade), diálise, ultrafiltragem- diafiltragem, precipitação seletiva empregando-se sulfato ou álcool de amónio e similares.

Conjugados e Composições Imunogênicas

[00126] Os conjugados de imunógeno de peptídeo-carreador de proteína capeados são administrados em uma composição imunogênica em mamíferos, particularmente humanos, para fins profiláticos e/ou terapêuticos. Os conjugados da presente invenção são usados para eliciar e/ou aumentar a resposta imune contra imunógenos. Por exemplo, os conjugados de CTL- carreador são usados para tratar e/ou evitar infecção virai, doenças amiloidogênicas, câncer etc. Alternativamente, os conjugados de imunógenos de polipeptídeo-carreador, que induzem respostas anticorpo, são também usados. Exemplos de doenças, que podem ser tratadas utilizando-se os conjugados da presente invenção, incluem várias infecções bacterianas, infecções virais, infecções fúngicas, infecções parasíticas e câncer.

[00127] Em aplicações terapêuticas, um conjugado da presente invenção é administrado a um indivíduo já sofrendo de uma doença amiloidogênica, tal como doença de Alzheimer, câncer, ou infectado com um microorganismo patogênico. Aqueles na fase de incubação ou na fase aguda da doença podem ser tratados com o conjugado da presente invenção separadamente ou em conjunto com outros tratamentos, como apropriado.

[00128] Em aplicações terapêuticas, uma composição imunogênica da presente invenção é administrada a um paciente em uma quantidade suficiente para eliciar uma resposta CTL ou resposta humoral eficaz para o microorganismo, plaque amilóide ou para um antígeno de tumor expresso em uma célula de câncer e para curar, ou pelo menos deter parcialmente a progressão da doença, sintomas e/ou complicações. Uma quantidade adequada para conseguir isto é definida como “dose terapeuticamente eficaz”. Quantidades eficazes para este uso dependerão em parte da composição do peptídeo, da maneira de administração, do estágio e severidade da doença sendo tratada, do peso e estado geral da saúde do paciente e do julgamento do médico prescribente.

[00129] As quantidades terapeuticamente eficazes das composições imunogênicas da presente invenção geralmente variam para a imunização inicial para administração terapêutica ou profilática de cerca de 0,1 pg a cerca de 10.000 pg de peptídeo para um paciente de 70 kg, usualmente de cerca de 0,1 a cerca de 8000 pg, preferivelmente entre cerca de 0,1 a cerca de 5000 pg e, muitíssimo preferivelmente, entre 0,1 a cerca de 1000 pg. Estas doses são seguidas por dosagens de reforço de cerca de 0,1 pg a cerca de 1000 pg de peptídeo, de acordo com um regime de reforço durante semanas a meses, dependendo da resposta e condição do paciente, medindo-se as respostas imune específicas.

[00130] Além disso, a presente invenção é usada profilaticamente para evitar e/ou melhorar infecções bacterianas, infecções virais, infecções fúngicas, infecções parasíticas, doença amiloidogênica ou câncer. Quantidades eficazes são como descritas acima. Adicionalmente, uma de habilidade comum na técnica também saberia como ajustar ou modificar tratamentos profiláticos, como apropriado, por exemplo, reforçando e ajustando dosagens e regimes de dosagem.

[00131] A administração terapêutica pode começar no primeiro sinal da doença ou da detecção ou remoção cirúrgica de tumores ou pouco após diagnóstico, no caso de infecção aguda. Esta é seguida por reforço de doses, até a progressão da doença ser parada ou invertida ou os sintomas serem substancialmente reduzidos e por um período em seguida. Na infecção crônica, altas doses iniciais, seguidas pelo reforço de doses, pode ser necessárias.

[00132] O tratamento de um indivíduo infectado com as composições da invenção pode apressar a resolução da infecção em indivíduos agudamente infectados. Para aqueles indivíduos susceptíveis (ou predispostos) ao desenvolvimento de infecção crônica, as composições são particularmente úteis nos métodos para evitar a evolução da infecção aguda a crônica. Onde indivíduos susceptíveis forem identificados antes ou durante a infecção, por exemplo, como aqui descrito, a composição pode ser destinada a eles, minimizando a necessidade de administração a uma população maior.

[00133] Os conjugados da presente invenção são também usados para o tratamento da infecção crônica e para estimular o sistema imune, para eliminar células infectadas por vírus em indivíduos com infecções latentes. É importante prover-se uma quantidade da composição imunogênica da presente invenção em uma formulação e modo de administração suficientes para eficazmente eliciar e/ou aumentar uma resposta imune. Assim, para o tratamento de infecção crônica, uma dose representativa é na faixa de cerca de 0,1 pg a cerca de 10.000 pg de peptídeo, usualmente de cerca de 0,1 a cerca de 8000 pg, preferivelmente entre cerca de 0,1 a cerca de 5000 pg e, muitíssimo preferivelmente, entre 0,1 a cerca de 1000 pg para um paciente de 70 kg por dose. Doses imunizantes, seguidas por doses de reforço em intervalos estabelecidos, por exemplo, de uma a quatro semanas, podem ser necessárias, possivelmente por um período prolongado de tempo, para eficazmente imunizar um indivíduo. No caso de infecção crônica, a administração deve continuar até pelo menos os sintomas clínicos ou testes de laboratório indicarem que a infecção viral foi eliminada ou substancialmente diminuída e por um período em seguida.

[00134] As composições imunogênicas da presente invenção, para tratamento terapêutico ou profilático, podem ser administradas por meio parenteral, tópico, intravenoso, oral, subcutâneo, intra-arterial, intracraniano, intra-peritoneal, intra-nasal ou intra-muscular para tratamento profilático e/ou terapêutico. Uma via típica de administração de um agente imunogênico é subcutânea, embora outras vias possam ser igualmente eficazes. Outra via comum é injeção intramuscular. Este tipo de injeção é mais tipicamente realizado nos músculos do braço ou perna. Em alguns métodos, os agentes são injetados diretamente dentro de um tecido particular, onde os depósitos se acumularam, por exemplo, injeção intracraniana. A injeção intramuscular ou infusão intravenosa é preferida para administração de anticorpo. Em alguns métodos, anticorpos terapêuticos particulares são injetados diretamente dentro do crânio. Por causa da facilidade de administração, as composições imunogênicas da invenção são particularmente adequadas para administração oral. A invenção provê ainda composições imunogênicas para administração parenteral, que compreende uma solução dos peptídeos ou conjugados dissolvidos ou suspensos em um carreador aceitável, preferivelmente um carreador aquoso.

[00135] Uma variedade de diluentes, excipientes e tampões pode ser usada, por exemplo, água, água tamponada, solução salina tamponada de fosfato, 0,3% de glicina, ácido hialurônico e similares. Estas composições podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização convencionais bem conhecidas ou podem ser filtradas estéreis. As soluções aquosas resultantes podem ser embaladas para uso como estão ou liofilizadas, a preparação liofilizada sendo combinada com uma solução estéril antes da administração. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis, como necessário para aproximar-se das condições fisiológicas, tais como agentes tamponantes, agentes de ajuste da tonicidade, agentes umectantes c similares, por exemplo, acetato de sódio, lactato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina etc.

[00136] Para composições sólidas, carreadores sólidos não- tóxicos convencionais podem ser usados. Estes podem incluir, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, talco, celulose, glicose, sacarose, carbonato de magnésio e similares. Para administração oral, uma composição não-tóxica farmaceuticamente aceitável é formada incorporando-se qualquer um dos excipientes normalmente empregados, tais como aqueles carreadores anteriormente listados e geralmcnte 10 - 95% de ingrediente ativo, isto é, um ou mais conjugados da invenção e, mais preferivelmente, em uma concentração de 25 - 75%.

[00137] A concentração das composições imunogênicas da presente invenção das formulações farmacêuticas pode variar largamente, isto é, de menos do que cerca de 0,1%, usualmente em ou pelo menos cerca de 2% a tanto quanto 20% a 50% ou mais cm peso e será selecionada principalmente por volumes, viscosidades etc. de lluido, de acordo com o modo particular de administração selecionado.

[00138] Os conjugados da presente invenção podem também ser administrados via lipossomas, que servem para dirigir os conjugados para um tecido particular, tal como tecido linfóide, ou alvejar seletivamente células infectadas, bem como aumentar a meia-vida da composição de peptídeo. Os lipossomas incluem emulsões, espumas, micelas, monocamadas insolúveis, cristais líquidos, dispersões de fosfolipídeos, camadas lamelares e similares. Nestas preparações, a composição a ser suprida é incorporada como parte de um lipossoma, sozinho ou em conjunto com uma molécula que se liga, por exemplo, a um receptor prevalente entre as células linfóides. Estas moléculas incluiriam anticorpos monoclonais, que se ligam ao antígeno CD45 ou com outras composições terapêuticas ou imunogênicas. Assim, os lipossomas carregados com uma composição desejada da presente invenção podem ser dirigidos ao sítio das células linfóides, onde os lipossomas então liberam as composições de peptídeo terapêuticas/imunogênicas. Os lipossomas para uso na invenção são formados de lipídeos formadores de vesícula padrão, que geralmente incluem fosfolipídeos neutros e negativamente carregados e um esterol, tal como colesterol. A seleção de lipídeos é geralmente guiada por consideração do tamanho do lipossoma, instabilidade em ácido e estabilidade dos lipossomas na corrente sanguínea. Uma variedade de métodos é disponível para preparar lipossomas, como descrito, por exemplo, em Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Biocng. 9:467 (1980). patentes U.S. Nos. 4.235.871, 4.501.728, 4.837.028 e 5.019.369, incorporadas aqui por referência.

[00139] Para alvejar as células imunes, um ligando a ser incorporado dentro do lipossoma pode incluir anticorpos ou fragmentos deles específicos para determinantes de superfície de célula das células do sistema imune desejadas. Uma suspensão de lipossoma contendo uma composição da presente invenção pode ser administrada intravenosa, local, topicamente etc., em uma dose que varia de acordo com, entre outras, da maneira de administração, da composição sendo suprida e do estágio da doença sendo tratada.

[00140] Para administração aerossol, as composições da presente invenção são preferivelmente supridas em forma finamente dividida, juntamente com um tensoativo e propelente. Percentagens típicas da composição são 0,01 - 20 % em peso, preferivelmente 1 - 10%. O tensoativo deve, naturalmente, ser não-tóxico e, preferivelmente, solúvel no propelente. Representativos de tais agentes são os ésteres ou ésteres parciais de ácidos graxos, contendo de 6 a 22 átomos de carbono, tais como ácidos capróico, octanóico, láurico, palmítico, esteárico, linoleico, linolênico, olestérico e oléico, com um álcool poliídrico alifático ou seu anidrido cíclico. Esteres mistos, tais como glicerídeos mistos ou naturais, podem ser empregados. O tensoativo pode constituir 0,1 - 20 % em peso da composição, preferivelmente 0,25 - 5%. O resto da composição é ordinariamente propelente. Um carreador pode também ser incluído, se desejado, como lecitina, para suprimento intranasal.

[00141] As composições desta invenção podem também ser usadas para produzir anticorpos monoclonais. Tais anticorpos podem ser úteis como agentes diagnósticos ou terapêuticos potenciais.

[00142] As composições da presente invenção podem também encontrar uso como reagentes diagnósticos. Por exemplo, uma composição da invenção pode ser usada para determinar a susceptibilidade de um indivíduo particular a um regime de tratamento, que empregue os imunógenos de polipeptídeo e, assim, pode ser útil na modificação de um protocolo de tratamento existente ou na determinação de um prognóstico para um indivíduo afetado. Além disso, as composições da presente invenção podem também ser usadas para predizer que indivíduos estarão substancialmente em risco de desenvolver infecção crônica.

[00143] Os conjugados da presente invenção podem opcionalmente ser administrados em combinação com outros agentes que sejam pelo menos parcialmente eficazes no tratamento e/ou melhoria de uma doença e/ou seus sintomas. No caso de Alzheimer e síndrome de Down, em que depósitos amilóides ocorrem no cérebro, os conjugados da invenção podem ser administrados em conjunto com outros agentes que aumentam a passagem dos agentes da invenção através da barreira cerebral sanguínea.

[00144] A composição imunogênica tipicamente contém um adjuvante. Um adjuvante é uma substância que aumenta a resposta imune, quando administrado junto com um imunógeno ou antígeno. Numerosas citocinas ou linfócitos mostraram ter atividade moduladora imune e, assim, podem ser usados como adjuvantes, incluindo mas não limitado às interleucinas 1-oc, 1-β, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 (vide, por exemplo, patente U.S. No. 5.723.127), 13, 14, 15, 16, 17 e 18 (c suas formas mutantes), os interferons-oc, β e y, fator estimulante da colônia de granulócitos-macrófagos (vide, por exemplo, patente U.S. No. 5.078.996), fator estimulante da colônia de macrófagos, fator estimulante da colônia de granulócitos, GSF, e o fator oc e β de necrose tumoral. Ainda outros adjuvantes úteis nesta invenção incluem a quimiocina, incluindo, sem limitação, MCP-1, MIP-loc, MIP-lβ e RANTES. As moléculas de adesão, tais como uma selectina, por exemplo, L- selectina, P-selectina e E-selectina, podem também ser úteis como adjuvantes. Ainda outros adjuvantes úteis incluem, sem limitação, uma molécula similar à mucina, por exemplo, CD34, GlyCAM-1 e MadCAM-1, um membro da família da integrina, tal como LFA-1, VLA-1, Mac-1 e pl50.95, um membro da superfamília da imunoglobulina, tal como PECAM, ICAMS, por exemplo, ICAM-1, ICAM-2 e ICAM-3, CD2 e LFA-3, moléculas co-estimulatórias, tais como CD40 e CD40L, fatores de crescimento incluindo fator de crescimento vascular, fator de crescimento de nervos, fator de crescimento de fibroblasto, fator de crescimento epidérmico, B7.2, PDGF, BE-1 e fator de crescimento endotelial vascular, moléculas receptoras, incluindo FAS, receptor TNF, Fit, Apo-1, p55, WSE-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, CARD, NGRF, DR4, DR5, KIEFER,TRAIL-R2, TRICK2 e DR6. Ainda outra molécula adjuvante inclui Caspase (ICE). Vide também Publicações de Patente Internacional nos. WO 98/17799 e WO 99/43839, que são incorporadas aqui por referência em sua totalidade, para todas as finalidades.

[00145] Adjuvantes adequados, usados para aumentar uma resposta imune, incluem, sem limitação, MPL™ (monofosforil lipídeo A 3-0- desacilado; Corixa, Halmilton, MT), que é descrito na patente U.S. No. 4.912.094, que é por este meio incorporada por referência para todas as finalidades. Também adequados para uso como adjuvantes são os análogos de lipídeo A sintéticos ou compostos de aminoalquil glicosaminafosfato (AGP) ou seus derivados ou análogos, que são disponíveis na Corixa (Hamilton, MT) e que são descritos na patente U.S. No. 6.113.918, que é por este meio incorporada por referência. Um tal AGP é 2-[(R)-3- tetradecanoiloxitetradecancilamino]etil-2-deóxi-4-O-fosfono-3-O-[(S)-3- tetradecanoioxitctradecanoíla]-2-[(R)-3-tetradecanoilóxi-tetradecanoil- amino]-b-D-glicopiranosídeo, que é conhecido como 529 (também conhecido como RC529; Corixa). Este adjuvante 529 é formulado como uma forma aquosa (529 AF) ou como uma emulsão estável (529 SE). Ainda outros adjuvantes incluem emulsões de óleo mineral e de água, sais de cálcio, tais como fosfato de cálcio, sais de alumínio (alume), tais como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio etc., Amphigênio, Avridina, L121/squeleno, D- lactídeo-polilactídeo/glicosídeo, ácidos plurônicos, polióis, dipeptídeo de muramila, Bordetella morta, saponinas, tais como Stimulon™ QS-21 (Antigênics, Framingham, MA), descritos na patente U.S. No. 5.057.540, que é incorporada aqui por referência, e partículas geradas deles, tais como ISCOMS (complexos imunoestimulantes), Mycobacterium tuberculosis, lipossacarídeos bacterianos, polinucleotídeos sintéticos, tais como oligonucleotíeos contendo um motivo CpG (patente U.S. No. 6.207.645, que é por este meio incorporada por referência), uma toxina da coqueluche (PT) ou uma toxina instável ao calor (UT) E. coli, particularmente UT-K63, UT-572, PT-K9/G129; vide, por exemplo, Publicações de Patentes Internacionais Nos. WO 93/13302 e WO 92/19265, que são incorporadas aqui por referência para todas as finalidades.

[00146] Também úteis como adjuvantes são as toxinas da cólera e seus mutantes, incluindo aquelas descritas no Pedido de Patente Internacional publicado número WO 00/18434 (em que o ácido glutâmico da posição amino ácida 29 é substituído por outro aminoácido (outro que não ácido aspártico, preferivelmente uma histidina). Toxinas CT similares ou mutantes, como descritos no Pedido de Patente Internacional número WO 02/098368 (em que a isoleucina da posição amino ácida 16 é substituída por outro aminoácido, sozinha ou em combinação com a substituição da serina da posição amino ácida 68 por outro aminoácido; e/ou em que a valina da posição amino ácida 72 é substituída por outro aminoácido). Outras toxinas CT são descritas no Pedido de Patente Internacional publicado número WO 02/098369 (em que a arginina da posição amino ácida 25 é substituída por outro aminoácido; e/ou um aminoácido é inserido na posição amino ácida 49; e/ou dois aminoácidos são inseridos na posição amino ácida 35 e 36.

[00147] Deve ser entendido que referência por todo este relatório a qualquer teoria para explicar os resultados descritos não é para limitar o escopo da invenção. Independente do método pelo qual a invenção funciona, os resultados e vantagens aqui descritos podem ser conseguidos por referência aos seguintes exemplos da invenção.

[00148] Será evidente para uma pessoa de habilidade comum na técnica que muitas mudanças e modificações podem ser feitas sem desvio do espírito ou escopo das reivindicações anexas. Todas as publicações e pedidos de patente mencionados neste relatório são incorporados por referência em sua totalidade para todas as finalidades, na mesma extensão como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

EXEMPLO 1 Conjugação de CRM197 com Peptídeo Aβ

[00149] A conjugação de haptenos/peptídeos antigênicos foi realizada reagindo-se carreador CRM197 ativado, que tem trinta e nove resíduos de lisina, com um hapteno/peptídeo antigênico, tendo um grupo tiol pendente, empregando-se o método descrito abaixo (Figura 1). Todos os peptídeos Aβ contidos em um resíduo de cisteína do término carbóxi, para facilitar a conjugação destes peptídeos, através do grupo cisteinil sulfidrila, com a proteína carreadora. Estes peptídeos foram produzidos por síntese de fase sólida.

I. Ativação

[00150] Os grupos amino livres de CRM197 foram bromoacetilados por reação com um excesso de éster de N- hidroxissuccinimida do ácido bromoacético (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) (Bernatowicz e Matsueda, 1986). Em uma solução gelada de CRM197 (~15 mg), 10% (v/v) 1,) M NaHCOt (pH 8,4) foram adicionados. Éster N- hidroxissuccinimida do ácido bromoacético, de peso igual àquele de CRM197 usado, foi dissolvido em 200 pl de dimetilformamida (DMF), adicionado lentamente a CRM197 e suavemente misturados em temperatura ambiente no escuro por 1 h. A proteína bromoacetilada resultante (ativada) foi purificada pela passagem através de uma coluna dessalinizante (P6-DG), empregando-se PBS / 1 mM EDTA (pH 7,0) como eluente. Em seguida à purificação, as frações correspondendo à CRM197 ativada foram reunidas e a concentração de proteína foi estimada por ensaio de proteína BCA. Os grupos amino de proteína, tanto antes como após o tratamento com éster N- hidroxissuccinimida de ácido bromoacético, foram reagidos com ácido 2,4,6- trinitrobenzenossulfônico (TNBSA), que serviu como um indicador da bromoacetilação (Means et al., 1972).

II. Conjugação

[00151] Antes da conjugação, os peptídeos foram reagidos com 5,5’-ditio-bis(2-nitrobenzóico ácido) [reagente de Ellman] para verificar o teor de grupos SH-livres (entre 62 - 88% reduzidos). Para os primeiros quatro peptídeos Aβ (aminoácidos 1-7 sem ligante, aminoácidos 1-12 com ligante GAGAC, aminoácidos 1-9 com ligante GAGAC e aminoácidos 1-7 com ligante GAGAC), aproximadamente 8,0 - 10,0 mg de peptídeo foram dissolvidos em água destilada estéril em uma concentração aproximada de 20 mg/ml. O peptídeo foi lentamente adicionado a CRM197 ativada fria, em uma relação 1:1 (p/p) e o pH foi ajustado a aproximadamente 7,0-7,2 com a adição de 20-36 pl de NaOH 1 N. O material resultante foi suavemente misturado durante a noite a 4 °C no escuro, seguido por diálise no escuro em relação a duas mudanças IL de PBS, pH 7,2. Para os quatro seguintes peptídeos Aβ (aminoácidos 1-5 sem ligante, aminoácidos 1-9 sem ligante, aminoácidos 1 - 12 sem ligante e aminoácidos 1-5 com ligante), reação com reagente de Ellman foi usada para verificar os grupos SH livres. CRM197 foi bromoacetilada, purificada e reagida com TNBSA, como anteriormente descrito. O pH de cada peptídeo foi ajustado a 7,0 com a adição de 0,1 M NaPCfi (pH 8,5) a 2,2x o volume do peptídeo dissolvido. O peptídeo foi lentamente adicionado para esfriar CRM197 ativada em uma relação de 1:1 e permitido reagir durante a noite a 4 °C no escuro. O material resultante foi dialisado. Um peptídeo de controle final (l-12mer em orientação inversa) foi conjugado com CRM197, como descrito acima, com a seguinte modificação. Em vez de ajustar o pH do peptídeo a 7,0, o pH de CRM197 ativada foi ajustada a aproximadamente 7,5 com a adição de 20% (v/v) 0,5 M NaPCfi (pH 8,0). Cada conjugado, após a diálise, foi transferido para um tubo de polipropileno de 15 ml estéril, envolvido em folha de alumínio e armazenado a 4 °C. A ativação dos resíduos amino reativos do carreador foi então subsequentemente verificada empregando-se espectrometria de massa. Conjugado Peptídeo Imunogênico Aβl-5-C-CRMi97 DAEFR-C (SEQ. ID NO: 1) Aβl-7-C-CRMi97 DAEFRHD-C ((SEQ. ID NO: 2) Aβl-9-C-CRMi97 DAEFRHDSG-C (SEQ. ID NO: 3) Aβl-12-C-CRMi97 DAEFRHDSGYEV-C (SEQ. ID NO: 4) Aβl-5-L-C-CRMi97 DAEFR-GAGA-C (SEQ. ID NO: 5) Aβl-7-L-C-CRMi97 DAEFRHD-GAGA-C (SEQ. ID NO: 6) Aβl-9-L-C-CRMi97 DAEFRHDSG-GAGA-C (SEQ. ID NO: 7) Aβl-12-L-C-CRMi97 DAEFRHDSGYEV-GAGA-C (SEQ. ID NO: 8) Aβl2-l-CRMi97 VEYGSDHRFEAD-C (SEQ. ID NO: 9) (CONTROLE -VE) L=ligante (GAGA) (SEQ. ID NO: 10)

EXEMPLO 2 Preparação de Conjugado de Peptídeo Aβ-CRMi97e Purificação por Bromoacetilação por Ultrafíltragem de CRM197

[00152] CRM197 (100 mg) em tampão de fosfato de sódio 0,01 M, 0,9% NaCl, pH 7,0, foi reagida com éster N-hidroxissuccinimida ácido bromoacético (dissolvido em 20 mg/ml em DMSO) em uma relação em peso de 1:1 sob uma atmosfera de argônio. A reação foi titulada como necessário para manter o pH a 7,0. A mistura foi agitada no escuro por 1,5 h em temperatura ambiente. A mistura de reação foi filtrada 1,2 pm no reservatório de retido de um sistema UF/DF (Millipore Labscale TFF, Billerica, MA). A purificação foi realizada usando-se uma membrana 10K ou 30K UF por diafiltragem (30-vezes) em relação a um tampão de fosfato de sódio 0,01 M / 0,9% NaCl, pH, pH 7,0. A CRVfi- bromoacetilada foi filtrada, passando-se através de um filtro de 0,2 pm. O grau de bromoacetilação foi determinado reagindo-se CRM197 ativada com cisteína, seguido por análise de aminoácido e quantificação da carboximetilcisteína (CMC) resultante.

Conjugação de peptídeo Aβ e CRM197 bromoacetilada e Capeamento com N- acetilcisteamina

[00153] CRM197 bromoacetilada (50 mg) foi transferida para um vaso de reação. A solução agitada, mantida a 2 - 8 °C, foi adicionado carbonato/bicarbonato de sódio 1 M. Titulação foi realizada para obter-se um pH alvo de 9,0, sob atmosfera de argônio. Separadamente, 50 mg de peptídeo Aβ foram pesados e dissolvidos em água para injeção (WFI) a 20 mg/ml. A esta solução foi adicionado carbonato/bicarbonato de sódio 1M, até ser obtido pH 9,0. A solução de peptídeo foi adicionada à solução de CRM197 bromoacetilada e a mistura foi agitada a 2 - 8 °C por 14 - 18 h. Os grupos de bromoacetila remanescentes foram capeados com um excesso molar de 20- vezes de N-acetilcisteamina por 3-6 horas a 2 - 8 °C.

[00154] A mistura de reação foi filtrada através de filtro de 1,2 pm para dentro do reservatório de retido de um sistema UF/DF (Millipore XL) e o conjugado foi purificado em temperatura ambiente por diafiltragem de 30-vezes em uma membrana MWCO 10K ou 30K (Millipore), diafiltrando-se contra tampão de fosfato de sódio 0,01 M / 0,9% NaCl, pH 7,0. O retido foi coletado e filtrado 0,2 pm e analisado quanto ao teor de proteína (ensaio colorimétrico Lowry ou Micro-BCA) por SDS-PAGE, por análise amino ácida e quanto à imunogenicidade em camundongos.

EXEMPLO 3 Conversão por Capeamento dos Grupos Bromoacetila Não-reagidos em Grupos Aminoacetila

[00155] CRM197 bromoacetilada (50 mg), preparada como descrito acima no Exemplo 2, foi transferida para um vaso de reação. À solução agitada, mantida a 2-8 °C, foi adicionado carbonato/bicarbonato de sódio 1M. A titulação foi realizada para obter-se um pH alvo de 9,0, sob atmosfera de argônio. Separadamente, 50 mg de peptídeo Aβ foram pesados e dissolvidos em WFI a 20 mg/ml. A esta solução foi adicionado carbonato/bicarbonato de sódio 1 M, até pH 9,0 ser obtido. A solução de peptídeo foi adicionada à solução de CRM197 bromoacetilada e a mistura foi agitada a 2 - 8 °C por 14 - 18 h. Os grupos bromoacetila restantes foram capeados usando-se 8% de solução de bicarbonato de amónio por 4 h a 2 - 8 °C.

[00156] A mistura de reação foi filtrada 1,2 pm para dentro do reservatório de retido de um sistema UF/DF (Millipore XL) e o conjugado foi purificado em temperatura ambiente por diafiltragem de 30-vezes em uma membrana MWCO 10K ou 30K, por diafiltragem vs tampão de fosfato de sódio 0,01 M / 0,9% NaCl, pH 7,0. O retido foi coletado e filtrado 0,2 pm e analisado quanto ao teor de proteína (ensaio colorimétrico Lowry ou Micro- BCA), por SDS-PAGE, por análise amino ácida, e quanto à imunogenicidade em camundongos.

EXEMPLO 4 Determinação Quantitativa de S-Carboximetilcisteína e S- Carboximetilcisteamina como Avaliação do Grau de Conjugação e Capeamento de Conjugados de Imunógeno de Peptídeo-Proteína/Polipeptídeo

[00157] Hidrólise ácida de conjugados de proteína-peptídeo, gerados usando-se química de bromoacetila, resultou na formação de S- carboximetileisteína estável em ácido (CMC) das cisteínas dos sítios conjugados e na formação de S-carboximetilcisteamina (CMCA) estável em ácido da cisleamina dos sítios capeados (Figura 2). Todas as lisinas conjugadas e capeadas foram convertidas de volta em lisina e detectadas como tal. Todas os outros aminoácidos foram hidrolisados de volta para aminoácidos livres, exceto quanto a triptofano e cisteína, que foram destruídos pelas condições de hidrólise. Asparagina e glutamina foram convertidos em ácido aspártico e ácido glutâmico, respectivamente.

[00158] Amostras de conjugado foram diluídas com água deionizadas a uma concentração de proteína total de menos do que 1 mg/ml. Duas alíquotas de 10 microgramas de cada conjugado foram secadas e ressuspensas em 100 pl de HC1 6N [Pierce], 5 pl de fenol fundido [Sigma- Aldrich] e 1 pl de 2-mercaptoetanol [Sigma-Aldrich], As amostras foram então incubadas sob vácuo (100 mT) a 110 °C por 22 h. Os hidrolisados resultantes foram secados, ressuspensos em 250 pl de tampão de diluição de amostra de citrato de sódio Na-S Beckman (pH 2,2) [Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA] e fdtrados usando-se fdtros de ponta de seringa de náilon de 0,2 pm Whatman e seringas de 1 ml.

[00159] Cada amostra foi então carregada dentro de um circuito fechado de amostra de analisador de aminoácido Beckman 6300 e colocada dentro do analisador. Os aminoácidos de cada amostra hidrolisada e controle foram separados empregando-se cromatografia de troca iônica, seguido por reação com solução de Ninidrina NinRX Beckman a 135 °C. Os aminoácidos derivados foram então detectados na faixa visível a 570 nm e 440 nm (vide Tabela 1). Um conjunto padrão de aminoácidos [Aminoácido Padrão H Pierce] contendo 500 picomoles de cada aminoácido foi usado juntamente com as amostras e controles para cada conjunto de análise. S- carboximetilcisteína [Sigma-Aldrich] foi adicionada ao padrão. Tabela 1 Tempos de Retenção para Aminoácidos, Empregando-se Programa de Gradiente 1 do Analisador de Aminoácido Beckman 6300

[00160] As áreas de cada pico padrão foram usadas como uma equivalência quantitativa para avaliação proporcional de cada amostra. Prolina foi determinada a partir de 440 nm e foi convertida a uma equivalência de 570 nm usando-se ácido Glutâmico, o aminoácido mais próximo.

[00161] Cada um destes valores de picomol foi convertido em uma relação molar de resíduos de aminoácido, empregando-se uma comparação de picomoles de lisina para valor de lisina teórica presente na proteína. A lisina foi escolhida para esta avaliação com base em sua fixação covalente em Cisteína e Cisteamina e na hidrólise similar esperada. Os números de móis resultantes de aminoácidos foram então comparados com a composição amino ácida da proteína e relatados juntamente com os valores para CMC e CMCA. O valor CMC foi usado diretamente para avaliação do grau de conjugação e o valor CMCA foi usado diretamente para avaliação do grau de capeamento.

EXEMPLO 5 Caracterização e Otimização dos Conjugados de Peptídeo Aβ-CRMi97

[00162] Para verificar a conjugação, todos os conjugados de peptídeo-CRMi97 foram analisados por análise amino ácida e ionização de dessorção leiser assistida por matriz de espectrometria de massa(MALDI- TOF) de tempo de vôo. Para cada conjugado, os moles de peptídeo conjugados com cada mol CRMÍ97 foram determinados por análise amino ácida (número de resíduos de S-carboximetilcisteína) e espectrometria de massa MALDI-TOF. Os valores determinados por cada método estavam geralmente de acordo.

I. Cromatografia de exclusão de tamanho

[00163] Amostras concentradas da batelada foram removidas do estoque e permitidas aquecer à temperatura ambiente. A amostra de conjugado peptídeo Aβ foi suavemente misturada para assegurar uma preparação homogênea. A amostra de conjugado e peptídeo Aβ foi girada em uma micro-centrífuga Eppendorf, para remover quaisquer particulados. O sobrenadante foi retirado para cromatografia TSK-Gel G3000SW TosoHaas (TosoHaas, Stuttgart, Alemanha). Uma coluna TSK-Gel G3000SW TosoHaas foi conectada a um sistema HPLC e o limite de pressão foi ajustado a 1,4 MPa. A coluna foi equilibrada com pelo menos 30 ml de PBS (fosfato de sódio 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 ± 0,1) em uma vazão de 0,75 ml/min. A amostra de conjugado de peptídeo Aβ foi carregada na coluna G3000SW TSK-Gel TosoHaas, empregando-se os seguintes parâmetros: Concentração de amostra de conjugado de peptídeo Aβ: 1,5 ± 1,0 mg/ml Vazão: 0,75 ml/min Volume da Amostra: 0,1 ml Tempo de realização: 30 min

[00164] A absorvência foi monitorada tanto em 280 nm como em 210 nm. Para armazenagem de longo termo, a coluna TSK-Gel G3000SW TosoHaas foi equilibrada com pelo menos 50 ml de 20% etanol em uma taxa e fluxo de 0,5 - 1,0 ml/min.

II. PAGE (Eletroforese de Gel de Poliacrilamida)

[00165] A CRM197 ativada (bromoacetilada) e os conjugados de peptídeo Aβ-CRMi97foram examinados por SDS-Géis empregando-se uma Bis-Tris Eletroforese NuPAGE (Novex, Frankfurt, Alemanha) com um pH neutro, sistema de mini-gel de poliacrilamida pré-fundido e NuPAGE MES SDS Running Buffer. Uma alíquota de 8 pg de cada CRV ou conjugado ativado foi misturada com tampão de amostra redutora e aquecido a 100 °C por 5 minutos. Os conjugados e padrões de peso molecular (MW) (Invitrogen, Carlsbad, CA) foram carregados em um 10% (p/v, acrilamida) gel NuPage (Novex) baseado em um sistema tamponado de Bis-Tris-HCl e submetidos a MES SDS Running Buffer-PAGE (Laemmli). Em seguida a SDS-PAGE, o gel foi colorido com Pierce Gel Code Blue (Pierce, Rockford, IL). O conjugado de peptídeo Aβ-CRMi97foi representado por uma faixa maior em torno de 66 kDa, acima da faixa da CRM nativa e uma faixa de dímero em torno de 120 kDa, juntamente com menores faixas de multímero (dados não mostrados).

III. Análise de Espectrometria de Massa MALDI-TQF de Conjugados de Peptideo-CRMi97;

[00166] Espectrometria de massa foi usada para imediata aproximação do grau de conjugação. Alíquotas adequadas de CRM197 ativada e amostras de conjugado foram analisadas por espectrometria de massa MALDI-TOF, empregando-se ácido 3,5-dimetóxi-4-hidróxi-cinâmico (ácido sinapínico) como a matriz. O peso molecular da CRM197 ativada, determinada por espectrometria de massa MALDI-TOF (Finnigan MAT Lasermat 2000 Mass Spectrometer, Ringoes, NY) foi constatado estar centrado em torno de 60,5 kDa e para os conjugados variou de 65 kDa a 74 kDa, dependendo do grau de conjugação (dados não mostrados). Até 22 das lisinas (-50%) da CRM197 foram constatadas estarem modificadas em relação 1:1.

IV. Experimentos de Otimização

[00167] O grau de ativação e conjugação são função da relação reagente:proteína, tipicamente da reação e pH do tampão de reação. Algumas amostras são dadas abaixo para ilustrar as condições de conjugação ótimas realizadas para identificar as condições de pH ótimas, a fim de terem- se parâmetros de controle do processo reprodutíveis para reações de conjugação. Os resultados (Figura 3) mostraram que a reação de conjugação para Aβ 5mer (DAEFRC) (SEQ. ID NO: 1), bem como Aβ 7mer (DAEFRHDC) (SEQ. ID NO: 2) é dependente do pH e produz um mais elevado grau de modificação/conjugação, quando o pH da condição de reação é aumentado. Usando-se o sal TFA de peptídeos 5mer e 7mer, o grau de conjugação foi avaliado em pH 9,0, com quantidades variáveis de carga de peptídeo (Figura 4). É evidente por estes resultados que os conjugados de peptídeo, com um número definido de cópias de peptídeo por molécula CRM, podem ser gerados variando-se a relação peptídeo/CRM ativado, durante o processo de conjugação. Experimentos similares foram realizados empregando-se sal acetato de peptídeo Aβ 7mer.

[00168] Para a conjugação Aβl-7/CRM, o processo de capeamento foi avaliado comparando-se as moléculas de CMCA por CRM com os moles de CMC por CRM. Uma vez que o total de CMC e CMCA era constante para cada relação de peptídeo:CRM testada, o processo de capeamento foi presumido estar completo (Figura 5). A modificação total do conjugado permaneceu entre 19 e 21, comparável ao número de lisinas bromoacetiladas (Figura 5). Estes experimentos foram realizados com TFA como o contra-íon para o peptídeo. A conjugação de Aβl-7/CRM foi repetida usando-se o sal acetato do peptídeo, em vez de o sal TFA e estes dados são mostrados na Figura 5 e 6. O processo de capeamento pareceu atingir a conclusão, com o total de CMC e CMCA para cada ponto permanecendo entre 20 e 22. As condições para a reação de conjugação de Aβ-CRM foram otimizadas em pH 9,0, com o grau de conjugação controlado pela relação de peptídeo para CRM da reação. Variando-se a relação de 0,1 para 1,5, o grau de conjugação pode ser variado (Figura 6).

[00169] O grau de ativação e conjugação são função da relação de reagente:proteína, temperatura da reação e pH do tampão de reação, o grau de modificação (conjugação) para cada conjugado foi calculado subtraindo-se o valor da massa da CRM197 ativada do valor da massa de cada conjugado e dividindo-se pela massa do peptídeo usado para preparar o conjugado. O grau de modificação (conjugação) para todos os conjugados é descrito na Tabela 2.

[00170] O grau de conjugação foi também comparado com os valores determinados pela quantidade estimada de resíduos de S- carboximetilcisteína formados por mol de CRM197 (também mostrado na Tabela 2). Grau de Modificação: Comparação de MALDI-TOF e Dados AAA

EXEMPLO 6 Estudos de Imunogenicidade de Conjugados de Peptídeo Aβ

[00171] Os peptídeos abarcando os resíduos de terminal-N 1-5, 1-7, 1-9 e 1-12 de Aβ (com e sem a seqüência ligante GAGAC) e um peptídeo correspondendo ao terminal-N de Aβ cm seqüência inversa do aminoácido doze ao aminoácido um (l-12mer em seqüência inversa), cada um conjugado com CRM197, foram usados para imunizar camundongos juntamente com um peptídeo Aβ l-12mer não conjugado, em uma formação com STIMULON™ QS-21. Cada grupo de camundongo foi imunizado subcutaneamente com uma dose de 30 pg ou 5 pg de uma das amostras formuladas com 20 pg do adjuvante STIMULON1 M QS-21, no início do estudo (semana 0) e subseqüentemente nas semanas 3 e 6. O protocolo de estudo é ilustrado na Tabela 3.

[00172] Como mostrado na Tabela 3, os peptídeos abrangendo os resíduos de terminal-N 1-5, 1-7, 1-9 c 1-12 de Aβ (com e sem a seqüência ligante GAGAC) c um peptídeo correspondendo ao terminal-N de Aβ em seqüência inversa do aminoácido doze até o aminoácido um (1-12 mer invertido), conjugado com CRM197, foram usados para imunizar camundongos juntamente com peptídeo Aβ 1-12 mer, em uma formulação com QS-21. Cada grupo de camundongo foi vacinado subcutaneamente com uma dose de 30 pg ou 5 pg de uma das amostras formuladas com 20 pg do adjuvante QS-21, no início do estudo (semana 0) e subseqüentemente nas semanas 3 e 6. Camundongos Swiss Webster foram usados para o inteiro estudo com 5 camundongos em cada grupo. Volume da injeção = 100 jxl; B = Sangramento; V = vacinado E = exsanguinado.

[00173] Títulos anti-Aβ foram medidos por ELISA em relação a Aβ e CRM 197, como descrito abaixo. Resumidamente, placas de 96 poços Costar (#3591) foram revestida durante a noite em temperatura ambiente com 2 pg/ml de Aβl-42 em tampão de carbonato/bicarbonato estéril, pH 9,6. As placas foram esvaziadas e bloqueadas por duas horas em temperatura ambiente com 200 [tl/poço de 0,05% BSA em IX PBS/0,05% Tween 20. As placas bloqueadas foram esvaziadas e lavadas com um lavador de placas contendo TBS, 0,1% tampão da lavagem Brij-35 (sem azida). Todos os anti-soros primários foram serialmente diluídos com 0,05% BSA em IX PBS contendo 0,05% de Tween 20/0,02% Azida e 100 |11 de cada diluição foram então transferidos para os apropriados poços de placa e incubados em temperatura ambiente por 2 horas. As placas foram então esvaziadas/lavadas como descrito acima. Anticorpo secundário IgG anti-camundongo de cabra conjugado com fosfatase alcalina de Southern Biotech (cidade, estado) foram diluídas 1:1000 com 0,05% BSA em PBS, contendo 0,05% Tween 20/0. 02% de Azida e 100 |11 foram adicionados em cada poço e incubados em temperatura ambiente por 1 hora. As placas foram então esvaziadas/lavadas como descrito acima e finalmente incubadas em temperatura ambiente por 1 hora com 100 |il/poço de uma solução de 1 mg/ml de substrato de fosfato de p-nitrofenila, preparado em dietanolamina/MgC12, pH 9,8. O desenvolvimento da cor foi parado com a adição de 50 pl/poço de NaOH 3N. As placas foram lidas a 405 nM com uma referência de 690 nM. Os títulos de ponto final foram calculados em um O.D. de 0,1 AU. Tabela 3 Protocolo de Estudo de Imunização de Camundongo

Tabela 3 Protocolo de Estudo de Imunização de Camundongo

CRM197 ELISA

[00174] Placas de 96 poços Greiner (#650011) foram revestidas a 37°C por 90 minutos com 5,0 ftg/ml (100 (tl/poço) de CRM197 em tampão de carbonato/bicarbonato estéril, pH 9,6. As placas foram esvaziadas e lavadas com um lavador de placas, contendo IX TBS, 0,1% tampão de lavagem Brij-35. Todos os antissoros foram serialmente diluídos com IX PBS contendo 0,3% Tween 20/EDTA e 100 ptl de cada diluição foram então transferidos para os poços de placa apropriados e incubados a 37 °C por 1 hora. As placas foram então esvaziadas/lavadas como descrito acima. Anticorpo secundário IgG anti-camundongo de cabra, conjugado com fosfatase alcalina, da Southern Biotech foi diluído 1:1000 com IX PBS contendo 0,05% Tween 20/0,02% Azida e 100 pl foram adicionados a cada poço e incubados a 37 °C por 1 hora. As placas foram esvaziadas/lavadas como descrito acima e finalmente incubadas em temperatura ambiente por 1 hora com 100 pl/poço de uma solução de 1 mg/ml de substrato de fosfato de p-nitrofenila, preparado em dietanolamina/MgCfi, pH 9,8. O desenvolvimento foi parado com a adição de 50 pl/poço de 3N NaOH. As placas foram lidas a 405 nM com uma referência de 690 nM. Os títulos de ponto final foram calculados em um O.D. de 0,1 AU. As tabelas 4-6 ilustram os títulos de ELISA de ponto final em relação a Aβ. Em seguida a imunização primária, todos os oito conjugados (excluindo o controle negativo) induziram respostas imunes igG anti-Aβ mensuráveis. Entretanto, a dose de 30 pg, porém não a dose de 5 pg, de Aβ forneceu uma resposta positiva na semana 3, em seguida à imunização primária. Entre todos os conjugados, parece que o peptídeo Aβ 1-7, conjugado sem ligante, eliciou resposta tão boa quanto ou melhor do que outros conjugados estudados. Na dose de 5 pg, Aβ 1-5C teve um melhor resultado nas semanas 8 - 16. Aβ 1-7C foi melhor na dose de 30 pg. Análise dos títulos de anticorpo, após a segunda e terceira imunização com dose de 5 ou 30 pg, indica que a máxima resposta imune para Aβ para a maioria dos conjugados foi vista após a segunda imunização. Pelo menos em camundongos a terceira imunização não pareceu aumentar a resposta imune. O peptídeo Aβ, entretanto, necessitou três imunizações com a dose de 30 pg para alcançar resposta imune máxima contra o peptídeo (Tabela 56). Em termos de declínio de anticorpo durante um período prolongado de tempo, o nível de anticorpo dos grupos imunizados com conjugados foi reduzido em 2 a 3 vez, em comparação com o nível mais elevado dentro daquele grupo. Amostras individuais das semanas 6 e 8 foram analisadas para calcular GMTs em relação a Aβ para cada um do grupo (Tabela 6), para ver se qualquer grupo de conjugado era substancialmente melhor do que os outros. Análise estatística de títulos da semana 6 de conjugados Aβl-5C, Aβl-7C e Aβ 1-9C indicou que o conjugado Aβ 1-7 induziu um título significativamente mais elevado. É também evidente por este experimento que a sequência ligante GAGAC não contribuiu para aumentar a resposta imune ao peptídeo. Tabela 4

Tabela 4. Títulos de ponto final de ELISA semanas 0, 3, 6, 8, 13 e 16 em relação a Aβ. empregando-se antissoro de dose de 5 pg de conjugados de peptídeo abarcando comprimentos variáveis do terminal-N de peptídeo Aβ Amilóide. Ref: Elan hyperimune polyclonal #592 = 3.073.307. Ponto final a O.D. 0,1 Au. Camundongos Swiss Webster foram imunizados SC-N com 5 pg dos antígenos acima, formulados com 20 pg de STIMULON™ QS-21 nas semanas 0, 3 e 6. Tabela 5

Tabela 5. Títulos de ponto final de ELISA semanas 0, 3, 6, 8, 13 e 16 em relação a Aβ, empregando-se antissoro de dose de 30 pg de conjugados de peptídeo abarcando comprimentos variáveis do terminal-N de peptídeo Aβ Amilóide. Ref: Elan hyperimune polyclonal #592 = 3.073.307. Ponto final em O.D. 0,1 Au. Camundongos Swiss Webster foram imunizados SC-N com 30 pg dos antígenos acima, formulados com 20 pg de STIMULON™ QS-21 nas semanas 0, 3 e 6. Tabela 6

Tabela 6. GMTs de ponto final de ELISA semanas 6 e 8 em relação a Aβ, empregando-se antissoros de dose de 30 pg de conjugados de peptídeo abarcando comprimentos variáveis do terminal-N de Amiloide-Aβ. Ref.: Elan Hyperimmune Polyclonal #592 = 3.073.307. Ponto final em O.D. 0,1 AU. Camundongos Swiss Webster foram imunizados SC-N com 30 pg dos antígenos acima, formulados com 20 pg de STIMULON™ QS-21 nas semanas 0, 3 e 6. a. Análise estatística dos títulos da semana 6 de 1-5C, 1-7C e 1-9C, empregando-se Tukey-Kramer mostra uma diferença estatística entre 1-5C vs 1-7C somente, enquanto que análise empregando-se teste-T de Student mostra uma diferença estatística entre 1-5C vs 1-7C e 1-5C vs 1-9C. b. Análise estatística de títulos da semana 8 de 1-5C, 1-7C e 1-9C não mostra uma diferença estatística entre os três grupos. Entretanto, parece ser uma tendência que pode indicar uma diferença entre 1-5C vs 1-7C.

Coloração de Tecido de Cérebro de Camundongo PDAPP

[00175] O ensaio de coloração de tecido de cérebro PDAPP fornece uma indicação da funcionalidade dos conjugados de peptídeo Aβ e/ou antissoro Aβ 1-42. Amostras de soro de grupos de camundongos individuais foram separadamente analisadas quanto a sua capacidade em reconhecer placas de tecido de cérebro de camundongo PDAPP, contendo peptídeo amilóide. Os resultados são mostrados na Tabela 7A e 7B. Com exceção dos antissoros de conjugados Aβ 5mer, houve uma resposta relacionada com a dose no reconhecimento das placas. Independente do ligante, 30 pg de antissoros induzidos por conjugado tiveram melhores padrões de reatividade, em comparação com aquele de 5 pg de antissoros conjugados. Entretanto, com os antissoros de conjugado Aβ 5mer, parece haver reatividade similar ou melhor para o grupo 5 pg. Comparando-se todos estes resultados, concluiu-se que os conjugados produzidos de Aβ l-5mer a Ab l-9mer são suficientes para eliciar placas reconhecendo resposta imune de camundongos e a presença de ligante não é essencial. As seguintes conclusões podem ser tiradas deste estudo: (a) Todos os conjugados dc peptídeo induziram antissoro altamente titulado em relação à proteína CRM197 carreadora em níveis iguais ou ligeiramente mais elevados, em comparação com o controle de CRM197 não conjugado (não mostrado), (b) Os conjugados com o ligante GACAC não aumentou a imunogenicidade ou funcionalidade, em comparação com os conjugados sem o ligante. (c) Os dados de imunogenicidade e coloração de tecido de cérebro PDAPP (uma indicação inicial do anticorpo funcional) mostram que os conjugados de Aβ 1-5mer e Aβ l-7mer pareceram ser os imunógenos preferidos para mais desenvolvimento. Tabela 7A. Coloração de tecido de cérebro de camundongo PDAPP

Todo o antissoro diluído 1:1000 para procedimento de coloração. Tabela 7B. Coloração de tecido de cérebro de camundongo PDAPP

Todo antissoro diluído 1:1000 para procedimento de coloração.

EXEMPLO 7 Estudos de Imunogenicidade em Macacos

[00176] Grupos de 6 macacos receberam 150 pg de conjugado 7mer (conjugado total), auxiliado com STIMULON1M QS-21, alume ou formulação RC529 SE nos dias 0, 29 e 58. Grupos adicionais incluídos foram 30 pg de conjugado 5mer com alume (Al(OH)s) ou RC529 SE, 75 e 300 pg de Aβ com STIMULON™ QS-21 como controles positivos. Os controles positivos foram imunizados a cada duas semanas. Nodia 36 e 64, os títulos anticorpo anti-Aβ foram determinados (Figuras 7 - 9). No dia 36, conjugados 7mer/CRM com STIMULON™ QS-21, Alume e RC529 SE eliciaram títulos GMT de 10110, 13330 e 17090, respectivamente (Figura 7). Ao contrário, Aβ 1-42 mais STIMULON™ QS-21 eliciaram GMTs de 223 e 1734 em níveis de doses de 75 e 300 pg, respectivamente. O conjugado Aβ 5mer eliciou um título de 2134 com alume e 15980 com RC529 SE. No dia 64, isto é, após 3 doses de conjugados com STIMULON™ QS21 ou RC-529 SE induziu substancialmente titulações substancialmente mais elevadas do que pós a segunda dose (GMTs 69910 para 7 mer/RC-529 SE; 21640 para Aβ 5mer/RC529 SE e 30310 para Aβ 7mer/STIMULON™ QS-21) (Figura 8). Os conjugados com alume eliciaram titulações reduzidas em pós terceira imunização, em comparação com pós segundo imunização. Parece que o conjugado Aβ 7mer eliciou uma melhor resposta em comparação com o conjugado Aβ 5mer. Em macacos, auxiliando-se o conjugado Aβ 7mer com RC-529 SE ou STIMULON™ QS-21 foi eliciada a resposta mais elevada (Figura 9. A resposta ao conjugado Aβ 7mer com alume foi moderada e similar àquela de 300 pg Aβ 1-42 com STIMULON™ QS-21.

[00177] Diversas conclusões podem ser tiradas do presente exemplo. Primeira, ambos os conjugados são muito imunogênicos em espécies primatas. Segunda, a presença de adjuvantes na formulação de imunização influencia significativamente a resposta imune. Terceira, exceto para o adjuvante de alumínio, RC-529 SE e STIMULON™ QS-21 aumentam a resposta imune após cada dose de imunização, pelo menos até três doses (Figuras 9). No total, o conjugado Aβ 7mer induziu resposta anticorpo mais elevada na presença de 529, seguido por STIMULON™ QS-21 (vide Figura 9).

EXEMPLO 8 Preparação de Conjugados de Múltiplos Peptídeos Antigênicos (MAP) e seu Estudo de Imunogenicidade

[00178] Diversos métodos são disponíveis para gerar múltiplos sítios antigênicos nos carreadores. Nos exemplos anteriores, cada sítio antigênico é separadamente conjugado com o carreador por químicas de conjugação e capeamento definidas. Neste exemplo, múltiplos sítios antigênicos são construídos por síntese de fase sólida de repetições em tandem de Aβl-7mer. Alternativamente, estas repetições em tandem podem ser acopladas com epítopos de célula-T, com ou sem ligação através de um núcleo de lisina como descrito em outra parte. Estes múltiplos peptídeos antigênicos foram sintetizados com um resíduo de cisteinila adicional para conjugação com a proteína carreadora. Os peptídeos contendo uma unidade repetidora (1-7), três unidades repetidoras (1-7)3 e cinco unidades repetidoras (1-7)5, com um resíduo cisteinila adicional na extremidade carboxila, foram sintetizadas. Estes peptídeos foram covalentemente ligados a CRM bromo acetilado durante a noite, através de seus resíduos de cisteína de terminal-C. A reação foi realizada em pH 9,0-9,2 com relações de peptídeo:CRM adicionadas como resumido na Tabela 8. Grupos bromoacetila, que não reagiram com peptídeo, foram capeados com N-acetilcisteamina. Estes lotes representam conjugados contendo uma única cópia, três cópias em tandem e cinco cópias em tandem do peptídeo Aβl-7 conjugado com CRM, respectivamente. A Tabela 8 resume brevemente as propriedades das amostras. Tabela 8 Amostras de Conjugados de Múltiplos Peptídeos Antigênicos (MAP)

[00179] Carga de peptídeo (o número médio de peptídeos Aβ 1-7 por carreador) e números de capeamento (Tabela 9) são os números dos únicos aminoácidos (CMC ou CMCA) por carreador, como determinado por análise amino ácida. Os valores CMC e CMCA foram referenciados para lisina. Tabela 9 Grau de Conjugação e Capeamento de Cada Conjugado

[00180] Camundongos Swiss-Webster (10 por grupo) foram imunizados subeutaneamente com 1 ou 0,1 pg de peptídeo conjugado Aβ/CRM. Metade dos camundongos foram imunizados com a composição formulada com 100 pg do adjuvante A1(OH)3 e metade foram imunizados sem o adjuvante. As imunizações foram programadas nas semanas 0 e 3. Os sangramentos foram programados paras as semanas 0, 3 e 6. As amostras de soro foram analisadas quanto a resposta anticorpo contra peptídeo Aβl- 42mer. Os resultados são mostrados na Tabela 10. Tabela 10 Titulações de Ponto Final Anti-Aβ para Conjugados de Múltiplos Peptídeos Antigênicos (MAP)

[00181] Todos os conjugados induziram título anticorpo anti-Aβ 1-42, após a imunização primária e os níveis foram substancialmente aumentados após a dose de reforço. Na ausência de adjuvante de alumínio, as diferenças na resposta de dose foram evidentes nos sangramentos tanto da semana 3 como da semana 6. A dose mais elevada eliciou resposta anti-corpo altamente titulada. O adjuvante de alumínio eliciou resposta anticorpo substancialmente mais elevada na semana 3 em ambos os níveis de dose (0,1 e 1 pg), em comparação com os grupos não-auxiliados. Após imunização secundária, os conjugados dados em dose de 1 pg eliciaram 5 a 10 vezes aumento dos níveis de anticorpo. Neste nível de dose, os conjugados de peptídeo com 3 e 5 repetições induziram resposta anticorpo mais elevada do que uma única repetição contendo o conjugado. Os títulos contra o carreador CRM foram também determinados e estes são listados na Tabela 11. Tabela 11 Títulos de Ponto Final Anti-CRM para Conjugados de Múltiplos Peptídeos Antigênicos (MAP)

[00182] Os animais foram imunizados nas semanas 0 e 3 e sangrados nas semanas 0, 3 e 6. Adjuvante: 100 pg A1(OH)3 ou nenhum. ND= Não Determinado.

[00183] Os dados da Tabela 11 indicam que os grupos não auxiliados induziram níveis muito baixos de resposta anticorpo anti-CRM em níveis de dose tanto de 1 pg, bem como de 0,1 pg, mesmo após duas imunizações. Entretanto, os conjugados com adjuvante de hidróxido de alumínio induziram níveis substanciais de resposta anticorpo anti-CRM em dose de 1 pg e resposta muito mais baixa em dose de 0,1 pg. Na presença do adjuvante, os títulos CRM foram mais elevado para o conjugado de repetição única, intermediário para o conjugado de tripla repetição e mais baixo para o conjugado de quíntupla repetição. Isto é como esperado, uma vez que a dose CRM por dose de peptídeo é mais baixa para Aβ(l-7)s/CRM e mais elevada para Aβ(l-7)i/CRM. As diferenças foram somente estatisticamente significativas na semana 6 para a dose de 0,1 pg.

[00184] O objetivo da presente invenção é eliciar elevada resposta imunogênica titulada contra o hapteno antigênico e não necessariamente contra a proteína carreadora. Sob certas circunstâncias, é desejável eliciar resposta imune ótica contra o determinante antigênico de hapteno, com a menor ou nenhuma resposta imune contra a proteína carreadora. Para tais aplicações, os conjugados com repetições em tandem de múltiplos determinantes antigênicos, com formulação não auxiliada, atenderão à necessidade.

EXEMPLO 9 Preparação de Conjugados Aβ-Peptideo com Várias Proteínas Carreadoras e sua Imunogenicidade

[00185] Este exemplo compara a imunogenicidade dos conjugados utilizando seis diferentes proteínas carreadoras. O sal acetato de Aβl-7 foi adicionado a carreadores de bromoacetilado em uma relação 1:1 em peso em pH 9. Todos os conjugados, exceto Aβl-7/rC5ap, foram capeados com N-acetilcisteamina. Todos os carreadores alternativos são proteínas bacterianas recombinantes, incluindo CRM (toxóide de difteria), peptidase C5a recombinante (rC5ap; clonado de Streptococcus agalactiae, inclui mutações D130A e S512A), ORFs 1224,1664,2452 (todos clonados de Streptococcus pyogenes) c T367, T858 (cada um clonado de Chlamydia pneumoniae).Um resumo dos carreadores usados e encontrado na Tabela 12. O grau de conjugação e capeamento de cada conjugado Aβ 1-7 com estes carreadores são apresentados na Tabela 13.

[00186] Este estudo mostrou que o conjugado de peptidase C5a recombinante induziu titulações mais elevadas contra Aβ do que a maioria dos outros carreadores testados, incluindo CRM. Esta diferença foi estatisticamente significativa para os títulos da semana 6 dos grupos que receberam hidróxido de alumínio. Além disso, o conjugado Aβl-7/T858 foi significativamente mais imunogênico do que a maioria dos outros conjugados, na ausência de adjuvante. O único conjugado que teve um fraco desempenho em relação ao conjugado de controle CRM foi Aβl-7/T367, um conjugado que também não reagiu com um anticorpo monoclonal específico AB por Western blot. Este estudo confirma que numerosos outros carreadores podem ser usados com sucesso contra o peptídeo Aβ. Tabela 12 Lista de Carreadores e Propriedades de Conjugado

Tabela 13 Grau de Conjugação e capeamento de Cada Conjugado

[00187] Resultados da conjugação: A carga de peptídeo (o número médio de peptídeos Aβl-7 por carreador) e o número de capeamento são os números de aminoácidos únicos (CMC ou CMCA) por carreador, como deternúnado por análise de aminoácido. Os valores CMC e CMCA foram referenciados para lisina.

Resultados da Imunização

[00188] O título médio geométrico para cada grupo deste estudo é listado na Tabela 14. Na semana 3, independente da presença do adjuvante, Aβl-7/rC5ap induziu significativamente títulos anti-Aβ mais elevados do que os correspondentes conjugados, preparados com Streptococcus pyogenes ORFs 1224, 1664,2452 ou Chlamydia pneumoniae ORFs T367 e T858. Na semana 3, na ausência de adjuvante, Aβl-7/rC5ap era mais imunogênico do que todos os outros conjugados, exceto Aβl-7/T858. O conjugado T858, sem A1(OH)3, induziu títulos mais elevados do que ORF1224, ORF1664, ORF2452 e conjugados CRM sem adjuvante. O único conjugado que era significativamente mais imunogênico do que Aβl-7/CRM foi Aβl-7/T367 (p< 0,00002). O carreador T367 teve um fraco desempenho com ou sem adjuvante nas semanas tanto 3 como 6. Na semana 6, o conjugado rC5ap com hidróxido de alumínio era mais imunogênico (p<0,04) do que todos os outros conjugados, exceto Aβl-7/ORF2452. Na ausência de adjuvante, tanto Aβl-7/rC5ap como Aβl-7/T858 induziram significativamente títulos mais elevados do que os conjugados ORF1224, ORF1664 ou T367. Aβl-7/CRM sem hidróxido de alumínio induziu títulos mais elevados do que Aβl-7/ORF1664 ou Aβl-7/T367. Tabela 14 Títulos de Ponto Final Anti-Aβ 1-42

[00189] Os animais foram imunizados nas semanas 0 e 3 e nas semanas 0, 3 e 6. A dose é baseada na quantidade total do conjugado. Adjuvante: 100 pg A1(OH)3 ou nenhum.

EXEMPLO 10 Preparação de Conjugados de Peptídeo Aβ-Proteina Adicionais I. Ativação

[00190] CRM197 descongelado (8 ml, 59,84 mg, a 7,48 mg/ml) foi dissolvido em tampão de borato 0,1 M (pH 9, 3,968 ml) para trazer a concentração para 5 mg/ml. A solução foi esfriada em um banho de gelo a 0 - 5 °C. N-hidroxissuccinimida de ácido bromoacético (59,9 mg) (Aldrich-Sigma) foi dissolvida cm DMF (100 gtL) (Aldrich-Sigma) e adicionada em gotas à solução de CRMI97. Na adição de N- hidroxissuccinimida do ácido bromoacético, um precipitado foi observado. Quando o pH foi verificado, ele havia diminuído para pH 6. O pH da mistura de reação foi trazido de volta para pH 9, adicionando-se mais tampão de borato 0,1 M. A mistura de reação foi então agitada a 4 °C por 1 h, com rotação suave. A mistura foi purificada e concentrada utilizando-se YM-10 como eluente. Frações positivas de Bradford Reagent foram reunidas e concentradas empregando-se centriprep YM-10. O grau de bromoacetilação foi determinado por ensaio de Bradford (linear). A concentração foi então ajustada para ser 5 mg/ml e foi armazenada no freezer em 5% de sacarose, até uso.

II. Conjugação

[00191] Para cada conjugação, CRM197 bromoacetilada descongelada foi usada. Os peptídeos foram dissolvidos em tampão de borato (2,5 mg em 125 ml de tampão de borato 0,1 M). Ligeira insolubilidade foi observada com peptídeos Aβ KLVFFAEDC (SEQ. ID NO: 45), CLVFFAEDV (SEQ. ID NO: 47), CKLVFFAED (SEQ. ID NO: 48) e LVFFAEDC (SEQ. ID NO: 50). CRM197 bromoacetilado (5 mg/ml) foi tratada com as soluções/suspensões de peptídeo. A relação de peptídeo e proteína na mistura era de 1:2. Turvação foi observada nas misturas de conjugado com os peptídeos KLVFFAEDC (SEQ. ID NO: 45), CLVFFAEDV (SEQ. ID NO: 47), CKLVFFAED (SEQ. ID NO: 48) e CLVFFAEDC (SEQ. ID NO: 45). As misturas foram então verificadas quanto a pH (pH 9) e incubadas a 4 °C durante a noite com lenta rotação. As concentrações finais das misturas foram feitas a 3 mg/ml antes da incubação. A turbidez das misturas de conjugado com os peptídeos CLVFFAEDV (SEQ. ID NO:47) e LVFFAEDC (SEQ. ID NO: 50) desapareceu após a incubação. Entretanto, KLVFFAEDC (SEQ. ID NO: 45) e CKLVFFAED ((SEQ. ID NO: 48) eram ainda ligeiramente turvos. Conjugado de proteína simulado foi também preparado com cisteamina em uma relação de 1:1 (p/p). Peptídeos sintetizados foram obtidos de BIOSOURCE com cerca de 95% de pureza. Octâmeros LVFFAEDVC (SEQ. ID NO: 44) KLVFFAEDC (SEQ. ID NO: 45) VFFAEDVGC (SEQ. ID NO: 43) CLVFFAEDV (SEQ. ID NO: 47) CKLVFFAED (SEQ. ID NO: 48) CVFFAEDVG (SEQ. ID NO: 46) Heptâmeros VFFAEDVC (SEQ. ID NO: 49) LVFFAEDC (SEQ. ID NO: 50)

III. Capeamento de Grupos de Lisina Não Reagidos em Proteína

[00192] As lisinas não reagidas foram capeadas com N- acetilcisteamina (CMCA; Aldrich-Sigma) em uma relação de 1/1 (p/p) por 4 h a 4 °C, enquanto girando no escuro. Os peptídeos não reagidos e os reagentes de capeamento foram removidos dos conjugados por diálise, empregando-se cassete Slide-A-Lyzer (corte Mw 10.000) (Pierce) contra tampão PBS (2 1) durante a noite (13 h). Troca de tampão e diálise foram realizadas duas vezes (2 x 14 h). Ligeira solubilidade foi observada nos conjugados com peptídeos KLVFFAEDC (SEQ. ID NO: 45) e CKLVFFAED (SEQ. ID NO: 48). Todos os conjugados foram então armazenados no refrigerador a 4 °C em um conservante.

IV. Caracterização do Carreador de Proteína:

[00193] MALDI-TOF MS foi usado para determinar a massa de CRM197 bromoacetilada e a massa do conjugado simulado N- acetilcisteamina-CRMi97.

[00194] Com base nas massas de CRMI97 e CRMI97 bromoacetilado, 11 resíduos de lisina foram modificados. (59941.46- 58590.29)/122 = 11 Onde: Mw de CRM197 é 58624.29 Mw de CRM197 bromoacetilada é 59941.46 Mw do bromoacetato é 122

[00195] O grau de bromoacetilação foi mais do que 28% (o número total de lisinas em CRM197 foi de 39). Destes 11 resíduos de lisina modificados, 10 foram acoplados com cisteamina. A eficiência de acoplamento foi de 90%. (61143- 59941)/119 = 10 Onde: Mw de CRM197 bromoacetilada é 59941.46 Mw do conjugado simulado é 61143 MW da N-acetilcisteamina é 119 (10/11) x 100 = 90

V. Caracterização dos Conjugados de Peptídeo-Proteína por Análise Western Blot SDS-PAGE com Gel Pré-moldado de Tris-Tricina:

[00196] Os conjugados de proteína-peptídeo foram analisados por Western blot. As faixas são: marcador (faixa 1); L-28375 24/01 (faixa 2); L-28375 24/02 (faixa 3); L-28375 24/03 (faixa 4); L-28375 24/04 (faixa 5); L-28375 24/05 (faixa 6); L-28375 24/06 (faixa 7) L-28375 24/07 (faixa 8); L-28375 24/08 (faixa 9); L-28375 24/09 (Simulado) (faixa 10); e BrAcCRMi97(faixa 11). Um anticorpo monoclonal específico de peptídeo de camundongos (248 - 6H9 - Aβ 17-28) foi usado como o anticorpo primário (antissoros) (diluição 1:3000 foi constatado ser a melhor). (H+L)-HPR IgG de camundongo Anti-Cabra foi o anticorpo secundário (1:1000 diluição). Foi observado que todos os conjugados foram reconhecidos pelo anticorpo primário, exceto quanto ao conjugado simulado e CRM197 ativada (Vide Figura 10).

Concentração da Proteína

[00197] As concentrações de proteína das amostras de conjugado foram determinadas pelo ensaio Pierce BC A (vide Tabela 15).

Análise de Aminoácido

[00198] A análise de aminoácido foi realizada para determinar o grau de conjugação. O grau de conjugação T foi calculado com base nos resíduos CMCA (carboximetilcisteamina) encontrados nos conjugados. CMCA foi usada para cobrir sítios ativados não-reativos, após conjugação com os peptídeos (vide Tabela 15). Tabela 15 Grau de Conjugação de Peptídeos com BrAcCRMig?

[00199] Todos os ensaios colorimétricos foram realizados empregando-se espectrofotômetro de microplaca e SOFTmax Pro.

EXEMPLO 11 Estudos Imunogênicos de Conjugados de Peptídeo Aβ em Camundongos Swiss Webster

[00200] Camundongos Swiss Webster exógamos foram imunizados com VFFAEDVG-C ((SEQ. ID NO: 43), LVFFAEDV-C (SEQ. ID NO: 44), KLVFFAED-C (SEQ. ID NO: 45), C-VFFAEDVG (SEQ. ID NO: 46), C-LVFFAEDV (SEQ. ID NO: 47),C-KLVFFAED (SEQ. ID NO: 48), VFFAEDV-C (SEQ. ID NO: 49), LVFFAED-C (SEQ. ID NO: 50) cada conjugado para CRMI97 ou com Aβl-7CRMi97, tudo formulado com o adjuvante RC 529 SE. Nove grupos de 10 animais por grupo foram imunizados subcutaneamente com um dos conjugados de peptídeo Aβ no início do estudo (semana 0) e subsequentemente na semana 4. Soro foi coletado antes porém nos mesmos dias da imunização.

Estudos Imunogênicos de Conjugados de Peptídeo Aβ em Camundongos Balb/c endógamos

[00201] Camundongos Balb/c endógamos foram imunizados no parágrafo precedente, porém foram também reforçados com conjugado e adjuvante na semana 12.

Resultados

[00202] Soros de ambos os estudos estão sendo coletados para análise de título de anticorpo IgG específico de peptídeo Aβi3_28. Os soros de camundongos Balb/c são também coletados para análise um dia antes do reforço da semana 12 e uma semana após. Células de baço de animais usados no Exemplo 11 são avaliadas quanto a seu potencial para responder in vitro a estímulo com um conjunto de peptídeos sobrepondo- se abarcando Aβi.42, Aβi-42 de comprimento total, CRMI97, ou ativadores policlonais. A análise consiste de leitora Ellispot para interleucinas 4 e 5 e interferon-gama. No término, os conjugados de peptídeo Aβ são avaliados como descrito acima e como descrito no Exemplo 6.

EXEMPLO 12 Estudos Imunogênicos de Conjugados de Peptídeo Aβ em Camundongos PSAPP

[00203] Camundongos PSAPP são imunizados com VFFAEDVG-C (SEQ. ID NO: 43), LVFFAEDV-C (SEQ. ID NO: 44), KLVFFAED-C (SEQ. ID NO: 45), C-FFAEDVG (SEQ. ID NO: 46), C- LVFFAEDV (SEQ. ID NO: 47), C-KLVFFAED (SEQ. ID NO: 48), VFFAEDV-C (SEQ. ID NO: 49), LVFFAED-C (SEQ. ID NO: 50). O camundongo PSAPP, um camundongo duplamente transgênico (PSAPP), superexpressando transgenes APO e PSI mutantes, é descrito em Holcomb et al. (1998) Nature Medicine 4:97-11.

Estudos Imunogênicos de Conjugados de peptídeo Aβ em Camundongos PDAPP

[00204] Os camundongos PDAPP são imunizados com VFFAEDVG-C (SEQ. ID NO: 43), LVFFAEDV-C (SEQ. ID NO: 44), KLVFFAED-C (SEQ. ID NO: 45), C-VFFAEDVG (SEQ. ID NO: 46), C- LVFFAEDV (SEQ. ID NO: 47), C-KLVFFAED (SEQ. ID NO: 48), VFFAEDV-C (SEQ. ID NO: 49), LVFFAED-C (SEQ. ID NO: 50). O camundongo PDAPP expressa uma forma mutante de APP humano (APPV71F) e desenvolve a doença de Alzheimer em idade jovem (Bard et al. (2000) Nature Medicine 6:916-919; Masliah E et al. (1996) J Neurosci. 15; 16(18): 5795 - 811).

Resultados

[00205] Soros de ambos os estudos são coletados para análise de título de anticorpo IgG específico de peptídeo Aβi3-i8. Na conclusão, os conjugados de peptídeo Aβ serão avaliados como descrito acima e como descrito nos Exemplos 6 e 11, bem como no ensaio de condicionamento de medo contextual (CFC).

[00206] O condicionamento de medo contextual é uma forma comum de aprender que é excepcionalmente confiável e rapidamente adquirida na maior parte dos animais, por exemplo, mamíferos. Os animais de teste aprendem a temer um estímulo e/ou ambiente anteriormente neutro, por causa de sua associação com uma experiência adversa (vide, por exemplo, Fanselow, Anim. Lear. Behav. 18:264-270 (1990); Wehner et al., Nature Genet. 17: 331-334, (1997); Caldarone et al., Nature Genet. 17: 335 - 337 (1997)).

[00207] O condicionamento de medo contextuai é especialmente útil para determinar a função ou disfunção cognitiva, por exemplo, como um resultado de doença ou distúrbio, tal como doença ou distúrbio neurodegenerativo, uma doença ou distúrbio relacionado-Aβ, uma doença ou distúrbio amiloidogênico, a presença de uma alteração genética desfavorável afetando a função cognitiva (por exemplo, mutação genética, rompimento de gene ou indesejado genótipo) e/ou a eficácia de um agente, por exemplo, um agente conjugado Aβ, sobre a capacidade cognitiva. Por conseguinte, o ensaio CFC provê um método para independentemente testar e/ou validar o efeito terapêutico dos agentes, para evitar ou tratar uma doença ou distúrbio cognitivo e, em particular, uma doença ou distúrbio afetando uma ou mais regiões do cérebro, por exemplo, o hipocampo, subículo, córtex cingulado, córtex prefrontal, córtex perirrinal, córtex sensório,e lobo temporal médio.

[00208] Tipicamente, o ensaio CFC é realizado usando-se câmaras de animal padrão e o emprego de treinamento condicionante, compreendendo um choque suave (por exemplo, choque no pé de 0,35 mA) junto com um choque auditivo (por exemplo, um período de ruído branco de 85 db), olfatório (por exemplo, extrato de amêndoa ou limão), tátil (por exemplo, textura do piso da gaiola) e/ou instrução visual (flash de luz). A resposta à experiência aversiva (choque) é tipicamente uma de congelamento (ausência de movimento, exceto quanto à respiração), porém pode incluir piscamento dos olhos ou mudança do reflexo da membrana nictitante, dependendo do animal de teste selecionado. A resposta aversiva é usualmente caracterizada no primeiro dia de treinamento, para determinar uma linha de referência para medo não- condicionado, com resultados de resposta aversiva nos subseqüentes dias de teste, por exemplo, congelamento na presença do contexto e/ou instrução, porém na ausência da experiência aversiva, sendo caracterizada como medo condicionado por contexto e sugestão, respectivamente. Para confiabilidade melhorada, os animais de teste são tipicamente testados separadamente por técnicos independentes e classificados durante o tempo. Detalhes de projeto experimental adicionais podem ser encontrados na técnica, por exemplo, em Crawley, JN, What’s Wrong with my Mouse; Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice, Wiley-Liss, NY (2000).

[00209] Animais de teste exempliticativos (por exemplo, animais modelo) incluem mamíferos (por exemplo, roedores ou primatas não-humanos), que exibem sintomas proeminentes ou patologia que é característica de um distúrbio amiloidogênico, tal como Alzheimer’s. Os animais modelo podem ser criados por endogamia seletiva ou podem ser geneticamente construídos empregando-se técnicas transgênicas que são bem conhecidas na técnica, tal como uma alteração genética alvejada (por exemplo, uma mutação genética, rompimento de gene) em um gene que é associado com o distúrbio de demência, resultando em expressão ou função aberrante do gene alvejado. Por exemplo, diversas cepas de camundongo transgênicas são disponíveis, que superexpressam APP e desenvolvem patologia de placa amilóide e/ou desenvolvem déficits cognitivos que são característicos da doença de Alzheimer (vide, por exemplo, Games et al., supra, Johnson-Wood et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA 94:1550 (1997); Masliah E e Rockenstein (2000) J Neural Transm Suppl.; 59: 175 - 83).

[00210] Alternativamente, o animal modelo pode ser criado usando-se compostos químicos (por exemplo, neurotoxinas, anestésicos) ou técnicas cirúrgicas (por exemplo, ablação estereotática, axotomização, transecção, aspiração), que ablactem ou de outro modo interfiram com a função normal de uma região do cérebro anatômica (por exemplo, hipocampo, amídala, córtex perirrinal, núcleo septal mediano, locos cerúleo, corpos mamários) ou neurônios específicos (por exemplo, serotonérgicos, colinérgicos ou dopaminérgicos) que são associados com sintomas característicos ou patologia do distúrbio amiloidogênico. Em certas formas de realização preferidas, o modelo animal exibe um déficit cognitivo proeminente,associado com o aprendizado ou memória, além da patologia neurodegenerativa que se associou com um distúrbio amiloidogênico. Mais preferivelmente, o déficit cognitivo progressivamente piora com o aumento da idade, de modo que a progressão da doença no modelo animal corresponde à progressão da doença em um indivíduo sofrendo do distúrbio amiloidogênico.

[00211] Os ensaios de condicionamento de medo contextuai c outros in vivo, para testar a funcionalidade dos conjugados descritos aqui, podem ser realizados empregando-se camundongos ou camundongo tipo selvagem, tendo uma certa alteração genética conduzindo a memória deteriorada ou modelos de camundongo de doença neurodegenerativa, por exemplo, doença de Alzheimer, incluindo modelos de camundongo que exibem elevados níveis de Aβ solúvel no fluido cerebroespinhal (CSF) ou plasma. Por exemplo, modelos animais para doença de Alzheimer incluem camundongos transgênicos que superexpressam a mutação “Swedish” da proteína precursora amilóide humana (hApPswe', Tg2575), que apresenta déficits e de memória dependentes da idade e placas (Hsiao et al. (1996) Science 274:99-102). A funcionalidade in vivo dos conjugados descritos aqui pode também ser testada usando-se o camundongo mutante PS-1, descrito em Duff et al. (1996) Nature 383, 710 - 713. Outros modelos transgênicos geneticamente alterados de doença de Alzheimer são descritos em Masliah E e Rockenstein E, (2000) J Neural Transm Suppl. 59:175-83.

[00212] Em vários aspectos, os métodos da invenção compreendem a administração de um conjugado Aβ que é capaz de melhorar a cognição em um indivíduo em que o conjugado Aβ foi identificado na utilização de um ensaio que é prediz adequadamente a eficácia imunoterapêutica no indivíduo. Nas formas de realização exemplificativas, o ensaio é um ensaio de modelo animal que é baseado, pelo menos em parte, na comparação da cognição, como determinado por um estudo de condicionamento de medo contextual, de um reagente imunológico de teste para o animal, como comparado com um controle adequado. O ensaio CFC avalia as mudanças de cognição de um animal (tipicamente um camundongo ou rato) no tratamento com um composto terapêutico potencial. Em certas formas de realização, a mudança de cognição avaliada é uma melhoria da condição de deterioração da memória ou uma inversão do déficit de memória. Por conseguinte, o ensaio CFC provê um método direto para determinar o efeito terapêutico dos agentes, para evitar ou tratar doença cognitiva e, em particular, uma doença ou distúrbio afetando uma ou mais regiões do cérebro, por exemplo, o hipocampo, subículo, córtex cingulado, córtex prefrontal, córtex perirrinal, córtex sensório e lobo temporal médio. Tais ensaios CFC são examinados no Pedido de Patente U.S. copendente No. 60/XXX.XXX, intitulado “Contextual Fear Condicioning for Predicting Immunotherapeutic Efficacy” (Pasta do Procurador No. ELN-058-1), depositado em 15 de dezembro de 2004 e Pedido de Patente U.S. No. de Série 60/XXX.XXX, intitulado “Contextual Fear Conditioning for Predicting Immunotherapeutic Efficacy” (Pasta do Procurador No. ELN- 058-2), cujo inteiro conteúdo é por este meio incorporado aqui por referência. BIBLIOGRAFIA Bernatowicz, M. S., e Matsueda, G. R. (1986) Analytical Biochemistry 155: 95-102. Kniskern, P. J., e Marburg, S. (1994) Development an Clinical Uses of Haemophilus b Conjugate Vaccines: Conjugation: Design, Chemistry, e Analysis Ellis, R. W., e Granoff, D. M., Eds; Marcel Dekker, Inc: New York, NY, 37-70 Arrizon, V., Biechler, R., Cummings, J., e Harbaugh, J. (1991) High- Performance Liquid Chromatography of Peptide and Proteins: Separation, Analysis, an Conformation Mant, C. T. e Hodges, R. S., Eds; CRC Press: Boca Raton, FL, 859-863. Carlsson, J. et al. (1978) Biochem J, 173: 723. Means, G. E., Cangdon, W. L, e Bender, M. I. (1972) Biochemistry 11: 3564- 3574. Glenner & Wong (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun. 120: 1131 Hardy (1984) Trends in Neurosciences 20: 1131. Hardy (1977) Trends in Neurosciences 20: 154. Stoute et al. (1997) N. Engl. J. Med. 336: 86-91. Goebel et al., (1939) J. Exp. Med. 69: 5 3. Schneerson etal. (1980) J Exp. Med. 152: 361-376. Chu et al. (1983) Infect. Immun. 40: 245. Schneerson et al. (1984) Infect. Immun. 45: 582-591. Anderson et al. (1985) J. Pediatr. 107: 346. Insel et al. (1986) J Exp. Med. 158: 294. Patente U. S. No. 4.673.574 Junho de 1987 Anderson Patente U. S. No. 4.902.506, Fev. de 1990 Anderson et al Patente U. S. No. 5,192.540 Março de 1993 Kuo et al. Patente U. S. No. 5.306.492 Abril de 1994, Porro Patente U. S. No. 5.360.897 Nov. de 1994 Anderson et al. Patente U. S. No. 5.785.973 Jul. de 1998 Bixler et al Patente U. S. No. 6.361.777 Março de 2002 Hoogerhout Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C. S. H. P. Pres, NY 2a. ed„ 1989) Bernatowicz, M. S., e Matsueda, G. R. (1986) Analytical Biochemistry 155, 95-102. Kniskern, P. J., e Marburg, S. (1994) Development and Clinical Uses of Haemophilus b Conjugate vaccines: Conjugation: Design, Chemistry and Analysis, Ellis, R. W. and Granoff, D. M., Eds. Marcel Decker, Inc: New York, NY, 37-70. Arrizon, V., Biechler, R., Cummings, J., e Harbaugh, J. (1991) High- Performance Liquid Chromatography of Peptide and Proteins: Separation, Analysis, and Conformation Mant, C. T. e Hodges, R. S., Eds; CRC Press: Boca Raton, FL, 859-863.

Claims

1. Método para produzir um conjugado imunogênico, caracterizadopelo fato de que compreende as etapas de: (a) introduzir um grupo reativo em um resíduo de aminoácido de um imunógeno de peptídeo; (b) derivar um ou mais grupos funcionais de uma proteína carreadora para gerar um grupo funcional ativado na proteína carreadora, em que a proteína carreadora é selecionada do grupo que consiste em CRM]97, Streptococcus pyogenes ORF 1224, Streptococcus pyogenes ORF1664, Streptococcus pyogenes ORF2452 e Chlamydia pneumoniae ORF T858; (c) reagir o imunógeno de peptídeo da etapa (a) com a proteína carreadora da etapa (b) sob condições de formar um conjugado, em que o grupo reativo do imunógeno de peptídeo é covalentemente ligado ao grupo funcional ativado na proteína carreadora; e (d) reagir ainda o conjugado da etapa (c) com N- acetilcisteamina, para inativar qualquer grupo funcional ativado remanescente na proteína carreadora para gerar o conjugado imunogênico, e para desse modo preservar a funcionalidade do carreador, de modo a reter sua capacidade de eliciar as desejadas respostas imunes contra o imunógeno de peptídeo, que de outro modo não ocorreria sem um carreador, em que o conjugado tem a formula:

em que C é a proteína carreadora e Xd é um grupo funcional derivado de um resíduo de aminoácido da proteína carreadora, P é um imunógeno de peptídeo, R é uma molécula de capeamento, n é um inteiro maior do que 0, porém menor do que ou igual a 85 e p é um inteiro maior do que 0, porém menor ou igual a 85.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a proteína carreadora é CRMI97.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o imunógeno de peptídeo é selecionado do grupo consistindo de uma proteína bacteriana, uma proteína virai e uma proteína eucariótica.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o grupo funcional de uma ou mais moléculas de aminoácido da proteína carreadora é derivado empregando-se um reagente reticulante.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizadopelo fato de que o grupo funcional é derivado com um agente haloacetilante.

6. Conjugado imunogênico compreendendo um imunógeno de peptídeo covalentemente ligado à proteína carreadora, caracterizadopelo fato de queo conjugado imunogênico tem a fórmula:

em que C é uma proteína carreadora selecionada do grupo que consiste em CRM197, Streptococcus pyogenesORF1224, Streptococcus pyogenes ORF1664, Streptococcus pyogenes ORF2452 e Chlamydia pneumoniae ORF T858 c Xdé um grupo funcional derivado de um resíduo de aminoácido da proteína carreadora, P é um imunógeno de peptídeo covalente ligado por meio de um grupo reativo de um resíduo de aminoácido do imunógeno de peptídeo ao grupo funcional derivado do resíduo de aminoácido da proteína carreadora, R é uma molécula de capeamento formada por reação do conjugado com N-acetilcisteamina covalentemente ligada ao grupo funcional derivado de um resíduo de aminoácido da proteína carreadora, desse modo preservando a funcionalidade da proteína carreadora, de modo a reter sua capacidade de eliciar as desejadas respostas imunes contra o imunógeno de peptídeo, o que de outro modo não ocorreria sem um carreador, n é um inteiro maior do que 0, porém menor do que ou igual a 85 e p é um inteiro maior do que 0, porém menor do que 85.

7. Conjugado imunogênico de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelo fato de que a proteína carreadora é CRM197.

8. Conjugado imunogênico de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelo fato de que o imunógeno de peptídeo é selecionado do grupo consistindo de uma proteína bacteriana, uma proteína virai e uma proteína eucariótica.

9. Composição imunogênica, caracterizadapelo fato de que compreende um conjugado imunogênico de um imunógeno de peptídeo com uma proteína carreadora gerado pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 8, junto com um ou mais excipientes, diluentes e/ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.

10. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 9, caracterizadapelo fato de que um ou mais adjuvantes são selecionados do grupo consistindo de GM-CSF, 529 SE, IL-12, fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio, Mycobacterium tuberculosis, Bordetella pertussis. lipopolissacarídeos bacterianos, compostos de aminoalquil glicosamina fosfato, MPL™ (monofosforil lipídeo A 3-O-desacilado), um polipeptídeo, Quil A, STIMULON™ QS-21, uma toxina da coqueluche (PT), uma toxina instável ao calor de E.coli (LT), IL-1 oc, IL-1 β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, interferon-α, interferon-β, interferon-y, G-CSF, TNF-oc e TNF-β.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de introdução do grupo reativo no peptídeo de imunógeno compreende adicionar um resíduo de aminoácido possuindo um grupo reativo.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o resíduo de aminoácido é um resíduo de cisteina em que o grupo reativo compreende -SH, ou o resíduo de aminoácido é um resíduo de arginina e o grupo reativo compreende um grupo guanidila, ou o resíduo de aminoácido é um resíduo de glutamato ou aspartato e o grupo reativo compreende -COOH, ou o resíduo de aminoácido é um resíduo de lisina e o grupo reativo compreende -NH2.

13. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o resíduo de aminoácido é introduzido no peptídeo de imunógeno por adição durante a síntese do peptídeo.

14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de introdução do grupo reativo no peptídeo de imunógeno compreende gerar um grupo tiol pendente em um resíduo de aminoácido suscetível a tal modificação por meio de um reagente tiolante.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado de que o reagente tiolante compreende N-acetil homocisteína tiolactona.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11, 13 ou 14, caracterizado pelo fato de o resíduo de aminoácido está localizado na porção amino-terminal do peptídeo de imunógeno ou na porção carbóxi-terminal do peptídeo de imunógeno.

17. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína carreadora ainda compreende um ou mais ligantes de polipeptídeos covalentemente ligado à proteína carreadora, e em que um ou mais grupos funcionais compreendem um substituinte de um ou mais ligantes de polipeptídeos.

18. Conjugado imunogênico de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o grupo reativo do resíduo de aminoácido do peptídeo de imunógeno compreende um grupo sulfidrila livre.

19. Conjugado imunogênico de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o grupo sulfidrila é uma cadeia lateral de um resíduo de cisteína, ou um cadeia lateral tiolada de um resíduo de lisina.

20. Conjugado imunogênico de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o grupo reativo do resíduo de aminoácido do peptídeo de imunógeno compreende um grupo guanidila, um grupo carboxila ou um grupo ε-amino.

21. Conjugado imunogênico de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a proteína carreadora ainda compreende um ligante de polipeptídeo covalentemente ligado à proteína carreadora, e em que o grupo funcional compreende um substituinte ou um ligante de polipeptídeo.

22. Conjugado imunogênico de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o resíduo de aminoácido do polipeptídeo de imunógeno compreendendo o grupo reativo está localizado na porção amino- terminal do peptídeo de imunógeno ou na porção carbóxi-terminal do peptídeo de imunógeno.