HUT71320A - Novel plasmid for production of crm protein and diphtheria toxin - Google Patents
Novel plasmid for production of crm protein and diphtheria toxin Download PDFInfo
- Publication number
- HUT71320A HUT71320A HU9400657A HU9400657A HUT71320A HU T71320 A HUT71320 A HU T71320A HU 9400657 A HU9400657 A HU 9400657A HU 9400657 A HU9400657 A HU 9400657A HU T71320 A HUT71320 A HU T71320A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- plasmid
- diphtheria toxin
- gene
- crm197
- protein
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
A találmány uj, CRM protein és diftériatoxin termelésére alkalmas plazmidokra, valamint ezek alkalmazásával diftériatoxin és CRM proteinek előállítására vonatkozik.
A CRM197 protein a diftériatoxin nem-toxikus formája, de attól immunologiailag nem megkülönböztethető. A CRM197 protein a nem-toxikus B197^OX“ fággal fertőzött C.diphtheriae-ben termelődik, amely fágot a toxigén corinefág β nitrozoguanidin mutagenézisével nyernek (Uchida,T. és munkatársai, 1971, Natúré New Biology, 233, 8-11). A CRM protein molekulatömege azonos a diftériatoxinéval, csak a szerkezeti génben egyetlen bázissal különbözik tőle, a guanin helyett adenint tartalmaz. Ez az egyetlen báziscsere az érett proteinben aminosav-szubsztituciót okoz (glicin helyett glutaminsav) és eliminálja a diftériatoxin toxikus tulajdonságát. A CRM197 protein egy biztonságos és hatásos T-sejt függő hordozó a szacharidok számára és jelenleg a Haemophilus influenzáé tip.b oligoszacharid CRM197 konjugátum vakcinában használják (HibTiter™; Lederle Praxis Biologicals, Rochester,Ν.Y.)
Jelentős mennyiségű CRM197 protein előállítását a vakcinákhoz való felhasználásra a protein kis mennyisége gátolja. Kifejlesztettek módszereket a CRM proteinek termelésének fokozására, a nem-toxikus korinefág B197 kettős lizogénjeinek (Rappuoli, R.,1983, Applied Env.Microbio.46,560-564;
USP 4 925 792; Rappuoli,R., 1983, J.Bacteriol., 153,1202-1210) alkalmazásával. Rappuoli közleménye szerint a kettős lizogén alkalmazásával akár háromszor nagyobb kitermelést is el lehet érni, mint a szingli lizogénekkel.A szingli lizogénekkel termelt CRM197 proteinek szintje kielégítő, de gazdaságilag nem megfelelő a CRM197 proteineket felhasználó vakcinák előállításához .
A korinefág β több lizogénjének bevitele a Corynebacterium diphtheriae törzsbe igen munkaigényes szkrinelő művelet, hogy kiválaszthatók legyenenek azon törzsek, amelyek nagy mennyiségben képesek a diftériatoxinnal keresztreakcióba lépő CRM197 protein, a diftériatoxin vagy más CRM proteinek termelésére. Továbbá ez az eljárás lehetőségeiben korlátozott, hogy csak rekombináns technikát alkalmazó protein expressziót végez. Szükséges ezért olyan eljárás kifejlesztése, amely képes jelentős mennyiségű diftériatoxin és CRM proteinek előállítására a gén kópia számának növelésére korinefág β alkalmazása nélkül; vagy úgy, hogy növeli ezen proteinek termelődését a korinefág β-ra lizogén törzsekből.
A találmány uj eljárásra és plazmidredszerre vonatkozik, amely alkalmas a diftériatoxin génből származtatott CRM197 proteint, a diftériatoxint és más CRM proteint kodoló gén manipulálására és bevezetésére, vonatkozik továbbá az ezzel transzformált mikroorganizmusokra. Egy különösen előnyös DNS plazmid, amelyet pPX 3511-ként jelölünk, az amely egyesíti a nem-toxikus betafág CRM197 proteinjének génjét és a pNG2-22 plazmidot. Az új plazmidrendszer képes a Corynebacterium diphtheriae törzsek olyan törzsekké való transzformálására, amelyek nagy mennyiségben expresszálják a CRM197 proteint több lizogén alkalmazása nélkül. A találmány szerinti megoldás egy elegáns eszköz a diftériatoxin génből származtatott CRM197 proteinek, diftériatoxin és más CRM proteinek expressziójának növelésére.
A gén expresszió továbbá manipulálható a promoter-erősség nőve• · • ♦·· · ··· • · · · · «·
- 4 lésével vagy a promoternek a vas-szabályozásból való eltávolításával. Egy előnyös kiviteli formánál a plazmidrendszer alkalmazható más, a CRM197 proteinnel, diftériatoxinnal vagy más CRM proteinnel genetikai fúzióban lévő proteinek expresszálására. A CRM197 proteinben, a diftériatoxinban vagy más, a diftériatoxin génből származtatott CRM proteinben található szabályozó és termelő (processing) szekvenciák alkalmazhatók idegen proteinek expresszálására Corynebacterium fajokban.
Az 1. ábrán bemutatjuk a pPX 3511 jelű rekombináns DNS plazmidot, amely tartalmazza a CRM197 génjét, az E.coliból származtatott pUC 18 klonozó vektort, amely tartalmazza a kloramfenikol rezisztencia (CmR) markert és a pNG2-22-ből származtatott replikációs origint (Serwold-Davis,T.M. és mtársai,1990, FÉM Microbiol.Lett., 66,119-124).
A 2. ábrán bemutatjuk a 12%-os SDS-PAGE gélt, amelyen láthatók a különböző C.diphtheriae C7 törzsekből termelt CRM197 proteinek (61,8 kdalton). Sáv A: nagy molekulatömegű standardok (BRL,200-14,3 kdalton); Sáv B: szingli lizogén Cl (B197)tox-. Sáv C: kettős lizogén C7(B197)tox-;
Sáv D: nem-lizogén C7(-)tox“ pPX 3511-gyel, klór-amfenikol (Cm2)(2μg/ml) nélkül tenyésztve; Sáv E: nem-lizogén C7(-)tox“ pPX 3511-gyel, klór-amfenikollal (2Mg/ml) tenyésztve; Sáv F: szingli lizogén C7(B197)tox“ pPX 3511-gyel klór-amfenikol nélkül (2Mg/ml) tenyésztve; Sáv G: szingli lizogén (C7(B197)t°x~ klór-amfenikollal ( 2Mg/ml) tenyésztve.
A 3. ábrán bemutatjuk a pPX 3511 stabilitását
C.diphtheriae C7(B197)tox- törzsben klór-amfenikol rezisztencia mint plazmid retenció indikátor felhasználásával, antibiotikus • · · · · • ··· · ··« • · · · · • · ·« · ·« szelekció nélkül.
A találmány új eljárásra és plazmidrendszerrre vonatkozik, amely alkalmas diftériatoxin, CRM197 és más a diftériatoxin génből származtatott proteinek előállítására olyan mennyiségben, amely elegendő vakcinákban való felhasználásra vagy más olyan helyeken, ahol ezen proteinek feldolgozható mennyisége szükséges. A plazmidrendszer hatásos eszköz a diftériatoxin gén vagy CRM gén Corynebacterium spp-be való bevezetésére és a kopiaszám növelésére. A plazmid saját független episzómával rendelkezik, amelynek saját replikációs funkciói vannak és így lehetővé teszi, hogy a plazmiddal extra kopiaszámú diftériatoxin vagy CRM gént vezessünk be a gazdatörzsekbe, amelyek nem képesek ilyen integrációra vagy amelyek előzőleg nem lettek B197^OX_ fággal megfertőzve. így például a találmány szerinti plazmidot magában foglaló Corynebacterium fajok által termelt CRM197 protein mennyisége összemérhető, ha nem több, mint a B197tox- korinefággal fertőzött C.diphtheriae több lizogénje által expresszált CRM197 protein mennyisége.
A nagy mennyiségű proteinek termelésére képes találmány szerinti plazmidok a következőket tartalmazzák : a diftériatoxint vagy CRM proteint kodoló gént , amely a promoterét és a szabályozó szignálszekvenciáját is tartalmazza; a Corynebacterium replikációs originjét, úgy, hogy a kapott plazmid Corynebacterium spp.-be bevezethető; és egy szelektálható markert, amely adott esetben a többszörös klonozóhelyhez van kapcsolva. Ezt a plazmidot alkalmazzuk a Corynebacterium fajhoz tartozó mikroorganizmusok és különösen a Corynebacterium diphtheriae transzformálására olyan körülmények között, amelyek lehetővé • 4
- 6 teszik a diftériatoxin vagy CRM gén expresszálódását. A tenyésztés megfelelő körülményei a szakember számára nyilvánvalóak a gazdaorganizmustól függően. így például az optimális CRM197 vagy diftériatoxin vagy más CRM protein termelés érdekében szükséges, hogy a Corynebacterium spp. mikroorganizmust kis vastartalmú vagy késleltetett (deferated) közegben tartsuk.
A plazmid tartalmaz egy a diftériatoxin génből származtatott, a diftériatoxint vagy a CRM proteint kodoló gént. CRM proteinként, azaz kersztreakcióra képes anyagként, amely immunológiailag keresztreakcióra képes a diftériatoxinnal és amely felhasználható a találmány szerinti plazmid megkonstruálásához, a korlátozás szándéka nélkül, alkalmazhatjuk például a következőket: CRM45, CRM30, CRM228 vagy CRM176. A CRM197 proteint kodoló gént a diftériatoxinból (DT) származtatjuk, amelynek szekvenciáját Greenffield és mtársai írták le (Greenffield és mtársai 1983, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 80,6853-6857). A DT gén és a CRM197 gén közötti egyetlen különbség egy báziscsere a szerkezeti génben. A CRM gének közül néhánynak a nukleotidszekvenciáját Uchida és mtársai ismertették ( Uchida és mtársai, J. Biol.Chem., 248, 3838-3844, 1975). A teljes CRM gént, amely a szabályozó szekvenciáját is tartalmazza, polimeráz láncreakcióval (PCR) állíthatjuk elő. Más amplifikációs vagy szintetikus módszerek alkalmazhatók a CRM197 gén vagy más CRM gének előállításához.
A diftériatoxint és a CRM proteint kodoló génen lévő szabályozó szignálszekvencia lehetővé teszi, hogy a protein a közegbe kiváljon. így a kivált protein a közegbeől kinyerhető, és ismert eljárásokkal, így például sókicsapással és oszlopkomato• « • · ·♦ · ··· • · · · « · • · · · · · ·
- 7 gráfiával tisztítható,
A többszörös klonozó helyet előnyösen a pUC 18 plazmidból származtatjuk, de más egyéb forrásból, így például pBluescriptból származtatott klonozó helyek vagy más szintetikus többszörös klonozó helyek is alkalmazhatók. Más módszernél a többszörös klonozó hely mind eliminálható anélkül, hogy a plazmid működőképessége károsodna.Mindegyik esetben a plazmidba egy szelektálható marker gén van beépítve. Szelektálható marker génként bármilyen antibiotikus rezisztencia marker alkalmazható, így például a korlátozás szándéka nélkül említjük a következőket: amficilin, eritromicin, kloramfenikol, kanamicin. Először a corinebakterium érzékenységét teszteljük a kiválasztott antibiotikummal szemben. Előnyösen kloramfenikolt alkalmazunk, ha az expresszált proteint humán felhasználásra szánjuk, mivel a kloramfenikolt ilyen célokra a Food and Drug Administration már elfogadta. Más plazmid-szelekciós módszerk, így például nehézfém-reszisztencia vagy táplálkozási követelmény is alkalmazható az antibiotikus reszisztencia markerek helyett.
A találmány szerinti nagy termelésű plazmidok megalkotásához alkalmas replikációs origint előnyösen például a Corynebacterium spp.-ből származtatjuk. A pPX3511 plazmidhoz választott replikációs origint a Corynebacterium diphtheriae törzsből származtatjuk (lásd a példákat). Más corynebakterium replikációs originek is alkalmazhatók.
Egy előnyös kiviteli módnál a CRM197 protein nagy mennyiségű expresszióját érjük el az új, pPX 3511-ként jelölt DNS rekombináns plazmid alkalmazásával, amely képes a C.diphtheriae • · · · ·· «··· • ♦ ·
- 8 C7 törzsek olyan törzsekké való transzformálására, amelyek nagy mennyiségű CRM197 proteint termelnek. Az 1. ábrán bemutatott pPX3511 plazmid a diftériatoxinból származatott CRM197 gént tartalmazza (Greenffield és mtársai 1983, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 80,6853-6857).A plazmid megmaradó része a pNG2-22 anya-plazmidból származik, amelybe a CRM197 gén van inszertálva.
A pPX 3511 plazmidot úgy állítjuk elő, hogy először a CRM197 gént a C.diphtheriae-ból amplifikáljuk polimeráz láncreakcióval (PCR).A CRM197 gént ezután a C.diphtheriae plazmidba klonozzuk, amely szelektálható markert, így például pNG2-t (Schiller és mtársai, 1980, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 18, 814-821) és pNG2-22-t (Serwold-Davis,T.M. és mtársai,1990,FÉM Microbiol.Lett. 66, 119-124) tartalmaz. Mindkét plazmid széles gazda-sávval rendelkezik és képesek alacsony kópiaszámmal (5-10 kópia/sejt) replikálódni minden eddig vizsgált coryneformában.
A pNG2 anya-plazmid természetben előforduló C.diphtheriae plazmid, amelyet eredetileg eritromicin-rezisztens klinikai törzsekből izoláltak. A pNG2 replikációs originje a 2,6kb EcoRI-Clal fragmensen található. Ezt a replikációs origint alkalmazzuk a pNG2-22 jelű klóramfenikol rezisztencia vektor (1. fenti Serwold-Davis hivatkozás) és a pCM 2,6 (Schmidt, 1991, Infect.Immun.,59,1899-1904) megalkotásához.
Az így nyert pPX 3511 plazmiddal ezután a C.diphtheriae C7 törzset elektroporációval transzformáljuk és így lehetővé tesszük, hogy baktérium CRM197 proteint termeljen B197tox~ fág jelenléte nélkül. Más transzformációs módszerek, így például ···· ·· ···· ·· • · · · · · ··« · ...
• · · · · · • · · · · · · ismert fizikai és kémiai módszerek szintén alkalmazhatók (1.
pl. fenti Serwold-Davis hivatkozás). Ezt a pPX 3511 plazmid alkalmazásával végzett elektrotranszformációs módszert elvégezzük C.diphtheriae C7 (6197)tox“ szingli lizogén alkalmazásával is a CRM197 mennyiségének növelésére. A transzformások által expresszált CRM197 protein mennyiségét összehasonlítjuk a szingli lizogén C.Diphtheriae C7(6197)tox_ ATCC No.5328 és a kettős lizogén C.diphtheriae C7(6197)toxMl, ATCC No.39255 amely nem foglalja magában a pPX 3511 plazmidot - által expresszált CRM197 protein mennyiségével .Megfigyeltük, hogy ha a pPX 3511 plazmidot a C.diphtheriae C7 törzsbe transzferáljuk, a transzformánsok képesek olyan mennyiségű CRM197 proteint expresszálni, amely azonos a C.diphtheriae kettős lizogén törzsekkel nyert mennyiséggel.
A találmány egy másik kiviteli formájánál az új plazmidot módosítjuk, hogy különböző képességű plazmid vektorokat nyerjünk. így például hely-specifikus mutagenézist alkalmazhatunk az egyetlen báziscsere helyreállítására a CRM197 proteinben, így az új plazmid expresszálná a diftériatoxint. Más változtatások is elvégezhetők a klonozott CRM197 gén szekvenciájában, hogy más diftériatoxin CRM proteint,így például a CRM45, CRM30, CRM228 vagy CRM176 proteineket expresszáljón ( Uchida és mtársai, J.Biol.Chem., 248, 3838-3844, 1973).
Rekombináns technika alkalmazásával más változtatások is elvégezhetők a CRM197 diftériatoxin szabályozó és termelő szekvenciájában ezen proteinek termelődésének további fokozása érdekében. így például a tox promoter szakaszt módosíthatjuk úgy, hogy a promoter mentes legyen vas-szabályozástól.
• ··· · ·«· • · · · « · ·· ·· · *·
Egy másik kiviteli formánál a plazmid vektor rendszert módosíthatjuk, a restrikciós enzim kodolóhely bevezetésére a CRM197 gén vagy hasonlóan kodolt diftériatoxin vagy CRM gén amino-terminusába. Más proteinekből származó DNS szekvenciáknak a klonozó helyekbe történő klonozása így megengedné, hogy a plazmid vektor ko-expresszáljón más rekombináns proteineket és antigéneket a CRM197 protein vagy hasonlóan kodolt diftériatoxin vagy CRM protein - amelyek mindegyike a tox promoter és szignál szekvencia irányítása alatt áll - amino-terminusán való fúziókkal. Továbbá, vagy más esetben a klonozó helyek beilleszthetők a CRM197, a diftériatoxin vagy más hasonlóan kodolt CRM protein karboxi-terminális részébe is más proteinek karboxi-terminális fúziókkal való expresszálására. A CRM197 szabályozó szekvencia jelenlétének köszönhetően a kapott fúziós protein a tenyészközegbe szekretálódik. Más esetben, csak a CRM197 szabályozó szignál szekvenciáját szükséges eszközként használni más proteinek tenyészközegbe szekretálodó formáinak expresszálására.
A találmány szerinti plazmidok előállítására alkalmas proteinek és antigének közé tartoznak például a szemcsés antigénekből, például baktériumokból,vírusokból, parazitákból vagy gombákból és sejtek és oldható antigének mikrokomponenseiből, így proteinekből, peptidekből, hormonokból és glükoproteinekből származó antigének. Különösen előnyösek a virális erdetű, gombákból, parazitákból vagy baktériumokból eredeő antigének, allergének, autoimmunitással vagy tumorokkal kapcsolatos antigének. Az antigének nyerhetők természetes forrásokból vagy előállíthatok rekombináns DNS technológiával vagy más • ·· • · · · · · ·· ·· · «♦
- 11 mesterséges utón is.
A felhasználható bakteriális antigének közé tartoznak a humán bakteriális patogénekkel kapcsolatos antigének, amelyek a korlátozás szándéka nélkül lehetnek például a következők: típusos vagy atipusos Haemophilus influenzáé, Escherichia coli, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneuomoniae, Streptococcus pyogenes, Branhamella catarrhalis, Vibrio cholerae, Neisseria gonorrhoeae, Bordetella pertussis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae és Clostridium tetani. Bizonoy specifikus bakteriális antigének tartalmaznak bakteriális felület és külső memebrán proteineket is (pl.Haemophilus influenzáé,Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae vagy Branhamella catarrhalis ) és bakteriális felületi proteineket (pl. a Streptococcus pyogenes M proteinje vagy a Streptococcus pneuomoniae 37 kdaltonos felüketi proteinje).
A patogén vírusokból származó virális antigének közé tartoznak a korlátozás szándéka pl. a következők: humán immunhiány vírus (I ésll típusok), humán T-sejt leukémia vírus I,II és III típusok), légzési syncytialis vírus, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, nem-A és nem-B hepatitis vírus, herpes simplex vírus ( I ésll tipusosk), citomegalovírus, influenza vírus, parainfluenza vírus, poliovírus, rotavírus, koronavírus, rubeola vírus, kanyaró vírus, bárányhimlő vírus, Epstein Barr vírus, adenovírus, papilloma vírus és sárgaláz vírus.
Ezen patogén vírusok közül néhány specifikus virális antigén tartalmazza a légzési syncytiális vírus ( RSV) F proteinjét (különösen F 283-315 pepiidet tartalmazó antigéneket • ·· • · «
11« ····«> · ·· ·· 4 «·
- 12 ismertetnek a W089/02935 számú, Respiratory Syncytial Vírus : Vaccines and Diagnostic Assays c. publikált szabadalmi bejelentésben) , N és G proteinjeit, a rotavírus VP4 (korábban VP3ként ismert), VP6 és VP7 polipeptidjeit, a humán immunhiány vírus burkoló glükoproteinjeit és a hepatitis prefelületi antigénjeit és a herpes B és D glükoproteineket.
Fungalis antigének származtathatók például a következő gombákból : Candida spp.( különösen albicans), Cryptococcus spp. ( különösen neoformans), Blastomyces spp. ( pl. dermatitidis), Histoplasma spp. (különösen capsulatum), Coccidroides spp. ( különösen immitis), Paracoccidroides spp. ( különösen brasiliensis) és Aspergillus spp. A parazita antigének közé tartoznak például a korlátozás szándéka nélkül a következők : Plasmodium spp., Eimeria spp., Schistosoma spp., Trypanosoma spp., Babesia spp., Leishmania spp., Cryptosporidia spp., Toxoplasma spp. és Pneumocytstis spp.
A találmányt közelebbről a következő nem-korlátozó példákkal illusztráljuk.
1. példa
Kons truktumok
Bakteriális törzsek
Minden klonozó művelethez E.coli DH5a (BRL,Gaithersburg,MD) törzset alkalmaztunk. Nem-toxikus, nem-lizogén C.diphtheriae C7(_)tox- ATCC5328 törzseket és nem-toxikus, szingli lizogén
C. diphtheriae C7(B198)tox“ ATCC 5328 törzseket alkalmaztunk mind plazmid gazdaként mind kontrollként a CRM197 protein ex- • « « · 4 • *·· · ««« * · · · · « • * ·· 4 4 ·
- 13 pressziós vizsgálatoknál. A nem-toxikus, kettős lizogén C.diphtheriae C7(B197)tox- ATCC 39255 törzset alkalmaztuk kontrollként a CRM197 protein expressziós kísérleteknél.
Tenyésztés közege és körülményei
Az E.coli DH5a törzset rutinszerűen növesztettük szuper optimális húsleves (SOB) agar médiumon és SOB folyadékban 37°C hőmérsékleten (Sambrook,J. és mtársai,1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,NY). A C.diphtheriae C7 törzseket rutinszerűen tenyésztettük SOC agaron (1. Sambrook féle fenti hivatkozást) és folyadékon. ET ozmotikus agar közeget (Best,G.R. és M.L: Britz, 1986, Appl.Microbiol.Biotech. 23, 288-293) alkalmaztunk amikor az elektroporált sejtek lemeztenyésztését végeztük. Késleltetett CY tápközeget (Rappuoli,R.és mtársai,1983, J.bacteriol.,153, 1202) alkalmaztunk a CEM197 expressziót is magában foglaló kísérleteknél. 34μg/ml kloramfenikolt adagoltunk a pPX 3511 plazmidot tartalmazó E.coli DH5a és 2^g/ml-t a C.diphtheriae C7 törzsekhez.
A CRM197 gén klonozása
A CRM197 gént PCR ( polimeráz láncreakció) eljárással klonoztuk a C.diphtheriae C7 (B197)^OX“ szingli lizogén DNS génszekvencia amplifikációjával oligonukleotid primerek alkalmazásával a diftériatoxin publikált szekvenciája alapján (Greenfield, L. és mtársai, 1983, Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80, 6853-6857) . A primereket úgy terveztük, hogy az egyik primer hozza létre az Sall/HincII restrikciós helyet a funkcionális gén kezdeténél és a másik az Xbal helyet a szerkezeti gén gén stop kodonja után. Ezeket és más hasonló primereket alkalmaz• * · · · · ··· · ·«« « · 4 · · · ·· ·· 4 ·4 tünk a CRM197 gén, a diftériatoxin gén vagy bármilyen más, a korinefág R által kodolt, a diftériatoxinhoz hasonló gén amplifikálására és klónozására.
A CRM197 PCR termékeket HincII-vel és Xbal-gyel emésztjük és Smal/Xbal-gyel emésztett pNG2-22 plazmidba ligáijuk, ami egy széles gazda-spektrumú kloramfenikol rezisztencia vektor olyan képességgel, hogy mind az Escherichia coli -bán mind a Corynebacterium spp-ben replikálódni képes. A ligátumot alkalmazzuk az E.coli DH5a törzs transzformálására és a rekombináns kolóniákat restrikciós analízissel szkrineljük a CRM197 gén jelenlétére. Az egyik izolátumot, a pPX 3511 plazmidot szekvenáljuk átlapoló primerek alkalmazásával annak ellenőrzésére, hogy van e bármilyen változás a CRM197 génben. A PCRnél valamint a szekvenálásnál alkalmazott oligonukleotid printereket Applied Biosystems 380B DNS szintetizátoron állítjuk elő. A PCR-t Perkin-Elmer Cetus DNS Thermal Cycler berendezéssel végezzük. A szekvenálást Applied Biosystem Sequencer 373A berendezéssel végezzük. A kapott plazmidot (pPX 3511) elektroporációval transzformáljuk nem-toxikus, nem-lizogén C.diphtheriae C7(-)^ox“ törzsbe és nem-toxikus C.diphtheriae C7 (5197)tox_, ATCC 5328 törzsbe.
C.diphtheriae C7 elektroporációja
A C.diphtheriae C7 törzset a pPX 3511 plazmid DNS-sel transzforrnáljuk elektroporációval a Corynebacterium glutamicun és Brevibacterium lactofermentum transzformálására kifejlesztett módszerek szerint ( Hayes, J.A. és M.L. Britz, 1989, FEMS Microbiol.Lett. 61, 329-334), kivéve, hogy 0,2% Tween-80-nal kiegészített SOC tápközeget alkalmaztunk. Az elektroporációt
BTX Transfector 100, Power Plus és Optimizor Graphic Pulse Analyzer és lmm-es küvetta alkalmazásával végeztük. A pPX 3511 plazmid jelenlétét a transzformált C.diphthriae C7 törzsekben plazmid-kimentéssel és restrikciós analízissel ellenőriztük.
2. példa
Expresszió Kvantitatív CRM197 expresszié vizsgálatok
A CRM197 termeléseket hasonlítottuk össze, úgy hogy C. diphtheriae C7 törzseket növesztettünk azonos körülmények között és összehasonlítottuk a tenyészet felülúszójában a kapott CRM proteinek mennyiségét. A törzsek kvantitatív összehasonlításánál 4 ml egyéjszakás tenyészetet hígítottunk od600=°í1 értékre késleltetett CY tápközegben (30 ml végső térfogat 250 ml-es Erlenmeyer lombikban) és rázótenyésztéssel tenyésztettük 20 órán át 37°C-on. A pPX 3511 plazmidot tartalmazó törzseket antibiotikus szelekcióval és anélkül is (2 Mg/ml kloramfenikol) tenyésztettük. Inkubálás után a tenyészeteket centrifugáltuk a sejtek ektávolítására és a tenyészet felülúszóját 12%-os SDS-PAGE gélre vittük. A gélt coomassie-vel festettük és kvantitatív összehasonlítást végeztünk Bio-Rad Model 1650 Transmittance/Reflectance Scanning Densitometer és Hoefer Scientific GS 370 Analysis Package alkalmazásával. A rekombináns CRM197 protein és a lizogén B197^OX” CRM197 protein antigén tulajdonságainak összehasonlítását a gél immunoblottingolásával és a CRM197 proteinnel szembeni monoklon antitesttel való próbával végeztük. A pPX 3511 plazmid által termelt CRM197 antigén tulajdonságait tekintve azonos a lizogén törzsek által termelt CRM197 proteinével.
pPX 3511 plazmid stabilitási vizsgálatai
A pPX 3511 plazmid stabilitását kloramfenikol rezisztencia megmaradásának vizsgálatával tanulmányoztuk, amely a plazmid retencióját indikálja antibiotikus szelekció nélkül. C. diphtheriae C7 (B197)tox“ pPX3511 tenyészeteket növesztettünk SOC húsleves tápközegben - a sejtek csomósodásának megakadályozására 01% Tween-80-nal kiegészítve - 18 órán át (14-17 generáció) 37°C-on. A tenyészeteket ezután SOC agaron lemeztenyésztettük a kolóniaszám meghatározására és a következő generációhoz 1/10 -es hígítást végeztünk. Az SOC agar lemeztenyészeteket SOC agar 2Mg/ml kloramfenikolra replikáztuk és számoltuk a kloramfenikol rezisztenciát megtartó kolóniák százalékos arányát. Ezt a műveleltet ismételtük 60 generáción keresztül.
3.példa
Biológiai eredmények
A különböző C.diphtheriae törzsekből termelt CRM197 proteinek kvantitatív összehasonlítása, amelyet a coomassiefestett gélek denzitometriás vizsgálatával végeztünk (2. ábra), azt mutatja, hogy a pPX 3511 plazmidot tartalmazó törzsek 2x-es mennyiségű CRM197 proteint termelnek mint a szingli lizogének és ugyanannyit mint a kettős lizogének (1.1. táblázat). A pPX3511 plazmid stabilitását 60 generáción át a 3. ábrán mutatj uk be.
1.táblázat
C.diphtheriae C7 törzsek által termelt CRM197 protein mennyiségének aránya a szingli lizogén (8197)tox_ áltermelt protein mennyiségéhez viszonyítva
Arány a szingli lizogénhez viszonyítva
Kettős lizogén (8197)tox” | 2,2 |
pPX 3511(-)tox“ no, Cm2 | 2,8 |
pPX 3511(-)tox“, Cm2 | 1,9 |
pPX 3511(8197)tox-,no, Cm2 | 2,0 |
pPX 3511(8197)tox~, Cm2 | 2,4 |
Biológiai deponálás
A pPX 3511 plazmidot a Budapesti Egyezmény értelmében az American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 intézménynél 1993. február 12-én, ATCC 75415 szám alatt deponáltuk.Minden korlátozás a hozzáférhetőségre vonatkozóan megszűnik a szabadalom engedélyezésével a jelen bejelentésre. A deponálás érvényessége 30 év a deponálás napjától számítva vagy a szabadalom érvényességi ideje vagy még öt év attól a naptól számolva, amikor az utolsó mintát kérték a biológiai anyagból, ezek közül a leghosszabb. A deponálást megismétlik, ha az anyag életképessége megszűnik vagy ha nemreplikálható.
A szakember számára nyilvánvaló, hogy rutinkisérletekkel a bemutatott formáktól eltérő megvalósítási formákat is létrehozzon és nyilvánvaló, hogy ezek is a találmány oltalmi körébe tartoznak.
Claims (10)
- Szabadalmi igénypontok1. Eljárás diftériatoxinnal keresztreakcióra képes diftériatoxin vagy CRM proteinek előállítására azzal jellemzve, hogy egy Corynebacterium fajhoz tartozó valamely mikroorganizmust egy plazmiddal transzforrnálünk, amely a következőket tartalmazza : a) a diftériatoxint vagy CRM proteint expresszáló gént, b) egy Corynebacterium replikációs origint, és c) egy szelektálható marker gént, majd az említett toxint vagy proteint a gén expresszáláshoz megfelelő körülmények között expresszáljuk.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemzve, hogy a transzformálást elektroporációval végezzük.
- 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemzve, hogy mikroorganizmusként Corynebacterium diphtheriae-t alkalmazunk.
- 4. A 3.igénypont szerinti eljárás azzal jellemzve, hogy Corynebacterium diphtheriae törzsként C7 törzset alkalmazunk.
- 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemzve, hogy CRM génként CRM197, CRM45, CRM30, CRM228 vagy CRM176 gént alkalmazunk.
- 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemzve, hogy a replikációs origint a pNG2 Corynebacterium plazmidból származtatjuk.
- 7. Plazmid a diftériatoxinnal keresztreakcióra képes diftériatoxin vagy CRM protein expresszálásához valamely gazdaszervezetben, amely a következőket tartalmazza:a) a diftériatoxint vagy CRM proteint kodoló gént,b) egy Corynebacterium replikációs origint,c) egy szelektálható markert, adott esetben a többszörös klonozó helyhez kapcsolva.
- 8. A 7. igénypont szerinti plazmid, amelyben a proteint kodoló gén működőképesen kapcsolódik egy egy vagy több proteint, peptidet vagy ezek epitópját kodoló nukleotid s z ekvenc i áho z.
- 9. A pPX 3511, ATCC No. 75415 plazmid.
- 10. A Corynebacterium fajhoz tartozó mikroorganizmus, amely a 7. igénypont szerinti plazmiddal van transzformálva.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US2728393A | 1993-03-05 | 1993-03-05 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HU9400657D0 HU9400657D0 (en) | 1994-05-30 |
HUT71320A true HUT71320A (en) | 1995-11-28 |
Family
ID=21836767
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU9400657A HUT71320A (en) | 1993-03-05 | 1994-03-04 | Novel plasmid for production of crm protein and diphtheria toxin |
Country Status (21)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5614382A (hu) |
EP (1) | EP0616034B1 (hu) |
JP (1) | JP4144813B2 (hu) |
KR (1) | KR100316004B1 (hu) |
CN (1) | CN1100757A (hu) |
AT (1) | ATE280235T1 (hu) |
AU (1) | AU686126B2 (hu) |
BR (1) | BR1100634A (hu) |
CA (1) | CA2116914C (hu) |
CZ (1) | CZ39394A3 (hu) |
DE (1) | DE69434079T2 (hu) |
DK (1) | DK0616034T3 (hu) |
ES (1) | ES2231770T3 (hu) |
FI (1) | FI112090B (hu) |
HU (1) | HUT71320A (hu) |
IL (1) | IL108822A (hu) |
NO (1) | NO313758B1 (hu) |
NZ (1) | NZ260027A (hu) |
PT (1) | PT616034E (hu) |
SK (1) | SK24094A3 (hu) |
ZA (1) | ZA941548B (hu) |
Families Citing this family (118)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE69638145D1 (de) * | 1995-04-14 | 2010-04-22 | Us Gov Health & Human Serv | Verfahren zur herbeiführung einer immuntoleranz mit hilfe von immuntoxinen |
US7696338B2 (en) | 1995-10-30 | 2010-04-13 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Immunotoxin fusion proteins and means for expression thereof |
US7288254B2 (en) | 1995-10-30 | 2007-10-30 | The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, Nih | Use of immunotoxins to induce immune tolerance to pancreatic islet transplantation |
US7517527B2 (en) | 1995-10-30 | 2009-04-14 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Immunotoxin with in vivo T cell suppressant activity and methods of use |
US7125553B1 (en) | 1996-04-15 | 2006-10-24 | The United States of America as represented by the Department of Health and Human Services c/o Centers for Disease Control and Prevention | Methods of inducing immune tolerance using immunotoxins |
DE69840913D1 (de) | 1997-03-05 | 2009-07-30 | Us Health | Divalent anti-t-zellen immuntoxinen und deren verwendung |
EP0968282A2 (en) * | 1997-03-05 | 2000-01-05 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | Vectors and methods for expression of mutant proteins |
US6676943B1 (en) | 1997-04-24 | 2004-01-13 | Regents Of The University Of Minnesota | Human complement C3-degrading protein from Streptococcus pneumoniae |
CN1086945C (zh) * | 1997-06-03 | 2002-07-03 | 胡章英 | 白喉口服液 |
GB9923060D0 (en) * | 1999-09-29 | 1999-12-01 | Chiron Spa | Vaccine |
MX339524B (es) | 2001-10-11 | 2016-05-30 | Wyeth Corp | Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica. |
GB0211118D0 (en) * | 2002-05-15 | 2002-06-26 | Polonelli Luciano | Vaccines |
WO2004011027A1 (en) * | 2002-07-30 | 2004-02-05 | Baxter International Inc. | Chimeric multivalent polysaccharide conjugate vaccines |
US7785608B2 (en) * | 2002-08-30 | 2010-08-31 | Wyeth Holdings Corporation | Immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease |
US7301554B2 (en) * | 2002-09-20 | 2007-11-27 | Ricoh Company, Ltd. | Light scanning device, scanning line adjusting method, scanning line adjusting control method, image forming apparatus, and image forming method |
EA012984B1 (ru) | 2003-12-17 | 2010-02-26 | Вайет | Конъюгаты иммуногенных пептидных носителей и способы их получения |
MY144231A (en) | 2003-12-17 | 2011-08-15 | Wyeth Corp | Aß IMMUNOGENIC PEPTIDE CARRIER CONJUGATES AND METHODS OF PRODUCING SAME |
GB0505996D0 (en) | 2005-03-23 | 2005-04-27 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Fermentation process |
IL308456A (en) | 2005-04-08 | 2024-01-01 | Wyeth Llc | A multivalent pneumomuroral protein-polysaccharide conjugate preparation |
US7709001B2 (en) | 2005-04-08 | 2010-05-04 | Wyeth Llc | Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
TW200806315A (en) | 2006-04-26 | 2008-02-01 | Wyeth Corp | Novel formulations which stabilize and inhibit precipitation of immunogenic compositions |
US8808707B1 (en) | 2006-05-08 | 2014-08-19 | Wyeth Llc | Pneumococcal dosing regimen |
CN101460180B (zh) * | 2006-05-31 | 2012-06-27 | 西尔维奥·布齐 | 与白喉毒素免疫相关的蛋白质分子的药物应用 |
AR064642A1 (es) | 2006-12-22 | 2009-04-15 | Wyeth Corp | Polinucleotido vector que lo comprende celula recombinante que comprende el vector polipeptido , anticuerpo , composicion que comprende el polinucleotido , vector , celula recombinante polipeptido o anticuerpo , uso de la composicion y metodo para preparar la composicion misma y preparar una composi |
CN101265288B (zh) * | 2007-03-13 | 2012-03-21 | 齐鲁制药有限公司 | Crm197突变体的纯化方法 |
BRPI1014494A2 (pt) | 2009-04-30 | 2016-08-02 | Coley Pharm Group Inc | vacina pneumocócica e usos da mesma |
SG10201406432RA (en) | 2009-06-22 | 2014-11-27 | Wyeth Llc | Compositions and methods for preparing staphylococcus aureus serotype 5 and 8 capsular polysaccharide conjugate immunogenic compositions |
SI2445522T1 (sl) | 2009-06-22 | 2017-10-30 | Wyeth Llc | Imunogeni sestavki antigenov Staphylococcusa aureusa |
IT1398927B1 (it) | 2009-06-25 | 2013-03-28 | Consorzio Interuniversitario Per Lo Sviluppo Dei Sistemi A Grande Interfase Csgi | Espressione batterica di un gene artificiale per la produzione di crm197 e derivati. |
AU2010201410B2 (en) * | 2010-03-30 | 2015-04-30 | Pelican Technology Holdings, Inc. | High level expression of recombinant CRM197 |
AU2011238711B2 (en) | 2010-03-30 | 2015-06-18 | Pelican Technology Holdings, Inc. | High level expression of recombinant toxin proteins |
AU2011262346B2 (en) | 2010-06-04 | 2014-12-11 | Wyeth Llc | Streptococcus pneumoniae vaccine formulations |
EP2575868A1 (en) | 2010-06-07 | 2013-04-10 | Pfizer Vaccines LLC | Ige ch3 peptide vaccine |
KR101594228B1 (ko) | 2010-08-23 | 2016-02-15 | 와이어쓰 엘엘씨 | 네이세리아 메닌기티디스 rLP2086 항원의 안정한 제제 |
AU2011300409B2 (en) | 2010-09-10 | 2015-03-26 | Wyeth Llc | Non-lipidated variants of Neisseria meningitidis ORF2086 antigens |
KR101839496B1 (ko) * | 2011-06-01 | 2018-03-19 | 시아먼 유니버시티 | 디프테리아 독소 무독성 돌연변이 씨알엠197 또는 그의 단편을 포함하는 융합 단백질 |
KR101763625B1 (ko) | 2012-03-09 | 2017-08-01 | 화이자 인코포레이티드 | 수막염균 조성물 및 이의 사용 방법 |
SA115360586B1 (ar) | 2012-03-09 | 2017-04-12 | فايزر انك | تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها |
US9169304B2 (en) | 2012-05-01 | 2015-10-27 | Pfenex Inc. | Process for purifying recombinant Plasmodium falciparum circumsporozoite protein |
KR102057217B1 (ko) | 2012-06-20 | 2020-01-22 | 에스케이바이오사이언스 주식회사 | 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물 |
WO2014013375A1 (en) | 2012-07-16 | 2014-01-23 | Pfizer Inc. | Saccharides and uses thereof |
CN102766647A (zh) * | 2012-07-25 | 2012-11-07 | 天津康希诺生物技术有限公司 | 在白喉杆菌中稳定复制的表达载体及含该载体的白喉杆菌 |
IN2015DN00694A (hu) | 2012-08-16 | 2015-06-26 | Pfizer | |
CN104582718B (zh) | 2012-10-03 | 2017-10-24 | 诺华股份有限公司 | 免疫原性组合物 |
KR20140075201A (ko) | 2012-12-11 | 2014-06-19 | 에스케이케미칼주식회사 | 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물 |
KR20140075196A (ko) | 2012-12-11 | 2014-06-19 | 에스케이케미칼주식회사 | 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물 |
IL274500B2 (en) | 2012-12-20 | 2024-01-01 | Pfizer | glycoconjugation process |
TWI572356B (zh) | 2013-01-04 | 2017-03-01 | 台灣浩鼎生技股份有限公司 | 具有較高碳水化合物抗原密度之疫苗及新穎皂素佐劑 |
US9802987B2 (en) | 2013-03-08 | 2017-10-31 | Pfizer Inc. | Immunogenic fusion polypeptides |
US9707153B2 (en) | 2013-04-24 | 2017-07-18 | Corning Incorporated | Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients |
CN104140972B (zh) * | 2013-05-07 | 2018-01-23 | 上海惠盾生物技术有限公司 | 白喉毒素突变体crm197的制备方法 |
US9908805B2 (en) | 2013-08-26 | 2018-03-06 | Corning Incorporated | Method for localized annealing of chemically strengthened glass |
US9822150B2 (en) | 2013-09-08 | 2017-11-21 | Pfizer Inc. | Neisseria meningitidis compositions and methods thereof |
US11708411B2 (en) | 2013-12-20 | 2023-07-25 | Wake Forest University Health Sciences | Methods and compositions for increasing protective antibody levels induced by pneumococcal polysaccharide vaccines |
CN105934251A (zh) | 2014-01-21 | 2016-09-07 | 辉瑞大药厂 | 肺炎链球菌荚膜多糖及其缀合物 |
US11160855B2 (en) | 2014-01-21 | 2021-11-02 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof |
PT3096786T (pt) | 2014-01-21 | 2021-08-24 | Pfizer | Polissacáridos capsulares de streptococcus pneumoniae e conjugados dos mesmos |
WO2015110941A2 (en) | 2014-01-21 | 2015-07-30 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof |
WO2015117093A1 (en) | 2014-01-31 | 2015-08-06 | Fina Biosolutions, Llc | Expression and purification of crm197 and related proteins |
JP2017505792A (ja) | 2014-02-14 | 2017-02-23 | ファイザー・インク | 免疫原性糖タンパク質コンジュゲート |
US9107906B1 (en) | 2014-10-28 | 2015-08-18 | Adma Biologics, Inc. | Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency |
CN107109416A (zh) | 2014-11-20 | 2017-08-29 | 生物E有限公司 | 用于crm197的高水平表达的密码子优化多核苷酸 |
PT3244917T (pt) | 2015-01-15 | 2023-05-31 | Pfizer | Composições imunogénicas para utilização em vacinas pneumocócicas |
KR20170103009A (ko) | 2015-02-19 | 2017-09-12 | 화이자 인코포레이티드 | 나이세리아 메닌지티디스 조성물 및 그의 방법 |
EP3292146A1 (en) | 2015-05-04 | 2018-03-14 | Pfizer Inc | Group b streptococcus polysaccharide-protein conjugates, methods for producing conjugates, immunogenic compositions comprising conjugates, and uses thereof |
DK3313436T3 (da) | 2015-06-23 | 2021-03-08 | Biological E Ltd | Multivalent pneumokok-konjugatvaccine |
SG10202005253TA (en) | 2015-07-21 | 2020-07-29 | Pfizer | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens, kits comprising the same and uses thereof |
EP3377098A1 (en) | 2015-11-20 | 2018-09-26 | Pfizer Inc | Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines |
CN109790545A (zh) | 2016-03-10 | 2019-05-21 | 约翰·霍普金斯大学 | 产生不含聚集物的单体白喉毒素融合蛋白的方法和治疗用途 |
US11965009B2 (en) | 2016-03-10 | 2024-04-23 | The Johns Hopkins University | Methods of producing aggregate-free monomeric diphtheria toxin fusion proteins and therapeutic uses |
US11203626B2 (en) | 2016-03-10 | 2021-12-21 | The Johns Hopkins University | Methods of producing aggregate-free monomeric diphtheria toxin fusion proteins and therapeutic uses |
EP3269385A1 (en) | 2016-07-12 | 2018-01-17 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
EP3474890A1 (en) | 2016-06-22 | 2019-05-01 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften E. V. | Pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
CN109862908B (zh) | 2016-08-05 | 2023-05-02 | 圣诺菲·帕斯图尔公司 | 多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物组合物 |
CN109890415B (zh) | 2016-08-05 | 2023-04-04 | 圣诺菲·帕斯图尔公司 | 多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物组合物 |
CA3037056A1 (en) | 2016-09-30 | 2018-04-05 | Biological E Limited | Multivalent pneumococcal vaccine compositions comprising polysaccharide-protein conjugates |
US10751402B2 (en) | 2016-11-09 | 2020-08-25 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions and uses thereof |
US11951165B2 (en) | 2016-12-30 | 2024-04-09 | Vaxcyte, Inc. | Conjugated vaccine carrier proteins |
KR102459629B1 (ko) | 2017-01-20 | 2022-10-28 | 화이자 인코포레이티드 | 폐렴구균 백신에 사용하기 위한 면역원성 조성물 |
WO2018144438A1 (en) | 2017-01-31 | 2018-08-09 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Methods for production of capsular polysaccharide protein conjugates from streptococcus pneumoniae serotype 19f |
PE20191107A1 (es) | 2017-01-31 | 2019-08-26 | Pfizer | Composiciones de neisseria meningitidis y metodos respectivos |
KR101908590B1 (ko) | 2017-02-01 | 2018-10-16 | (주)포바이오코리아 | Crm197의 용해성 단백질 발현 및 정제 방법 |
WO2018144799A1 (en) | 2017-02-03 | 2018-08-09 | SCHADECK, Eva, Barbara | Haemophilus influenzae saccharide-carrier conjugate compositions and uses thereof |
US10259865B2 (en) | 2017-03-15 | 2019-04-16 | Adma Biologics, Inc. | Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection |
RS63551B1 (sr) | 2017-04-22 | 2022-09-30 | Biological E Ltd | Poboljšani postupak za proizvodnju crm na visokom nivou |
CN111093650B (zh) | 2017-09-07 | 2024-03-01 | 默沙东有限责任公司 | 肺炎球菌多糖及其在免疫原性多糖-载体蛋白缀合物中的用途 |
CN117982633A (zh) | 2017-12-06 | 2024-05-07 | 默沙东有限责任公司 | 包含肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的组合物及其使用方法 |
KR102475419B1 (ko) * | 2018-07-16 | 2022-12-07 | 주식회사 유바이오로직스 | Crm197을 고농도로 발현하는 코리네박테리움 균주 |
US11260119B2 (en) | 2018-08-24 | 2022-03-01 | Pfizer Inc. | Escherichia coli compositions and methods thereof |
CN109100517A (zh) * | 2018-10-08 | 2018-12-28 | 武汉生命科技股份有限公司 | 一种用于检测白喉抗体的抗原蛋白、试剂盒及制备方法 |
CA3120922A1 (en) | 2018-12-12 | 2020-06-18 | Pfizer Inc. | Immunogenic multiple hetero-antigen polysaccharide-protein conjugates and uses thereof |
SG11202106541WA (en) | 2018-12-19 | 2021-07-29 | Merck Sharp & Dohme | Compositions comprising streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof |
JP7239509B6 (ja) | 2019-02-22 | 2023-03-28 | ファイザー・インク | 細菌多糖類を精製するための方法 |
CA3136278A1 (en) | 2019-04-10 | 2020-10-15 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens, kits comprising the same and uses thereof |
AU2020323498A1 (en) | 2019-07-31 | 2022-03-03 | Sk Bioscience Co., Ltd. | Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate compositions and methods of using the same |
IL292494A (en) | 2019-11-01 | 2022-06-01 | Pfizer | Preparations of Escherichia coli and their methods |
CN115362177A (zh) | 2020-02-21 | 2022-11-18 | 辉瑞公司 | 糖类的纯化 |
JP2023514697A (ja) | 2020-02-23 | 2023-04-07 | ファイザー・インク | 大腸菌組成物およびその方法 |
EP3900739A1 (en) | 2020-04-21 | 2021-10-27 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Synthetic streptococcus pneumoniae saccharide conjugates to conserved membrane protein |
EP3919076A1 (en) | 2020-06-02 | 2021-12-08 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Synthetic oligosaccharide vaccines against streptococcus pneumoniae with microparticle adjuvant formulations |
EP4203995A1 (en) | 2020-08-26 | 2023-07-05 | Pfizer Inc. | Group b streptococcus polysaccharide-protein conjugates, methods for producing conjugates, immunogenic compositions comprising conjugates, and uses thereof |
KR20230043157A (ko) | 2020-09-17 | 2023-03-30 | 얀센 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 | 다가 백신 조성물 및 이의 용도 |
CA3199094A1 (en) | 2020-10-22 | 2022-04-28 | Pfizer Inc. | Methods for purifying bacterial polysaccharides |
AU2021368151A1 (en) | 2020-10-27 | 2023-06-01 | Pfizer Inc. | Escherichia coli compositions and methods thereof |
US20240000912A1 (en) | 2020-11-04 | 2024-01-04 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines |
EP4243863A2 (en) | 2020-11-10 | 2023-09-20 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof |
US20220202923A1 (en) | 2020-12-23 | 2022-06-30 | Pfizer Inc. | E. coli fimh mutants and uses thereof |
KR20220102871A (ko) | 2021-01-14 | 2022-07-21 | (주)셀트리온 | 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물 |
TW202245835A (zh) | 2021-02-04 | 2022-12-01 | 美商默沙東有限責任公司 | 用於肺炎球菌結合物疫苗之奈米乳化液佐劑組合物 |
CA3218544A1 (en) | 2021-05-03 | 2022-11-10 | Pfizer Inc. | Vaccination against bacterial and betacoronavirus infections |
WO2022234416A1 (en) | 2021-05-03 | 2022-11-10 | Pfizer Inc. | Vaccination against pneumoccocal and covid-19 infections |
EP4346893A2 (en) | 2021-05-28 | 2024-04-10 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof |
US20220387613A1 (en) | 2021-05-28 | 2022-12-08 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof |
WO2023135515A1 (en) | 2022-01-13 | 2023-07-20 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof |
WO2023161817A1 (en) | 2022-02-25 | 2023-08-31 | Pfizer Inc. | Methods for incorporating azido groups in bacterial capsular polysaccharides |
WO2023218322A1 (en) | 2022-05-11 | 2023-11-16 | Pfizer Inc. | Process for producing of vaccine formulations with preservatives |
WO2024084397A1 (en) | 2022-10-19 | 2024-04-25 | Pfizer Inc. | Vaccination against pneumoccocal and covid-19 infections |
WO2024089001A1 (en) | 2022-10-24 | 2024-05-02 | Idorsia Pharmaceuticals Ltd | Vaccine against klebsiella pneumoniae |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CH660375A5 (it) * | 1983-02-08 | 1987-04-15 | Sclavo Spa | Procedimento per la produzione di proteine correlate alla tossina difterica. |
FR2549855B1 (fr) * | 1983-07-29 | 1987-03-27 | Grp Genie Genetique | Sequence nucleotidique codant pour le peptide signal de la toxine diphterique, vecteur contenant cette sequence nucleotidique, leur application a la transformation de micro-organismes et compositions peptidiques obtenues |
-
1994
- 1994-02-07 DE DE69434079T patent/DE69434079T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-02-07 DK DK94101770T patent/DK0616034T3/da active
- 1994-02-07 ES ES94101770T patent/ES2231770T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-02-07 EP EP94101770A patent/EP0616034B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-02-07 AT AT94101770T patent/ATE280235T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-02-07 PT PT94101770T patent/PT616034E/pt unknown
- 1994-02-22 CZ CZ94393A patent/CZ39394A3/cs unknown
- 1994-02-28 SK SK240-94A patent/SK24094A3/sk unknown
- 1994-03-01 JP JP05442894A patent/JP4144813B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-03-02 IL IL10882294A patent/IL108822A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-03-03 CA CA002116914A patent/CA2116914C/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-03-04 ZA ZA941548A patent/ZA941548B/xx unknown
- 1994-03-04 HU HU9400657A patent/HUT71320A/hu unknown
- 1994-03-04 NZ NZ260027A patent/NZ260027A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-03-04 NO NO19940774A patent/NO313758B1/no not_active IP Right Cessation
- 1994-03-04 KR KR1019940004356A patent/KR100316004B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-03-04 FI FI941050A patent/FI112090B/fi not_active IP Right Cessation
- 1994-03-04 AU AU57595/94A patent/AU686126B2/en not_active Expired
- 1994-03-04 CN CN94102360A patent/CN1100757A/zh active Pending
-
1995
- 1995-05-25 US US08/450,333 patent/US5614382A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-05-13 BR BR1100634-0A patent/BR1100634A/pt active IP Right Grant
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2116914A1 (en) | 1994-09-06 |
ES2231770T3 (es) | 2005-05-16 |
NO313758B1 (no) | 2002-11-25 |
EP0616034A3 (en) | 1996-10-16 |
KR100316004B1 (ko) | 2002-02-19 |
CA2116914C (en) | 2005-02-08 |
FI112090B (fi) | 2003-10-31 |
BR1100634A (pt) | 1999-12-07 |
HU9400657D0 (en) | 1994-05-30 |
SK24094A3 (en) | 1995-03-08 |
DK0616034T3 (da) | 2005-02-21 |
CZ39394A3 (en) | 1995-02-15 |
AU686126B2 (en) | 1998-02-05 |
FI941050A (fi) | 1994-09-06 |
NO940774L (no) | 1994-09-06 |
CN1100757A (zh) | 1995-03-29 |
ZA941548B (en) | 1994-10-03 |
EP0616034A2 (en) | 1994-09-21 |
JPH06292593A (ja) | 1994-10-21 |
KR940021731A (ko) | 1994-10-19 |
ATE280235T1 (de) | 2004-11-15 |
JP4144813B2 (ja) | 2008-09-03 |
IL108822A0 (en) | 1994-06-24 |
PT616034E (pt) | 2005-02-28 |
FI941050A0 (fi) | 1994-03-04 |
NO940774D0 (no) | 1994-03-04 |
US5614382A (en) | 1997-03-25 |
EP0616034B1 (en) | 2004-10-20 |
DE69434079D1 (de) | 2004-11-25 |
IL108822A (en) | 2004-09-27 |
NZ260027A (en) | 1996-03-26 |
DE69434079T2 (de) | 2005-02-24 |
AU5759594A (en) | 1994-09-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
HUT71320A (en) | Novel plasmid for production of crm protein and diphtheria toxin | |
EP0712442B1 (en) | Vaccine compositions | |
EP0544685A1 (en) | Mycobacterial expression vector | |
EP0478664B1 (en) | Vector-mediated genomic insertion and expression of dna in bcg | |
JPH07502646A (ja) | リポタンパク質の分泌シグナルをコード化するdnaを含む細菌発現ベクター | |
JPH08503602A (ja) | 弱毒化細菌における組換え融合タンパク質の発現 | |
CA2323634A1 (en) | Lactobacilli harboring aggregation and mucin binding genes as vaccine delivery vehicles | |
AU743165B2 (en) | Live attenuated bacteria of the species Actinobacillus pleuropneumoniae | |
JP4077878B2 (ja) | S―層―タンパク質の組み換え発現 | |
JP7334176B2 (ja) | 肺炎球菌表面タンパク質A(PspA)の発現 | |
US20040202678A1 (en) | Actinobacillus pleuropneumoniae subunit vaccine | |
HUT52701A (en) | Process for producing vaccine of bordetella pertussis | |
AU750847B2 (en) | Clostridium toxin, and method for preparing immunogenic compositions | |
JPH1075774A (ja) | パスツレラ科の弱毒化rtx産生細菌 | |
EP1518558A2 (en) | Vaccine against infection with Actinobacillus pleuropneumoniae comprising purified ApxIV toxin | |
EP0742829B1 (en) | Expression of heterologous proteins in attenuated bacteria using the htra-promoters | |
EP1468076B1 (en) | AroQ-deficient Bordetella strain and uses thereof | |
AU2002301780B2 (en) | Clostridium toxin and method for preparing immunogenic compositions | |
WO1997016207A1 (en) | Peptide expression and delivery system | |
EA045199B1 (ru) | ЭКСПРЕССИЯ ПНЕВМОКОККОВОГО ПОВЕРХНОСТНОГО БЕЛКА А (PspA) | |
HU205372B (en) | Process for producing vaccines against cholera | |
AU2007201975B2 (en) | Clostridium Toxin and Method for Preparing Immunogenic Compositions | |
KR101038266B1 (ko) | 개 렙토스피라 예방을 위한 재조합 항원 단백질 및 그제조방법 | |
AU2002357406A1 (en) | Defective entities and uses therefor |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |