KR100316004B1

KR100316004B1 - Crm단백질및디프테리아독소의생산을위한방법및플라스미드

Info

Publication number: KR100316004B1
Application number: KR1019940004356A
Authority: KR
Inventors: 벤자민제이메트카프
Original assignee: 윌리암 에이취 캘넌, 에곤 이 버그; 아메리칸사이아나미드컴파니
Priority date: 1993-03-05
Filing date: 1994-03-04
Publication date: 2002-02-19
Also published as: CA2116914A1; ES2231770T3; NO313758B1; EP0616034A3; CA2116914C; FI112090B; BR1100634A; HU9400657D0; SK24094A3; HUT71320A; DK0616034T3; CZ39394A3; AU686126B2; FI941050A; NO940774L; CN1100757A; ZA941548B; EP0616034A2; JPH06292593A; KR940021731A

Abstract

본 발명은 CRM 197 단백질 디프테리아 독소 및 디프테리아 독소와 관련된 기타 CRM 단백질들의 풍부한 양을 생산하기 위한 새로운 방법 및 플라스미드 시스템, 뿐만아니라 상기 새로운 플라스미드 의해 형질전환된 미생물에 관한 것이다.

특히 바람직한 DNA 플라스미드, 즉 플라스미드 pNG2-22 및 비독소원 베타파지로부터의 CRM197에 대한 유전자를 조합한 명칭 pPX 3511을 서술한다. 새로운 플라스미드 시스템은 코리네박테리움 디프테리아 (Corynebacterium diphtheriae)의 균주를 다수 리조겐의 사용없이 높은 수준의 CRM 197 단백질을 발현할 수 있는 균주로 형질전환시킬 수 있다. 본 발명은 예컨대 프로모터 강도를 증가시키거나 철 조절로 프로모터를 제거하므로써 발현 벡터를 조작할 필요없이 단백질 생산을 증가시키기 위한 정밀한 수단을 제공한다.

Description

CRM 단백질 및 디프테리아 독소의 생산을 위한 방법 및 플라스미드{METHOD AND PLASMID FOR PRODUCTION OF CRM PROTEIN AND DIPHTHERIA TOXIN}

CRM197 단백질은 디프테리아 독소의 비독성 형태이나 디프테리아 독소로부터 면역학적으로 구별할 수 없다. CRM197은 독소원 코리네파지 β의 니트로소구아니딘 돌연변이 유발에 의해 창출된 비독소원 파지 197^tox-에 의해 감염된 시이. 디프테리아에 의해 생산된다(우키다, T. 일동, 1971,Nature New Biology 233: 8-11). CRM197 단백질은 디프테리아 독소와 동일한 분자량을 가지나 구조 단백질내 단일염기 변화(구아니딘이 아데닌으로)에 의해 그와 상이하다. 상기 단일 염기 변화는 성숙단백질에서 아미노산 치환(글루탐산이 글리신으로)을 야기하고 디프테리아 독소의 독성 성질을 제거한다. CRM197 단백질은 당류에 대해 안전하고 효과적인 T-세포 의존성 캐리어이고 현재 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) b형 올리고당 CRM197 접합체 백신으로 사용되고 있다(HibTiter^Tm; Lederle Praxis Biologicals, Rochester, N,Y.).

백신에서 사용하기 위한 상당량의 CRM197 단백질 생산은 낮은 단백질 양으로 인해 방해받아 왔다. 기술을 개발하여 비독소원 코리네파지 β197의 이중 라이소젠(lysogen)을 사용하여 CRM 단백질의 생산을 보강했다. (라풀리, R., 1983,Applied Env. Microbio. 46: 560-564; R. 라풀리에게 특허된 미합중국 특허 4,925,792; 및 라풀리, R., 1983,J. Bacteriol. 153: 1202-1210). 라풀리는 단일 라이소젠보다 세배까지 더 높은 이중 라이소젠으로부터의 CRM197 산출을 보고한다. 단일 라이소젠에 의한 CRM197의 생산 수준은 적당하나 CRM197 단백질을 사용하는 백신의 생산을 위해서는 경제적으로 불만족스럽다.

코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae)내로 코리네파지 β의 다수 라이소젠의 도입은 CRM197 단백질, 디프테리아 독소 또는 디프테리아 독소와 교차-반응성인 기타 CRM 단백질들을 과잉생산할 수 있는 균주를 동정하기 위한 고된 스크리닝 방법이다. 게다가, 상기 방법은 표준 재조합 기술을 사용하여 단백질 발현을 조작하는 그의 능력에서 한정된다. 따라서 코리네파지 β를 사용하지않고 유전자 복사물 수를 증가시키거나; 코리네파지 β에 대해 용원성인 균주로부터 상기 단백질들의 생산 수준을 증가시키므로써 디프테리아 독소 및 CRM 단백질의 유의한 양을 생산할 수 있는 방법을 개발하는 것이 이로울 것이다.

본 발명은 CRM197, 디프테리아 독소 및 디프테리아 독소 유전자로부터 유래된 기타 CRM 단백질들을 코딩하는 유전자를 조작하고 도입시키기 위한 새로운 방법 및 플라스미드 시스템, 뿐만 아니라 상기 수단에 의해 형질전환된 미생물에 관한 것이다. 특히 바람직한 DNA 플라스미드, 즉 플라스미드 pNG2-22 및 비독소원 베타파지로부터 CRM197에 대한 유전자를 조합한 명칭 pPX3511을 서술한다. 새로운 플라스미드 시스템은 코리네박테리움 디프테리아의 균주를 다수 라이소젠의 사용없이 높은 수준의 CRM197 단백질을 발현할 수 있는 균주로 형질전환시킬 수 있다. 본 발명은 CRM197, 디프테리아 독소, 및 디프테리아 독소 유전자로부터 유래된 기타 CRM 단백질의 단백질 발현을 증가시키기 위한 정밀한 수단을 제공한다. 또한 유전자 발현은 프로모터 강도를 증가시키거나 철 조절로 프로모터를 제거하므로써 조작할 수 있다. 바람직한 실시양태로, 상기 플라스미드 시스템을 사용하여 CRM197, 디프테리아 독소 또는 디프테리아 독소 유전자로부터 유래된 기타 CRM 단백질들과의 유전적 융합체로서 다른 단백질들을 발현할 수 있다. CRM197, 디프테리아 독소 또는 디프테리아 유전자로부터 유래된 기타 CRM 단백질들로부터의 조절 및 처리 서열을 사용하여 코리네박테리움 종들 내로 외래 단백질들을 발현시킬 수 있다.

제1도에서, 재조합 DNA 플라스미드 pPX3511은 CRM197에 대한 유전자, 클로람페니콜 내성(CmR) 마커를 함유하는 이. 콜라이(E. coli)클로닝 벡터 pUC 18로부터유래된 다수 클로닝 부위 및 플라스미드 pNG2-22 로부터 유래된 복제 개시점을 함유한다(Serwold-Davis, T.M. 일동., 1990,FEM Microbiol, Lett, 66 : 119-124).

제2도에서, 레인 A: 고분자량 표준 (BRL, 200-14.3 킬로달톤); 레인 B: 단일라이소젠 C7 (β197)^tox-; 레인 C: 이중 라이소젠 C7 (β197)^tox-; 레인 D: pPX 3511을 갖는 비용원성 C7 (-)^tox-, 클로람페니콜 (Cm2) (2㎍/㎖)없이 증식시킴; 레인 E: pPX 3511을 갖는 C7 (-)^tox-, 클로람페니콜(2㎍/㎖)과 함께 증식시킴; 레인 F: pPX3511을 갖는 단일 라이소젠 C7 (β197)^tox-, 클로람페니콜 (2㎍/㎖)없이 증식시킴; 레인 G: 단일 라이소젠 C7 (β197)^tox-, 클로람페니콜 (2㎍/㎕)과 함께 증식시킴.

본 발명은 디프테리아 독소, CRM197 및 디프테리아 독소 유전자로부터 유래된 기타 CRM 단백질을 백신 또는 상기 단백질들의 적당한 작업가능한 양을 필요로 하는 기타 용도에 사용하기 충분한 양으로 생산하기 위한 새로운 방법 및 플라스미드에 관한 것이다. 플라스미드 시스템은 코리네박테리움 종들에서 디프테리아 독소 유전자 또는 CRM 유전자의 도입 및 그의 복사물 수 증가를 위한 효율적인 수단을 제공한다. 상기 플라스미드는 그 자체의 복제 기능을 갖는 자체의 독립적인 에피좀을 가지므로, 상기 플라스미드는, 상기 합성을 할 수 없거나 파지 β197^tox-에 의해 앞서 감염되지 않은 숙주 균주 내로 디프테리아 독소 또는 CRM 유전자의 과량 복사물을 도입시킬 수 있게 한다. 예컨대, 본 발명의 플라스미드를 포함하는 코리네박테리움 종들에 의해 생산된 CRM197 의 수준은 코리네파지 β197^tox-로써 감염된 시이. 디프테리아의 다수 라이소젠에 의해 발현된 CRM197 단백질의 수율보다 우수하지는 않더라도 그에 필적한다.

본 발명의 높은 수준 생산 플라스미드는 그의 프로모터 및 조절 시그날 서열을 포함하는 디프테리아 독소 또는 CRM 단백질을 코딩하는 유전자; 결과 생성된 플라스미드가 코리네박테리움 종들 내로 도입될 수 있도록 코리네박테리움 복제 개시점; 및 다수 클로닝 부위에 임의로 연결된 선택 가능한 마커로 구성된다. 상기 플라스미드를 사용하여 디프테리아 독소 또는 CRM 유전자의 발현을 촉진시키기에 충분한 조건 하에서 코리네박테리움 종들, 및 특히 코리네박테리움 디프테리아의 미생물들을 형질전환시킨다. 적당한 증식 조건은 숙주 유기체에 따라 당업자에게 용이하게 명백하다. 예컨대, 코리네박테리움 종들로부터 최적의 CRM197, 디프테리아 독소 또는 기타 CRM 단백질 생산을 위해 낮은 철 함유 또는 철 제거 배지에서 미생물을 유지시키는 것이 필수적이다.

상기 플라스미드는 디프테리아 독소 또는 디프테리아 독소 유전자로부터 유래된 CRM 단백질을 코딩하는 유전자를 함유한다. CRM 단백질의 실례, 즉 디프테리아 독소와 면역학적으로 교차 반응성이고 본 발명의 플라스미드 구성물에 사용될 수 있는 교차-반응성 물질의 CRM197, CRM45, CRM30, CRM228 및 CRM176을 포함하나 이에 제한되지 않는다. CRM197 단백질을 코딩하는 유전자는 디프테리아 독소(DT)로부터 유래되며, 이의 서열은 그린필드 일동에 의해 보고되었다 (그린필드, L. 일행, 1983,Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 80: 6853-6857). DT유전자와 CRM197 유전자 사이의 차이는 구조 유전자에서 단일 염기 변화이다. CRM 유전자 중 몇몇에 대한 뉴클레오티드 서열은 우키다, T. 일행에 의해 보고되었다 (J. Biol. Chem.,248: 3838-3844, 1975), 조절 시그날 서열을 포함하는 전체 CRM 유전자는 폴리머 라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 생산될 수 있다. CRM197 유전자 또는 기타 CRM 유전자들을 생산하기 위해 다른 증폭기술 또는 합성 기술도 사용할 수 있다.

디프테리아 독소 및 CRM단백질을 코딩하는 유전자에 대한 조절 시그날 서열은 단백질이 배지 내에 분비되도록 한다. 따라서, 분비된 단백질은 배지로부터 회수 가능하고 염 침강법 및 컬럼 크로마토그래피 같은 공지 기술을 사용하여 정제할 수 있다.

바람직하게 다수 클로닝 부위는 pUC 18로부터 유래되나, 다른 원으로부터 유래된 다수 클로닝 부위, 예컨대 pBluescript 또는 기타 합성 다수 클로닝 부위를 사용할 수 있다. 대안적으로, 다수 클로닝 부위는 플라스미드의 조작능력을 장애하지 않으면서 모두 함께 제거될 수 있다. 어느 경우에든, 선택가능한 마커를 플라스미드 내로 혼입시킨다. 임의 항생제 내성 마커를 선택가능한 마커로서 사용할 수 있으며, 예컨대 앰피실린, 에리트로마이신, 클로람페니콜, 카나마이신을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 먼저, 선택된 항생제에 대한 코리네박터의 감수성을 시험한다. 사람 용도에 상기 발현된 단백질을 사용하고자 한다면 식품 및 약품 관리국이 상기 목적을 위해 클로람페니콜을 허가하였으므로 클로람페니콜이 바람직하다. 항생제 내성 마커에 대한 대안으로서 중금속내성 또는 영양 요구조건과 같은 다른 플라스미드 선택 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 높은 생산량 플라스미드의 구성에 유용한 복제 개시점은 코리네박테리움 종들로부터 유래된 것들이다. pPX 3511의 경우에 선택된 복제 개시점은 코리네박테리움 디프테리아로부터 유래된다. 실시예 부문 참고. 다른 코리네박터 복제 개시점을 사용할 수 있다.

바람직한 실시양태로, CRM197 단백질의 높은 수준 발현은 시이. 디프테리아 C7의 균주를 높은 수준의 CRM197 단백질을 생산하는 균주로 형질전환시킬 수 있는 새로운 재조합 DNA 플라스미드를 사용하여 성취된다. 제1도에 제시된 플라스미드 pPX3511은 디프테리아 독소로부터 유래된 CRM197 유전자를 함유한다 (그린필드, L. 일동, 1983,Proc, Natl. Acad. Sci. USA 80: 6853-6857). 플라스미드의 나머지 부분은 모 플라스미드 pNG2-22 로부터 유래되는데, 이것 내로 CRM197 유전자가 삽입된다.

플라스미드 pPX 3511은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 시이. 디프테리아로부터 CRM197 유전자를 먼저 증폭시키므로써 생산된다. 그 다음 CRM197 유전자를 pNG2 (쉴러, J. 일동, 1980, 항미생물 제제 및 화학요법18: 814-821) 및 pNG2-22(세울드-데이비스, T.M. 일동, 1990.FEM Microbiol, Lett. 66: 119-124)와 같은 선택가능한 마커를 함유하는 시이. 디프테리아 플라스미드 내로 클로닝한다. 상기 플라스미드 둘다는 넓은 숙주 범위를 가지고 있고 이제까지 시험된 모든 코리네형균에서 적은 복사물 수(5-10복사물/세포)로 복제할 수 있다.

모 플라스미드 pNG2는 원래 에리트로마이신 내성 임상 균주로부터 단리된 자연 발생성 시이. 디프테리아 플라스미드이다. pNG2에 대한 복제 개시점은 2.6kb EcoRI-ClaI 단편 상에 함유된다. 상기 복제 개시점은 클로람페니콜 내성 벡터, 명칭 pNG2-22 (세울드-데이비스 일동, 앞의 책) 및 pCM 2.6 (슈미트, 1991,Infect. Immun.59: 1899-1904)을 창출하기 위해 사용되었다.

균주 시이. 디프테리아 C7을 일렉트로포레이션에 의해 결과생성된 pPX 3511 플라스미드로써 형질전환시켜 세균이 파지 β197^tox-의 존재없이 CRM197을 생산할 수 있게 한다. 공지된 물리적 및 화학적 방법들과 같은 다른 형질전환 기술을 사용할 수 있다(세울드-데이비스, 일행, 앞의 책). 또한 pPX 3511에 의한 상기 전자 형질전환 기술은 CRM197 단백질의 생산 수준을 증가시키기 위해 시이. 디프테리아 C7(β197)^tox-단일 라이소젠을 사용하여 수행된다. 형질전환체에 의해 발현된 CRM197 단백질의 수준은 단일 라이소젠 시이. 디프테리아 C7(β197)^tox-ATCC No. 5328 및 pPX 3511 플라스미드를 포함하지 않는 이중 라이소젠 시이. 디프테리아 C7 (β197)^tox-M1, ATCC No. 39255 로부터의 발현 수준에 필적한다. 시이. 디프테리아 C7균주 내로 플라스미드 pPX 3511을 트랜스펙팅시킬 때, 이 형질전환체가 시이. 디프테리아 이중 라이소젠 균주와 동등한 수준으로 CRM197을 발현할 수 있음이 관찰된다.

본 발명의 다른 실시양태로, 새로운 플라스미드 벡터를 변형시켜 다양한 능력을 갖는 일련의 플라스미드 벡터를 창출한다. 예컨대, 부위 조작(Site directed) 돌연변이유발을 사용하여 새로운 플라스미드가 디프테리아 독소를 발현하도록 CRM197 내에 단일 염기 변화를 복구할 수 있다. 클로닝된 CRM197 유전자 서열이 다른 공지된 디프테리아 독소 CRM 단백질, 예컨대 CRM45, CRM30, CRM228 및 CRM176을 발현하도록 다른 변화를 만들 수 있다 (우키다, T. 일동, 1973,J. Biol. Chem. 248: 3838-3844).

재조합 DNA 기술을 사용하여 CRM197의 디프테리아 독소 조절 또는 처리 서열, 또는 다른 유사하게 클로닝된 디프테리아 독소 또는 CRM 유전자에 대해 만들어진 변화를 사용하여 상기 단백질의 생산을 더더욱 증가시킬 수 있다. 예컨대, tox 프로모터 영역을 변형시켜 철 조절로 프로모터를 제거할 수 있다.

또 다른 실시양태로, 플라스미드 벡터 시스템을 변형시켜 CRM197 유전자 또는 유사하게 클로닝된 디프테리아 독소 또는 CRM 유전자의 아미노 말단내로 제한 효소 클로닝 부위를 도입시킬 수 있다. 다른 단백질로부터의 DNA 서열의 클로닝부위 내로의 클로닝은 모두 tox 프로모터 및 시그날 서열의 지휘 하에 플라스미드 벡터가 CRM197 단백질 또는 유사하게 클로닝된 디프테리아 독소 또는 CRM 독소와의 아미노 말단 융합체로서 다른 재조합 단백질 또는 항원을 공발현하도록 허용할 것이다. 게다가, 또는 대안적으로, 클로닝 부위를 CRM197, 디프테리아 독소 또는 유사하게 클로닝된 CRM의 카르복시 말단 부분내로 삽입시켜 카르복시 말단 융합체로서 다른 단백질을 발현할 수 있다. CRM197 조절 시그날 서열의 존재로 인하여, 결과생성된 융합 단백질은 배양 배지내로 분비될 것이다. 대안적으로, CRM197의 조절시그날 서열만이 배양 배지내로 다른 단백질의 분비형태를 발현시키기 위한 수단으로 사용되어야 한다.

본 발명의 생산 플라스미드에 유용한 적합한 단백질 및 항원은 세균, 비루스, 기생균 또는 곰팡이로부터 유래된 것들과 같은 미립자 항원, 및 단백질, 펩티드, 호르몬 및 당단백질과 같은 세포 및 용해성 항원 및 세포의 미세성분들을 포함한다. 특히 관심있는 항원은 비루스의, 곰팡이의, 기생균 또는 세균의 항원, 알레르겐, 자동면역성 관련 항원, 또는 암-결합 항원이다. 상기 항원들은 천연 원천으로부터 얻을 수 있거나 재조합 DNA 기술에 의해 또는 기타 인위적 수단에 의해 생산될 수 있다.

관심있는 세균 항원 중 하나는 사람 세균성 병원균과 관련된 것이며, 이는 예컨대 대표적인 및 대표적이지 않은 헤모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae), 에쉬리키아 콜라이 (Escherichia coli), 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 퓨게네스 (Streptococcus pyogenes), 브란하멜마 카타르하리스 (Branhamella catarrhalis), 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae), 네이세리아 고노르호에 (Neisseria gonorrhoesae), 보르데델라 퍼투시스 (Bordetella pertussis), 슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 크렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae) 및 클로스트리듐 테타니 (Clostridium tetani)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 몇몇 특이적 세균 항원은 세균 표면 및 외부막 단백질 (예컨대, 헤모필루스 인플루엔자, 네이세리아 메닌키티디스, 네이세리아 고노르호에 또는 브란하멜라 카타르하리스로부터) 및 세균 표면 단백질(예컨대 스트렙토코커스 퓨게네스로부터의 M 단백질 또는 스트렙토코커스 뉴모니아로부터의 37 킬로달톤 표면 단백질)을 포함한다.

병원성 비루스로부터의 비루스 항원은 사람 면역결함 비루스 (Ⅰ 및 Ⅱ 형), 사람 T-세포 백혈병 비루스 (Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ 형), 호흡기 합포체 비루스, A형 간염, B형 간염, C형 간염, 비-A형 및 비-B형 간염 비루스, 단순포진 비루스 (Ⅰ 및 Ⅱ형) 사이토메갈로비루스, 인플루엔자 비루스, 파라인플루엔자 비루스, 폴리오비루스, 로타비루스, 코로나비루스, 루벨라비루스, 마진 비루스, 수두, 엡스타인 바르비루스, 아데노비루스, 유두종 비루스 및 황열비루스를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

상기 병원성 비루스의 몇몇 특이적 비루스 항원은 호흡기 합포체 비루스(RSV)의 F 단백질 (특히 파라디소, P. 일동에 의해 "호흡기 합포체 비루스: 백신 및 진단 검정법"으로 표제된 WO89/02935에 서술된 F 펩티드 283-315을 함유하는 항원) 및 N 및 G 항원, 로타비루스의 VP4 (이전에 VP3로 공지되었음), VP6 및 VP7 플리펩티드, 사람 면역결함 비루스의 엔벨로프 당단백질, B형 간염의 표면 및 프리서피스 항원 및 포진 당단백질 B 및 D를 포함한다.

곰팡이 항원은 칸디다속 종들 (특히 알비칸스 (albicans)), 크립토코커스속종들 (특히 네오포르만스 (neoformans), 블라스토마이세스 (Blastomyces)속 종들(예컨대, 데르마티티디스 (dermatitidis)), 히스토플라스마 (Histoplasma)속 종들(특히 캡슬라튬 (capsulatum)), 코시드로이드 (Coccidroides)속 종들 (특히 임미티스 (immitis), 파라코시드로이드 (Paracoccidroides)속 종들 (특히 브라실리엔시스(brasiliensis)) 및 아스퍼질러스 (Aspergillus)속 종들을 포함하나 이에 제한되지 않는 곰팡이로부터 유래된 것들일 수 있다. 기생균 항원의 실례는 프라스모듐속종들, 에이머리아 (Eimeria)속 종들, 시스토소마 (Schistosoma)속 종들, 트리파노소마 (Trypanosoma)속 종들, 바베시아 (Babesia)속 종들, 레이시마니아(Leishmanmia)속 종들, 크립토스포리디아 (Cryptosporidia)속 종들, 톡소플라스마(Toxoplasma)속 종들 뉴모시스티스 (Pneumocystis)속 종들을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 하기 비제한적인 실례에 의해 부가적으로 예시될 것이다:

실시예 1 : 구성물

세균 균주

모든 클로닝 절차에 이. 콜라이 DH5α (BRL, Galthersburg, MD)을 사용한다. 비독소원성, 비용원성 시이. 디프테리아 C7(-)^tox-, 비독소원성, 단일 라이소젠 시이. 디프테리아 C7 (β197)^tox-ATCC No. 5328의 균주들을 CRM197 단백질 발현 연구에서 플라스미드 숙주 및 대조표준 둘다로 사용한다. 비독소원성, 이중 라이소젠 시이. 디프테리아 C7(β197)^tox-ATCC No. 39255를 CRM197 단백질 발현 실험에서 대조표준으로 사용한다.

배양 배지 및 조건

이. 콜라이 DH5α를 37℃에서 슈러 옵티멀 브로쓰(SOB) 한천 배지 및 SOB 액에서 일상적으로 증식시킨다 (Sambrook, J. 일동, 1989. 분자 클로닝: 연구소 매뉴얼 뉴욕주 콜드 스프링 하버시 콜드 스프링 하버 연구소 출판부). 시이. 디프테리아 C7 균주를 SOC 한천 및 액체 상에서 통상적으로 배양한다 (Sambrook, J. 일행, 앞의책). 일렉트로포레이션된(electroporated) 세포를 도포시킬 때 ET 삼투 한천 배지 (Best, G. R. 및 M.L. Britz, 1986,Appl. Microbiol. Biotech,23: 288-293)를 사용한다. CRM197의 발현을 수반하는 실험을 위해 철제거된 CY 배지(Rappuoli, R. 일동, 1983, J. Bacteriol, 153 : 1202)를 사용한다. 클로람페니콜을 이. 콜라 이 DH5α 의 경우에 34 ㎍/ml 및 플라스미드 pPX 3511을 함유하는 시이. 디프테리아 C7 균주의 경우에 2㎍/ml 첨가한다.

CRM197 유전자의 클로닝

CRM197 유전자를 디프테리아 독소의 공개된 서열에 기초하여 올리고 뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 시이. 디프테리아 C7 (β107)^tox-단일 라이소젠 DNA로 부터 유전자 서열의 PCR (폴리머라제 연쇄 반응) 증폭에 의해 클로닝한다 (Greenfield, L. 일동, 1983,Proc. natl, Acad, Sci. USA 80: 6853-6857). 한 프라이머가 기능 유전자의 시작부에 SalI/HincII 제한 부위를 창출하고 나머지가 구조 유전자의 유전자 정지 코돈 뒤에 XbaI 부위를 창출하도록 프라이머들을 고안한다. 상기의 또는 유사한 프라이머를 사용하여 CRM197 유전자, 디프테리아 독소 유전자 또는 코리네파지 β에 의해 코딩된 디프테리아 독소 유전자와 유사한 임의 CRM 유전자를 증폭하고 클로닝시킨다.

CRM197 PCR 생성물을 HincII 및 XbaI 로써 소화시키고 에쉬리키아 콜라이 및 코리네바게리움 종들 둘다에서 복제하는 능력을 갖는 넓은 숙주 범위 클로람페니콜 내성벡터인 SmaI/XbaI 소화된 pNG2-22 내로 결찰시킨다. 이 결찰물을 사용하여 이. 콜라이 DH5α를 형질 전환시키고 재조합 콜로니를 CRM197 유전자의 존재에 대한 제한 분석에 의해 스크리닝한다, 단 단리물, pPX3511을 CRM197 유전자에 대한 임의 변화를 조사하기 위해 중첩 프라이머를 사용하여 서열화한다. PCR 및 서열화 에 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머들은 어플라이드 바이오시스템스 308B DNA 합성기 상에서 합성한다. PCR은 퍼킨-엘머 세투스 DNA 써멀 시클러로써 수행한다. 서열화는 어플라이드 바이오시스템스 시퀀서 373A를 사용하여 수행한다. 결과의 플라스미드(pPX 3511)를 일렉트로포레이션에 의해 비독소원성, 비-용원성 균주 시이. 디프테리아 C7(-)^tox-및 비독소원성 균주 시이. 디프테리아 C7 (β197)^tox-, ATCC No. 5328에로 전이시킨다.

시이. 디프테리아 C7의 일렉트로포레이션

0.2% 트윈 -80으로써 보충된 SOC 배지를 사용하는 것을 제외하고 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corymebacterium glutamicum) 및 브레미박테리움 락토퍼멘튬(Breibacterium lactofermentum)의 형질도입을 위해 개발된 프로토콜을 사용하여 시이. 디프테리아 C7을 일렉트로포레이션에 의해 플라스미드 pPX 3511로써 형질전환시킨다 (Hayes, J. A. 및 M.L. Britz, 1989, FEMS Microbiol lett 61: 329-334). 일렉트로포레이션을 위해 파워 플러스 및 옵티마이저 그래픽 펄스 어낼라이저를 갖는 BTX 트랜스펙터 및 1mm 갭 쿠베트를 사용한다. 형질전환 시이. 디프테리아 C7균주내 플라스미드 pPX 3511의 존재는 플라스미드 레스큐 및 제한 분석에 의해 조사한다.

실시예 2: 발현

정량 CRM ¹⁹⁷ 발현 연구

CRM197 생산의 비교는 유사한 조건하에 시이. 디프테리아 C7의 균주 증식 및 배양 상등물내 CM197 양의 비교에 의해 이루어진다. 균주들의 정량 비교에서, 4ml 밤샘 배양물을 철제거된 CY 배지내에 OD₆₈₀=0.1로 희석시키고 (250 ml 엘렌메이어 플라스크내 30mL 최종 부피) 37℃에서 20시간 동안 진탕시키면서 증식시킨다. pPX3511을 함유하는 균주를 항생제 선택성 (2㎍/ml 클로람페니콜) 있게 및 없이 증식시킨다. 인큐베이션 후에, 그 다음 배양물을 원심분리시켜 세포를 제거하고 20㎕의 배양 상등물을 12% SDS-PAGE 겔 상에 주행시킨다. 겔을 코마시에 염색하고 헤퍼 공학용 GS 370 분석 패키지를 갖는 바이오-라드 모델 1650 투과도/반사도 스캐닝 덴시토미터를 사용하여 비교한다. 재조합 CRM197 단백질 및 용원성 β197^tox-CRM197 단백질의 항원 성질 비교는 겔을 면역블로팅하고 모노클로날 항체로써 CRM197을 탐침하므로써 이루어진다. pPX 3511에 의해 생성된 CRM197은 용원성 균주에 의해 생산된 CRM197과 동일하다.

플라스미드 pPX 3511 안정성 실험

플라스미드 pPX 3511의 안정성은 항생제 선택성없이 플라스미드 보유의 지시물로서 클로람페니콜 내성의 유지를 사용하므로써 연구한다. 시이. 디프테리아 C7(β197)^tox-pPX 3511의 배양물을 37℃에서 18시간동안 (14-17 세대) 세포 응집을 방지하기 위해 0.1% 트윈-80으로 보충된 SOC 브로쓰에서 증식시킨다. 그 다음 배양물을 콜로니 계수를 위해 SOC 한천상에 도포시키고 다음 세대를 위해 1/10로 희석시킨다. SOC 한천 평판을 SOC 한천 2 ㎍/ml 클로람페니콜 상에 레플리카-도포시키고 클로람페니콜 내성을 유지하는 콜로니의 퍼센트를 계산한다. 상기 방법을 60 세대 반복한다.

실시예 3: 생물학적 결과

코마시에 염색된 겔의 밀도분석법에 의해 상이한 시이. 디프테리아 C7 균주로부터 CRM197 생산의 정량비교 (제2도)는, pPX 3511을 갖는 균주가 단일 라이소젠의 약 2배만큼 많은 CRM197 및 이중 라이소젠 만큼의 CRM 197을 창출함을 보인다 (표 1). 60 세대를 능가하는 플라스미드 pPX 3511의 안정성이 제3도에 제시된다.

표 1

단일 라이소젠(β197)^tox-보다 큰 배수로 발현되는 시이. 디프테리아 C7 균주에 의한 CRM 197의 생산

생물학적 기탁

플라스미드 pPX 3511은 1993년 2월 12일에 메릴랜드주 20852 록빌시 파크론드라이브 12301에 소재하는 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 부다페스트 조약의 협정하에 기탁되었고 ATCC 수탁 번호 75415를 받았다. 상기 기탁물의 대중에 대한 구입가능성에 대한 모든 제한은 본 출원에 대한 특허의 허여시에 결정적으로 제거될 것이다. 기탁물은 수탁일로부터 최소한 30년간 및 가장최근의 상기 생물체의 시료 제공 청구일 후 5년간 어느쪽이든 더 긴 기간동안 공공기탁기관에 유지될 것이다. 기탁물이 생존가능하지 않거나 복제가능하지 않게 되면 대체될 것이다.

당업자들은 본원에 특별히 서술된 본 발명의 특정 실시양태에 대한 많은 동등물을 인지하거나 단지 일상적인 실험을 사용하여 확인할 수 있다. 상기 동등물을 하기 청구 범위의 영역에 망라시키고자 한다.

제1도는 재조합 DNA 플라스미드, 명칭 pPX3511 이다.

제2도는 시이. 디프테리아(C. diphtheriae) C7의 상이한 균주로부터 CRM197(61.8 킬로달톤)의 생산을 나타내는 12% SDS-PAGE 겔이다.

제3도는 항생제 선택성이 없이 플라스미드 보유의 지시물로서 클로람페니콜내성을 사용하여 시이. 디프테리아 C7 (β 197)^tox-내 플라스미드 pPX3511의 안정성을 나타낸다.

Claims

a) 디프테리아 독소 또는 CRM단백질을 코딩하는 유전자; b) 코리네박테리움(Corynebacterium) 복제 개시점; 및 c) 선택가능한 마커를 함유하는 플라스미드로써 코리네박테리움 종들의 미생물을 형질전환시키고, 미생물이 유전자를 발현하기에 충분한 조건하에서 상기 독소 또는 단백질을 발현시키는 것으로 이루어지는 디프테리아 독소와 교차 반응성인 CRM단백질 또는 디프테리아 독소의 생산 방법.
제1항에 있어서, 형질전환 방법이 일렉트로포레이션에 의한 방법.
제1항에 있어서, 미생물이 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae)인 방법.
제3항에 있어서, 코리네박테리움 디프테리아의 균주가 C7 균주인 방법.
제1항에 있어서, CRM 유전자는 CRM197, CRM45, CRM30, CRM228 및 CRM176으로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
제1항에 있어서, 복제 개시점이 코리네박테리움 플라스미드 pNG2로부터 유래된 방법.
ATCC 수탁번호 75415인 플라스미드 pPX 3511.
제7항의 플라스미드로써 형질전환된 코리네박테리움 종들의 미생물.