NO340432B1

NO340432B1 - Fremgangsmåte for å konjugere et peptid-immunogen, peptid-immunogen-protein/polypeptidbærerkonjugat og immunogen blanding

Info

Publication number: NO340432B1
Application number: NO20062687A
Authority: NO
Inventors: Krishna A Prasad; Rasappa G Arumugham
Original assignee: Wyeth Llc
Priority date: 2003-12-17
Filing date: 2006-06-09
Publication date: 2017-04-24
Also published as: AU2004299501B2; AR046960A1; HUE026000T2; TWI355390B; JP4764830B2; HK1091219A1; EA012984B1; TW200533681A; MY146566A; SG149013A1; BRPI0417744A8; EA200800300A1; AU2004299501A1; PT1701968E; ZA200604957B; IL176006A0; EP1701968B1; ECSP066655A; ES2546175T3; CA2549132A1

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for å konjugere et peptid-immunogen via en reaktiv gruppe fra en aminosyrerest fra peptid-immunogenet til en protein/polypeptidbærer som har en eller flere funksjonelle grupper.

Oppfinnelsen vedører også et peptid-immunogen-protein/polypeptidbærerkonj ugat.

Oppfinnelsen vedrører også en immunogen blanding.

Det vesentlige ved adaptiv immunitet er en organismes evne til å reagere på tilstedeværelsen av fremmede substanser og produsere komponenter (antistoffer og celler) som er i stand til spesifikt å interagere med og beskytte verten fra deres invasjon. Et " antigen" eller " immunogen" er en substans som er i stand til å fremkalle denne type immunrespons og som også kan interagere med de sensibiliserte cellene og antistoffene som er fremstilt mot det.

Antigener eller immunogener er vanligvis makromolekyler som inneholder distinkte antigene seter eller " epitoper" som gjenkjennes og interagerer med de forskjellige komponentene av immunsystemet. De kan eksistere som individuelle molekyler sammensatt av syntetiske organiske kjemikalier, proteiner, lipoproteiner, glykoproteiner, RNA, DNA eller polysakkarider eller de kan være deler av cellulære strukturer (bakterier eller sopper) eller virus (Harlow og Lane 1988a,b, c; Male et al., 1987).

Små molekyler som korte peptider, selv om de normalt er i stand til å interagere med produktene av en immunrespons, kan ofte ikke fremkalle en respons alene. Disse peptid-immunogenene eller " haptener" som de også kalles, er reelt sett ufullstendige antigener og, selv om de ikke alene er i stand til å bevirke immunogenisitet eller til å fremkalle antistoffproduksjon, kan de gjøres immunogene ved å koble dem til en egnet bærer. Bærere er typisk protein-antigener med høyere molekylvekt som kan fremkalle en immunologisk respons når de administreres in vivo.

I en immunrespons blir antistoffer produsert og utskilt av B-lymfocyttene

sammen med T-hjelper (TH)-cellene. I de fleste hapten-bærer-systemene, produserer B-cellene antistoffer som er spesifikke for både haptenet og bæreren. I disse tilfellene, vil T-lymfocyttene ha spesifikke bindingsdomener på bæreren, men vil ikke gjenkjenne haptenet alene. Ved en type synergisme samarbeider B og T-cellene for å indusere en hapten-spesifikk antistoffrespons. Etter at en slik immunrespons har funnet sted vil verten, ved

senere provokasjon med kun haptenet, vanligvis respondere ved å produsere hapten-spesifikke antistoffer fra hukommelsesceller dannet etter den første immuniseringen.

Syntetiske haptener som etterligner noen kritiske epitop-strukturer på større makromolekyler konjugeres ofte til bærere for å fremkalle en immunrespons til det større "parentale"-molekylet. For eksempel kan korte peptidsegmenter syntetiseres fra den kjente sekvensen av et protein og kobles til en bærer for å indusere immunogenisitet mot det native protein. Denne type av syntetisk tilnærming for produksjon av immunogener har lagt grunnlaget for mye av den aktuelle forskningen angående frembringelse av vaksiner. I mange tilfeller vil imidlertid det å kun frembringe en B-celle-respons ved anvendelse av syntetiske peptid-bærer-konjugater, uansett hvor godt de er utformet, ikke alltid garantere fullstendig beskyttende immunitet mot et intakt antigen. Immunresponsen frembrakt ved en kort peptidepitop fra en større viruspartikkel eller bakteriecelle kan kanskje bare være tilstrekkelig til å frembringe hukommelse på B-cellenivå. I disse tilfellene er det nå generelt anerkjent at en cytotoksisk T-celle-respons er en viktigere indikator for beskyttende immunitet. Utforming av peptid-immunogener med passende epitopbindingsseter for både B-celle og T-celle-gjenkjennelse er én av de mest utfordrende forskningsområdene innenfor immunologi i dag.

Metoden for å øke immunogenisiteten av små eller svakt immunogene molekyler ved å konjugere disse molekylene til store "bærer"-molekyler har vært anvendt med hell i flere tiår (se f. eks. Goebel et al. (1939) J. Exp. Med. 69: 53). For eksempel har det blitt beskrevet mange immunogene sammensetninger hvor rensede kapselpolymerer er konjugert til bærerproteiner for å skape mer effektive immunogene sammensetninger ved å utnytte denne "bærer-effekten." Schneerson et al. (1984) Infect. Immun. 45: 582-591). Konjugering er også vist å omgå den dårlige antistoffresponsen vanligvis observert hos barn ved immunisering med et fritt polysakkarid (Anderson et al. (1985) J. Pediatr. 107: 346; Insel et al. (1986) J. Exp. Med. 158: 294).

Hapten-bærer-konjugater er med hell dannet ved anvendelse av forskjellige kryssbinding/koblingsreagenser slik som homo-bifunksjonelle, hetero-bifunksjonelle eller null-lengde ("zero-length") kryssbindere. Mange slike metoder er for tiden tilgjengelige for kobling av sakkarider, proteiner og peptider til peptidbærere. De fleste metodene frembringer amin, amid, uretan, isotiourea eller disulfidbindinger eller i noen tilfeller tioetere. En ulempe ved anvendelse av koblingsreagenser, som innfører reaktive seter i sidekj edene til reaktive aminosyremolekyler på bærer og/eller haptenmolekyler, er at de reaktive setene, dersom de ikke nøytraliseres, er fri til å reagere med hvilket som helst uønsket molekyl enten in vitro (følgelig påvirke funksjonaliteten eller stabiliteten av konjugatet(ene) negativt) eller in vivo (representerer følgelig en potensiell risiko for ugunstige hendelser hos personer eller dyr immunisert med preparatene). Slike overskytende reaktive seter kan reageres eller "cappes", for å inaktivere disse setene, ved anvendelse av forskjellige kjente kjemiske reaksjoner, men disse reaksjonene kan på annen måte være forstyrrende for funksjonaliteten av konjugatene. Dette kan være spesielt problematisk ved forsøk på å skape et konjugat ved å innføre de reaktive setene inn i bærermolekylet, ettersom dets større omfang og mer komplekse struktur (relativt til haptenet) kan gjøre det mer sårbart for de forstyrrende effektene av kjemisk behandling. Faktisk er det ikke kjent noen eksempler på fremgangsmåter hvorved et konjugat blir fremstilt ved først å aktivere bæreren, og deretter reagere med haptenet i en konjugeringsreaksjon og til slutt "cappe" de gjenværende reaktive setene, mens evnen av det resulterende konjugatet til å fungere som en immunogen sammensetning som har de ønskede egenskapene av "bærer-effekten", bevares.

WO 0050077 Al tilveiebringer peptid-immunogener koblet til en bærer hvor bæreren er avledet fra Haemophilus Influenzae protein D eller fragmenter derav.

WO 9315760 Al angår en dobbel-bærer ummunogen konstruksjon som utgjøres av minst en primær bærer som omfatter et molekyl med høy molekylvekt som er større enn 70 KD og minst en sekundær bærer som omfatter et T-avhengig antigen konjugert til en primær bærer.

EP 09411738 A angår en metode for å konjugere et polysakkarid til et bærerprotein.

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for å konjugere et peptid-immunogen via en reaktiv gruppe fra en aminosyrerest fra peptid-immunogenet til en protein/polypeptidbærer som har én eller flere funksjonelle grupper, som omfatter trinnene: (a) derivatisere én eller flere av de funksjonelle gruppene fra protein/polypeptidbæreren for å frembringe en derivatisert bærer med reaktive seter; hvor bæreren er valgt fra gruppen bestående av CRM197, Streptococcus pyogenes ORF1224, Streptococcus pyogenes ORF1664, Streptococcus pyogenes ORF2452, Chlamydiapneumoniae ORF 858; (b) reagere den derivatiserte protein/polypeptidbæreren ifølge trinn (a) med en reaktiv gruppe fra en aminosyre fra peptid-immunogenet under reaksjonsbetingelser slik at peptid-immunogenet konjugeres til den derivatiserte protein/polypeptidbæreren via de funksjonelle gruppene; og (c) ytterligere reagere konjugatet med N-acetylcysteamin for å inaktivere frie, reaktive ureagerte funksjonelle grupper på den derivatiserte protein/polypeptidbæreren, for derved å bevare funksjonaliteten til bæreren, slik at den beholder sin evne til å fremkalle de ønskede immunresponsene mot peptid-immunogenet som på annen måte ikke ville forekomme uten en bærer, hvor konjugatet har formelen:

hvor,

C er protein/polypeptidbæreren, X<d>er en derivatisert funksjonell gruppe fra protein/polypeptidbæreren, P er peptid-immunogenet, R er et capping molekyl,

n er et helt tall større enn 0, men mindre enn eller lik 85, og p er et helt tall større enn 0, men mindre enn 85.

Foreliggende oppfinnelse vedører også et peptid-immunogen-protein/polypeptidbærerkonjugat, som har formelen:

hvor,

C er protein/polypeptidbæreren valgt fra gruppen bestående av CRM197, Streptococcus pyogenes ORF1224, Streptococcus pyogenes ORF 1664, Streptococcus pyogenes ORF2452, Chlamydiapneumoniae ORF 858, Xd er en derivatisert funksjonell gruppe av en aminosyrerest fra protein/polypeptidbæreren, P er et peptid-immunogenmolekyl kovalent bundet til den derivatiserte funksjonelle gruppen fra aminosyreresten fra protein/peptidbæreren, R er et capping-molekyl dannet ved reaksjon av konjugatet med N-acetylcysteamin kovalent bundet til den derivatiserte funksjonelle gruppen fra en aminosyrerest fra protein/polypeptidbæreren, hvilket derved bevarer funksjonaliteten til bæreren slik at den beholder sin evne til fremkalle de ønskede immunresponsene mot peptid-immunogenet som på annen måte ikke ville forekomme uten en bærer,

n er et helt tall større enn 0, men mindre enn eller lik 85,

og p er et helt tall større enn 0, men mindre enn 85.

Det beskrives fremgangsmåter for fremstilling av et immunogent konjugat av et peptid-immunogen med en protein/polypeptidbærer, hvor peptid-immunogenet konjugeres til bæreren via derivatiserte funksjonelle grupper av aminosyrerester fra bæreren slik som lysinrester og hvor hvilke som helst unkonjugerte, derivatiserte funksjonelle grupper fra aminosyrerestene inaktiveres ved capping for å blokkere dem fra å reagere med andre molekyler, inkludert proteiner/polypeptider for derved å bevare funksjonaliteten av bæreren, slik at det beholder sin evne til fremkalle de ønskede immunresponsene mot peptid-immunogenet som på annen måte ikke ville oppstå uten en bærer. Det beskrives også konjugater fremstilt ved fremgangsmåtene ovenfor, og immunogene blandinger inneholdende slike konjugater.

Det beskrives en første fremgangsmåte for å konjugere et peptid-immunogen via en reaktiv gruppe fra en aminosyrerest i peptid-immunogenet til et protein/polypeptidbærer som har én eller flere funksjonelle grupper, idet fremgangsmåten omfatter de følgende trinnene: (a) derivatisere én eller flere av de funksjonelle gruppene av protein/polypeptidbæreren for å danne et derivatisert molekyl med reaktive seter; (b) reagere den derivatiserte protein/polypeptidbæreren ifølge trinn (a) med en reaktiv gruppe fra en aminosyrerest av peptid-immunogenet under reaksjonsbetingelser slik at peptid-immunogenet konjugeres til den derivatiserte protein/polypeptidbæreren via de funksjonelle gruppene; og (c) i tillegg reagere konjugatet med en capping-reagens for å inaktivere frie, reaktive funksjonelle grupper på den aktiverte protein/polypeptidbæreren, for derved å bevare funksjonaliteten av bæreren mot peptid-immunogenet som på annen måte ikke ville fremkomme uten en bærer.

Protein/polypeptidbæreren beskrevet her er valgt fra gruppen bestående av humant serumalbumin, keyhole limpet hemocyanin, immunglobulinmolekyler, tyroglobulin, ovalbumin, influensa hemagglutinin, PAN-DR bindende peptid (PADRE-polypeptid), malaria circumsporozit (CS)-protein, hepatitt B overflateantigen (HBsAgi9-28), varmesjokkprotein (HSP) 65, Bacillus Calmette-Guerin (BCG), koleratoksin, koleratoksinmutanter med redusert toksisitet, difteritoksin, CRM197protein som er kryssreaktivt med difteritoksin, rekombinant streptokokk C5a peptidase, Streptococcus pyogenes ORF1224, Streptococcus pyogenes ORF1664, Streptococcus pyogenes ORF 2452, Chlamydiapneumoniae ORF T367, Chlamydiapneumoniae ORF T858, Tetanus toksoid, HIV gpl20 Tl, mikrobielle overflatekomponenter som gjenkjenner adhesiv matriks-molekyler (MSCRAMMS), vekstfaktor / hormon, cytokiner og kjemokiner.

Protein/polypeptidbæreren ifølge oppfinnelsen kan inneholde en T-celle-epitop.

Protein/polypeptidbæreren som er beskrevet her kan være et bakterielt toksoid slik som et tetanus toksoid, koleratoksin eller koleratoksinmutant som beskrevet ovenfor.

I en foretrukket utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse er protein/polypeptidbæreren CRM197.

Protein/polypeptidbæreren som er beskrevet her kan være et influensa hemagglutinin, et PADRE-polypeptid, et malaria CS-protein, et Hepatitt B-overflateantigen (HSBAgi9-28), et varmesjokkprotein 65 (HSP 65) eller et polypeptid fra Mycobacterium tuberculosis (BCG).

Det er beskrevet at protein/polypeptidbæreren er valgt fra Streptokokk rC5a peptidase, Streptococcus pyogenes ORF1224, Streptococcus pyogenes ORF 1664 eller Streptococcus pyogenes ORF2452, Chlamydia pneumoniae ORF T367 og Chlamydia pneumoniae ORF T858.

I en del av beskrivelsen er protein/polypeptidbæreren en vekstfaktor eller et hormon, som stimulerer eller forbedrer immunrespons og er valgt fra gruppen bestående av IL-1, IL-2, y-interferon, IL-10, GM-CSF, MIP-la, MIP-lp og RANTES.

Peptid-immunogenet kan velges fra et bakterielt protein, et virusprotein og et eukaryot protein.

Peptid-immunogenet kan avledes fra et bakterielt proteinantigen fra Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Staphlylococcus epidermidis, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrheae, Haemophilus influenzae, Esherichia coli, Klebsiella enterobacter, Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Pseudomonasarter, Salmonella typhimurium, Borrelia burgdorferi, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella dysentriae, Alloiococcus otitidis og streptokokk gruppe B.

Alternativt kan peptid-immunogenet avledes fra et proteinantigen fra et virus valgt fra gruppen bestående av human immunsvikt-virus (HIV), herpes simplex virus (HSV), humant papillomavirus (HPV), parainfluenzavirus (PIV), vesikulær stomatitt-virus (VSV), respiratorisk syncytialvirus (RSV), Epstein-Barr virus (EBV), coronavirus, vaccinia virus, rotavirus, rabiesvirus, hepatitt C-virus (HCV) og hepatitt B-virus (HBV).

Peptid-immunogenet kan også avledes fra et proteinantigen fra en sopp valgt fra en Candida art, en Kryptokokk art, en Coccidioides art, en Histoplasma art og en Aspergillus art.

Peptid-immunogenet kan også avledes fra et proteinantigen fra en parasitt valgt fra et plasmodium, en trypanosom, en schistosom og en leishmania.

Alternativt kan peptid-immunogenet avledes fra et proteinantigen fra en eukaryot. Eukaryoten er foretrukket et menneske.

Peptid-immunogenet fra mennesket kan foretrukket avledes fra en malign tumor. Mere foretrukket er peptid-immunogenet fra et tumorantigen fra et nyrecellekarsinom, et brystkarsinom, et melanom og et prostatakarsinom. Alternativt kan peptid-antigenet avledes fra tumorantigenet, carcinoembryonic antigen (CEA).

Det beskrives et peptid-immunogen omfattende AP-peptid eller fragmenter av Ap eller analoger derav som fremkaller en immunogen respons mot visse epitoper innen Ap. Immunogene peptider for anvendelse i overensstemmelse med oppfinnelsen omfatter immunogene heterologe peptider. I noen immunogene peptider blir et AP-fragment bundet til en bærer for å danne et immunogent heterologt peptid og deretter blir dette heterologe peptidet bundet til en bærer ved anvendelse av en fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse for å danne et konjugat.

Peptid-immunogenet kan være et polypeptid omfattende et N-terminalt segment av i det minste restene 1-5 av Ap, hvor den første resten av Ap er den N-terminale resten av polypeptidet, hvor polypeptidet er fri for et C-terminalt segment av Ap. Alternativt kan peptid-immunogenet være et polypeptid omfattende et N-terminalt segment av Ap, hvor segmentet starter ved restene 1-3 fra Ap og ender ved restene 7-11 fra Ap. Peptid-immunogenet kan også være et middel som fremkaller en immunogen respons mot et N-terminalt segment av Ap, hvor segmentet starter ved restene 1-3 av Ap og ender ved restene 7-11 av Ap uten å fremkalle en immunogen respons mot en epitop innenfor restene 12-43 av AP43. Det er også beskrevet at peptid-immunogenet kan være et heterologt polypeptid omfattende et segment av Ap bundet til en heterolog aminosyresekvens som fremkaller en hjelper T-celle-respons mot den heterologe aminosyresekvensen og derved en B-celle-respons mot det N-terminale segmentet.

I noen peptid-immunogener er det N-terminale segmentet fra Ap bundet ved dets C-terminale ende til et heterologt polypeptid. I noen peptid-immunogener er det N-terminale segmentet fra Ap bundet ved dets N-terminale ende til et heterologt polypeptid. I noen peptid-immunogener, er det N-terminale segmentet fra Ap bundet ved dets N og C - terminale ende til første og andre heterologe polypeptider. I noen peptid-immunogener er det N-terminale segmentet fra Ap bundet ved dets N-terminale ende til et heterologt polypeptid og vd dets C-terminale ende til minst én ytterligere kopi av det N-terminale segmentet. I noen peptid-immunogener omfatter polypeptidet fra N-terminalen til C-terminalen, det N-terminale segmentet av Ap, en rekke ytterligere kopier av det N-terminale segmentet og det heterologe aminosyresegmentet.

I noen av de ovennevnte peptid-immunogenene omfatter polypeptidet videre minst én ytterligere kopi av det N-terminale segmentet. I noen av de ovennevnte peptid-immunogenene er fragmentet fri for minst de 5 C-terminale aminosyrene i AP43.

I noen aspekter av de ovennevnte peptid-immunogenene omfatter fragmentet opptil 10 påfølgende aminosyrer fra Ap.

I et annet aspekt omfatter kan peptid-immunogenetomfattende AP-peptid eller fragmenter av Ap eller analoger derav som fremkaller en immunogen respons mot visse epitoper innen Ap, være i en konfigurasjon referert til som en multippel antigent peptid (MAP)-konfigurasj on.

I noen av de ovennevnte aspektene er peptid-immunogenet fra den N-terminale halvparten av Ap. I noen aspekter er peptid-immunogenet et AP fragment valgt fra gruppen bestående av Api-3,1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-10,1-11, 1-12, 1-16, 3-6 og 3-7.1 noen av de ovennevnte aspektene er peptid-immunogenet fra den indre regionen av Ap. I noen aspekter er peptid-immunogenet et Ap-fragment valgt fra gruppen bestående av Api3-28,

15-24, 17-28 og 25-35.1 noen av de ovennevnte aspektene er peptid-immunogenet fra den C-terminale enden av Ap. I noen aspekter er peptid-immunogenet et AP-fragment valgt fra gruppen bestående av AP33-42, 35-40 og 35-42.1 noen aspekter er peptid-immunogenet et Ap-fragment valgt fra gruppen bestående av Api-3, 1-4, 1-5,1-6, 1-7, 1-10, 1-11, 1-12,1-16, 1-28, 3-6, 3-7,13-28, 15-24, 17-28, 25-35, 33-42, 35-40 og 35-42.1 noen aspekter er peptid-immunogenet et Ap-fragment valgt fra gruppen bestående av Api-5, Api-7, Api-9 og Api-12. I noen aspekter er peptid-immunogenet et Ap-fragment valgt fra gruppen bestående av Api-5-L, Api-7-L, Api-9-L og Api-12-L, hvor L er en linker. I noen aspekter er peptid-immunogenet et AP-fragment valgt fra gruppen bestående av Api-5-L-C, Api-7-L-C, Api-9-L-C og Api-12-L-C, hvor C er en cystein-aminosyrerest.

I noen aspekter er peptid-immunogenet et AP-fragment valgt fra gruppen bestående av Api6-22, Api6-23, Api7-23, Api7-24, Api 8-24 og Api8-25.1 noen aspekter ifølge oppfinnelsen er peptid-immunogenet et AP-fragment valgt fra gruppen bestående av Al6-22-C, Al6-23-C, Al7-23-C, Al7-24-C, Al8-24-C og Apl8-25-C, hvor C er en cystein-aminosyrerest. I andre aspekter er peptid-immunogenet et Ap-fragment valgt fra gruppen bestående av C-Apl6-22, C-Apl6-23, C-Apl7-23, C-Apl7-24, C-Api 8-24 og C-Api 8-25, hvor C er en cystein aminosyrerest.

I noen av de ovennevnte peptid-immunogenene er det heterologe polypeptidet valgt fra gruppen bestående av peptidene som har en T-celle-epitop, en B-celle-epitop og kombinasjoner derav.

I den foreliggende oppfinnelse blir den funksjonelle gruppen fra én eller flere aminosyremolekyler av protein/polypeptidbæreren eller av den eventuelt tilknyttede polypeptidlinkeren derivatisert ved anvendelse av en kryssbindingsreagens. I en utførelsesform er derivatiseringsreagensen en null-lengde ("zero-length") kryssbindingsreagens. I en annen utførelsesform er derivatiseringsreagensen en homobifunksjonell kryssbindingsreagens. I enda en annen utførelsesform er derivatiseringsreagensen en heterobifunksjonell kryssbindingsreagens.

I en foretrukket utførelsesform er det heterobifunksjonelle reagenset et reagens som reagerer med en primær eller en s-amin funksjonell gruppe fra én eller flere aminosyremolekyler fra protein/polypeptidbæreren og en pendant tiol-gruppe fra én eller flere aminosyremolekyler av peptid-immunogenet. I én utførelsesform er det heterobifunksjonelle reagenset N-succinimidylbromacetat.

I en annen utførelsesform er den primære eller e-amin funksjonelle gruppen lysin. I enda en annen utførelsesform resulterer derivatiseringen av den primære eller s-amin funksjonelle gruppen fra lysinet fra protein/polypeptidbæreren med N-succinimidylbromacetat, i bromacetylering av de primære eller s-amin-restene i lysinmolekyler på protein/polypeptidbæreren. I en mer foretrukket utførelsesform er pendant tiol-gruppen en cysteinrest fra peptid-immunogenet, som kan være lokalisert ved den aminoterminale enden av peptid-immunogenet, ved den karboksyterminale enden av peptid-immunogenet eller internt i peptid-immunogenet.

I en annen utførelsesform dannes pendant tiol-gruppen ved et tiolating reagens slik som N-acetylhomocysteinetiolakton, Trauf s reagens (2-iminothilan) SATA (N-Succinimidyl-S-acetyltioacetat), SMPT (4-Succinimidyloksykarbonyl-metyl2-pyridylditio toluen), Sulfo LC SPDP (Sulfo Succinimidyl pyridylditiopropionamidoheksanoat), SPDP (Succinimidylpyridylditiopropionat). I en foretrukket utførelsesform er capping-reagenset som blir anvendt for å inaktivere frie reaktive, funksjonelle grupper i den aktiverte protein/polypeptidbæreren valgt fra gruppen av reagenser bestående av cysteamin, N-acetylcysteamin og etanolamin.

I en spesielt foretrukket utførelsesform er cappingsreagenset som blir anvendt for å inaktivere frie reaktive funksjonelle grupper i den aktiverte protein/polypeptidbæreren valgt fra gruppen av reagenser bestående av natriumhydroksid, natriumkarbonat, ammoniumbikarbonat og ammoniakk.

I én utførelsesform er den reaktive gruppen av aminosyreresten fra peptid-immunogenet en fri sulfhydrylgruppe.

I en annen utførelsesform er én eller flere av de funksjonelle gruppene på en linker, som eventuelt er bundet til protein/polypeptidbæreren. I en foretrukket utførelsesform, er linkeren en peptid-linker. I en mer foretrukket utførelsesform er peptidlinkeren polylysin.

Det beskrives også en annen fremgangsmåte for å konjugere et peptid-immunogen fra et protein/polypeptid med en protein/polypeptidbærer som har strukturen:

hvor,

C er en protein/polypeptidbærer og X er en derivatiserbar funksjonell gruppe fra en aminosyrerest i protein/polypeptidbæreren eller eventuelt fra en aminosyrerest av en peptid-linker kovalent bundet til protein/polypeptidbæreren og hvor m er et helt tall større enn 0, men mindre enn eller lik 85, idet metoden omfatter trinnene: (a) derivatisere én eller flere av de funksjonelle gruppene fra protein/polypeptidbæreren eller fra det eventuelt tilknyttede linker-molekylet for å danne et derivatisert molekyl med reaktive seter;

(b) reagere den derivatiserte protein/polypeptidbæreren ifølge trinn (a) med en reaktiv gruppe fra en aminosyrerest fra peptid-immunogenet for å danne et kovalent koblet peptid immunogen-protein/polypeptidbærer-konjugat; og (c) videre reagere det nevnte konjugatet med en capping-reagens for å inaktivere de frie reaktive funksjonelle gruppene på den aktiverte protein/polypeptidbæreren, slik at de cappede gruppene ikke er fri til å reagere med andre molekyler, omfattende proteiner/polypeptider hvilket derved bevarer funksjonaliteten til bæreren, slik at den beholder sin evne til å fremkalle de ønskede immunresponsene mot peptid-immunogenet som på annen måte ikke ville oppstå uten en bærer for å danne et capped peptid-immunogen-protein/polypeptidbærerkonjugat som har formelen:

hvor,

C er protein/polypeptidbæreren og X<d>er en derivatisert funksjonell gruppe av en aminosyrerest fra protein/polypeptidbæreren eller eventuelt av en aminosyrerest fra en peptid-linker kovalent bundet til protein/polypeptidbæreren og, hvor,

P er peptid-immunogenmolekylet kovalent bundet til den derivatiserte funksjonelle gruppen på aminosyreresten på proteinbæreren eller eventuelt på en aminosyrerest på en peptid-linker kovalent bundet til en protein/polypeptidbærer, R er et capping-molekyl kovalent bundet til den derivatiserte funksjonelle gruppen på en aminosyrerest på protein/polypeptidbæreren eller eventuelt på en aminosyrerest på en peptid-linker kovalent bundet til en protein/polypeptidbærer, n er et helt tall større enn 0, men mindre enn eller lik 85 og p er et helt tall større enn 0, men mindre enn 85.

De detaljerte utførelsesformene for den første fremgangsmåten beskrevet ovenfor er også anvendbar for konjugatene nettopp beskrevet fremstilt ved den andre fremgangsmåten.

Det beskrives også peptid-immunogen-protein/polypeptidbærerkonjugater hvor protein/polypeptidbæreren har formelen:

hvor,

C er en protein/polypeptidbærer og X er en derivatiserbar funksjonell gruppe fra en aminosyrerest fra protein/polypeptidbæreren eller eventuelt fra en aminosyrerest fra en peptid-linker kovalent bundet til protein/polypeptidbæreren og, hvor, m er et helt tall større enn 0, men mindre enn eller lik 85 og hvor det cappede peptid-immunogen-protein/polypeptidbærer-konjugatet har formelen:

hvor,

C er protein/polypeptidbæreren og X<d>er en derivatisert funksjonell gruppe fra en aminosyrerest fra protein/polypeptidbæreren eller eventuelt fra en aminosyrerest fra en peptid-linker kovalent bundet til protein/polypeptidbæreren og, hvor, P er peptid- immunogenmolekylet kovalent bundet til den derivatiserte funksjonelle gruppen fra aminosyreresten fra proteinbæreren eller eventuelt fra en aminosyrerest fra en peptid-linker kovalent bundet til en protein/polypeptidbærer, R er et capping-molekyl kovalent bundet til den derivatiserte funksjonelle gruppen med en aminosyrerest fra protein/polypeptidbæreren eller eventuelt fra en aminosyrerest fra en peptid-linker kovalent bundet til en protein/polypeptidbærer, for derved å bevare funksjonaliteten til bæreren, slik at den beholder sin evne til fremkalle de ønskede immunresponsene mot peptid-immunogenet som på annen måte ikke ville oppstå uten en bærer., n er et helt tall større enn 0, men mindre enn eller lik 85 og p er et helt tall større enn 0, men mindre enn 85.

De detaljerte utførelsesformene for de første og andre fremgangsmåtene beskrevet ovenfor er også anvendbare for konjugatene nettopp beskrevet.

Det beskrives også peptid-immunogen-protein/polypeptidbærer-konjugater dannet i henhold til den andre fremgangsmåten som beskrevet og som har formelen:

hvor,

C er protein/polypeptidbæreren og X<d>er en derivatisert funksjonell gruppe fra en aminosyrerest fra protein/polypeptidbæreren eller eventuelt fra en aminosyrerest fra en peptid-linker kovalent bundet til protein/polypeptidbæreren og, hvor, P er peptid-immunogenmolekylet kovalent bundet til den derivatiserte funksjonelle gruppen fra aminosyreresten fra proteinbæreren eller eventuelt fra en aminosyrerest fra en peptid-linker kovalent bundet til en protein/polypeptidbærer, R er et capping-molekyl kovalent bundet til den derivatiserte funksjonelle gruppen fra en aminosyrerest fra protein/polypeptidbæreren eller eventuelt fra en aminosyrerest fra en peptid-linker kovalent bundet til en protein/polypeptidbærer for derved å bevare funksjonaliteten av bæreren, slik at den beholder sin evne til å fremkalle de ønskede immunresponsene mot peptid-immunogenet som på annen måte ikke ville oppstå uten en bærer, n er et helt tall større enn 0, men mindre enn eller lik 85 og p er et helt tall større enn 0, men mindre enn 85.

De detaljerte utførelsesformene for den andre fremgangsmåten beskrevet ovenfor er også anvendbare for konjugatene dannet ved den andre metode, som nettopp beskrevet.

Oppfinnelsen vedrører også immunogene blandinger omfattende et konjugat av et peptid-immunogen med en protein/polypeptidbærer ifølge oppfinnelsen sammen med én eller flere farmasøytisk akseptable tilsetningsmidler, fortynningsmidler og adjuvantia.

Det er også beskrevet en fremgangsmåte for å indusere en immunrespons hos et pattedyr-subjekt, som omfatter å administrere en effektiv mengde av en immunogen blanding ifølge foreliggende oppfinnelse til subjektet.

De detaljerte utformingene som er anvendbare for den immunogene blandingen inneholdende konjugatene ifølge foreliggende oppfinnelse er også anvendbare for fremgangsmåten for anvendelse av disse immunogene blandingene.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1: Flytskjema som viser prosesskjemien anvendt for konjugering av AP-peptidfragmenter til protein/polypeptidbærer CRM197for å danne konjugatet AP/CRM197. Figur 2: Flytskjema som viser syrehydrolyse-kjemi anvendt for kvantitativ bestemmelse av S-karboksymetylcystein og S-karboksymetylcysteamin som evaluering av graden av konjugering av peptid-immunogen-protein/polypeptid-konjugater slik som konjugatet Ap/CRMi97. Figur 3: Denne figuren viser pH-avhengigheten for AP-peptid/CRM-konjugeringsreaksjonen. Figur 4: Denne figuren viser avhengigheten for AP-peptid/CRM-konjugering av peptid: CRM-ratio. Figur 5: Verifisering av capping-prosess for Api-7/CRM-konjugering. PH i reaksjonen var 9,15. Reaksjonstid med peptid var 16 timer, capping med N-acetylcysteamin var 8 timer. Figur 6: Konjugering og capping med forskjellige peptid:CRM-ratioer med peptid. PH i reaksjonen ble 9,0. Reaksjonstid med peptid var 16 timer, capping med N-acetylcysteamin var 8 timer. Figur 7: Titere ved dag 36 av primat sera etter immunisering av primater med AP-peptidkonjugater med forskjellige adjuvantia. Figur 8: Titere ved dag 64 av primat sera etter immunisering av primater med AP-peptidkonjugater med forskjellige adjuvantia. Figur 9: Titere for primater ved dag og behandlingsgruppe. Primater ble immunisert med Ap 1-7 eller Ap 1-5 CRM197-konjugater med alun eller 529 som adjuvantia og titere av anti-AP-antistoffer ble målt ved dag 29, 36, 57 og 54. Figur 10: Peptid-protein-konjugater blekarakterisert vedanvendelse av SDS-PAGE Western blot-analyse med en tris-tricin ferdigstøpt gel. Brønnene er: markør (brønn I) ; L-28375 24/01 (brønn 2); L-28375 24/02 (brønn 3); L-28375 24/03 (brønn 4); L-28375 24/04 (brønn 5); L-28375 24/05 (brønn 6); L-28375 24/06 (brønn 7) L-28375 24/07 (brønn 8); L-28375 24/08 (brønn 9); L-28375 24/09 (Mock) (brønn 10); og, BrAcCRMi97(brønn

II) .

KORT BESKRIVELSE AV SEKVENSER

Foreliggende oppfinnelse angår den patentsøkte fremgangsmåte for fremstilling av peptid-immunogen-bærerkonjugater hvor de ureagerte aktive funksjonelle gruppene på bæreren som er dannet under aktivering blir inaktivert ved anvendelse av capping-reagenser slik som iV-acetylcysteamin for å forhindre dem fra å reagere ytterligere. Foreliggende oppfinnelse angår også det patentsøkte cappede bærer-peptid-immunogenkonjugatet fremstilt ved denne fremgangsmåten og immunogene blandinger omfattende nevnte konjugat.

Metoden med å øke immunogenisitet av små eller svakt immunogene molekyler, slik som sakkarider, gjennom konjugering har vært anvendt med hell i flere tiår (se f. eks., Goebel et al. (1939) J. Exp. Med. 69: 53) og mange immunogene blandinger er beskrevet hvor rensede kapselpolymerer er konjugert til bærerproteiner for å frembringe mer effektive immunogene blandinger ved å utnytte denne "bærereffekten". For eksempel beskriver Schneerson et al. ( J. Exp. Med. 152: 361-376, 1980), Haemophilus influenzae b polysakkaridproteinkonjugater som gir immunitet mot invasive sykdommer forårsaket av denne mikroorganismen. Konjugater av PRP (polyribosylribitolfosfat, et kapselpolymer fra H. influenzae b) er vist å være mer effektive enn immunogene blandinger basert på polysakkaridet alene (Chu et al, (1983) Infect. Immun. 40: 245; Schneerson et al. (1984), Infect. Immun. 45: 582-591). Konjugering er også vist å omgå den dårlige antistoffresponsen vanligvis observert hos barn ved immunisering med et fritt polysakkarid (Anderson et al. (1985) J. Pediatr. 107: 346; Insel et al. (1986) J. Exp. Med. 158: 294).

En ytterligere fordel ved å anvende som proteinbærer et bakterielt toksin eller toksoid mot hvilke rutinemessig immunisering av mennesker (f.eks., tetanus eller difteri) er en standard praksis er at en ønsket immunitet mot toksinet eller toksoidet induseres sammen med immunitet mot patogenene forbundet med kapselpolymeren.

Antigen determinant/hapten-bærerkonjugater anvendes også for fremstilling av svært spesifikke monoklonale antistoffer som kan gjenkjenne atskilte kjemiske epitoper på det koblete haptenet. De resulterende monoklonale antistoffene anvendes ofte for å undersøke epitopen-strukturen og interaksjoner mellom native proteiner. I mange tilfeller er de antigene determinantene/haptenene anvendt for å fremstille disse monoklonale antistoffene små peptidsegmenter som representerer viktige antigene seter på overflaten av større proteiner. Kriteriene for en vellykket bærer for anvendelse for fremstilling av et antigen determinant/hapten-bærer-konjugat er potensialet for immunogenisitet, tilstedeværelsen av egnede funksjonelle grupper for konjugering med en antigen determinant/hapten, rimelige oppløselighetsegenskaper selv etter derivatisering og mangel på toksisitet in vivo.

Disse kriteriene imøtekommes av konjugatene fremstilt ved fremgangsmåtene ifølge foreliggende beskrivelse. Konjugatene kan være hvilke som helst stabile peptid-immunogen-bærerkonjugater dannet ved anvendelse av konjugeringsprosessen beskrevet her. Konjugatene fremstilles ved anvendelse av en fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse hvor en protein/polypeptidbærer som har følgende struktur:

blir kovalent bundet til en protein/polypeptidbærer,

hvor,

C er en protein/polypeptidbærer og X er en derivatiserbar funksjonell gruppe på

en aminosyrerest på protein/polypeptidbæreren eller eventuelt på en aminosyrerest på en peptid-linker kovalent bundet til protein/polypeptidbæreren og hvor m er et helt tall større enn 0, men mindre enn eller lik 85, blir kovalent bundet til et peptid-immunogen og hvor peptid-immunogen-protein/polypeptidbærerkonjugatet har den følgende formelen, er representert ved den følgende formelen:

hvor,

C er protein/polypeptidbæreren og X<d>er en derivatisert funksjonell gruppe på en aminosyrerest på protein/polypeptidbæreren eller eventuelt på en aminosyrerest på en peptid-linker kovalent bundet til protein/polypeptidbæreren, P er et peptidimmunogen kovalent bundet til den derivatiserte funksjonelle gruppen på aminosyreresten på protein/polypeptidbæreren eller eventuelt på en aminosyrerest på en peptid-linker kovalent bundet til en protein/polypeptidbærer, R er et capping-molekyl kovalent bundet til den derivatiserte funksjonelle gruppen på en aminosyrerest på protein/polypeptidbæreren eller eventuelt på en aminosyrerest på en peptid-linker kovalent bundet til en protein/polypeptidbærer for derved å bevare funksjonaliteten av bæreren, slik at den beholder sin evne til å fremkalle de ønskede immunresponsene mot peptid-immunogenet som ellers ikke inntreffer uten en bærer., n er et helt tall større enn 0, men mindre enn eller lik 85 og p er et helt tall større enn 0, men mindre enn 85.

Valg av bærere

Noen peptid-immunogener inneholder den egnede epitopen for å indusere en immunrespons, men er for liten til å være immunogen. I denne situasjonen blir peptid-immunogenene bundet til en egnet bærer for å bidra til å fremkalle en immunrespons. I den ovennevnte skjematiske presentasjonen er peptid-immunogener-bærerkonjugatet dannet ved en fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse er C en protein/polypeptidbærer til hvilken peptid-immunogener konjugeres direkte via derivatiserte funksjonelle grupper på aminosyrerester på bæreren i seg selv eller indirekte via derivatiserte funksjonelle grupper på peptid-linkere kovalent bundet til bærerene. Egnede protein/polypeptidbærere omfatter, men er ikke begrenset til, albumin (omfattende humant serumalbumin), keyhole limpet hemocyanin, immunglobulinmolekyler, tyroglobulin, ovalbumin, tetanus toksoid eller et toksoid fra andre patogene bakterier som har redusert toksisitet, omfattende mutanter, slik som difteri, E. coli, kolera eller H. pylori, eller et svekket toksinderivat. En slik bærer er CRM197-proteinet (SEKV ID NR.:40) som er kryssreaktivt med difteritoksin.

Andre bærere omfatter T-celle-epitoper som binder til multiple MHC-alleler, f.eks, minst 75% av alle humane MHC-alleler. Slike bærere er noen ganger kjent på området som "universelle T-celle-epitoper." Eksempler på bærere med universelle T-celle-epitoper omfatter:

Andre bærere for å stimulere eller forbedre en immunrespons og til hvilke et peptid-immunogen eller et hapten kan konjugeres omfatter cytokiner slik som IL-1, IL-la og P-peptider, IL-2, ylNF, IL-10, GM-CSF og kjemokiner, slik som MIP la og P og RANTES. Immunogene peptider kan bindes til proteiner/peptidbærere som forbedrer transport gjennom vev, som beskrevet i 0'Mahony, WO 97/17163 og WO 97/17614.

Enda ytterligere bærere omfatter rekombinant streptokokk C5a peptidase, Streptococcus pyogenes ORFs 1224, 1664 og 2452, Chlamydia pneumoniae ORFs T367 og T858, vekstfaktorer og hormoner.

I én foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er bærerproteinet CRM197, en ikke-toksisk mutant av difteritoksin med én aminosyreendring i dets primære sekvens. Glysinet til stede ved aminosyreposisjon 52 i molekylet blir erstattet med en glutaminsyre beroende på en enkelt kodon-endring i nukleinsyren. På grunn av denne endringen mangler proteinet ADP-ribosyl transferaseaktivitet og blir ikke-toksisk. Det har en molekylvekt på 58,408

Da. CRM197blir produsert i store mengder ved rekombinant ekspresjon i henhold til U.S.

Patent 5,614,382. Konjugasjoner av sakkarider så vel som peptider til CRM197blir utført ved kobling gjennom e-aminogruppene av lysinrester. Det har blitt alminnelig anerkjent gjennom mange kommersielle produkter at CRM197er en utmerket og sikker bærer for B-celle-epitoper.

Immunogene peptider

Som anvendt heri er betegnelsen " peptid- immunogen" eller " hapten" hvilket som helst protein eller subenhet-struktur/fragment/analog avledet derfra som kan fremkalle, lette eller induseres for å frembringe en immunrespons ved administrering til et pattedyr. Spesielt anvendes betegnelsen for å referere til en polypeptid-antigen determinant fra hvilken som helst kilde (bakterier, virus eller eukaryote), som kan kobles til en bærer ved anvendelse av en fremgangsmåte beskrevet her. Slike polypeptid immunogen/antigene determinanter kan være av viral, bakteriell eller eukaryot celle-opprinnelse.

Peptid-immunogener fra en bakteriecelle omfatter de avledet fra bakteriecelleoverflate eller utskilte proteiner, som kan anvendes i proteinbaserte immunogene blandinger. Eksempler på bakteriestammer omfatter Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Klebsiella spp., Pseudomonas spp., Salmonella spp., Shigella spp., Alloiococcus otiditis og streptokokk gruppe B.

Eksempler på peptid-immunogener fra virus omfatter de avledet fra humant immunsvikt-virus (HIV), herpes simplex virus (HSV), humant papillomavirus (HPV), parainfluenzavirus (PIV), vesikulær stomatittvirus (VSV), respiratorisk syncytialvirus (RSV), Epstein-Barr virus (EBV), coronavirus, vaccinia virus, rotavirus, rabiesvirus, hepatitt C-virus (HCV) og hepatitt B-virus (HBV) for å nevne noen få.

Eksempler på fungale peptidimmunogener omfatter de avledet fra Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Coccidoider spp., Histoplasma spp. og Aspergillus spp. Parasitt antigener omfatter de avledet fra Plasmodium spp., Trypanosoma spp., Schistosoma spp., Leishmaniasis spp. og lignende.

Eksempler på eukaryote peptidimmunogener som kan konjugeres til en bærer for anvendelse som et immunoterapeutisk middel for forebygging, behandling, profylakse eller forbedring av forskjellige humane sykdommer omfatter de forbundet med tumorceller, de avledet fra Ap, et peptid på 39-43 aminosyrer, fortrinnsvis 42 aminosyrer, som er den viktigste komponenten av karakteristiske plaques ved Alzheimers sykdom (AD) ( se US 4,666,829; Glenner & Wong (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun. 120: 1131, Hardy

(1984) T1NS 20: 1131; Hardy (1977) TINS 20: 154), de avledet fra amyloide peptider fra amylin, et polypeptidmateriale produsert av pankreatisk øy-celler som er implisert i type II diabetes, peptider avledet fra low density lipoprotein-genprodukter, som er implisert i aterosklerose og antigene peptider avledet fra inflammatoriske cytokiner og vekstfaktorer slik som interleukin 6 (IL-6), tumornekrosefaktor a (TNF-a) og GDF-8. Slike eukaryote peptidimmunogener kan omfatte enten T-celle (CTL) eller B-celle-epitop.

En " CTL- epitop" er én avledet fra valgte epitopregioner av potensielle mål-antigener, slik som tumorassosierte antigener, omfattende, men ikke begrenset til, nyrecellekarsinom, brystkreft, carcinoembryonic antigener, melanom (MAGE)-antigener og prostatakreftspesifikk antigener slik som prostataspesifikk membranantigen (PSMA) og prostata stamcelle-antigen (PSCA), hepatitt C-antigener,

Ap også kjent som P-amyloid peptid eller A4-peptid ( se US 4,666,829; Glenner & Wong, Biochem. Biophys. Res. Commun., 120, 1131 (1984)), er et peptid på 39-43 aminosyrer, som er den viktigste komponenten i karakteristisk plaques ved Alzheimers sykdom. Ap dannes ved prosessering av et større protein APP ved to enzymer, betegnet P og y sekretaser ( se Hardy, TINS 20, 154 (1997)). Kjente mutasjoner i APP forbundet med Alzheimers sykdom inntreffer nært setet for P eller y sekretase eller inne i Ap. For eksempel er posisjon 717 nært setet for y-sekretase-spaltning av APP ved dens prosessering til Ap og posisjonene 670/671 er nært setet for P-sekretase-kløyving. Det er antatt at mutasjonene forårsaker AD ved å interagere med kløyvingsreaksjonene ved hvilke Ap dannes for slik å øke mengden av 42/43-aminosyreformen av Ap dannet.

Ap har den sjeldne egenskapen at den kan fiksere og aktivere både klassiske og alternative komplementkaskader. Spesielt binder det til Clq og til slutt til C3bi. Denne assosieringen letter binding til makrofager hvilket fører til aktivering av B-celler. I tillegg brytes C3bi ytterligere ned og bindes deretter til CR2 på B-celler på en T-celleavhengig måte hvilket fører til en 10,000 ganger økning i aktivering av disse cellene. Denne mekanismen fører til at Ap fremkaller en immunrespons utover den fra andre antigener.

Ap har mange naturlig forekommende former. De humane formene av Ap blir referert til som Ap39, Ap40, Ap41, Ap42 og Ap43. Sekvensene av disse peptidene og deres slektskap til APP-forløperen er illustrert ved Figur 1 ifølge Hardy et al., TINS 20, 155-158 (1997). For eksempel har Ap42 sekvensen: H2N-Asp-ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-ala-Ile-Ile-Gly-Leu-met-Val-Gly-Gly-Val-Val-

Ee-ala-OH (SEKV ID NR. 21).

Ap41, Ap40 og Ap39 skiller seg fra Ap42 ved utelatelse av Ala, Ala-Ile og Ala-Ile-Val henholdsvis fra den C-terminale enden. AP43 skiller seg fra AP42 ved tilstedeværelsen av en treoninrest ved den C-terminale enden.

Peptid-immunogener som er fragmenter av Ap er fordelaktige i forhold til det intakte molekylet for anvendelse i foreliggende fremgangsmåter av mange grunner. For det første, fordi bare visse epitoper innen Ap induserer en anvendelig immunogen respons for behandling av Alzheimers sykdom, gir en lik dose med hensyn til masse av et fragment inneholdende slike epitoper en høyere molar konsentrasjon av de anvendelige immunogene epitopene enn en dose av intakt Ap. For det andre frembringer visse peptid-immunogener av Ap en immunogen respons mot amyloide avleiringer uten å frembringe en betydelig immunogen respons mot APP-protein fra hvilke Ap er avledet fra. For det tredje er peptid immunogener av Ap enklere å fremstille enn intakt Ap på grunn av deres mindre størrelse. For det fjerde aggregerer ikke peptid-immunogener av Ap på samme måte som intakt Ap, hvilket forenkler fremstilling av konjugater med bærere.

Noen peptid-immunogener av Ap har en sekvens på minst 2, 3, 5, 6, 10 eller 20 påfølgende aminosyrer fra et naturlig peptid. Noen peptid-immunogener har ikke mer enn 10, 9, 8, 7, 5 eller 3 påfølgende rester fra Ap. I en foretrukket utførelsesform anvendes peptid-immunogener fra den N-terminale halvdelen av Ap for fremstilling av konjugater. Foretrukne peptid-immunogener omfatter Ap 1-5, 1-6, 1-7, 1-10, 1-11, 3-7, 1-3 og 1-4. Betegnelsen Api-5, for eksempel, angir et N-terminalt fragment omfattende restene 1-5 av Ap. AP-fragmenter som starter ved N-terminalen og ender ved en rest innenfor restene 7-11 av Ap er spesielt foretrukket. Fragmentet Ap 1-12 kan også anvendes men er mindre foretrukket. I noen fremgangsmåter er fragmentet et N-terminalt fragment forskjellig fra Apl-10. Andre foretrukne fragmenter omfatter Apl3-28, 15-24, 1-28, 25-35, 35-40, 35-42 og andre indre fragmenter og C-terminale fragmenter.

Noen AP-peptider for anvendelse i oppfinnelsen er immunogene peptider som ved administrering til en human pasient eller dyr frembringer antistoffer som spesifikt binder til én eller flere epitoper mellom restene 16 og 25 av Ap. Foretrukne fragmenter omfatter Ap 16-22, 16-23,17-23,17-24,18-24 og 18-25. Antistoffer som spesifikt binder til epitoper mellom restene 16 og 25 binder spesifikt til løselig Ap uten å binde til plaques av Ap. Disse typer av antistoffer kan spesifikt binde til oppløselig AP i sirkulasjonen til en pasient eller dyremodell uten å spesifikt binde til plaques av AP-avleiringer i hjernen til pasienten eller modellen. Den spesifikke bindingen av antistoffer til oppløselig AP hemmer AP fra å bli inkorporert i plaques hemmer og følgelig enten utvikling av plaque hos en pasient eller hemmer en ytterligere økning i størrelsen eller hyppigheten av plaque hvis slike plaque allerede er utviklet før behandling blir administrert.

Fragmentet av Ap mangler foretrukket en epitop som ville frembringe en T-celle-respons til fragmentet. Generelt er T-celle-epitoper større enn 10 påfølgende aminosyrer. Derfor er foretrukne fragmenter av Ap av størrelse 5-10 eller fortrinnsvis 7-10 påfølgende aminosyrer eller mest foretrukket 7 påfølgende aminosyrer; dvs., tilstrekkelig lengde til å frembringe en antistoffrespons uten å frembringe en T-celle-respons. Fravær av T-celle-epitoper er foretrukket fordi disse epitopene ikke er nødvendige for immunogen aktivitet av fragmenter og kan forårsake en uønsket inflammatorisk respons i en undergruppe av pasienter (Anderson et al., (2002) J. Immunol. 168, 3697-3701; Senior (2002) Lancet Neurol. 1,3).

Fragment A015-25 og subfragmenter på 7-8 påfølgende aminosyrer derav er foretrukket fordi disse peptidene konsekvent utvikler en høy immunogen respons til AØ-peptid. Disse fragmentene omfatter Apl6-22, Apl6-23, Apl6-24, Apl7-23, Apl7-24, Ap 18-24 og Api 8-25. Spesielt foretrukne Api5-25 subfragmenter er 7 påfølgende aminosyrer i lengde. Betegnelsen Ap 15-21, for eksempel, angir et fragment omfattende restene 15-21 av Ap og som mangler andre rester av Ap og fortrinnsvis 7-10 påfølgende aminosyrer. Disse fragmentene kan utvikle en antistoffrespons som omfatter ende-spesifikke antistoffer.

Peptid-immunogener av Ap'er krever screening for aktivitet med hensyn til klaring eller forebygging av amyloide avleiringer ( se WO 00/72880). Administrering av N-terminale fragmenter av Ap induserer produksjon av antistoffer som gjenkjenner AP-avleiringer in vivo og in vitro. Fragmenter som mangler minst én og noen ganger minst 5 eller 10 C-terminale aminosyrer til stede i naturlig forekommende former av Ap anvendes i noen fremgangsmåter. For eksempel, et fragment som mangler 5 aminosyrer fra den C-terminale ende av AP43 omfatter de første 38 aminosyrer fra den N-terminale enden av

AP.

Dersom ikke annet er angitt omfatter referanse til Ap de naturlige humane aminosyresekvensene angitt ovenfor så vel som analoger omfattende alleliske, spesier og induserte varianter. Analoger skiller seg typisk fra naturlig forekommende peptider ved én, to eller noen få posisjoner, ofte i kraft av konservative substitusjoner. Analoger oppviser typisk minst 80 eller 90% sekvensidentitet med naturlige peptider. Noen analoger omfatter også unaturlige aminosyrer eller modifikasjoner av N- eller C-terminale aminosyrer ved én, to eller noen få posisjoner. For eksempel kan den naturlige asparaginsyreresten i posisjon 1 og/eller 7 av Ap erstattes med iso-asparaginsyre.

Eksempler på unaturlige aminosyrer er D, alfa, alfa-disubstituerte aminosyrer, N-alkylaminosyrer, melkesyre, 4-hydroksyprolin, gamma-karboksyglutamat, epsilon-N,N,N-trimetyllysin, epsilon-N-acetyllysin, O-fosfoserin, N-acetylserin, N-formylmetionin, 3-metylhistidin, 5-hydroksylysin, omega-N-metylarginin, P-alanin, ornithin, norleucin, norvalin, hydroxprolin, tyroksin, gamma-aminosmørsyre, homoserin, citrullin og isoasparaginsyre. Immunogene peptider omfatter også analoger av Ap og fragmenter derav. Noen terapeutiske midler ifølge oppfinnelsen er alle-D peptider, f.eks., all-D Ap, all-D Ap fragment eller analoger av all-D Ap eller alle-D Ap fragment. Fragmenter og analoger kan screenes for profylaktisk eller terapeutisk aktivitet i transgene dyremodeller sammenlignet med ubehandlede eller placebo-kontroller som beskrevet i WO 00/72880.

Peptid-immunogener omfatter også lengre polypeptider som omfatter for eksempel en immunogen av Ap-peptid, sammen med andre aminosyrer. For eksempel omfatter foretrukne immunogene peptider fusjonsproteiner omfattende et segment av Ap bundet til en heterolog aminosyresekvens som induserer en hjelper T-celle-respons mot den heterologe aminosyresekvensen og derved en B-celle-respons mot Ap-segmentet. Slike polypeptider kan screenes for profylaktisk eller terapeutisk effektivitet i dyremodeller sammenlignet ubehandlede eller placebo-kontroller som beskrevet i WO 00/72880.

Ap-peptidet, analog, immunogent fragment eller annet polypeptid kan administreres i disaggregert eller aggregert form. Disaggregert Ap eller fragmenter derav betyr monomere peptidenheter. Disaggregert Ap eller fragmenter derav er generelt oppløselige og kan selv aggregere for å danne oppløselige oligomerer, protofibriller og ADDL'er. Oligomerer av Ap og fragmenter derav er vanligvis oppløselige og eksisterer overveiende som alfa-helikser eller "random coils". Aggregert Ap eller fragmenter derav betyr oligomerer av AP eller fragmenter derav som er assosiert inn i uoppløselige samlinger av "beta-sheet". Aggregert Ap eller fragmenter derav betyr også fibrillære polymerer. Fibriller er vanligvis uoppløselige. Noen antistoffer binder enten oppløselig AP eller fragmenter derav eller aggregert Ap eller fragmenter derav. Noen antistoffer binder både oppløselig Ap eller fragmenter derav og aggregert Ap eller fragmenter derav.

Immunogene peptider omfatter også multimerer av monomere immunogene peptider. Immunogene peptider forskjellige fra AP-peptider skulle indusere en immunogen respons mot ett eller flere av de foretrukne fragmentene av Ap listet opp ovenfor (f.eks. Apl-3, 1-7, 1-10 og 3-7).

Immunogene peptider for anvendelse i den foreliggende oppfinnelse bindes til en bærer ved anvendelse av en fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse for å danne et konjugat. Det immunogene peptidet kan bindes ved dets aminoterminale ende, dets karboksylterminale ende, eller begge til en bærer for å danne et konjugat. Eventuelt kan multiple repetisjoner av det immunogene peptidet være til stede i konjugatet.

Et N-terminalt fragment av Ap kan bindes ved dets C-terminale ende til et bærerpeptid for å danne et konjugat. I slike konjugater utgjør den N-terminale resten av fragmentet av Ap den N-terminale resten av konjugatet. Følgelig er slike konjugater effektive med hensyn til å indusere antistoffer som binder til en epitop som fordrer den N-terminale resten av Ap i fri form. Noen immunogene peptider ifølge oppfinnelsen omfatter en rekke repetisjoner av et N-terminalt segment av Ap bundet ved den C-terminale enden til én eller flere kopier av et bærerpeptid for å danne et konjugat. Det N-terminale fragmentet av Ap inkorporert i slike konjugater starter noen ganger ved Ap 1-3 og ender ved AP7-11. Api-7, 1-3, 1-4, 1-5 og 3-7 er foretrukket N-terminalt fragment av Ap. Noen konjugater omfatter forskjellige N-terminale segmenter av Ap i tandem. For eksempel kan et konjugat omfatte Ap 1-7 fulgt av Ap 1-3 bundet til en bærer.

I noen konjugater er et N-terminalt segment av Ap bundet ved dets N-terminale ende til et bærerpeptid. Det samme mangfold av N-terminale segmenter av Ap kan anvendes som ved C-terminal binding. Noen konjugater omfatter et bærerpeptid bundet til den N-terminale enden av et N-terminalt segment av Ap, som igjen er bundet til én eller flere ytterligere N-terminale segmenter av Ap i tandem. Fortrinnsvis induserer slike immunogene AP-fragmenter, når de først er konjugert til en passende bærer, en immunogen respons som er spesifikt rettet mot Ap-fragmentet uten å være rettet mot andre fragmenter av Ap.

Immunogene peptider for anvendelse i oppfinnelsen omfatter immunogene heterologe peptider. I noen immunogene peptider er et AP-fragment bundet til en bærer for å danne et immunogent heterologt peptid. Dette heterologe peptidet er bundet til en bærer ved anvendelse av en fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse for å danne et konjugat. Noen av disse immunogene heterologe peptidene omfatter fragmenter av Ap bundet til tetanus toksoid-epitoper slik som beskrevet i US 5,196,512, EP 378,881 og EP 427,347. Eventuelt kan et immunogent peptid være bundet til én eller multiple kopier av en bærer, for eksempel ved både N og C terminalene av bæreren for å danne et immunogent heterologt peptid. Andre av disse immunogene heterologe peptidene omfatter fragmenter av Ap bundet til bærerpeptider beskrevet i US 5,736,142. For eksempel kan et immunogent heterologt peptid omfatte Ap 1-7 fulgt av Ap 1-3 fulgt av en bærer. Eksempler på slike immunogene heterologe peptider omfatter:

Noen immunogene heterologe peptider omfatter en multimer av immunogene peptider representert ved formelen 2X, hvor x er et helt tall fra 1-5. Fortrinnsvis er x 1, 2 eller 3, hvor 2 er mest foretrukket. Når x er to har en slik multimer fire immunogene peptider bundet i en foretrukket konfigurasjon referert til som MAP4 ( se US 5,229,490). Slike immunogene peptider blir deretter bundet til en bærer ved anvendelse av en fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse for å danne et konjugat.

MAP4-konfigurasjonen er vist nedenfor, hvor forgrenede strukturer er fremstilt ved å initiere peptidsyntese ved både N-terminalen og sidekjede-aminer av lysin. Avhengig av antall ganger lysin blir inkorporert i sekvensen og tillat å forgrene seg, vil den resulterende strukturen fremby multiple N-termini. I dette eksemplet fremstilles fire identiske N-termini på den forgrenede lysin-inneholdende kjernen. Slik multiplisitet øker sterkt mottageligheten av beslektede B-celler.

Eksempler på slike immunogene heterologe peptider omfatter: AP 1-7/Tetanus toksoid 830-844 i en MAP4 konfigurasjon:

DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL (SEKV ID NR.:22)

Ap 1-7/Tetanus toksoid 947-967 i en MAP4 konfigurasjon:

DAEFRHD-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEKV ID NR.:23)

Ap 3-9/Tetanus toksoid 830-844 i en MAP4 konfigurasjon:

EFRHDSG-QYIKANSKFIGITEL (SEKV ID NR.:25)

DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL i en 2 forgrenet resin

Ap-peptidet, analog, aktivt fragment eller annet polypeptid kan administreres i assosiert eller multimer form eller i dissosiert form. Terapeutiske midler omfatter også multimerer av monomere immunogene midler. Midler forskjellig fra AP-peptider skulle indusere en immunogen respons mot ett eller flere av de foretrukne fragmentene av Ap listet opp ovenfor (f.eks. 1-10,1-7, 1-3 og 3-7) og kan også konjugeres til en bærer ved anvendelse av en fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse. Fortrinnsvis induserer slike midler, når de først er konjugert til en passende bærer, en immunogen respons som er spesifikt rettet mot én av disse fragmentene uten å være rettet mot andre fragmenter av Ap. For å lette konjugering av et peptid-immunogen med en bærer kan ytterligere aminosyrer tilføyes til endene av antigene determinanter. De ytterligere restene kan også anvendes for modifikasjon av de fysiske eller kjemiske egenskapene av peptid-immunogenet. Aminosyrer slik som tyrosin, cystein, lysin, glutaminsyre eller asparaginsyre eller lignende, kan innføres ved den C- eller N-terminale enden av peptid-immunogenet. I tillegg kan peptid-linkere inneholdende aminosyrer slik som glysin og alanin også innføres. I tillegg kan de antigene determinantene skille seg fra den naturlige sekvensen ved at de er modifisert ved acylering av terminal NFb-gruppe, f. eks. ved alkanoyl (C1-C20) eller tioglykolyl acetylering, terminal-karboksyamidering, f.eks. ammoniakk, metylamin, osv. I noen tilfeller kan disse modifikasjonene tilveiebringe seter for kobling til en bærer eller annet molekyl.

Peptid-immunogener anvendt for å danne konjugater ifølge foreliggende oppfinnelse ved anvendelse av en fremgangsmåte beskrevet her kan kombineres via binding til å danne polymerer (multimerer) eller kan formuleres i en sammensetning uten binding, som en blanding. Når et peptid er bundet til et identisk peptid, for derved å danne en homopolymer, fremvise en rekke repeterende epitop-enheter. For eksempel anvendes multippel antigent peptid (MAP)-teknologi for å konstruere polymerer inneholdende både CTL og/eller antistoffpeptider og peptider. Når peptidene er forskjellige, f.eks., en blanding som representerer forskjellige virale subtyper, forskjellig epitoper innenfor en subtype, forskjellig HLA restriksjon spesifisiteter eller peptider som inneholder T-hjelper-epitoper, tilveiebringes heteropolymerer med repeterende enheter. I tillegg til kovalente bindinger omfattes også ikke-kovalente bindinger som er i stand til å danne intermolekylære og ultrastrukturelle bindinger.

Slike peptid-immunogener og deres analoger blir syntetisert ved fastfase peptidsyntese eller rekombinant ekspresjon eller blir oppnådd fra naturlige kilder. Automatiske peptidsyntesemaskiner er kommersielt tilgjengelige fra en rekke leverandører, slik som Applied Biosystems, Foster City, California.

Rekombinant ekspresjon kan finne sted i bakterier (slik som E. coli), gjær, insektceller eller pattedyrceller. Fremgangsmåter for rekombinant ekspresjon er beskrevet av Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, NY, 2nd ed., 1989). Noen immunogene peptider er også kommersielt tilgjengelige (f.eks., American Peptides Company, Inc., Sunnyvale, CA og California Peptide Research, Inc., Napa, CA).

"Random" biblioteker av peptider eller andre forbindelser kan også screenes for velegnethet som et peptid-immunogen. Kombinatoriske biblioteker kan fremstilles for mange typer forbindelser som kan syntetiseres ved en trinn-for-trinn-metode. Slike forbindelser omfatter polypeptider, beta-bøy mimetika, hormoner, oligomere iV-substituerte glysiner og oligokarbamater og lignende. Store kombinatoriske biblioteker av forbindelsene kan konstrueres ved "encoded synthetic libraries" (ESL)-metoden beskrevet

i WO 95/12608, WO 93/06121, WO 94/08051, WO 95/35503 og WO 95/30642. Peptidbiblioteker kan også fremstilles ved fag display-metoder ( se, f.eks., Devlin, WO 91/18980).

Derivatisering og konjugering av et immunogent peptid til et proteinbærer

Setet for binding av et peptid-immunogen til en protein/polypeptidbærer og type tverrbindingsmiddel som anvendes for å binde et peptid-immunogen til bæreren er begge viktige for spesifisiteten av det resulterende antistoffet dannet mot det. For korrekt gjenkjennelse, må peptid-immunogenet kobles til bæreren med hensiktsmessig orientering. For at et antistoff senere skal kunne gjenkjenne de frie peptid-immunogenene uten bærer, må peptid-immunogen-protein/polypeptidbærerkonjugatet presentere peptid-immunogenene i en eksponert og tilgjengelig form. Optimal orientering blir ofte oppnådd ved å styre kryssbindingsreaksjonen til spesifikke seter i peptid-immunogenene. En måte å oppnå dette på med et peptid-immunogen er å binde en terminal cysteinrest under peptidsyntese. Dette gir en sulfhydrylgruppe på én ende av peptidet for konjugering til bæreren. Kryssbinding gjennom denne gruppen gir binding av peptid-immunogenet kun ved én ende, og sikrer derved konsekvent orientering.

Ved konjugering av peptid-immunogen og bærer, er ikke målet å opprettholde den native tilstanden eller stabiliteten av bæreren, men å presentere haptenet på best mulig måte for immunsystemet. For oppnåelse av dette målet, kan valg av konjugeringsmetoder kontrollere den resulterende titeren, affinitetet og spesifisiteten av antistoffene dannet mot haptenet. Det kan i noen tilfeller være viktig å velge et tverrbindingsmiddel inneholdende en spacer-arm lang nok til å presentere antigenet på en uinnskrenket måte. Det kan også være viktig å kontrollere tettheten av peptid-immunogener på overflaten av bæreren. For liten peptid-immunogen substitusjon kan føre til liten eller ingen respons. En for høy tetthet av peptid-immunogen kan faktisk forårsake immunologisk suppresjon og redusere responsen. I tillegg kan kryssbinderen i seg selv frembringe en uønsket immunrespons. Disse issues må tas i betraktning i selecting ikke bare det passende kryssbinding reagenser, men også det passende forhold av protein/polypeptidbærer og peptid-immunogen.

En rekke metoder for binding av protein/peptidbærerene til peptid-immunogener er mulige. Ioniske interaksjoner er mulig gjennom endene eller gjennom e-aminogruppen fra lysin. Hydrogenbinding mellom sidegruppene fra restene og peptid-immunogenet er også mulig. Til slutt kan konformasjonsinteraksjoner mellom protein/peptidbærerene og det immunogene peptidet gi opphav til en stabil binding.

Peptid-immunogener-bærer-konjugater er med hell dannet ved anvendelse av forskjellige tverrbindingsreagenser slik som null-lengde, homobifunksjonelle eller heterobifunksjonelle kryssbindere. De minste tilgjengelige reagenssystemene for bio-konjugering er de såkalte null-lengde kryssbinderene. Disse forbindelsene medierer konjugering av to molekyler ved å danne en binding som ikke inneholder noen ytterligere atomer. Ett atom av et molekyl er følgelig spacer. Ved mange metoder for konjugering er det endelige komplekset bundet sammen i kraft av kjemiske komponenter som tilfører fremmede strukturer til substansene som er kryssbundet. I noen anvendelser kan tilstedeværelsen av disse mellomliggende linkerene være skadelig for den tilsiktede anvendelsen. For eksempel er, ved fremstilling av peptid-immunogen-bærerkonjugater, komplekset dannet med den hensikt å frembringe en immunrespons mot det tilknyttede haptenet. Nå og da vil en del av antistoffene produsert ved denne responsen ha spesifisitet for tverrbindingsmiddelet anvendt i konjugeringen prosedyre. Null-lengde tverrbindingsmidler fjerner potensialet for denne type kryssreaktivitet ved å mediereen en direkte binding mellom to substanser.

Homo-bifunksjonelle reagenser, som var de første kryssbindingsreagensene anvendt for modifikasjon og konjugering av makromolekyler, besto av bireaktive forbindelser inneholdende samme funksjonelle gruppe ved begge ender (Hartman og Wold, 1966). Disse reagensene kunne binde ett protein til et annet ved å kovalent reagere med de samme felles gruppene på begge molekyler. Følgelig kunne lysin s-aminene eller de N-terminale aminene fra ett protein kryssbindes til samme funksjonelle grupper på et andre protein ved ganske enkelt å blande de to sammen i nærvær av det homo-bifunksjonelle reagenset.

Reagenser for hetero-bifunksjonell konjugering inneholder to forskjellig reaktive grupper som kan kobles til to forskjellig funksjonelle mål på proteiner og andre makromolekyler. For eksempel kan én del av en tverrbinder inneholde en amin-reaktiv gruppe, mens en annen del kan bestå av en sulfhydryl-reaktiv gruppe. Resultatet er evnen til å dirigere krys sbindingsreaksj onen til valgte deler av målmolekyler, og følgelig oppnå bedre kontroll over konjugeringsprosessen.

Hetero-bifunksjonelle reagenser blir anvendt til å kryssbinde proteiner og andre molekyler i en to- eller tretrinns prosess som begrenser graden av polymerisering som ofte oppnås ved anvendelse av homo-bifunksjonelle kryssbindere.

Mange metoder er for tiden tilgjengelig for kobling av peptid-immunogener til protein/polypeptidbærere ved anvendelse av null-lengde, homo-bifunksjonell eller hetero-bifunksjonell kryssbindere. De fleste metoder danner amin, amid, uretan, isotiourea eller disulfidbindinger eller i noen tilfeller tioetere. Den mer generelle metoden for kobling av proteiner eller peptider til peptider anvender bifunksjonelle kryssbindingsreagenser. Disse er små spacer-molekyler som har aktive grupper ved hver ende. Spacer-molekylene kan ha like eller forskjellige aktive grupper ved hver ende. De mest vanlige aktive funksjonalitetene, koblingsgruppene og bindingene dannet er:

1. Aldehyd - amino —> sekundær amin

2. Maleimido - sulfhydryl —> tioeter

3. Succinimido - amino amid

4. Imidatestere - amino amid

5. Fenylazider - amino —> fenyl amin

6. Acylhalogenid - sulfhydryl -» tioeter

7. Pyridyldisulfider - sulfhydryl -> disulfid

8. Isotiocyanat - amino —» isotiourea.

Reaktiviteten av et gitt bærerprotein, med hensyn til dets evne til å bli modifisert av et tverrbindingsmiddel slik at det kan konjugeres til et peptid-immunogen, bestemmes av dets aminosyresammensetning og sekvenslokalisering av de individuelle aminosyrene i den tredimensjonale strukturen av molekylet, så vel som av aminosyresammensetningen av peptid-immunogenet.

I tilfellet av linkere ("L") mellom protein/peptidbærere og andre peptider (f. eks. en protein/peptidbærer og et peptid immunogen), er spacerene typisk valgt fra Ala, Gly eller andre nøytrale spacere av ikke-polare aminosyrer eller nøytrale polare aminosyrer. I visse utførelsesformer er den nøytrale spaceren Ala. Det vil forstås at spaceren som eventuelt er til stede ikke trenger å være omfattet av de samme restene og kan følgelig være en hetero- eller homo-oligomer. Eksempler på spacere omfatter homo-oligomerer av Ala. Når den er til stede, vil spaceren vanligvis være minst én eller to rester, mer vanlig tre til seks rester. I andre utførelsesformer er protein/peptidbæreren konjugert til et peptid- immunogen, fortrinnsvis med protein/peptidbæreren plassert ved den aminoterminale enden. Peptidet kan være bundet til en nøytral linker, slik som Ala-ala-ala eller lignende og inneholder foretrukket videre en lipidrest slik palmitinsyre eller lignende som er bundet til alfa og epsilon-aminogrupper av en Lys-rest ((PAMtøLys), som er bundet til den aminoterminale enden av peptidkonjugatet, typisk via Ser-Ser-binding eller lignende.

Peptid-immunogenet kan være et AP-fragment valgt fra gruppen bestående av Apl-5-L, Apl-7-L, Apl-9-L og Apl-12-L. I noen aspekter er linkeren GAGA (SEKV ID NR: 10).

For å lette konjugeringen av et peptid-immunogen med en bærer, kan ytterligere aminosyrer tilføyes til endene av de antigene determinantene. De ytterligere restene kan også anvendes for modifikasjon av de fysiske eller kjemiske egenskapene til peptid-immunogenet. Aminosyrer slik som tyrosin, cystein, lysin, glutaminsyre eller asparaginsyre eller lignende, kan innføres ved de C- eller N-terminale endene av peptid-immunogenet. I tillegg kan peptid-linkere inneholdende aminosyrer slik som glysin og alanin også innføres. I tillegg kan de antigene determinantene skille seg fra den naturlige sekvensen ved at den er modifisert ved acylering av terminal NH2-gruppe, feks., ved alkanoyl (C1-C20) eller tioglykolyl-acetylering, terminal-karboksy amidering, feks., ammoniakk, metylamin, osv. I noen tilfeller kan disse modifikasjonene gi seter for binding til en bærer eller annet molekyl.

Peptid-immunogenet kan være et AP-fragment valgt fra gruppen bestående av Api-5-C, Api-7-C, Api-9-C og Api-12-C, hvor C er en cystein-aminosyrerest. I noen aspekter er peptid-immunogenet et AP-fragment valgt fra gruppen bestående av Api-5-L-C, Apl-7-L-C, Apl-9-L-C og Apl-12-L-C.

Peptid-immunogenet er bundet til protein/peptidbæreren enten direkte eller via en linker enten ved den amino eller karboksy-terminale enden av peptid-immunogenet. Den aminoterminale enden av enten peptid-immunogenet eller protein/peptidbæreren kan acyleres. I tillegg kan peptid-immunogen-protein/peptidbærerkonjugatet være bundet til visse alkanyol (Ci-C2o)-lipider via én eller flere forbindende rester slik som Gly, Gly-Gly, Ser, Ser-Ser som beskrevet nedenfor. Andre anvendelige lipidgrupper omfatter kolesterol, fettsyrer og lignende.

Peptid-immunogener kan bindes til en bærer ved kjemisk kryssbinding. Teknikker for binding av et immunogen til en bærer omfatter danning av disulfidbindinger ved anvendelse av iV-succinimidyl-3-(2-pyirdyl-tio) propionat (SPDP) (Carlsson, J et al.

(1978) Biochem J, 173: 723,) og succinimidyl 4-(A^-maleimidometyl) cykloheksan-1-karboksylat (SMCC) (hvis peptidet mangler en sulfhydrylgruppe, kan denne gis ved tilsetning av en cysteinrest til haptenet). Disse reagensene danner en disulfidbinding mellom dem selv og peptid cysteinrester i ett protein og en amidbinding gjennom e-amino i et lysin eller annen fri aminogruppe i andre aminosyrer. En rekke slike disulfid/amid-dannenede midler er beskrevet i Immune. Rev. 62: 85 (1982). Andre bifunksjonelle koblingsmidler danner en tioeter heller enn en disulfidbinding. De tioeter-dannende midlene omfatter reaktiv ester av 6-maleimidokapronsyre, 2-bromeddiksyre og 2-jodeddiksyre, 4-(A^-maleimido-metyl)-cykloheksan-1 -karboksylsyre. Karboksylgruppene kan aktiveres ved å kombinere dem med succinimid eller l-hydroksyl-2-nitro-4-sulfonsyre, natriumsalt.

Oftest er lysinrester de aminosyrerestene som finnes i størst mengde i bærerproteiner og disse restene blir modifisert ved anvendelse av kryssbindingsreagenser for å danne neucleofile seter som deretter blir koblet til et hapten. Denne koblingen blir oppnådd via hvilken som helst av de hydrofile sidekj edene på haptenmolekylene som er kjemisk aktive. Disse omfatter guanidylgruppen med arginin, (-karboksylgrupper av glutamat og asparaginsyre, sulfhydrylgruppen fra cystein og e-aminogruppen fra lysin, for å nevne noen få. Modifikasjon av proteiner slik at de nå kan kobles til andre grupper blir oppnådd ved anvendelse av kryssbindingsreagenser, som reagerer med hvilke som helst av sidekj edene på proteinbæreren eller haptenmolekylene.

Bærerproteinet med eller uten et linker-molekyl er funksjonalisert (derivatisert) med et reagens som innfører reaktive seter inn i bærerproteinmolekylet som er mottagelige for ytterligere modifikasjon for å innføre nukleofile grupper. I én utførelsesform blir bæreren reagert med en halogenacetylerende reagens, som fortrinnsvis reagerer med flere funksjonelle grupper på aminosyrerester i proteiner slik som sulfhydrylgruppen fra cystein, den primære s-amingruppen fra lysinresten, a -terminalen fra a-aminer, tioeteren fra metionin og begge imidazoyl sidekjede-nitrogenene fra histidin (Gurd, 1967). I en foretrukket utførelsesform blir de primære s-amingruppene i lysinrester av bærerproteinet derivatisert med b N-hydroksysuccinimidylbromacetat for å danne en bromacetylert bærer. Konjugering av peptid-immunogen og den aktiverte proteinbærer ble utført ved langsom tilsetning av den aktiverte bæreren til løsningen inneholdende peptid-immunogenet.

Ved anvendelse av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan peptid-immunogenene beskrevet i avsnitt B, ovenfor, konjugeres til hvilke som helst av bærerene ifølge krav 1. Konjugatene som er et resultat av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes som immunogener for danning av antistoffer mot Ap for anvendelse i passiv/aktiv immunoterapi. Videre kan Ap eller et Ap-fragment bundet til en bærer administreres til et laboratoriedyr ved fremstilling av monoklonale antistoffer mot

AP-

I ett aspekt ifølge oppfinnelsen er konjugatet et konjugat valgt fra gruppen bestående av Apl-7-CRMi97, (Apl-7 x 3)-CRMi97og (Apl-7 x 5)-CRMi97.1 ett aspekt ifølge oppfinnelsen er konjugatet et konjugat valgt fra gruppen bestående av CRMi97-Api-5, CRMi97-Apl-7, CRMi97-Apl-9 og CRMi97-Apl-12.1 et annet aspekt av oppfinnelsen, er konjugatet et konjugat valgt fra gruppen bestående av Api-5-C-CRMi97, Api-7-C-CRMi97, Apl-9-C-CRMi97og Apl-12-C-CRMi97, Apl6-23-C-CRMi97, Apl7-24-C-CRMi97, Apl8-25-C-CRMi97, CRMi97-C-Api 6-23, CRMi97-C-Ap 17-24, CRMi97-C-Apl8-25, Apl6-22-C-CRMi97, Apl7-23-C-CRMi97, Apl8-24-C-CRMi97, CRMi97-C-Apl6-22, CRMi97-C-Api7-23 og CRMi97-C-Ap 18-24.1 enda et annet aspekt av oppfinnelsen er konjugatet et konjugat valgt fra gruppen bestående av valgt fra gruppen bestående av Apl-5-L-C-CRMi97, Apl-7-L-C-CRMi97, Apl-9-L-C-CRMi97og Apl-12-L-C-CRMi97.

Capping

En ulempe ved anvendelse av koblingsreagenser, som innfører reaktive seter inn i sidekj edene til reaktive aminosyremolekyler på bærer og /eller haptenmolekyler, er at de reaktivt setes, dersom de ikke nøytraliseres, er fri til å reagere med hvilken som helst uønsket molekyl enten in vitro eller in vivo. Ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse blir capping av de ureagerte funksjonelle gruppene gjennomført ved å reagere konjugatene med pendant reaktive grupper med N-acetylcysteamin som inaktiverer/capper de reaktive gruppene. Andre eksempler på inaktiverings/cappingsreagenser som er beskrevet her omfatter cysteamin og etanolamin. Alternativt kan capping gjennomføres ved reaksjon med ammoniakk eller ammoniumbikarbonat, som begge omdanner halogenacetylgruppene til aminoacetylgrupper. Capping blir også utført ved alkalisk pH (9,0-9,8) ved anvendelse av natriumhydroksid eller natriumkarbonat, som omdanner halogenacetylgruppene til hydroksyacetylgrupper. En potensiell fordel ved å omdanne halogenacetylgruppene til aminoacetyl eller hydroksyacetylgrupper, i motsetning til reaksjonen med cysteaminderivater, etanolamin osv., er innføring av kjemiske funksjonaliteter med relativt mindre størrelse, ved reaksjon med ammoniakk eller hydroksid/karbonat. De resulterende cappede funksjonelle gruppene, feks. aminoacetyl eller hydroksyacetyl, gir relativt mindre forstyrrelse i bærerprotein-andelen av konjugatet. Det cappede peptid-immunogen-bærerproteinet kan renses som nødvendig ved anvendelse av kjente metoder, slik som kromatografi (gelfiltrering, ionebytter, hydrofob interaksjon eller affinitet), dialyse, ultrafiltrering-diafiltrering, selektiv presipitering ved anvendelse av ammoniumsulfat eller alkohol og lignende.

Immunogene konjugater og blandinger

De cappede peptid-immunogen-bærerproteinkonjugatene er i en immunogen blanding for administrering til pattedyr, spesielt mennesker, for profylaktiske og/eller terapeutiske formål. Konjugatene ifølge foreliggende oppfinnelse er for anvendelse for å fremkalle og/eller forbedre immunresponser mot immunogener. For eksempel er CTL-bærerkonjugater for anvendelse for å behandle og/eller forebygge virusinfeksjon, amyloidogene sykdommer, kreft osv. Alternativt kan også peptid-immunogen-bærerkonjugater, som induserer antistoffresponser anvendes. Eksempler på sykdommer som kan behandles ved anvendelse av konjugatene ifølge foreliggende oppfinnelse, omfatter forskjellige bakterieinfeksjoner, virale infeksjoner, fungale infeksjoner, parasittinfeksjoner og kreft.

Ved terapeutiske anvendelser kanet konjugat ifølge foreliggende oppfinnelse administreres til et individ som allerede lider av en amyloidogen sykdom slik som Alzheimers sykdom, kreft eller er infisert med et patogen mikroorganisme. De som er i inkubasjonsfasen eller den akutte fasen av sykdommen kan behandles med konjugatet ifølge foreliggende oppfinnelse separat eller sammen med andre behandlinger, som passende.

Ved terapeutiske anvendelser kan en immunogen blanding ifølge foreliggende oppfinnelse administreres til en pasient i en mengde tilstrekkelig til å fremkalle en effektiv CTL-respons eller humoral respons mot mikroorganismen, amyloide plaque eller til et tumorantigen uttrykt på en kreftcelle og til kurere eller i det minste delvis stanse sykdomsprogresjon, symptomer og/eller komplikasjoner. En mengde tilstrekkelig til å oppnå dette er definert som "terapeutisk effektiv dose". Mengder effektive for denne anvendelsen vil avhenge delvis av peptidblandingen, administreringsmetoden, stadiet og alvorlighetsgraden av sykdommen som behandles, vekten og den generelle tilstanden til pasienten og bedømmelsen ved legen som foreskriver.

Terapeutisk effektive mengder av de immunogene blandingene ifølge foreliggende oppfinnelse varierer generelt for den innledende immuniseringen for terapeutisk eller profylaktisk administrering, fra ca. 0,1 ug til ca. 10,000 ug peptid for en pasient på 70 kg, vanligvis fra ca. 0,1 til ca. 8000 ug, fortrinnsvis mellom ca. 0,1 til ca. 5000 jig og mest foretrukket mellom 0,1 til ca. 1,000 ug. Disse dosene etterfølges av boosting-doser på fra ca. 0,1 ug til ca. 1000 ug peptid i henhold til et boostingsregime over uker til måneder avhengig av pasientens respons og tilstand ved å måle spesifikke immunresponser.

Videre kan en immunogen blanding ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes profylaktisk for å forebygge og/eller forbedre bakterieinfeksjoner, virale infeksjoner, fungale infeksjoner, parasittinfeksjoner, amyloidogen sykdom eller kreft. Effektive mengder er som beskrevet ovenfor. I tillegg ville fagfolk på området også vite hvordan profylaktiske behandlinger skal reguleres og modifiseres, som passende, for eksempel ved boosting og regulering av doser og doseringsregimer.

Terapeutisk administrering kan begynne ved det første tegn på sykdommen eller deteksjon eller kirurgisk fjerning av tumorer eller kort etter diagnose i tilfellet av akutt infeksjon. Dette blir etterfulgt av boosting-doser inntil sykdomsprogresjonen blir stanset eller reversert eller symptomene er vesentlig reduserte og i en periode deretter. Ved kronisk infeksjon kan det være nødvendig med innledende høye doser etterfulgt av boosting-doser.

Behandling av et infisert individ med blandingene ifølge oppfinnelsen kan fremskynde oppløsning av infeksjonen hso akutt infiserte individer. For de individene som er mottagelige (eller predisponert) for å utvikle kronisk infeksjon er blandingene spesielt anvendelige ved fremgangsmåter for å forhindre utvikling fra akutt til kronisk infeksjon. Når de mottagelige individene er identifisert før eller under infeksjon, for eksempel, som beskrevet her, kan blandingene målrettes til dem, hvilket reduserer behovet for administrering til en større populasjon.

Konjugatene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også anvendes for behandling av kronisk infeksjon og til å stimulere immunsystemet for å fjerne virusinfiserte celler hos individer med latente infeksjoner. Det er viktig å gi en mengde av den immunogene blandingen ifølge foreliggende oppfinnelse i en formulering og administreringsmetode tilstrekkelig til å effektivt fremkalle og/eller forbedre en immunrespons. Følgelig er, for behandling av kronisk infeksjon, en representativ dose i området fra ca. 0,1 ug til ca. 10,000 ug peptid, vanligvis fra ca. 0,1 til ca. 8000 ug, fortrinnsvis mellom ca. 0,1 til ca. 5000 jig og mest foretrukket mellom 0,1 til ca. 1,000 ug for en 70 kg pasient pr. dose. Immuniserende doser fulgt av boosting-doser ved fastsatte intervaller, feks. fra én til fire uker, kan være nødvendig, muligens i en forlenget tidsperiode for å immunisere et individ effektivt. I tilfellet av kronisk infeksjon skulle administrering fortsette inntil i det minste kliniske symptomer eller laboratorietester indikerer at den virale infeksjonen har blitt fjernet eller vesentlig dempet og i en periode deretter.

Immunogene blandinger ifølge foreliggende oppfinnelse for terapeutisk eller profylaktisk behandling kan administreres ved parenteral, topisk, intravenøs, oral, subkutan, intra-arteriell, intrakranial, intraperitoneal, intranasal eller intramuskulær metode for profylaktisk og/eller terapeutisk behandling. En typisk administreringsvei for et immunogent middel er subkutan, selv om andre ruter kan være like effektive. En annen vanlig rute er intramuskulær injeksjon. Denne type injeksjon utføres mest typisk i arm eller leggmusklene. Ved noen metoder blir midler injisert direkte inn i et bestemt vev hvor avleiringer har akkumulert, for eksempel intrakranial injeksjon. Intramuskulær injeksjon eller intravenøs infusjon er foretrukket for administrering av antistoff. Ved noen metoder blir bestemte terapeutiske antistoffer injisert direkte inn i kraniet. På grunn av den enkle administreringen, er de immunogene blandingene ifølge oppfinnelsen spesielt egnet for oral administrering. Oppfinnelsen tilveiebringer videre immunogene blandinger for parenteral administrering, hvilke omfatter en løsning av konjugatene, oppløst eller suspendert i en akseptabel bærer, fortrinnsvis en vandig bærer.

En rekke fortynningsmidler, tilsetningsmidler og buffere kan anvendes, feks. vann, bufiret vann, fosfatbufret saltløsning, 0,3% glysin, hyaluronsyre og lignende. Disse blandingene kan steriliseres ved konvensjonelle, velkjente steriliseringsteknikker eller kan sterilfiltreres. De resulterende vandige løsningene kan pakkes for anvendelse som sådan, eller lyofiliseres, hvor den lyofiliserte blandingen kombineres med en steril løsning før administrering. Blandingene kan inneholde farmasøytisk akseptable hjelpestoffer som nødvendig for tilnærmet fysiologiske betingelser, slik som buffermidler, tonisitetsregulerende midler, fuktemidler og lignende, for eksempel natriumacetat, natriumlaktat, natriumklorid, kaliumklorid, kalsiumklorid, sorbitan-monolaurat, trietanolamin oleat, osv.

For faste preparater, kan konvensjonelle ikke-toksiske faste bærere anvendes. Disse kan for eksempel omfatte mannitol, laktose, stivelse, magnesiumstearat, natrium sakkarin, talk, cellulose, glukose, sukrose, magnesiumkarbonat og lignende av farmasøytisk kvalitet. For oral administrering dannes en farmasøytisk akseptabel ikke-toksisk blanding ved å inkorporere hvilke som helst av de vanlig anvendte tilsetningsmidlene, slik som bærerene tidligere listet opp og generelt 10-95% av aktiv bestanddel, dvs. én eller flere konjugater ifølge oppfinnelsen og mer foretrukket i en konsentrasjon på 25-75%.

Konsentrasjonen av immunogene blandinger ifølge foreliggende oppfinnelse i farmasøytiske formuleringer kan variere sterkt, dvs. fra mindre enn ca. 0,1%, vanligvis ved eller minst ca. 2% til så mye som 20% til 50% eller mer etter vekt og vil velges primært ved fluidvolumer, viskositeter, osv., i henhold til den bestemte administreringsmetoden som velges.

Konjugatene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også administreres via liposomer, som tjener til å målrette konjugatene til et bestemt vev, slik som lymfoid vev, eller målrette selektivt til infiserte celler, så vel som å øke halveringstiden av peptidblandingen. Liposomer omfatter emulsjoner, skum, miceller, uoppløselig monolag, flytende krystaller, fosfolipid dispersjoner, lamellære lag og lignende. I disse preparatene er blandingen som skal leveres inkorporert som del av et liposom, alene eller sammen med et molekyl, som binder til, for eksempel en reseptor utbredt hos lymfoide celler. Disse molekylene ville inkludere monoklonale antistoffer, som binder til CD45-antigenet, eller med andre terapeutiske eller immunogene blandinger. Følgelig kan liposomer fylt med en ønsket blanding ifølge foreliggende oppfinnelse rettes mot sete for lymfoide celler, hvor liposomene så leverer de valgte terapeutiske/immunogene peptidblandingene. Liposomer for anvendelse med konjugatene ifølge oppfinnelsen blir dannet fra standard vesikkeldannende lipider, som generelt omfatter nøytrale og negativt ladete fosfolipider og et sterol, slik som kolesterol. Seleksjon av lipider styres generelt ved hensyn til liposomstørrelse, syrelabilitet og stabilitet av liposomene i blodstrømmen. En rekke metoder er tilgjengelige for fremstilling av liposomer, som beskrevet i, feks. Szoka, et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980), U.S. Pat. Nr. 4,235,871, 4,501,728, 4,837,028 og 5,019,369.

For målretting til immuncellene, kan en ligand som skal inkorporeres i liposomet omfatte antistoffer eller fragmenter derav spesifikke for celleoverflatedeterminanter for de ønskede cellene av immunsystemet. En liposomsuspensjon inneholdende en blanding ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres intravenøst, lokalt, topisk, osv. i en dose som varierer i henhold til, bl. a. administreringsmetoden, blandingen som leveres og tilstanden av sykdommen som behandles.

For aerosoladministrering blir blandingene ifølge foreliggende oppfinnelse fortrinnsvis levert i findelt form sammen med en surfaktant og drivmiddel. Typiske prosentdeler av blandingen er 0,01-20 vekt%, fortrinnsvis 1-10%. Surfaktanten må, selvfølgelig, være ikke-toksisk og fortrinnsvis oppløselig i drivmiddelet. Representative for slike midler er estere eller partielle estere av fettsyrer inneholdende fra 6 til 22 karbonatomer, slik som kapron, oktan, laurinsyre, palmitinsyre, stearinsyre, linolsyre, linolensyre, olesteric og oleinsyrer med en alifatisk polyhydrisk alkohol eller dens sykliske anhydrid. Blandede estere, slik som blandede eller naturlige glyserider kan anvendes. Surfaktanten kan utgjøre 0,1- 20 vekt% av blandingen, fortrinnsvis 0,25-5%. Balansen for blandingen er ordinært drivmiddel. En bærer kan også være omfattet, om ønsket, som med lecitin for intranasal levering.

Blandingene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også anvendes for fremstilling av monoklonale antistoffer. Slike antistoffer kan være anvendelige som potensielle diagnostiske eller terapeutiske midler.

Blandingene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også anvendes som diagnostiske reagenser. For eksempel kan en blanding ifølge oppfinnelsen anvendes for å bestemme mottageligheten for et bestemt individ for et behandlingsregime, som anvender polypeptid-immunogenene, og kan følgelig være nyttig for modifikasjon av en eksisterende behandlingsprotokoll eller for bestemmelse av en prognose for et rammet individ. I tillegg kan blandingene ifølge foreliggende oppfinnelse også anvendes for å predikere hvilke individer som vil ha en vesentlig risiko for å utvikle kronisk infeksjon.

Konjugater ifølge foreliggende oppfinnelse kan eventuelt administreres i kombinasjon med andre midler som er i det minste delvis effektive for behandling og/eller forbedring av en sykdom og/eller dens symptomer. I tilfellet av Alzheimers og Downs syndrom, hvor amyloide avleiringer forekomme i hjernen, kan konjugatene ifølge oppfinnelsen administreres sammen med andre midler som øker passasje av midlene ifølge oppfinnelsen over blod-hjerne-barrieren.

Den immunogene blandingen inneholder typisk en adjuvans. En adjuvans er en substans som forbedrer immunresponsen når administrert sammen med et immunogen eller antigen. Flere cytokiner eller lymfokiner er vist å ha immunmodulerende aktivitet og kan således anvendes som adjuvantia, omfattende, men ikke begrenset til, interleukinene l-a, l-p, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 (se feks. U.S. Patent nr. 5,723,127), 13, 14, 15, 16, 17 og 18 (og dens mutante former), interferonene-a, P og y, granulocytt-makrofag kolonistimulerende faktor (se feks. U.S. Patent nr. 5,078,996) makrofag-kolonistimulerende faktor, granulocytt-kolonistimulerende faktor, GSF og tumorennekrosefaktor a og p. Enda andre adjuvantia anvendelige i foreliggende oppfinnelse omfatter et kjemokin, omfattende uten begrensning, MCP-1, MEP-la, MIP-ip og RANTES. Adhesjonsmolekyler, slik som et selektin, feks. L-selektin, P-selektin og E-selektin kan også være anvendelige som adjuvantia. Enda andre anvendelige adjuvantia omfatter, uten begrensning, et mucin-lignende molekyl, feks. CD34, GlyCAM-1 og MadCAM-1, et medlem av integrin-familien slik som LFA-1, VLA-1, Mac-1 og pl 50,95, et medlem av immunglobulin superfamilien slik som PECAM, ICAMs, feks. ICAM-1, ICAM-2 og ICAM-3, CD2 og LFA-3, ko-stimulerende molekyler slik som CD40 og CD40L, vekstfaktorer omfattende vaskulær vekstfaktor, nervevekstfaktor, fibroblast vekstfaktor, epidermale vekstfaktor, B7,2, PDGF, BL-1 og vaskulær endotel vekstfaktor, reseptormolekyler omfattende Fas, TNF-reseptor, Fit, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2 og DR6. Enda et annet adjuvansmolekyl omfatter Caspase (ICE). Se også Internasjonal patentpublikasjon nr. W098/17799 og W099/43839.

Egnede adjuvantia anvendt for å forbedre en immunrespons omfatter, uten begrensning, MPL™ (3-O-deacylert monofosforyl-lipid A; Corixa, Hamilton, MT), som er beskrevet i U.S. Patent nr. 4,912,094. Også egnet for anvendelse som adjuvantia er syntetisk lipid A-analoger eller aminoalkyl-glukosaminfosfat-forbindelser (AGP) eller derivater eller analoger derav, som er tilgjengelige fra Corixa (Hamilton, MT) og som er beskrevet i U.S. Patent nr. 6,113,918. En slik AGP er 2-[(R)-3-tetradekanoyloksytetradecancylaminojetyl 2-Deoksy-4-0-fosfono-3-0-[(S)-3-tetradecanoyoksytetradekanoyl]-2-[(R)-3-tetradekanoyloksy-tetradekanoyl-amino]-b-D- glykopyranosid, som er kjent som 529 (også kjent som RC529; Corixa). Denne 529-adjuvansen er formulert som er vandig form (529 AF) eller som en stabil emulsjon (529

SE).

Enda andre adjuvantia omfatter mineralolje og vann-emulsjoner, kalsiumsalter slik som kalsiumfosfat, aluminiumsalter (alun), slik som aluminiumhydroksid, aluminiumfosfat, osv., Amphigen, Avridin, L121/squalen, D-laktid-polylaktid/glykosid, pluronic syrer, polyoler, muramyl dipeptid, drept Bordetella, saponiner, slik som Stimulon™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA), beskrevet i U.S. Patent nr. 5,057,540, og partikler dannet derfra slik som ISCOMS (immunstimulerende komplekser), Mycobacterium tuberculosis, bakterielle lipopolysakkarider, syntetiske polynukleotider slik som oligonukleotider inneholdende et CpG-motiv (U.S. Patent nr. 6,207,646), et pertussistoksin (PT) eller etE. coli varmelabilt toksin (LT), spesielt LT-K63, LT-R72, PT-K9/G129; se, feks. Internasjonal patentpublikasjon nr. WO 93/13302 og WO 92/19265.

Også anvendelige som adjuvantia er koleratoksiner og mutanter derav, omfattende de beskrevet i publisert internasjonal patentsøknad nummer WO 00/18434 (hvor glutaminsyren ved aminosyreposisjon 29 blir erstattet med en annen aminosyre (andre enn asparaginsyre, fortrinnsvis et histidin). Lignende CT-toksiner eller mutanter er beskrevet i publisert internasjonal patentsøknad nummer WO 02/098368 (hvor isoleucin ved aminosyreposisjon 16 blir erstattet med en annen aminosyre, enten alene eller i kombinasjon med erstatningen av serin ved aminosyreposisjon 68 med en annen aminosyre; og/eller hvor valin ved aminosyreposisjon 72 blir erstattet med en annen aminosyre). Andre CT-toksiner er beskrevet i publisert internasjonal patentsøknad nummer WO 02/098369 (hvor arginin ved aminosyreposisjon 25 blir erstattet med en annen aminosyre; og/eller en aminosyre blir insertert ved aminosyreposisjon 49; og/eller to aminosyrer blir insertert ved aminosyreposisjon 35 og 36).

Det skal forstås at henvisning i hele dette dokumentet til hvilken som helst teori for å forklare resultatene beskrevet er ikke ment å begrense omfanget av oppfinnelsen. Uavhengig av fremgangsmåten ved hvilken oppfinnelsen fungerer, kan resultatene og fordelene beskrevet her oppnås ved henvisning til de følgende eksemplene ifølge oppfinnelsen.

EKSEMPEL 1

Konjugering av CRM197til A3- peptid

Konjugering av haptener/antigene peptider ble utført ved å reagere aktivert bærer CRM197, som har trettini lysinrester, med et hapten/antigent peptid som har en pendant tiol-gruppe ved anvendelse av fremgangsmåten beskrevet nedenfor (Figur 1). Alle AØ-peptidene inneholdt en cysteinrest ved den karboksyterminale enden for å lette konjugeringen av disse peptidene gjennom cysteinylsulfhydrylgruppen til bærerproteinet. Disse peptidene ble fremstilt ved fastfase syntese.

I. Aktivering

Frie aminogrupper av CRM197ble bromactylert ved reaksjon med et overskudd av bromeddiksyre-Af-hydroksysuccinimidester (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)

(Bernatowicz og Matsueda, 1986). Til en iskald løsning av CRM197(-15 mg), ble 10%

(volum/volum) 1,0 M NaHC03(pH 8,4) tilsatt. Bromeddiksyre-A^-hydroksysuccinimidester, lik i vekt med den av CRM197anvendt, ble oppløst i 200 ul dimetylformamid (DMF), tilsatt langsomt til CRM197og forsiktig blandet ved romtemperatur i mørke i 1 time. Det resulterende bromacetylerte (aktiverte) proteinet ble renset ved passasje gjennom en avsalting (P6-DG)-kolonne ved anvendelse av PBS / 1 mM EDTA (pH 7,0) som elueringsmidlet. Etter rensing, ble fraksjonene svarende til aktivert CRM197samlet og proteinkonsentrasjonen ble beregnet ved BCA protein-analyse. Protein-aminogruppene, både før og etter behandling med bromeddiksyre-A^-hydroksysuccinimid-ester, ble reagert med 2,4,6-trinitrobenzensulfonsyre (TNBSA), som tjente som en indikator for bromacetylering (Means et al., 1972).

II. Konjugering

Før konjugering ble peptidene reagert med 5,5'-ditio-bis(2-nitrobenzosyre)

[Ellman's reagens] for å verifisere innholdet av frie SH-grupper (mellom 62-88% redusert). For de første fire AP-peptidene (aminosyrene 1-7 uten linker, aminosyrene 1-12 med GAGAC-linker, aminosyrene 1-9 med GAGAC-linker og aminosyrene 1-7 med GAGAC-linker), ble omtrent 8,0 - 10,0 mg peptid oppløst i sterilt, destillert vann til en omtrentlig konsentrasjon på 20 mg/ml. Peptidet ble langsomt tilsatt til kald aktivert CRM197i et 1:1-forhold (vekt/vekt) og pH ble regulert til omtrent 7,0-7,2 ved tilsetning av 20-36 ul 1 N NaOH. Det resulterende materialet ble forsiktig blandet natten over ved 4°C i mørke fulgt av dialyse i mørke mot to 11 vekslinger av PBS, pH 7,2. For de neste fire AP-

peptidene (aminosyrene 1-5 uten linker, aminosyrene 1-9 uten linker, aminosyrene 1-12 uten linker og aminosyrene 1-5 med linker), ble reaksjon med Ellman's reagens anvendt for å verifisere de frie SH-gruppene. CRM197ble bromacetylert, renset og reagert med

TNBSA som tidligere beskrevet. PH for hvert peptid ble justert til 7,0 ved tilsetning av 0,1 M NaPC>4 (pH 8,5) ved 2,2x volumet av det oppløste peptidet. Peptidet ble langsomt tilsatt til kald aktivert CRM197i et 1:1-forhold og fikk reagere natten over ved 4°C i mørke. Det resulterende materialet ble dialysert. En endelig kontrollpeptid (l-12mer i revers orientering) ble konjugert til CRM197som beskrevet ovenfor med den følgende modifikasjonen. Heller enn å regulere pH for peptidet til 7,0, ble pH for det aktiverte CRM197regulert til omtrent 7,5 ved tilsetning av 20% (volum/volum) 0,5 M NaPCU(pH 8,0). Hvert konjugat ble, etter dialyse, overført til et sterilt 15 ml polypropylenrør, pakket inn i aluminiumsfolie og lagret ved 4°C. Aktivering av de reaktive aminorestene på bæreren ble deretter verifisert ved anvendelse av massespektrometri.

L= linker (GAGA) (SEKV ID NR.: 10)

EKSEMPEL 2

Fremstilling av A3- peptid- CRMi97 - konjugat og rensing ved ultrafiltrering Bromacetvlering av CRM197

CRM197(100 mg) i 0,01 M natriumfosfatbuffer, 0,9% NaCl, pH 7,0, ble reagert med bromeddiksyre-A^-hydroksysucinimidester (oppløst til 20 mg/ml i DMSO) ved et 1:1-vektforhold under en argonatmosfære. Reaksjonen ble titrert etter behov for å opprettholde pH ved 7,0. Blandingen ble omrørt i mørke i 1,5 timer ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble l,2um filtrert inn i retentatreservoiret i et UF/DF-system (Millipore Labscale TFF, Billerica, MA). Rensing ble utført ved anvendelse av en 10K eller 30K UF membran ved diafiltrering (30 ganger) mot 0,01 M natriumfosfatbuffer / 0,9% NaCl, pH 7,0. Det bromacetylerte CRM197ble filtrert ved passering gjennom et 0,2um filter. Graden av bromacetylering ble bestemt ved å reagere det aktiverte CRM197med cystein, etterfulgt av aminosyreanalyse og kvantifisering av det resulterende karboksymetylcysteinet (CMC).

Konjugering av A3- peptid og bromacetylert CRM197og capping med N- acetylacysteamin

Bromacetylert CRM197(50 mg) ble overført til en reaksjonsbeholder. Til den omrørte løsningen, holdt ved 2-8°C, ble det tilsatt 1 M natriumkarbonat/bikarbonat. Titrering ble utført for å oppnå en mål-pH på 9,0, under argonatmosfære. Separat ble 50 mg AP-peptid veiet ut og oppløst i vann for injeksjon (WFI) til 20 mg/ml. Til denne løsningen ble det tilsatt 1 M natriumkarbonat/bikarbonat inntil pH 9,0 ble oppnådd. Peptidløsningen ble satt til den bromacetylerte CRM197-løsningen og blandingen ble omrørt ved 2-8°C i 14-18 timer. De gjenværende bromacetylgruppene ble capped med et 20 ganger molar overskudd av A^-acetylcysteamin i 3-6 timer ved 2-8°C.

Reaksjonsblandingen ble filtrert gjennom l,2um filter inn i retentatreservoiret i et UF/DF-system (Millipore XL) og konjugatet ble renset ved romtemperatur ved 30 ganger diafiltrering på en 10K eller 30K MWCO membran (Millipore) ved diafiltering mot 0,01 M natriumfosfatbuffer / 0,9% NaCl, pH 7,0. Retentatet ble oppsamlet og 0,2um filtrert og analysert for proteininnhold (Lowry eller Micro-BCA kolorimetrisk assay), ved SDS-PAGE, ved aminosyreanalyse og for immunogenisitet i mus.

EKSEMPEL 3

Omdannelse ved capping av de ureagerte bromacetylgruppene til aminoacetvlgrupper

Bromacetylert CRM197(50 mg), fremstilt som beskrevet ovenfor i Eksempel 2, ble overført til en reaksjonsbeholder. Til den omrørte løsningen, holdt ved 2-8°C, ble det tilsatt lM natriumkarbonat/bikarbonat. Titrering ble utført for å oppnå en mål-pH på 9,0, under argonatmosfære. Separat ble 50 mg AP-peptid veiet ut og oppløst i WFI til 20 mg/ml. Til denne løsningen ble det tilsatt 1 M natriumkarbonat/bikarbonat inntil pH 9,0 ble oppnådd. Peptidløsningen ble satt til den bromacetylerte CRM197-løsningen og blandingen ble omrørt ved 2-8°C i 14-18 timer. De gjenværende bromacetylgruppene ble cappet ved anvendelse av 8% ammoniumbikarbonat-løsning i 4 timer ved 2-8°C.

Reaksjonsblandingen ble l,2um filtrert inn i retentatreservoiraret i et UF/DF-system (Millipore XL) og konjugatet ble renset ved romtemperatur ved 30 ganger diafiltrering på en 10K eller 30K MWCO-membran ved diafiltering vs 0,01 M natriumfosfatbuffer / 0,9% NaCl, pH 7,0. Retentatet ble oppsamlet og 0,2um filtrert og analysert for proteininnhold (Lowry eller Micro-BCA kolorimetrisk assay), ved SDS-PAGE, ved aminosyreanalyse og for immunogenisitet i mus.

EKSEMPEL 4

Kvantitativ bestemmelse av ff- karboksvmetylcystein og ff- karboksymetylcysteamin som evaluering av grad av konjugering og capping av peptid- immunogen-protein/ polypeptidkonjugater

Syrehydrolyse av protein-peptidkonjugater fremstilt ved anvendelse av bromacetylaktiveringskjemi resulterte i danningen av syrestabil S-karboksymetylcystein (CMC) fra cysteinene ved de konjugerte setene og danningen av syrestabil S-karboksymetylcysteamin (CMCA) fra cysteaminet ved de cappede setene (Figur 2). Alle de konjugerte og cappede lysinene ble omdannet tilbake til lysin og detektert som sådan. Alle andre aminosyrer ble hydrolysert tilbake til frie aminosyrer bortsett fra tryptofan og cystein, som ble ødelagt av hydrolysebetingelsene. Asparagin og glutamin ble omdannet til asparaginsyre og glutaminsyre, henholdsvis.

Prøver av konjugat ble fortynnet med avionisert vann til en total proteinkonsentrasjon på mindre enn 1 mg/ml. To alikvoter på 10 mikrogram av hvert konjugat ble tørket og resuspendert i 100 jxl 6N HC1 [Pierce], 5 ul smeltet fenol [Sigma- aldrich] og 1 ul 2-merkaptoetanol [Sigma-aldrich]. Prøvene ble deretter inkubert under vakuum (100 mT) ved 110 °C i 22 timer. Den resulterende hydrolysatene ble tørket, resuspendert i 250 ul Beckman Na-S natriumcitrat prøvefortynningsbuffer (pH 2,2)

[Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA] og filtrert ved anvendelse av Whatman 0,2 um nylonsprøyte tip filtere og 1 ml sprøyter.

Hver prøve ble deretter fylt i en Beckman 6300 aminosyreanalysator prøve sløyfe og plassert i analysatoren. Aminosyrene fra hver hydrolysert prøve og kontroll ble separert ved anvendelse av ionebytterkromatografi fulgt av reaksjon med Beckman Ninhydrin NinRX-løsning ved 135 °C. Derivatetiserte aminosyrer ble deretter detektert i det synlige område ved 570 nm og 440 nm ( se Tabell 1). Et standard sett av aminosyrer [Pierce Amino Acid Standard H] inneholdende 500 pikomol av hver aminosyre ble kjørt sammen med prøvene og kontroller for hvert sett av analyse. S-karboksymetylcystein [Sigma-aldrich] ble tilsatt til standarden.

Arealene av hver standard topp ble anvendt som en kvantitativ ekivalens for proporsjonal evaluering av hver prøve. Prolin ble bestemt fra 440 nm og ble omregnet til en ekivalens ved 570 nm ved anvendelse av glutaminsyre, den nærmeste aminosyren.

Hver av disse pikomol-verdiene ble omregnet til en molar ratio av aminosyrerester ved anvendelse av en sammenligning av pikomol av lysin med den teoretiske lysinverdi til stede i proteinet. Lysin ble valgt for denne evalueringen basert på dens kovalente binding til Cystein og Cysteamin og den forventede lignende hydrolyse. Det resulterende antall mol av aminosyrer ble deretter sammenlignet med aminosyresammensetningen for proteinet og angitt sammen med verdiene for CMC og CMC A. CMC-verdien ble anvendt direkte for evaluering av graden av konjugering og CMCA-verdi ble anvendt direkte for evaluering av graden av capping.

EKSEMPEL 5

Karakterisering og optimalisering av A3- CRMi97Peptidkonjugater

For å verifisere konjugering, ble alle peptid-CRMi97-konjugatene analysert ved aminosyreanalyse og matriks assistert laser desorpsjon ionisasjon-time of flight (MALDI-TOF) massespektrometri. For hvert konjugat, ble mol av peptid konjugert til hvert mol CRM197bestemt ved aminosyreanalyse (antall S-karboksymetylcysteinrester) og MALDI-TOF massespektrometri. Verdiene bestemt ved hver metode var generelt i overensstemmelse.

I. Størrelseseksklusionskromatografi:

Batch konsentrat-prøver ble fjernet fra lagring og fikk oppvarmes til romtemperatur. AP-peptidkonjugat-prøven ble forsiktig blandet for å sikre et homogent preparat. AP-peptidkonjugat-prøven ble spunnet i en Eppendorf mikrosentrifuge for å fjerne eventuelt partikulært materiale. Supernatanten ble tatt tilbake for TosoHaas TSK-Gel G3000SW-kromatografi (TosoHaas, Stuttgart, Tyskland). En TosoHaas TSK-Gel G3000SW-kolonne ble forbundet med et HPLC-system og trykkgrensen ble satt til 1,4 MPa. Kolonnen ble ekvilibrert med minst 30 ml PBS (10 mM natriumfosfat, 150 mM NaCl, pH 7,2 ±0,1) ved en strømningshastighet på 0,75 ml/min. AP-peptidkonjugat-prøven ble fylt i TosoHaas TSK-Gel G3000SW-kolonnen ved anvendelse av de følgende parameterene:

Konsentrasjon av AP peptidkonjugat-prøve: 1,5 ± 1,0 mg/ml

Strømningshastighet: 0,75 ml/min

Prøvevolum: 0,1 ml

Kjøringstid: 30 minutter

Absorbansen ble overvåket ved både 280nm og 210nm. For langvarig lagring, ble TosoHaas TSK-Gel G3000SW-kolonne ekvilibrert med minst 50 ml 20% etanol ved en strømningshastighet på 0,5 - 1,0 ml/min.

n. PAGE ( Porvakrvlamidgelelektroforese) :

Det aktiverte (bromacetylerte) CRM197og AP-peptid-CRMi97-konjugater ble undersøkt ved SDS-geler ved anvendelse av en NuPAGE Bis-tris Elektroforese (Novex, Frankfurt, Tyskland) med nøytral ph, ferdigstøpt polyakrylamid minigelsystem og NuPAGE MES SDS Running Buffer. En 8ug alikvot av hver aktivert CRM eller konjugat ble blandet med reduserende prøvebuffer og oppvarmet ved 100°C i 5 minutter. Konjugatene og molekylvekt (MW)-standarder (Invitrogen, Carlsbad, CA) ble fylt på en 10% (vekt/volum, akrylamid) NuPage-gel (Novex) basert på et Bis-tris-HCl-bufret system og kjørt i MES SDS Running Buffer-PAGE (Laemmli). Etter SDS- PAGE, ble gelen merket med Pierce Gel Code Blue (Pierce, Rockford, IL). AP-peptid-CRMi97-konjugat ble representert ved et stort band rundt 66 kDa, over bandet av nativt CRM og et dimer-bånd rundt 120 kDa, sammen med mindre multimer-bånd (data ikke vist).

Hl. MALDI- TOF massespektrometri- analyse av peptid- CRMi97 - konjugater: Massespektrometri ble anvendt for umiddelbart anslag av graden av konjugering. Egnede alikvoter av aktivert CRM197og konjugatprøver ble analysert ved MALDI-TOF massespektrometri ved anvendelse av 3,5-dimetoksy-4-hydroksy-kanelsyre (sinapinsyre) som matriksen. Molekylvekten av aktivert CRM197bestemt ved MALDI-TOF massespektrometri (Finnigan MAT Lasermat 2000 Massespektrometer, Ringoes, NY) ble funnet å være sentrert rundt 60,5kDa og for konjugater varierte den fra 65kDa til 74kDa avhengig av graden av konjugering (data ikke vist). Opptil 22 av lysinene (-50%) i CRM197ble funnet å være modifisert ved 1:1-forhold.

IV. Optimaliseringsforsøk:

Graden av aktivering og konjugering er en funksjon av reagens :protein-forhold, temperatur av reaksjonen og pH av reaksjonsbufferen. Noen eksempler er gitt nedenfor for å illustrere de optimale konjugeringsbetingelsene, utført for å identifisere de optimale pH-betingelsene for å ha reproduserbar prosesskontrollparametere for konjugeringsreaksj oner. Resultater (Figur 3) viste at konj ugeringsreaksj on til Ap 5mer (DAEFRC)(SEKV ID NR: 1) så vel som Ap 7mer (DAEFRHDC)(SEKV ID NR: 2) er pH-avhengig og gir en høyere grad av modifikasj on/konj ugering når pH ved reaksjonsbetingelsene er øket. Ved anvendelse av TFA-saltet av 5mer og 7mer-peptidene, ble graden av konjugering evaluert ved pH 9,0 med varierende mengder av peptid påfylt (Figur 4). Det er åpenbart fra disse resultatene at peptidkonjugater med et definert antall peptidkopier pr. CRM-molekyl kan dannes ved å variere peptid /aktivert CRM-ratio under konjugeringsprosessen. Lignende forsøk ble utført ved anvendelse av acetatsalt av Ap 7mer-peptid.

For Api-7/CRM-konjugeringen, ble cappingsprosess evaluert ved å sammenligne mol av CMCA pr. CRM med mol av CMC pr. CRM. Siden den totale av CMC og CMCA var konstant for hver peptid: CRM-forhold testet, ble cappingsprosessen antatt å være fullstendig (Figur 5). Det samlede modifikasjonen i konjugatet forble mellom 19 og 21, komparabelt med antall lysiner bromacetylert (Figur 5). Disse forsøkene ble utført med TF A som motionet for peptidet. Api-7/CRM-konjugeringen ble gjentatt ved anvendelse av acetatsaltet av peptidet heller enn TFA-saltet og disse data er vist i Figur 5 og 6. Cappingprosessen syntes å gå til fullstendiggj øring, hvor det totale av CMC og CMCA for hvert punkt forble mellom 20 og 22. Betingelsene for AP-CRM-konjugeringsreaksjonen er optimalisert ved pH 9,0, hvor graden av konjugering kontrolleres ved peptid til CRM-forholdet i reaksjonen. Ved å variere forholdet fra 0,1 til 1,5, kan graden av konjugering varieres (Figur 6).

Graden av aktivering og konjugering er en funksjon av reagens:protein-forhold, temperatur av reaksjonen og pH av reaksjonsbufferen. Graden av modifikasjon (konjugering) for hvert konjugat ble beregnet ved å subtrahere masseverdien av aktivert CRM197fra masseverdien for hvert konjugat og dividere med massen til peptidet anvendt for å fremstille konjugatet. Graden av modifikasjon (konjugering) for alle konjugatene er beskrevet i tabellen 2.

Graden av konjugering ble også sammenlignet med verdiene bestemt ved den beregnede mengde av S-karboksymetylcysteinrester dannet pr. mol av CRM197(også vist i Tabell 2).

EKSEMPEL 6

Immunogenisitet- studier av A3- peptidkoniugater

Peptider som spenner over de N-terminale restene 1-5, 1-7, 1-9 og 1-12 av Ap (med og uten linkersekvensen GAGAC) og et peptid svarende til N-terminalen av Ap i omvendt rekkefølge fra aminosyre tolv til aminosyre én (l-12mer i revers sekvens), hver konjugert til CRM197, ble anvendt for å immunisere mus sammen med et ukonjugert AP 1-12-mer peptid i en formulering med STIMULON™ QS-21. Hver gruppe av mus ble immunisert subkutant med en dose av enten 30 ug eller 5 ug av én av prøvene formulert med 20 ug av adjuvansen STIMULON™ QS-21, ved begynnelsen av studiet (uke 0) og deretter ved ukene 3 og 6. Studieprotokollen er illustrert i Tabell 3.

Som vist i Tabell 3, ble peptider som spenner over de N-terminale restene 1-5, 1-7, 1-9 og 1-12 av Ap (med og uten linkersekvensen GAGAC) og et peptid svarende til N-terminalen av Ap i omvendt rekkefølge fra aminosyre tolv til aminosyre én (l-12mer i revers sekvens), konjugert til CRM197, ble anvendt for å immunisere mus sammen med et ukonjugert Ap l-12mer peptid i en formulering med QS-21. Hver gruppe av mus ble vaksinert subkutant med en dose av enten 30 ug eller 5 ug av én av prøvene formulert med 20 ug av adjuvansen QS-21, ved starten av studiet (uke 0) og deretter ved ukene 3 og 6. Swiss Webster mus ble anvendt for hele studiet med 5 mus i hver gruppe. Injeksjonsvolum = 100 B = Tapping; V = vaksinere; E = exsanguinat.

Anti-AP-titere ble målt ved ELISA mot AP og CRM197som beskrevet nedenfor. I korthet ble Costar 96-brønners plater (#3591) belagt natten over ved romtemperatur med 2 ug/ml Api-42 i steril karbonat/bikarbonatbuffer, pH 9,6. Plater ble tømt og blokkert i to timer ved romtemperatur med 200 ul/brønn av 0,05% BSA i IX PBS/0,05% Tween 20. Blokkerte plater ble tømt og vasket med en platevasker inneholdende TBS, 0,1% Brij-35 (uten azid) vaskebuffer. Alle primære antisera ble serielt fortynnet med 0,05% BSA i IX PBS inneholdende 0,05% Tween 20/0,02% Azid og 100 ul av hver fortynning ble deretter overført til de passende plate-brønnene og inkubert ved romtemperatur i 2 timer. Plater ble deretter tømt/vasket som beskrevet ovenfor. Alkalisk fosfatase-konjugert geit anti-mus IgG sekundært antistoff fra Southern Biotech (city, stat) ble fortynnet 1:1000 med 0,05% BSA i PBS inneholdende 0,05% Tween 20/0,02% Azid og 100 ul ble tilsatt til hver brønn og inkubert ved romtemperatur i 1 time. Plater ble deretter tømt/vasket som beskrevet ovenfor og til slutt inkubert ved romtemperatur i 1 time med 100 u.l/brønn av en 1 mg/ml løsning av p-nitrofenylfosfat-substrat fremstilt i dietanolamin/MgCb, pH 9,8. Fargeutviklingen ble stanset ved tilsetning av 50 ul/brønn av 3 N NaOH. Plater ble avlest ved 405 nM med en 690 nM referanse. Sluttpunkt titere ble beregnet ved en O.D. på 0,1 AU.

CRMi97ELISA

Greiner 96-brønners plater (#650011) ble belagt ved 37°C i 90 minutter med 5,0 ug/ml (100 u.l/brønn) av CRM197i steril karbonat/bikarbonatbuffer, pH 9,6. Plater ble tømt og vasket med en platevasker inneholdende IX TBS, 0,1% Brij-35 vaskebuffer. Alle primære antisera ble serielt fortynnet med IX PBS inneholdende 0,3% Tween 20/EDTA og 100 ul av hver fortynning ble deretter overført til de passende plate-brønnene og inkubert ved 37°C i 1 time. Platene ble deretter tømt/vasket som beskrevet ovenfor. Alkalisk fosfatase-konjugert geit anti-mus IgG sekundært antistoff fra Southern Biotech ble fortynnet 1:1000 med IX PBS inneholdende 0,05% Tween 20/0,02% Azid og 100 ul ble tilsatt til hver brønn og inkubert ved 37°C i 1 time. Plater ble deretter tømt/vasket som beskrevet ovenfor og til slutt inkubert ved romtemperatur i 1 time med 100 ul/brønn av e 1 mg/ml løsning av p-nitrofenylfosfat-substrat fremstilt i dietanolamin/MgCh, pH 9,8. Utviklingen ble stanset ved tilsetning av 50 ul/brønn av 3 N NaOH. Plater ble avlest ved 405 nM med en 690 nM referanse. Sluttpunkt titere ble beregnet ved en O.D. på 0,1 AU.

Tabellene 4-6 illustrerer sluttpunkt ELISA titere mot Ap. Etter primær immunisering induserte alle åtte konjugatene (bortsett fra den negative kontrollen) målbare anti-Ap IgG immunresponser. Imidlertid ga dosen på 30ug, men ikke dosen på 5ug, av Ap en positiv respons ved uke 3 etter primær immunisering. Blant alle konjugatene, fremsto det at AP 1-7-peptid konjugert uten linker fremkalte like god eller bedre respons enn andre konjugater studert. Ved 5ug dose, var Ap 1-5C bedre ved ukene 8-16. Ap 1-7C var best ved 30ug dose. Analyse av antistofftitere etter andre og tredje immunisering med enten 5 eller 30ug dose indikerer at den maksimale immunresponsen til Ap for de fleste av konjugatene ble sett etter den andre immuniseringen. I det minste hos mus, syntes ikke den tredje immuniseringen å forbedre immunresponsen. AP-peptid krevde imidlertid tre immuniseringer med 30ug dose for å nå maksimal immunrespons mot peptidet (Tabell 5). Når det gjelder antistoff-svekkelse over en forlenget tidsperiode, ble antistoffnivået fra gruppene immunisert med konjugater redusert ved 2 til 3 ganger sammenlignet med det høyeste nivået innenfor den gruppen. Individuelle prøver fra ukene 6 og 8 ble analysert for å beregne GMT'er mot ApD for hver av gruppene (Tabell 6) for å se om noen konjugatgruppe var vesentlig bedre enn de andre. Statistisk analyse av uke 6-titere fra AP1-5C, Ap 1-7C og Ap l-9C-konjugater indikerte at Ap 1-7-konjugatet induserte en betydelig høyere titer. Det er også åpenbart fra dette studiet at linkersekvensen GAGAC ikke bidro til å øke immunresponsen til peptidet.

Tabell 6. Ukene 6 og 8 ELISA sluttpunkt GMT'er mot Ap ved anvendelse av antisera fra 30 ug dose av peptidkonjugater som spenner over varierende lengder av den N-terminale enden av Amyloid-Ap. Ref: Elan Hyperimmune Polyclonale #592 = 3,073,307. Sluttounkt ved O.D. 0,1 AU. Swiss Webster-mus ble immunisert SC-N med 30 ug av ovennevnte antigener formulert med 20 ug STIMULON™ QS-21 ved ukene 0, 3 og 6

a. Statistisk analyse av uke 6-titere fra 1-5C, 1-7C og 1-9C ved anvendelse av Tukey-Kramer viser en statistisk forskjell mellom 1-5C vs 1-7C kun, mens analyse ved anvendelse av Student's T-test viser en statistisk forskjell mellom 1-5C vs 1-7C og 1-5C vs 1-9C.

b. Statistisk analyse av uke 8-titere fra 1-5C, 1-7C og 1-9C viser ikke en statistisk forskjell mellom de tre gruppene. Imidlertid synes det å være en tendens som kan indikere en forskjell mellom 1-5C vs 1-7C.

PD APP Mus hjernevev- Merking

PD APP hjernevev merkingsanalyse gir en indikasjon på funksjonaliteten av AØ-peptidkonjugatene og/eller AP 1-42 antiserum. Serumprøver fra individuelle musegrupper ble separat analysert for deres evne til å gjenkjenne PD APP mus hjernevev plaques inneholdende amyloid peptid. Resultatene er vist i Tabell 7A og 7B. Med unntak av AP 5mer konjugat antisera, var det en dose-relatert respons med hensyn til gjenkjenning av plaques. Uavhengig av linkeren, hadde 30u.g konjugat-induserte antisera bedre reaktivitsmønstere sammenlignet med det for 5ug konjugat antisera. Med Ap 5mer konjugat-antisera, synes det imidlertid å være lignende eller bedre reaktivitet for 5ug-gruppen. Ved sammenligning av alle disse resultatene, konkluderes det med at konjugater fremstilt fra AP l-5mer til og med AP l-9mer er tilstrekkelig til å få frem plaques som gjenkjenner immunrespons hos mus og tilstedeværelse av linker er ikke essensiell. De følgende konklusjonene kan trekkes fra denne undersøkelsen: (a) Alle peptidkonjugatene induserte antiserum med høy titer mot bærerproteinet CRM197i like eller litt høyere nivåer sammenlignet med den ukonjugerte CRM197-kontrollen (ikke vist), (b) Konjugatene med GAGAC-linkeren forbedret ikke immunogenisitet eller funksjonalitet sammenlignet med konjugater uten bindingene, (c) Immunogenisitetsdataene og PD APP hjernevev-merkingen (en initiell indikasjon på funksjonelt antistoff) viser at Ap l-5mer og Ap l-7mer-konjugatene syntes å være de foretrukne immunogenene for videre utvikling.

Alle antisera fortynnet 1:1000 for merkingsmetoden.

Alle antisera fortynnet 1:1000 for merkingsprosedyren.

EKSEMPEL 7

Immunogenisitetsstudier i aper

[0001] Grupper på 6 aper mottok 30 ug av 7mer-konjugat (totalt konjugat) tilsatt adjuvans i form av enten STIMULON™ QS-21, alun eller RC529 SE-formulering ved dagene 0, 29 og 58. Ytterligere grupper inkludert var 30 ug 5mer konjugat med enten alun (Al(OH)3) eller RC529 SE, 75 og 300ug Ap med STIMULON™ QS-21 som positive kontroller. Positive kontroller ble immunisert hver annen uke. Ved dag 36 og 64 ble anti-AP □antistoff-titere bestemt (Figurene 7 - 9). Ved dag 36, fremkalte 7mer/CRM-konjugater med STIMULON™ QS-21, Alun og RC529 SE, GMT-titere på 10110, 13330 og 17090 henholdsvis (Figur 7). I motsetning til dette fremkalte Ap 1-42 pluss STIMULON™ QS-21, GMT'er på 223 og 1734 ved dosenivåer på 75 og 300ug, henholdsvis. AP 5mer-konjugatet fremkalte en titer på 2134 med alun og 15980 med RC529 SE. Ved dag 64, dvs. etter 3 doser av konjugater med enten STIMULON™ QS21 eller RC-529 SE fremkalte hovedsakelig høyere titere enn etter andre dose (GMT'er 69910 i 7 mer/RC-529 SE; 21640 for Ap 5mer/RC-529 SE og 30310 for Ap 7mer/STIMULON™ QS-21) (Figur 8). Konjugater med alun fremkalt reduserte titere etter tredje immunisering sammenlignet med etter andre immunisering. Det synes som om AP 7mer-konjugatet fremkalte en bedre respons sammenlignet med AP 5mer-konjugatet. I aper, fremkalte AP 7mer-konjugat med tilsatt adjuvans RC-529 SE eller STIMULON™ QS-21 den høyeste respons (Figur 9). Responsen til AP 7mer-konjugatet med alun var moderat og likt den for 300ug AP 1-42 med STIMULON™ QS-21.

Mange konklusjoner kan trekkes fra det aktuelle eksemplet. For det første er begge konjugatene svært immunogene i primate arter. For det andre påvirket tilstedeværelsen av

adjuvantia i immuniseringsformulering immunresponsen betydelig. For det tredje, bortsett fra for aluminium-adjuvansen forbedrer RC-529 SE og STIMULON™ QS-21 immunresponsen etter hver dose av immunisering i det minste opptil tre doser (Figur 9). Generelt induserte AP 7mer-konjugat høyere antistoffrespons i nærvær av 529, etterfulgt av STIMULON™ QS-21 ( se Figur 9).

EKSEMPEL 8

Fremstilling av Multippel Antigent Peptid ( MAP)- konjugater og deres immunogenisitet- studie

Mange metoder er tilgjengelig for fremstilling av multiple antigene seter på bærerene. I de foregående eksemplene, blir hvert antigene sete separat konjugert til bæreren ved definerte konjugerings- og cappingskjemier. I dette eksemplet konstrueres multiple antigene seter ved fastfase syntese av tandemrepetisjoner av Ap 1-7 mer. Alternativt kan disse tandemrepetisjonene kobles med T-celle-epitoper med eller uten binding gjennom en lysin-kjerne som beskrevet andre steder. Disse multiple antigene peptidene ble syntetisert med en ytterligere cysteinylrest for konjugering til bærerproteinet. Peptider inneholdende én repetert enhet (1-7), tre repeterte enheter (1-7)3og fem repeterte enheter (l-7)s med en ytterligere cysteinylrest ved karboksylenden ble syntetisert. Disse peptidene ble kovalent bundet til bromacetylert CRM natten over gjennom deres C-terminale cysteinrester. Reaksjonen ble utført ved pH 9,0-9,2 med peptid:CRM-forhold tilsatt som beskrevet i Tabell 8. Bromacetylgrupper, som ikke reagerte med peptid, ble cappet med N-acetylcysteamin. Disse mengdene representerer konjugater inneholdende én enkelt kopi, tre tandemkopier og fem tandemkopier av Api-7-peptidet konjugert til CRM, henholdsvis. Tabell 8 viser i korthet egenskapene til prøvene.

Peptidlast ("load") (gjennomsnittlig antall Ap 1-7-peptider pr. bærer) og capping-antall (Tabell 9) er antallet av unike aminosyrer (CMC eller CMCA) pr. bærer som bestemt ved aminosyreanalyse. CMC og CMCA-verdiene ble referansed til lysin.

Swiss-Webster-mus (10 pr. gruppe) ble immunisert subkutant med 1 eller 0,1 u.g Ap/CRM-konjugert peptid. Halvparten av musene ble immunisert med blandingen formulert med 100 ug av adjuvansen Al(OH)3og halvparten ble immunisert uten adjuvans. Immuniseringer ble planlagt for ukene 0 og 3. Tappinger ble planlagt for ukene 0, 3 og 6. Serumprøver ble analysert for antistoffrespons mot Api-42mer peptid. Resultatene er vist i Tabell 10.

Alle konjugatene induserte anti-AP 1-42 antistofftiter etter primær immunisering og nivåene ble hovedsakelig øket etter boosterdosen. I fravær av aluminiumadjuvans, ble forskjellene i doserespons åpenbar både ved uke 3 og uke 6 tappinger. Den høyere dosen fremkalte høy-titer antistoffrespons. Aluminiumadjuvans fremkalt hovedsakelig høyere antistoffrespons ved uke 3 ved begge dosenivåer (0,1 og 1 ug) sammenlignet med de gruppene uten tilsatt adjuvans. Etter sekundær immunisering fremkalte konjugater gitt ved 1 ug dose 5 til 10 ganger økning i antistoffnivåer. Ved dette dosenivået induserte peptidkonjugater med 3 og 5 repetisjoner høyere antistoffrespons enn en enkelt repetisjon-inneholdende konjugat. Titerene mot CRM-bæreren ble også bestemt og disse er listet opp i Tabell 11.

Dyr ble immunisert ved ukene 0 og 3 og tappinger ved ukene 0, 3 og 6. Adjuvans: 100 u.g Al(OH)3eller ingen. ND=Ikke Bestemt.

Data i Tabell 11 indikerer at gruppene som ikke var tilsatt adjuvan induserte svært lave nivåer av anti-CRM antistoffrespons ved både lug så vel som 0,1 ug dosenivåer selv etter to immuniseringer. Imidlertid induserte konjugater med aluminiumhydroksid-adjuvans vesentlige nivåer av anti-CRM antistoffrespons ved 1 ug dose og mye lavere respons ved 0,1 ug dose. I nærvær av adjuvansen, var CRM-titere høyest for enkelt repetisjon-konjugatet, intermediær for trippel repetisjon-konjugatet og lavest for femdobbelt repetisjon-konjugatet. Dette er som forventet, siden CRM-dosen pr. peptiddose er laveste for AP(l-7)s/CRM og høyest for AP(l-7)i/CRM. Forskjellene var bare statistisk signifikante ved uke 6 for dosen på

Formålet ifølge foreliggende oppfinnelse er å fremkalle immunogen respons med høye titere mot det antigene haptenet og ikke nødvendigvis mot bærerproteinet. Under visse omstendigheter er det ønskelig å fremkalle optimal immunrespons mot antigene determinanter på haptenet med liten eller ingen immunrespons mot bærerproteinet. For slike anvendelser vil konjugater med tandemrepetisjoner av multiple antigendeterminanter med formulering uten tilsatt adjuvans tjene behovet.

EKSEMPEL 9

Fremstilling av AP- peptidkonjugater med forskjellige bærerproteiner og deres immunogenisitet

Dette eksemplet sammenligner immunogenisiteten av konjugater ved anvendelse av seks forskjellig bærerproteiner. Acetatsaltet av Ap 1-7 ble tilsatt til bromacetylerte bærere i et 1:1-forhold etter vekt ved pH 9. Alle konjugater bortsett fra Api-7/rC5ap ble cappet med N-acetylcysteamin. Alle de alternative bærerene er rekombinante bakterielle proteiner, omfattende CRM (difteri toksoid), rekombinant C5a peptidase (rC5ap; klonet fra Streptococcus agalactiae, omfatter D130A og S512A-mutasjoner), ORF'er 1224,1664, 2452 (alle klonet fra Streptococcus pyogenes) og T367, T858 (hver klonet fra Chlamydia pneumoniae). En oppsummering av bærerene anvendt er funnet i Tabell 12. Graden av konjugering og capping av hvert Ap 1-7-konjugat til disse bærerene er presentert i Tabell 13.

Denne undersøkelsen viste at det rekombinante C5a peptidasekonjugatet induserte høyere titere mot Ap enn de fleste av de andre bærerene testet, omfattende CRM. Denne forskjellen var statistisk signifikant for uke 6-titere for grupper som mottok aluminiumhydroksid. I tillegg var Api-7/T858-konjugatet betydelig mer immunogent enn de fleste andre konjugater i fravær av adjuvans. Det eneste konjugatet som virket dårlig i forhold til CRM kontrollkonjugatet var AP1-7/T367, et konjugat som heller ikke reagerte med et AP-spesifikt monoklonalt antistoff ved Western blot. Denne undersøkelsen bekrefter at en rekke andre bærere med hell kan anvendes for immuniseringe mot AP-peptidet.

Konjugeringsresultater: Peptidlast ("load") (gjennomsnittlig antall Api-7-peptider pr. bærer) og capping-antall er antallet av unike aminosyrer (CMC eller CMCA) pr. bærer som bestemt ved aminosyreanalyse. CMC og CMC A-verdiene ble referert til lysin.

Resultater av immunisering

Det geometriske gjennomsnittet for titeren for hver gruppe i denne undersøkelsen er listet opp i Tabell 14. Ved uke 3, uansett tilstedeværelse av adjuvans, induserte Api-7/rC5ap betydelig høyere anti-AP-titere enn de tilsvarende konjugatene fremstilt med Streptococcus pyogenes ORFs 1224, 1664, 2452 eller Chlamydia pneumoniae ORFs T367 og T858. Ved uke 3 i fravær av adjuvans, var Api-7/rC5ap også mer immunogen enn alle andre konjugater bortsett fra AP1-7/T858. T858-konjugatet uten Al(OH)3induserte høyere titere enn ORF1224, ORF1664, ORF2452 og CRM-konjugatene uten adjuvans. Det eneste konjugatet som var betydelig mindre immunogent enn Api-7/CRM var AP1-7/T367 (p< 0,00002). T367-bærereren virket dårlig med eller uten adjuvans ved både ukene 3 og 6. Ved uke 6, var rC5ap-konjugatet med aluminiumhydroksid mer immunogent (p<0,04) enn alle de andre konjugatene bortsett fra Ap 1-7/ORF2452.1 fravær av adjuvans, induserte både Api-7/rC5ap og Apl-7/T858 betydelig høyere titere enn ORF1224, ORF1664 eller T367-konjugatene. AB1-7/CRM uten aluminiumhydroksid induserte høyere titere enn både Api-7/ORF1664 og Apl-7/T367.

Dyr ble immunisert ved ukene 0 og 3 og tapping ved ukene 0, 3 og 6. Dose er basert på den totale mengden av konjugat. Adjuvans: 100 ug Al(OH)3eller ingen.

EKSEMPEL 10

Fremstilling av ytterligere AB- peptid- protein- konjugater

I. Aktivering

Tinte CRM197(8 ml, 59,84 mg, ved 7,48 mg/ml) ble oppløst i 0,1 M boratbuffer (pH 9, 3,968 ml) for å bringe konsentrasjonen til 5 mg/ml. Løsningen ble avkjølt i et isbad til 0-5°C. Bromeddiksyre-N-hydroksysuccinimid (59,9 mg) (Aldrich-Sigma) ble oppløst i DMF (100 ul) (Aldrich-Sigma) og tilsatt dråpevis, til løsningen av CRM197. Ved tilsetning av bromeddiksyre-N-hydroksysuccinimid, ble et presipitat observert. Når pH ble kontrollert, var den redusert til pH 6. PH i reaksjonsblandingen ble brakt tilbake til pH 9 ved tilsetning av mer 0,1 M boratbuffer. Reaksjonsblanding ble deretter omrørt ved 4°C i 1 time, med forsiktig virvling. Blandingen ble renset og konsentrert ved anvendelse av YM-10 centriprep centrifugal konsentrasjon og renset på nytt på Sephadex G-25 ved anvendelse av 10 mM borat som elueringsmidlet. Fraksjoner positive til Bradford Reagens ble samlet og konsentrert ved anvendelse av centriprep YM-10. Graden av bromacetylering ble bestemt ved Bradford assay (lineær). Konsentrasjonen ble funnet å være 5,36 mg/ml (Ga 30 mg). Den endelige konsentrasjon ble deretter regulert til 5 mg/ml og ble lagret i fryseren i 5% sukrose inntil videre anvendelse.

II. Konjugering

For hver konjugering ble tint bromacetylert CRM197anvendt. Peptider ble oppløst i boratbuffer (2,5 mg i 125 ml 0,1 M boratbuffer). Svak uoppløselighet ble observert med AB-peptidene KLVFFAEDC (SEKV ID NR:45), CLVFFAEDV (SEKV ID NR:47), CKLVFFAED (SEKV ID NR:48) og LVFFAEDC (SEKV ID NR:50). Bromacetylert CRM197(5 mg/ml) ble behandlet med peptidløsningene/suspensj onene. Forholdet av peptidet og proteinet i blandingen var 1:2. Turbiditet ble observert i konjugat-blandingene med peptidene KLVFFAEDC (SEKV ID NR:45), CLVFFAEDV (SEKV ID NR:47), CKLVFFAED (SEKV ID NR:48) og KLVFFAEDC (SEKV ID NR:45). Blandingene ble deretter kontrollert for pH (pH 9) og inkubert ved 4°C natten over med langsom virvling. Endelige konsentrasjoner av blandingene ble dannet til 3 mg/ml før inkubering. Turbiditeten av konjugat-blandingene med peptidene CLVFFAEDV (SEKV ID NR: 47) og LVFFAEDC (SEKV ID NR: 50) forsvant etter inkubering. Imidlertid var KLVFFAEDC (SEKV ID NR:45) og CKLVFFAED (SEKV ID NR:48) fortsatt litt uklar. Oppløselig simulert proteinkonjugat ble også fremstilt med cysteamin ved et forhold på 1:1 (vekt/vekt). Syntetiserte peptider ble oppnådd fra BIOSOURCE med ca. 95% renhet.

Oktamerer:

Heptamerer:

III. Capping av ureagerte lvsingrupper på protein:

De ureagerte lysinene ble cappet med N-acetylcysteamin (CMCA; Aldrich-Sigma) ved et forhold på 1/1 (vekt/vekt) i 4 timer ved 4°C under virvling i mørke. De ureagerte peptidene og capping-reagensene ble fjernet fra konjugatene ved dialyse ved anvendelse av Slid-A-Lyzer kasett (Mw cut off 10,000) (Pierce) mot PBS-buffer (2 1) natten over (13 timer). Bufferutveksling og dialyse ble utført to ganger (2x14 timer). Svak uoppløselighet ble observert i konjugatene med peptidene KLVFFAEDC (SEKV ID NR:45) og CKLVFFAED (SEKV ID NR:48). Alle konjugatene ble deretter lagret i kjøleskapet ved 4°C i et konserveringsmiddel.

IV. Karakterisering av proteinbæreren:

MALDI-TOF MS ble anvendt for å bestemme massen av bromacetylert CRM197og massen til simulert ("mock") konjugat N-acetylcysteamin-CRMi97.

Basert på massene til CRM197og bromacetylert CRM197, ble 11 lysinrester modifisert.

(59941,46- 58590,29)/122 = 11

Hvor; Mw av CRM197er 58624,29

Mw av bromacetylert CRM197er 59941,46

Mw av bromacetat er 122

Graden av bromacetylering var mer enn 28%. (Det totale antallet lysiner i CRM197var 39). Fra disse 11 modifiserte lysinrestene, ble 10 koblet med cysteamin. Koblingseffektiviteten var 90%.

(61143- 59941)/119 = 10

Hvor; Mw of bromacetylert CRM197er 59941,46

Mw av simulert konjugat er 61143

Mw av N-acetylcysteamin er 119

(10/11) x 100 = 90

V. Karakterisering av peptid- proteinkonjugatene ved SDS- PAGE Western Blot- analyse med Tris- tricin ferdigstøpt gel: Protein-peptidkonjugatene ble analysert ved Western blot. Brønnene er: markør (brønn 1); L-28375 24/01 (brønn 2); L-28375 24/02 (brønn 3); L-28375 24/03 (brønn 4); L-28375 24/04 (brønn 5); L-28375 24/05 (brønn 6); L-28375 24/06 (brønn 7) L-28375 24/07 (brønn 8); L-28375 24/08 (brønn 9); L-28375 24/09 (Simulert) (brønn 10); og, BrAcCRMi97(brønn 11). Et peptidspesifikt monoklonalt antistoff fra mus (248 - 6H9 - 806 Ap 17-28) ble anvendt som primært antistoff (antisera) (1:3000 fortynning ble funnet å være best). Geit-Anti mus IgG (H+L)-HPR var det sekundære antistoffet (1:1000 fortynning). Det ble observert at alle konjugatene ble gjenkjent av det primære antistoffet, bortsett fra for simulert konjugat og det aktiverte CRM197. ( Se Figur 10.)

Proteinkonsentrasjon

Proteinkonsentrasjoner av konjugatprøvene ble bestemt ved the Pierce BCA-analyse.

( Se Tabell 15.)

Aminosyreanalyse

Aminosyreanalyse ble utført for å bestemme graden av konjugering. T grad av konjugering ble beregnet basert på CMCA (karboksymetylcycteamin)-restene funnet i konjugatene. CMCA ble anvendt til å cappe de ureagerte aktiverte setene etter konjugering med peptidene. ( Se Tabell 15.)

Alle kolorimetriske analyser ble utført ved anvendelse av mikroplate spektrofotometer og SOFTmax Pro.

EKSEMPEL 11

Immunogene undersøkelser av AB- peptidkonjugater i Swiss Webster- mus

Utavlede Swiss Webster-mus ble immunisert med VFFAEDVG-C (SEKV ID NR:43),

LVFFAEDV-C (SEKV ID NR:44), KLVFFAED-C (SEKV ID NR:45), C-VFFAEDVG (SEKV ID NR: 46), C-LVFFAEDV (SEKV ID NR: 47), C-KLVFFAED (SEKV ID NR: 48),

VFFAEDV-C (SEKV ID NR:49), LVFFAED-C (SEKV ID NR: 50) hver konjugert til

CRM197eller med Api-7CRMi97, alle formulert med adjuvansen RC 529 SE. Ni grupper på 10 dyr pr. gruppe ble immunisert subkutant med én av Ap-peptidkonjugatene ved starten av undersøkelsen (uke 0) og deretter ved uke 4. Serum ble oppsamlet før, men på samme dager som immunisering.

Immunogene undersøkelser av AB- peptidkonjugater i Inbred Balb/ c Mus

Innavlede Balb/c-mus ble immunisert som i det foregående avsnittet, men ble også boostet med konjugat og adjuvans ved uke 12.

Resultater

Sera fra begge undersøkelsene er oppsamlet for analyse av APo-28peptid-spesifikk IgG-antistofftiter. Sera fra Balb/c-mus er også oppsamlet for analyse én dag før boosten ved uke 12 og én uke deretter. Miltceller fra dyr anvendt i Eksempel 11 er evaluert for deres potensiale til å respondere in- vitro til stimulering med en overlappende samling av peptider som spenner fra Ap 1.42, fulllengde Ap 1.42, CRM197eller polyklonale aktivatorer. Analyse omfatter Elispot avlesning for interleukinene 4 og 5 og interferon-gamma. Etter fullføring, skal Ap peptidkonjugatene evalueres som beskrevet ovenfor og som beskrevet i Eksempel 6.

EKSEMPEL 12

Immunogene undersøkelser av AB- peptidkonjugater i PSAPP- mus

PSAPP mus immuniseres med VFFAEDVG-C (SEKV ID NR:43), LVFFAEDV-C

(SEKV ID NR:44), KLVFFAED-C (SEKV ID NR:45), C-VFFAEDVG (SEKV ID NR:46), C-LVFFAEDV (SEKV ID NR:47), C-KLVFFAED (SEKV ID NR:48), VFFAEDV-C

(SEKV ID NR:49), LVFFAED-C (SEKV ID NR: 50). PSAPP-musen, en dobbelt transgen mus (PSAPP) som overuttrykker mutant APP og PSl-transgener, er beskrevet i Holcomb, et al. (1998) Nature Medicine 4:97-11.

Immunogene undersøkelser av AB- peptidkonjugater i PDAPP- mus

PDAPP-mus immuniseres med VFFAEDVG-C (SEKV ID NR:43), LVFFAEDV-C

(SEKV ID NR:49), LVFFAED-C (SEKV ID NR: 50) PDAPP-musen uttrykker en mutant form av human APP (APP<V71F>) og utvikler Alzheimers sykdom ved ung alder (Bard, et al.

(2000) NatureMedicine 6:916-919; MasliahE, etal. (1996) JNeurosci. 15;16(18):5795-811).

Resultater

Sera fra begge undersøkelsene blir oppsamlet for analyse av Ap 13-28 peptid-spesifikk IgG-antistofftiter. Etter fullføring vil Ap-peptidkonjugatene evalueres som beskrevet ovenfor og som beskrevet i Eksemplene 6 og 11, så vel som i "contextual fear condition" (CFC)-analyse.

Contextual fear condition er en vanlig form for læring som er usedvanlig pålitelig og raskt erverves for de fleste dyr, for eksempel pattedyr. Testdyr lærer å frykte et tidligere nøytralt stimulus og/eller omgivelse på grunn av dets assosiering med en aversiv erfaring, ( se, feks., Fanselow, Anim. Learn. Behav. 18:264-270 (1990); Wehner etal, Nature Genet. 17:331-334. (1997); Caldaron etal, Nature Genet. 17:335-337 (1997)).

Contextual fear conditioning er spesielt anvendelig for å bestemme kognitiv funksjon eller dysfunksjon, feks., som et resultat av sykdom eller en lidelse, slik som en neurodegenerativ sykdom eller lidelse, en AP-relatert sykdom eller lidelse, en amyloidogen sykdom eller lidelse, tilstedeværelse av en ufordelaktig genetisk endring som bevirker kognitiv funksjon (feks., genetisk mutasjon, genfortyrrelse eller uønsket genotype) og/eller effektiviteten av et middel, feks., et AP-konjugatmiddel, på kognitiv evne. Følgelig tileiebringer CFC-analysen en metode for uavhengig testing og/eller validering av den terapeutiske effekten av midler for forebygging eller behandling av en kognitiv sykdom eller lidelse og spesielt, en sykdom eller lidelse som påvirker én eller flere regioner av hjernen, feks., hippocampus, subiculum, cingulated cortex, prefrontal cortex, perirhinal cortex, sensorisk cortex og medial temporal lobe.

CFC-analysen blir typisk utført ved anvendelse av standard dyrekammere og anvendelse av betinging trening omfattende et mildt sjokk (feks., 0,35mA fotsjokk) paret med en hørsel (feks., en periode på 85 db hvit støy), lukt (feks., mandel eller sitronekstrakt), berøring (feks., struktur av burgulvet) og/eller visuelt signal (lysglimt). Responsen på den aversive erfaringen (sjokk) er typisk én av frysing (fravær av bevegelse bortsett fra for respirasjon) men kan også omfatte øyeblink eller forandring i blinkhinne membran-refleks, avhengig av forsøksdyrene valgt. Den aversive responsen blir vanligviskarakterisertpå den første dag av trening for å bestemme en baselinje for "unconditioned fear", med aversive responsresultater ved påfølgende testdager, feks., frysing i nærvær av sammenhengen og/eller signalet men i fravær av den aversive erfaringen,karakterisertsom sammenheng og signal-kondisjonert frykt, henholdsvis. For forbedret pålitelighet blir testdyr typisk testet separat av uavhengige teknikere og scoret over tid. Ytterligere detaljer for eksperimentelt kan finnes på området, for eksempel i Crawley, JN, Whafs Wrongwith my Mouse; Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice, Wiley-Liss, NY (2000).

Eksempler på testdyr (feks., modelldyr) omfatter pattedyr (feks. gnagere eller ikke-humane primater) som fremviser prominent symptomer eller patologi som er karakteristisk for en amyloidogen lidelse slik som Alzheimers. Modelldyr kan dannes ved selektiv innavl for en ønsket eller de kan konstrueres genetisk ved anvendelse av transgene teknikker som er velkjent på området, slik at en målrettet genetisk endring (feks. en genetisk mutasjon, genforstyrrelse) i en gen som er forbundet med demenslidelsen, hvilket fører til avvikende ekspresjon eller funksjon av det målrettede genet. For eksempel er det tilgjengelig mange transgene musastammer som overuttrykker APP og utvikler amyloid plaque-patologi og/eller utvikler kognitive mangler som er karakteristisk for Alzheimers sykdom (se for eksempel Games etal, supra, Johnson-Wood etal, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 94:1550 (1997); Masliah E og Rockenstein E. (2000) JNeural Transm %?/?/. ;59:175-83).

Alternativt kan det frembringes modelldyr ved anvendelse av kjemiske forbindelser (feks. neurotoksiner, anestetika) eller kirurgiske teknikker (feks. stereotaktisk ablasjon, axotomization, transeksjon, aspirering) som fjerner eller på annen måte griper inn i den normale funksjonen til en anatomisk hjerneregion (feks. hippocampus, amygdala, perirhinal cortex, medial septal kjerne, locus coeruleus, mammalary bodies) eller spesifikk neuroner (feks. serotonerge, cholinerge eller dopaminerge neuroner) som er forbundet med karakteristiske symptomer eller patologi av den amyloidogene lidelsen. I visse foretrukne utførelsesformer oppviser dyremodellen en utpreget kognitiv defisitt forbundet med læring eller hukommelse i tillegg til den neurodegenerative patologien som er forbundet med en amyloidogen lidelse. Mer foretrukket forverres den kognitive defisitten progressivt med økende alder, slik at sykdomsprogresjonen i modelldyr svarer til sykdomsprogresjonen hos et subjekt som lider av den amyloidogene lidelsen.

"Contextual fear conditioning" og andre in vivo forsøk for å teste funksjonaliteten av konjugatene beskrevet her kan utføres ved anvendelse av villtypemus eller mus som har en

bestemt genetisk endring som fører til svekket hukommelse eller musemodeller av neurodegenerativ sykdom, feks., Alzheimers sykdom, omfattende musemodeller som oppviser forhøyede nivåer av oppløselig Ap i cerebrospinalvæske (CSF) eller plasma. For eksempel dyremodeller for Alzheimers sykdom omfatter transgene mus som overuttrykker "Swedish"-mutasjonen av humant amyloid forløperprotein ( hAPPswe; Tg2576) som viser aldersavhengig hukommelsessvikt og plaques (Hsiao etal. (1996) Science 274:99-102). In vzvo-funksjonaliteten av konjugatene beskrevet her kan også testes ved anvendelse av PS-1-mutant mus, beskrevet i Duff, etal. (1996) Nature 383, 710-713. Andre genetisk endrede transgene modeller av Alzheimers sykdom er beskrevet i Masliah E og Rockenstein E. (2000) JNeural Transm Suppl. 59:175-83.

I forskjellige aspekter omfatter fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen administrering av et AP-konjugat som kan forbedre kognisjon hos et subjekt hvor AP-konjugatet har blitt identifisert ved anvendelse av en analyse som er hensiktsmessig prediktiv for immunoterapeutisk effektivitet i subjektet. I eksempler på utførelsesformer, er forsøket en dyreforsøk-modell som er basert, i det minste delvis, på sammenligning av kognisjon, som bestemt fra en "contextual fear conditioning"-studie, av et dyr etter administrering av en test immunologisk reagens til dyret, sammenlignet med en egnet kontroll. CFC-forsøket evaluerer endringer i kognisjon for et dyr (typisk en mus eller rotte) etter behandling med en potensiell terapeutisk forbindelse. I visse utførelsesformer er forandringen i kognisjon evaluert en forbedring i hukommelsessvikt-status eller en reversering av hukommelse-defisitt. Følgelig tilveiebringer CFC-forsøket en direkte metode for å bestemme den terapeutiske effekten av midler for forebygging eller behandling av kognitiv sykdom og spesielt, en sykdom eller lidelse som påvirker én eller flere regioner av hjernen, feks. hippocampus, subiculum, cingulated cortex, prefrontal cortex, perirhinal cortex, sensorisk cortex og medial temporal lobe. Slike CFC-forsøk er beskrevet i samtidige U.S. Patentsøknad Serial nr. 60/XXX,XXX betegnet "Contextual Fear Conditioning for Predicting Immunotherapeutic Efficacy" (som har Attorney Docket nr. ELN-058-1), innlevert 15. desember, 2004 og U.S. Patentsøknad Serial nr. 60/XXX,XXX betegnet "Contextual Fear Conditioning for Predicting Immunotherapeutic Efficacy" (som har Attorney Docket nr. ELN-058-2).

BIBLIOGRAPHY

Bernatowicz, M.S., and Matsueda, G.R. (1986) AnalyticalBiochemistry 155: 95-102.

Kniskern, P.J., and Marburg, S. (1994) Development and Clinical Uses of Haemophilus b Conjugate Vaccines: Conjugation: Design, Chemistry, and Analysis Ellis, R.W., and Granoff, D.M., Eds; Marcel Dekker, Inc: New York, NY, 37-70

Arrizon, V., Biechler, R., Cummings, J., and Harbaugh, J. (1991) High- Performance Liquid Chromatography ofPeptide and Proteins: Separation, Analysis, and Conformation Mant, C.T. and Hodges, R.S., Eds; CRC Press: Boca Raton, FL, 859-863.

Carlsson, J. etal. (1978) Biochem J, 173: 723.

Means, GE., Cangdon, W.I., and Bender, MI. (1972) Biochemistry 11: 3564-3574. Glenner & Wong (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun. 120: 1131 Hardy (1984) Trends in Neurosciences 20: 1131.

Hardy (1977) Trends in Neurosciences 20: 154.

Stoute et al. (1997) N. Engl. J. Med. 336: 86-91.

Goebel et al, (1939) J. Exp. Med. 69: 5 3.

Schneerson et al. (1980) J. Exp. Med 152: 361-376.

Chu etal. (1983) Infect. Immun. 40: 245.

Schneerson etal. (1984) Infect. Immun. 45: 582-591.

Anderson et al. (1985) J. Pediatr. 107: 346.

laseletal. (1986) J. Exp. Med. 158: 294.

U.S. Patent No. 4,673,574 Jun., 1987 Anderson

U.S. Patent No. 4,902,506 Feb., 1990 Anderson et al

U.S. Patent No. 5,192,540 Mar., 1993 Kuo etal.

U.S. Patent No. 5,306,492 Apr., 1994Porro

U.S. Patent No. 5,360,897 Nov., 1994 Anderson et al.

U.S. Patent No. 5,785,973 Jul, 1998 Bixler etal

U.S. Patent No. 6,361,777 Mar., 2002 Hoogerhout

Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H. P. Pres, NY 2d ed., 1989)

Bernatowicz, M. S., and Matsueda, G. R. (1986) Analytical Biochemistry 155, 95-102.

Claims

1. Fremgangsmåte for å konjugere et peptid-immunogen via en reaktiv gruppe fra en aminosyrerest fra peptid-immunogenet til en protein/polypeptidbærer som har én eller flere funksjonelle grupper,karakterisert vedat den omfatter trinnene: (a) derivatisere én eller flere av de funksjonelle gruppene fra protein/polypeptidbæreren for å frembringe en derivatisert bærer med reaktive seter; hvor bæreren er valgt fra gruppen bestående av CRM197, Streptococcus pyogenes ORF1224, Streptococcus pyogenes ORF1664, Streptococcus pyogenes ORF2452, Chlamydia pneumoniae ORF 858; (b) reagere den derivatiserte protein/polypeptidbæreren ifølge trinn (a) med en reaktiv gruppe fra en aminosyre fra peptid-immunogenet under reaksjonsbetingelser slik at peptid-immunogenet konjugeres til den derivatiserte protein/polypeptidbæreren via de funksjonelle gruppene; og (c) ytterligere reagere konjugatet med N-acetylcysteamin for å inaktivere frie, reaktive ureagerte funksjonelle grupper på den derivatiserte protein/polypeptidbæreren, for derved å bevare funksjonaliteten til bæreren, slik at den beholder sin evne til å fremkalle de ønskede immunresponsene mot peptid-immunogenet som på annen måte ikke ville forekomme uten en bærer, hvor konjugatet har formelen:

hvor, C er protein/polypeptidbæreren, X<d>er en derivatisert funksjonell gruppe fra protein/polypeptidbæreren, P er peptid-immunogenet, R er et capping molekyl, n er et helt tall større enn 0, men mindre enn eller lik 85 og p er et helt tall større enn 0, men mindre enn 85.

2. Peptid-immunogen-protein/polypeptidbærerkonjugat,karakterisert vedat det har formelen:

hvor, C er protein/polypeptidbæreren valgt fra gruppen bestående av CRM197, Streptococcus pyogenes ORF1224, Streptococcus pyogenes ORF1664, Streptococcus pyogenes ORF2452, Chlamydia pneumoniae ORF 858, X<d>er en derivatisert funksjonell gruppe av en aminosyrerest fra protein/polypeptidbæreren, P er et peptid-immunogenmolekyl kovalent bundet til den derivatiserte funksjonelle gruppen fra aminosyreresten fra protein/peptidbæreren, R er et capping-molekyl dannet ved reaksjon av konjugatet med N-acetylcysteamin kovalent bundet til den derivatiserte funksjonelle gruppen fra en aminosyrerest fra protein/polypeptidbæreren, hvilket derved bevarer funksjonaliteten til bæreren slik at den beholder sin evne til fremkalle de ønskede immunresponsene mot peptid-immunogenet som på annen måte ikke ville forekomme uten en bærer, n er et helt tall større enn 0, men mindre enn eller lik 85, og p er et helt tall større enn 0, men mindre enn 85.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller peptid-immunogen-protein/polypeptidbærerkonjugatet ifølge krav 2,karakterisert vedat protein/polypeptidbæreren er CRM197.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller peptid-immunogen-protein/polypeptidbærerkonjugatet ifølge krav 2,karakterisert vedat peptidimmunogenet er valgt fra gruppen bestående av et bakterielt protein, et viralt protein, et fungalt protein, et parasittprotein og et eukaryot protein.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat den videre omfatter å innføre en cysteinrest i C- eller N-terminalen av peptidimmunogenet.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5,karakterisert vedat cysteinresten innføres i C-terminalen av peptidimmunogenet.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 5,karakterisert vedat cysteinresten innføres i N-terminalen av peptidimmunogenet.

8. Peptid-immunogen-protein/polypeptidbærerkonjugat ifølge krav 2,karakterisert vedat peptidimmunogenet omfatter en cysteinrest lokalisert i aminoterminalen til peptidimmunogenet eller i karboksyterminalen til peptidimmunogenet.

9. Peptid-immunogen-protein/polypeptidbærerkonjugat ifølge krav 8,karakterisert vedat cysteinresten er lokalisert i karboksyterminalen til peptidimmunogenet.

10. Peptid-immunogen-protein/polypeptidbærerkonjugat ifølge krav 8,karakterisert vedat cysteinresten er lokalisert i aminoterminalen til peptidimmunogenet.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller peptid-immunogen-protein/polypeptidbærerkonjugatet ifølge krav 2,karakterisert vedat den funksjonelle gruppen av én eller flere aminosyremolekyler fra protein/polypeptidbæreren derivatiseres ved anvendelse av en kryssbindingsreagens.

12. Fremgangsmåte eller peptid-immunogen- protein/polypeptidbærerkonjugatet ifølge krav 11,karakterisert vedat protein/polypeptidbæreren reageres med et halogenacetyleringsmiddel.

13. Immunogen blanding,karakterisert vedat den omfatter et konjugat av et peptid-immunogen med en protein/polypeptidbærer ifølge hvilket som helst av kravene 2 til 4, eller 8 til 12, sammen med én eller flere farmasøytisk akseptable tilsetningsmidler, fortynningsmidler og /eller adjuvantia.

14. Immunogen blanding ifølge krav 13,karakterisert vedat én eller flere adjuvantia er valgt fra gruppen bestående av GM-CSF, 529 SE, IL-12, aluminiumfosfat, aluminiumhydroksid, Mycobacterium tuberculosis, Bordetellapertussis, bakterielle lipopolysakkarider, aminoalkylglukosaminfosfat-forbindelser, MPL™ (3-0-deacylert monofosforyl-lipid A), et polypeptid, Quil A, STIMULON™ QS-21, et pertussis toksin (PT), en Kcoli varmelabilt toksin (LT), IL-1 a, IL-1 p, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, interferon-a, interferon-p, interferon-y, G-CSF, TNF-a og TNF-p.